JP6422778B2 - Ｐｋｃアクチベーターおよびその組合せ - Google Patents

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    • G01N33/5058—Neurological cells

Description

開示の分野
本出願は、２０１１年１１月１３日出願の、米国仮特許出願第６１／５５９，１４１号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、ＰＫＣアクチベーターおよびその組合せに関する。本開示は、ＰＫＣアクチベーターおよびその組合せを用いた、組成物、キット、および処置の方法にさらに関する。
開示の背景
プロテインキナーゼＣは、プロテインキナーゼ酵素の最大のファミリーの１つであり、様々なアイソフォームから構成される。従来のアイソフォームにはα、βＩ、βＩＩ、γが含まれ、新規なアイソフォームにはδ、ε、η、θが含まれ、非定型的なアイソフォームにはξ、およびι／λが含まれる。
ＰＫＣ酵素は主にサイトゾル性であるが、活性化すると膜に転位する。ＰＫＣは、細胞質において、他のキナーゼによってリン酸化され、または自己リン酸化する。ＰＫＣのアイソフォームの中には（例えば、ＰＫＣ−ε）、活性化するために、ジアシルグリセロール（「ＤＡＧ」）結合部位またはホスファチジルセリン（「ＰＳ」）結合部位に結合するための分子を必要とするものもある。他のアイソフォームは、いかなる二次結合伝達物質がなくても活性化できる。
ＤＡＧ部位に結合するＰＫＣアクチベーターには、それだけには限定されないが、ブリオスタチン、ピコローグ（picologue）、ホルボールエステル、アプリシアトキシン、およびグニジマクリンが含まれる。ＰＳ部位に結合するＰＫＣアクチベーターには、それだけには限定されないが、多価不飽和脂肪酸およびその誘導体が含まれる。
ＰＫＣは、活性化および転位した後は、アンカータンパク質ＲＡＣＫ１によって、膜中に繋留される。例えば、Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８８、３９９７〜４０００；Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ ９、４８４−４９６；Ｓｋｌａｎら、（２００６）Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、７８、１１７〜１３４を参照されたい。ＲＡＣＫ１は、ＰＫＣを、リン酸化のための対応する基質に局在化させ、よってＰＫＣを機能的に活性にし、生理学的に関連付ける。
活性化したＰＫＣは、様々な生物学的経路に関与する。例えば、ＰＫＣはＥＬＡＶ ｍＲＮＡ安定化タンパク質およびｃ−ＣＡＭＰ応答エレメント結合（「ＣＲＥＢ」）タンパク質を活性化する。ＰＫＣのアイソフォームも、アミロイド前駆タンパク質（「ＡＰＰ」）のプロセシングおよびアミロイドの蓄積において調節的役割を果たす。例えば、ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εは、非アミロイド形成性経路によってＡＰＰのプロセシングを調節し、これら酵素が低減するとＡβの合成および蓄積の増大をもたらし得ることが示唆される。それゆえ、ＰＫＣアクチベーターは可溶性Ａβのレベルを低減し、可溶性ＡＰＰ−αのレベルを増大することができ得る。ＰＫＣアクチベーターは、アミロイドプラークおよび神経原線維変化を低減または除去することもでき得る。
ＰＫＣアクチベーターは、様々な疾患および状態の予防および処置に関連している。例えば、ＰＫＣアクチベーターは、神経変性疾患および状態、神経情動性疾患および障害、認知障害、ならびに神経またはシナプスの喪失に付随する疾患および状態の予防および処置を可能にし得る。実際、ＰＫＣアクチベーターは、シナプス形成を誘発することが見出されている。さらに、ＰＫＣアクチベーターは、例えば、長期記憶を含めた記憶および学習における改善に関連している。
具体的な一例において、ＰＫＣアクチベーターは、アルツハイマー病（「ＡＤ」）の動物モデルにおける神経保護活性を実証している。Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９：７１８４〜７１８８を参照されたい。ＡＤは、記憶、認知、論理的思考、判断、および情意安定性の進行性の低下によって臨床的に特徴付けられ、徐々に深刻な精神衰退をもたらし、最終的には死をもたらす、神経変性障害である。
病理学的に、ＡＤは、β−およびγ−セクレターゼによるアミロイド前駆タンパク質（「ＡＰＰ」）のタンパク分解性の切断によって生成される４ｋＤａのペプチドである、凝集したβ−アミロイド（「Ａβ」）の蓄積に付随する。ここで開示する通り、Ａβのオリゴマーは最も毒性であると考えられている一方、原線維性Ａβは概ね不活性である。興味深いことに、モノマーのＡβは正常患者において見出され、機能は未だ決定されていない。
ＰＫＣアクチベーターは、Ａβのレベルを低減し、ＡＤトランスジェニックマウスの生存を延長することができる。Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：７１８４〜７１８８を参照されたい。ＰＫＣ−εは、Ａβ生成を抑制するのに最も効果的であることが示された。Ｚｈｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００１、２８５：９９７〜１００６を参照されたい。したがって、アイソフォーム特異的ＰＫＣアクチベーターは、潜在的な抗ＡＤ薬およびＡβ生成に付随する他の状態として、極めて望ましい。
ＡＤにおける最初期の持続的な細胞病理学的変化は、シナプスの喪失である。Ｓｃｈｅｆｆ ら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、２００６、２７：１３７２〜１３８４、およびＭａｒｃｅｌｌｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００８、５８５：１０９〜１１８を参照されたい。実際、シナプスの喪失は、ＡＤ患者における認知症の程度に緊密に相関する、脳における唯一の病理学的知見であると思われる。Ｔｅｒｒｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９１、３０：５７２〜５８０を参照されたい。この目的で、Ａβがシナプスの喪失に関与することを、証拠は示唆している。
ＰＫＣアクチベーターは、シナプスの喪失および／またはＡβに付随する、他の疾患および状態を処置および予防するのに用いることもできる。脳傷害に罹患しているヒトは、例えば、ＡＰＰ、およびＡＰＰのタンパク分解性生成物であるＡβの合成および発現の増大を示す。Ｚｏｈａら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ、２０１１、４１：３２９〜３３７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９１、１４２２〜１４２３；Ｇｅｎｔｌｅｍａｎら、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ、１９９７、８：１５１９〜１５２２；Ｉｗａｔａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２００２、６１：１０５６〜１０６８を参照されたい。動物モデルにおいて、ＰＫＣアクチベーターであるブリオスタチン−１は、外傷性脳傷害誘発性の学習および記憶の欠損から保護することが示された。Ｚｏｈａｒら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ、２０１１、４１：３２９〜３３７を参照されたい。このように、ＰＫＣアクチベーターは、記憶および他の認知機能を増強することができ得る。
さらに、脳卒中の形態には、Ａβによって引き起こされるもの、例えば、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）に付随するものがある。米国出願公開第２０１０／００２２６４５ Ａ１号を参照されたい。この障害は、ＡＤにおいて見出されるのと同じＡβ沈着が、脳の軟膜の壁および表在性の大脳皮質の血管に蓄積する、一形態の血管障害である。アミロイド沈着はこれらの血管を不全にする素因となり、出血性脳卒中の危険性を増大する。ＣＡＡは、一過性虚血発作、くも膜下出血、ダウン症候群、照射後壊死、多発性硬化症、白質脳症、海綿状脳症、および拳闘家認知症にも関連する。
ＰＫＣ−αとＰＫＣ−εの両方が、シナプトジェネシス、すなわちシナプスの形成にとって重要である。シナプス前の神経線維にＰＫＣ−εが非常に大量にあることは、神経突起の伸長、シナプスの形成、および神経伝達物質の放出における役割を示唆する。Ｓｈｉｒａｉら、ＦＥＢＳ、２００８、２９：１４４５〜１４５３を参照されたい。ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εを活性化する非毒性の薬物は、非病理学的条件下のシナプス形成を促進し、実際に病理学的条件下でシナプス喪失を予防することができる。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２００９、３４：１３６〜１４５；Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７、１０４：１９５７１〜１９５７６；Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００８、１０５：１３６２０〜１３６２５；Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００９、１０６：１４６７６〜１４６８０を参照されたい。
例えば、ＰＫＣアクチベーターは、脳卒中の動物モデルにおける神経保護活性を実証している。Ｓｕｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００５、５１２：４３〜５１を参照されたい。ＰＫＣのいくつかのアイソフォームは、脳卒中後の虚血および再灌流の損傷を媒介する上で中心的役割を果たす。実験的脳卒中モデル、マウス遺伝学、ならびに選択的ペプチドインヒビターおよびアクチベーターでの試験は、ＰＫＣ−εは虚血抵抗性の誘発に関与し、損傷を予防することを実証する一方で、ＰＫＣ−δおよびＰＫＣ−γは傷害に関係する。Ｔａｋａｙｏｓｈｉら、Ｓｔｒｏｋｅ、２００７、３８（２）：３７５〜３８０；およびＢｒｉｇｈｔら、Ｓｔｒｏｋｅ、２００５；３６：２７８１を参照されたい。ブリオスタチン−１での虚血後／低酸素の処置は、シナプス形成、神経栄養活性、ならびに空間学習および記憶における虚血誘発性欠損を効果的に救出する。Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、２００８、１０５（３６）：１３６２０〜１３６２５を参照されたい。
ＰＫＣの活性化は学習および記憶の増強において決定的な役割を有し、ＰＫＣアクチベーターは記憶および学習を増大することが示されている。Ｓｕｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５、５１２：４３〜５１；Ａｌｋｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、２００５、１０２：１６４３２〜１６４３７を参照されたい。例えば、ブリオスタチンは、齧歯動物、ウサギ、および無脊椎動物において学習の速度を増大する。Ｓｕｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００５、５１２：４３〜５１；Ｗａｎｇら、Ｂｅｈａｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００８、１９：２４５〜２５６；およびＫｕｚｉｒｉａｎら、Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．、２００６、２１０：２０１〜２１４を参照されたい。さらに、長期連合記憶に対するブリオスタチン誘発性シナプス形成は、ＰＫＣ活性化によって調節されることが示された。Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７、１０４：１９５７１〜１９５７６。
ＰＫＣ活性化は、様々な他の状態に付随している。例えば、ＰＫＣアクチベーターは、うつ病の動物モデルにおける神経保護活性を実証している。Ｓｕｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００５、５１２：４３〜５１を参照されたい。
開示の概要
本開示は、ＰＫＣアクチベーターおよびその組合せに関する。一態様において、ＰＫＣアクチベーターは、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビター、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）、インスリン成長因子、ホルモン、成長因子アクチベーター、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される。
本開示は、少なくとも上記のＰＫＣアクチベーターの組合せにさらに関する。これらの組合せは、混合物、コンジュゲート、使用の組合せであってもよい。少なくとも一つの態様において、組合せは、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターおよび少なくとも１つの他のＰＫＣアクチベーターを含む。別の一態様において、組合せは、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーター、および少なくとも１つの他の薬剤、例えば、レチノイドまたはコレステロールを含む。
さらに、本開示は、神経変性障害または状態、例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病；神経情動性障害、例えば、うつ病、双極性障害、および統合失調症；精神遅滞；脳卒中；外傷性脳傷害および照射により誘発される脳傷害を含めた脳傷害を処置するための方法に関し、前記方法は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せを、それを必要とする患者に投与することを含む。本開示は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せを、それを必要とする患者に投与することを含む、学習および／または記憶を改善するための方法にさらに関する。
本開示は、少なくとも１つのレチノイドおよび少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターを細胞に添加すること、シナプスネットワークを形成させること、シナプスネットワークを破壊する少なくとも１つの毒素を添加すること、スクリーニングしようとする少なくとも１つの薬物を添加すること、ならびにシナプスネットワークが少なくとも部分的に回復しているか否か、またはなんらかのシナプス形成が生じているか否かを決定することを含む、少なくとも１つの薬物をスクリーニングするための方法にも関する。一態様において、スクリーニングを用いて、薬物がシナプスネットワークを少なくとも部分的に回復することができるか否か、シナプス形成を誘発することができるか否か、および／またはシナプスネットワークの破壊を防ぐことができるか否かを決定する。
ＤＣＰＬＡおよびＤＨＡ−ＣＰ６と比べた、ＤＣＰＬＡメチルエステル（「ＤＣＰＬＡ−ＭＥ」）によるＰＫＣ活性化。 ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルおよびＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステルのＰＫＣ活性化および選択性。 ＤＣＰＬＡ−エチルエステル、ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、およびＤＣＰＬＡレチニルエステルのＰＫＣ活性化および選択性。 コレステリルリノレエートと比べたＤＣＰＬＡ−コレステロールエステルのＰＫＣ活性化および選択性。 様々なＡβ集合体の神経毒性効果。ＡＳＰＤ、ＡＤＤＬ、ＯＡβ＜１００ｋＤａろ液、およびモノマーのＡβを、本明細書の実施例のセクションに記載した通りに調製し、２０時間後の一次ラット海馬ニューロン培養物に対するこれらの毒性を、ＭＴＴアッセイを用いて推定した。ＡＳＰＤは１００ｋＤａろ液からの保持物を表し、ＯＡβはろ液を表す。 ＰＫＣアクチベーター（ブリオスタチン−１、ＤＣＰＬＡ、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ）による、ＡＳＰＤ誘発性毒性からの神経保護。５０ｎＭ ＡＳＰＤ処理した培養一次ラット海馬ニューロン（図６Ａ）およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（図６Ｂ）中、ＰＫＣアクチベーター（ブリオスタチン−１、ＤＣＰＬＡ、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ）処理後の細胞の生存率を、ここに記載する通りＭＴＴアッセイによって測定した。ＰＫＣ−ε転位インヒビターペプチド［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］で処理した後ＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理したニューロンおよび細胞の生存率も測定した。ＰＫＣアクチベーターの中で、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）が、ＡＳＰＤから最も保護的であったことが見出された。データを、平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定*．ｐ＜０．０５；**，ｐ＜０．００５および***，ｐ＜０．０００５、ｎ＝６）。 （続き） ＡＳＰＤ処理はＰＫＣ−ε発現を低減する。実施例セクションに記載する通り、培養一次ラット海馬ニューロン中のＰＫＣ−εレベルを免疫蛍光（ｎ＝６）およびウエスタンブロット（ｎ＝３）によって測定した。細胞染色用に、２０時間ＡＳＰＤ処理した細胞を洗浄し、固定し、透過処理した。次いで、細胞を免疫染色し、共焦点顕微鏡において画像化した。共焦点画像分析とウエスタンブロットの両方が、ＡＳＰＤ処理後、ＰＫＣ−εレベルにおける有意な低減を示した。「Ｍ」は分子量マーカーであり、「Ｃ」は対照である。 ＡＳＰＤおよびＡＤＤＬ処理後のＰＫＣ−εの膜への転位。モノマーＡβ、ＡＤＤＬ、およびＡＳＰＤで処理した、対照（「Ｃ」）およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫を膜およびサイトゾル分画に分離し、ウエスタンブロットを行った。ＰＫＣ−ε活性化を、膜に存在する全ＰＫＣ−εのパーセント値として測定した。データを平均値±ＳＥＭとして表す。（スチューデントのｔ検定**，ｐ＜０．００５および***，ｐ＜０．０００５）。「Ｍ」は分子量マーカーであり、「Ｃ」は対照である。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ誘発性のＰＫＣ−ε喪失を防ぐ。一次ニューロンを、ＡＳＰＤおよび／またはＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した（図８Ａ）。データを、標準化したＰＫＣ−ε値の平均値±ＳＥＭとして表す。ウエスタンブロット分析を：１００ｎＭ ＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した一次ニューロン（図８Ｂ）；５μＭ ＰＫＣ−εインヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］の存在および非存在下でＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した、５０ｎＭ ＡＳＰＤ−処理した一次ニューロン（図８Ｃ）；ならびに対照および処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＰＫＣ−ε活性化（図８Ｄ）に対して行った。ＰＫＣ−ε発現を、βアクチンに対して標準化した。データを、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定*．ｐ＜０．０５；**，ｐ＜０．００５および***，ｐ＜０．０００５）。図８Ｄにおいて、「可溶性」は、ＰＫＣ−εがサイトゾル中に残存することを表し、「粒子状」はＰＫＣ−εが膜に存在することを表す。ＰＫＣ活性化を、膜に存在する全ＰＫＣ−εのパーセント値として測定した。 （続き） （続き） （続き） ＡＳＰＤはシナプスの喪失を誘発した。ラット海馬一次ニューロンの共焦点画像を、図９Ａに示す。４番目のカラムは、最初の３つのカラムを併合した画像である。平均蛍光強度を算出し、対照のパーセント値として表した（ｎ＝６）。ＰＳＤ−９５（図９Ｂ）およびシナプトフィジン（図９Ｃ）の発現レベルの図による表現を示す。値を、平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定*．ｐ＜０．０５および**，ｐ＜０．００５***）。 （続き） （続き） ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ誘発性のシナプス喪失から保護する。ラット海馬一次ニューロンの共焦点画像を図１０Ａに示す。第１の「併合」のカラムは先の２つのカラム、すなわち核およびＭＡＰ−２に対して染色した細胞の併合である。第２の「併合」のカラムは、先の３つのカラム、すなわち、核、ＰＳＤ−９５、およびシナプトフィジンに対して染色した細胞の併合である。平均蛍光強度を算出し、対照のパーセント値として表した（ｎ＝６）。ＡＳＰＤ処理は染色した神経突起の突起における顕著な低減を示し、ＤＣＰＬＡ−ＭＥはシナプスの喪失から保護した。図１０Ｂに、ＭＡＰ−２、ＰＳＤ−９５、およびシナプトフィジンの発現の、図による表現を示す。図１０Ｃは、対照、ＡＳＰＤ処理した細胞、ＡＳＰＤおよびＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した細胞、ならびにＰＫＣ−εインヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］、ＡＳＰＤ、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理一次ラット海馬ニューロンで処理した細胞における、シナプトフィジン発現のウエスタンブロット分析である。値を、平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定*．ｐ＜０．０５**，ｐ＜０．００５および***，ｐ＜０．０００５）。 （続き） （続き） ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ処理した一次ニューロンにおいてＧＳＫ−３βを不活性化する。ビヒクル（対照）、ＡＳＰＤ（５０ｎＭ）、ＡＳＰＤ（５０ｎｍ）およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）、ならびにＡＳＰＤ（５０ｎｍ）、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）、およびＰＫＣ−εインヒビター（５μＭ）［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］で処理したラット海馬ニューロンからの、ホスホＧＳＫ−３β（Ｓｅｒ−９）および全ＧＳＫ−３βタンパク質のウエスタンブロット分析。ホスホＧＳＫ−３β発現を、全ＧＳＫ−３β発現に対して標準化した。ＡＳＰＤ処理はＧＳＫ−３βを活性化し、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理はＧＳＫ−３βを不活性化した。データを、平均値±ＳＥＭとして表す（スチューデントのｔ検定*．ｐ＜０．０５および**，ｐ＜０．００５、ｎ＝３）。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびブリオスタチンの皮質ニューロンに対する効果。左：一次ヒト皮質ニューロンにおけるフラクタル次元。右：２１２×２１２μｍ視野における、シナプス／細胞。「ＤＣＰ」はＤＣＰＬＡメチルエステルである。「Ｂｒｙ」はブリオスタチンである。（*ｐ＜０．０３） ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、学習において用量依存的な改善を表す。ＤＣＰＬＡ−ＭＥを、実施例セクションにおいて記載する通り、５．３ｍｇ／ｋｇまたは１６．０ｍｇ／ｋｇの何れかをラットに投与した。水迷路空間学習試験において効果を評価し、対照群と比較した。 ＤＣＰＬＡ−ＭＥは記憶における用量依存的な改善を表す。ＤＣＰＬＡ−ＭＥを、実施例セクションにおいて記載する通り、５．３または１６．０ｍｇ／ｋｇの何れかをラットに投与した。データを、標的の四分円比（quadrant ratio）を用いて分析した。 （続き） （続き） （続き） ＰＫＣ−ε活性化はヒト一次ニューロンの変性を防ぐ。一次ヒトニューロンを、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）の何れかで４０日間処理した。新鮮な薬物を３日毎に添加し、培地の５０％を交換した。図１５Ａ−４０日齢の、非処理（「対照」）、ブリオスタチン１、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理したニューロンの画像。図１５Ｂ−経時的に、３つの２０×視野（５０８μｍ2）から計数した、神経突起陽性細胞の数。ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびブリオスタチン１処理は、少なくとも４０日間、細胞の生存を安定化した。非処理細胞の生存率は２０日後に低下した。図１５Ｃ、図１５Ｄ−１日のニューロンと比べた、４０日齢のニューロンにおけるＰＫＣ−εの免疫ブロット分析。ＤＣＰＬＡ−ＭＥはＰＫＣ−εを保護する。図１５Ｅ−ブリオスタチンまたはＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理４０日後の、ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの免疫ブロット分析。図１５Ｆ、図１５Ｇ−ウエスタンブロットから算出した、ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの免疫染色。染色は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびブリオスタチン１処理した細胞において有意に高い。図１５Ｈ−３０日齢のニューロンの共焦点画像。ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびブリオスタチン１は、点状におけるＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの共局在した染色を増大し、シナプスの数の増大を指摘するものであった。挿入は、典型的なシナプスを示す、拡大領域を示す。図１５Ｉ−細胞１個あたりのシナプスの数は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理した細胞において増大した。データを平均値±ＳＥとして表し、*は１日目のニューロンに関する有意性を表し、＃は非処理の４０日または３０日のニューロンに関する有意性を表す。（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．００５および***ｐ＜０．０００５）。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） ブリオスタチン−１（０．２７ｎＭ）で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＰＫＣアイソフォームの、０、５、１５、３０、および６０分後の転位。（*はｐ＜０．０５を表し、**はｐ＜０．００５を表し、***はｐ＜０．０００５を表す）。 （続き） ブリオスタチン−１は、ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εの、ＲＡＣＫ１との相互作用を誘発する。ＲＡＣＫ１およびＰＫＣ−ε（上）またはＰＫＣ−α（下）の画像は、ブリオスタチン−１（０．２７ｎＭ）で処理後、０、１５、および３０分に撮ったものであり、併合するとＰＫＣのＲＡＣＫ１との共局在が明らかになった。４番目のカラムはチャンネル１およびチャンネル２に対する共局在曲線を示す。 （続き） ０、５、１５、および３０分に測定した、ブリオスタチン−１（０．２７ｎＭ）で処理した細胞のＲＡＣＫ１免疫沈降。「Ｃ」は対照であり、「Ｍ」はマーカーである。データを、独立した３つの実験の平均値±ＳＥとして表す。（*はｐ＜０．００５を表し、**はｐ＜０．００５を表し、***はｐ＜０．０００５を表す）。 レチノイン酸（「ＲＡ」）で処理した細胞、ならびにＲＡおよびブリオスタチン１で処理した細胞の、７２時間の共焦点画像。第１のカラム（左から）はＤＡＰＩで染色した核、第２のカラムはＲＡＣＫ１、第３のカラムはＰＫＣ−ε、最後は共局在を示す併合した画像である。 非処理の細胞（「対照」）、レチノイン酸で処理した細胞（「ＲＡ」）、ならびにＲＡおよびブリオスタチン１で処理した細胞（「ＲＡ＋Ｂｒｙ」）の、７２時間での共焦点画像（および図による表現）。第１のカラム（左から）はＤＡＰＩで染色した核、第２のカラムはＭＡＰ−２、第３のカラムはβ−チューブリンＩＩＩ、最後は最初の３つを併合した画像である。 非処理の細胞（「対照」）、レチノイン酸で処理した細胞（「ＲＡ」）、ならびにＲＡおよびブリオスタチン１で処理した細胞（「ＲＡ＋Ｂｒｙ」）の、７２時間での共焦点画像（および図による表現）。第１のカラムはＤＡＰＩで染色した核、第２のカラムはＰＳＤ−９５、第３のカラムはシナプトフィジン、最後は最初の３つを併合した画像である。 非処理の細胞（「対照」）、ならびにＲＡおよびブリオスタチン１で処理した細胞（「ＲＡ＋Ｂｒｙ」）の、７２時間での共焦点画像。第１のカラムはＤＡＰＩで染色した核であり、第２のカラムは微分干渉コントラストであり、第３のカラムはニューロリギン１であり、第４のカラムはシナプシンまたはバスーンであり、最後は４つの最初の画像を併合した画像である。 非処理の細胞、ＲＡで処理した細胞、ブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）で処理した細胞、ＲＡおよびブリオスタチン１（０．２７ｎＭ）で処理した細胞、ＲＡおよびブリオスタチン１（１ｎＭ）で処理した細胞、ならびにＲＡおよびブリオスタチン１（１０ｎＭ）で処理した細胞における、７２時間での、β−チューブリンＩＩＩおよびシナプトフィジンレベルの免疫ブロット分析（および図による表現）。データを、３つの独立した実験の平均値±ＳＥとして表す（*はｐ＜０．０５を表し、**はｐ＜０．００５を表し、***はｐ＜０．０００５を表す）。 （続き） 非処理の細胞（「Ｃ」）、ＲＡで処理した細胞、ブリオスタチン１で処理した細胞（「Ｂｒｙ」）、ならびにＲＡおよびブリオスタチン１で処理した細胞（「ＲＡ＋Ｂｒｙ」）におけるＰＫＣ−εの転写レベル。グラフにおける値は、非処理の細胞に比べた処理細胞における、βチューブリンに対して標準化したＰＫＣ−εの濃度測定値におけるパーセント値の増大として表したものである。データを、３つの独立した実験の平均値±ＳＥとして表す（*はｐ＜０．０５を表し、**はｐ＜０．００５を表し、***はｐ＜０．０００５を表す）。 非処理の細胞（「対照」）、１２時間のＲＡ処理した細胞、ならびにＲＡおよびブリオスタチン１で処理した細胞の、サイトゾルおよび膜における全ＰＫＣ活性。ＲＡおよびブリオスタチン１で処理した細胞は、１２時間、２４時間、４８時間、および７２時間に測定した。データを、３つの独立した実験からのＣＰＭの平均値±ＳＥとして表す（*はｐ＜０．０５を表し、**はｐ＜０．００５を表し、***はｐ＜０．０００５を表す）。 ＰＫＣ−ε、ＰＫＣ−α、およびＰＫＣ−δのＲＡによる活性化。図中のデータは、３つの独立した実験からのＣＰＭの平均値±ＳＥを表す。 非処理の細胞のサイトゾルおよび膜（「対照」）、１２時間でのＲＡで処理した細胞、ならびにＲＡおよびブリオスタチン１で処理した細胞（「ＲＡ＋Ｂｒｙ」）における、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−αのウエスタンブロット分析。ＲＡおよびブリオスタチン１で処理した細胞を、１２時間、２４時間、４８時間、および７２時間に測定した。ＰＫＣの活性化を、膜における全ＰＫＣのパーセント値として算出した（膜／サイトゾル＋膜）。データを、３つの独立した実験の平均値±ＳＥとして表す。（*はｐ＜０．０５を表し、**はｐ＜０．００５を表し、***はｐ＜０．０００５を表す）。 （続き） 非処理の細胞（「対照」）、ＲＡで処理した細胞、ブリオスタチン１で処理した細胞、ならびにＲＡおよびブリオスタチン１で処理した細胞（「ＲＡ＋Ｂｒｙ」）から調製したシナプトソームにおける、ＰＫＣ−εレベルのウエスタンブロット分析。図中のデータは、３つの独立した実験の平均値±ＳＥを表す。（*はｐ＜０．０５を表し、**はｐ＜０．００５を表す）。 非処理の細胞（「対照」）、ＲＡで処理した細胞、ブリオスタチン１で処理した細胞、ならびにＲＡおよびブリオスタチン１で処理した細胞（「ＲＡ＋Ｂｒｙ」）から調製したシナプトソームにおける、ＰＳＤ−９５レベルのウエスタンブロット分析。 非処理の細胞（「対照」）、ＲＡで処理した細胞、ブリオスタチン１で処理した細胞、ならびにＲＡおよびブリオスタチン１で処理した細胞（「ＲＡ＋Ｂｒｙ」）から調製したシナプトソームにおける、シナプトフィジンレベルのウエスタンブロット分析。図中のデータは、３つの独立した実験の平均値±ＳＥを表す。（*はｐ＜０．０５を表す）。 非処理のラット海馬一次ニューロン（「対照」）、ＡＳＰＤで処理したニューロン、ならびにＡＳＰＤ、ＲＡ、およびブリオスタチン１で処理したニューロンの共焦点画像。第１のカラムはＤＡＰＩで染色した核であり、第２のカラムはＰＳＤ−９５であり、第３のカラムはシナプトフィジンであり、最後は最初の３つを併合した画像である。 非処理の細胞、ＡＳＰＤで処理した細胞、ならびにＡＳＰＤ、ＲＡ、およびブリオスタチン１で処理した細胞（「ＡＳＰＤ＋ＲＡ＋Ｂｒｙ」）における、ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの平均蛍光強度を測定した。 ビヒクル；ＲＡ；ＡＳＰＤ；ＡＳＰＤおよびＲＡ；ＡＳＰＤおよびブリオスタチン１；ＡＳＰＤ、ＲＡ、およびブリオスタチン１；ＡＳＰＤ、ＲＡ、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ；ＰＫＣインヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］、ＡＳＰＤ、ＲＡ、およびブリオスタチン１；ならびにＰＫＣインヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］、ＡＳＰＤ、およびＲＡで処理した、ラット海馬一次ニューロンの生存率。全ての試験にＡＳＰＤ５０ｎＭを用いた。細胞の生存率を、２４時間後にＭＴＴアッセイによって測定した。 ＲＡおよびブリオスタチン１で分化させたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の電流固定。 ＰＫＣ−εはＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の分化に必要とされる。ＰＫＣ−εノックダウンは、ＲＡ＋ブリオスタチン１が誘発するニューロンの分化を妨げる。図２６Ａ−ｓｉＲＮＡによるＰＫＣ−εノックダウン（ＰＫＣεノックアウト（「ＫＯ」）細胞）は、ＰＫＣ−ε発現を５０％低減する。ＰＫＣ−ε過剰発現（「ＯＥ」）細胞は、ＰＫＣ−ε発現を２倍超増大する。図２６Ｂ−ＰＫＣ−εノックアウト細胞におけるシナプトフィジンの免疫ブロット分析。シナプトフィジンの免疫染色はＰＫＣ−εＫＯ細胞において低減し、ＲＡ＋ブリオスタチン１処理は発現を増大させることができなかった。図２６Ｃ−ＰＫＣ−ε過剰発現細胞におけるシナプトフィジン発現。図２６Ｄ−対照細胞、ＲＡ＋ブリオスタチン１処理した細胞、およびＲＡ＋ブリオスタチン１処理したＰＫＣ−εノックアウト細胞の共焦点画像。ＲＡ＋ブリオスタチンは、ＰＫＣ−εＫＯ細胞において効果がない。図２６Ｅおよび２６Ｆ−ＰＫＣ−εの存在および非存在下の、ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの免疫染色の図による表現。データを、３つの独立した実験の平均値±ＳＥとして表す。*は対照に関する有意性を表す。（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．００５、および***ｐ＜０．０００５）。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） ＰＫＣ−ε特異的な活性化は、ラット一次ニューロンにおける成熟および分化を誘発する。ラット海馬ニューロンの７日齢の培養物を、ＲＡ（１０μＭ）、ブリオスタチン１（Ｂｒｙ）０．２７ｎＭ、ＲＡ＋ブリオスタチン１（ＲＡ＋Ｂｒｙ）、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）、またはＲＡ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥで、４８時間処理した。図２７Ａ−ＭＡＰ−２（緑色）、シナプトフィジン（赤色）、およびＤＡＰＩ（青色）に対して染色したラット海馬ニューロンを示す共焦点顕微鏡写真。図２７Ｂ−ニューロン１個あたりの樹状分岐の数の図による表現。ＲＡ＋ブリオスタチン（ＲＡ＋Ｂｒｙ）、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ、またはＲＡ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥによるＰＫＣ−ε活性化は、樹状分岐を２倍増大する。図２７Ｃ−８つのランダムな２２５μｍ２の共焦点画像から算出したＭＡＰ−２またはシナプトフィジンに対する平均蛍光強度。データを、平均値±ＳＥとして表す。*は対照に関する有意性を表す。（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．００５、***ｐ＜０．０００５）。 （続き） （続き）
定義
ここで用いる、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。
ここで用いる、「プロテインキナーゼＣアクチベーター」または「ＰＫＣアクチベーター」は、ＰＫＣによって触媒される反応の速度を増大する物質を意味する。ＰＫＣアクチベーターは、非特異的または特異的なアクチベーターであってもよい。特異的なアクチベーターは、１つのＰＫＣアイソフォーム、例えばＰＫＣ−εを、別のＰＫＣアイソフォームよりも大きな検出可能な程度に活性化する。
ここで用いる、「脂肪酸」の語は、炭化水素鎖からなり、遊離酸、酸性塩、またはエステルで終わる化合物を意味する。特定しない場合は、「脂肪酸」の語は、３つの形態を全て包含することを意味する。当業者には、ある種の表現が交換可能であることが理解される。例えば、「リノレン酸のメチルエステル」は、「リノレン酸メチルエステル」と同じであり、これは「メチルエステル型のリノレン酸」と同じである。
ここで用いる、「ＬＤＬ」、「ＬＤＬ（複数）」、「ＬＤＬ粒子」、および「ＬＤＬ粒子（複数）」の語は、脂質コアを有する低密度リポタンパク質を意味する。ＬＤＬ粒子の組成および全体的な構造は当技術分野において知られている。例えば、Ｈｅｖｏｎｏｊａら、２０００、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１４８８：１８９〜２１０を参照されたい。ＬＤＬ粒子は、天然の供給源から単離（天然ＬＤＬ）、または合成的に調製（人工ＬＤＬ）することができる。例えば、ＷＯ２００４／０５００６２を参照されたい。天然ＬＤＬ粒子の表面は、ＬＤＬ粒子を特異的な受容体に対して標的にするアポリポタンパク質と会合している。アポリポタンパク質Ｅ受容体は、肝臓中に、および血液脳関門上の内皮細胞上に見出される。
ここで用いる、「少なくとも１個のＬＤＬ粒子」は、ＬＤＬ粒子が同じ組成または構造である必要がないことを示す。例えば、アポリポタンパク質Ｂと会合しているＬＤＬ粒子は、アポリポタンパク質Ｅと会合しているＬＤＬ粒子と異なる組成を少なくとも有すると考えることができる。
ここで用いる、「シクロプロパン化」または「ＣＰ」の語は、分子における少なくとも１個の炭素−炭素二重結合が、シクロプロパン基で置きかえられている化合物を意味する。シクロプロパン基は、シスまたはトランス配置であってよい。別段の指摘がなければ、シクロプロパン基はシス配置であることを理解されたい。複数の炭素−炭素二重結合を有する化合物は、多くのシクロプロパン化形態を有する。例えば、たった１個の二重結合がシクロプロパン化されている多価不飽和化合物は、「ＣＰ１型」にあると言われる。同様に、「ＣＰ６型」は、６個の二重結合がシクロプロパン化されていることを示す。
例えば、ドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）メチルエステルは６個の炭素−炭素二重結合を有し、したがって１から６個のシクロプロパン環を有することができる。下記に示すのはＣＰ１およびＣＰ６型である。完全にシクロプロパン化されていない化合物（例えば、ＤＨＡ−ＣＰ１）に関して、シクロプロパン基（複数可）は、炭素−炭素二重結合のいずれかに生じさせることができる。
ここで用いる、「コレステロール」の語は、コレステロールおよびその誘導体を意味する。例えば、「コレステロール」は、ジヒドロコレステロール種を含むことが理解される。
ここで用いる、「シナプス形成性」の語は、シナプスの形成を伴う過程を意味する。
ここで用いる、「シナプスネットワーク」の語は、ニューロン、および個々のニューロン間のシナプス連結の多重度を意味する。シナプスネットワークは、複数の相互作用を有する広範な分岐を含んでもよい。シナプスネットワークは、例えば、共焦点視覚化、電子顕微鏡視覚化、および電気生理学的記録によって認識することができる。
態様の説明
本開示は、ＰＫＣアクチベーターおよびその組合せに関する。本開示は、ＰＫＣアクチベーターおよびその組合せを用いた、組成物、キット、および処置の方法にさらに関する。
本開示は、選択的ＰＫＣアクチベーター、および／または少なくとも１つの選択的もしくは非選択的ＰＫＣアクチベーターの組合せは、分化、広範な神経突起の伸長、シナプスの形成、およびシナプスネットワークさえ引き起こすことができるという発見に関する。このような結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの設定、例えば、組織培養プレートにおいてさえ起こり得るため、この結果はとりわけ驚くべきことである。このような過酷な条件下で、非選択的なＰＫＣアクチベーターがこのようなネットワークを作り出すことは知られていない。同様に他の薬剤（例えば、レチノイド）は、単独でこのようなネットワークを作り出さない。
さらに、選択的ＰＫＣアクチベーター、および／または少なくとも非選択的もしくは選択的なＰＫＣアクチベーターの組合せは、非選択的なＰＫＣアクチベーター（複数可）単独に比べて、持続的なＰＫＣ活性化をもたらし得る。少なくとも１つの選択的ＰＫＣアクチベーター、または少なくとも１つの非選択的もしくは選択的ＰＫＣアクチベーターの組合せの使用は、シナプスの喪失が毒性薬剤、例えば、アミロスフェロイド（「ＡＳＰＤ」）によって作り出される状況において、シナプスをやはり回復し、シナプスネットワークを作り出し得る。シナプスの回復、および／またはシナプスネットワークの創出は、シナプス喪失に付随する、障害および状態からの速やかな回復を可能にし得る。シナプスネットワークの創出は、潜在的な薬物をスクリーニングするためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法の創出ももたらし得る。
さらに、選択的ＰＫＣアクチベーター、または少なくとも１つの非選択的もしくは選択的ＰＫＣアクチベーターの組合せは、非選択的ＰＫＣアクチベーター単独を、しかし低濃度を、投与したのと同じ結果を実現し得る。低濃度は、より低い発生率の副作用をもたらし得るという点で有利であり得る。
さらに、選択的ＰＫＣアクチベーター、または少なくとも１つの選択的もしくは非選択的ＰＫＣアクチベーターの組合せは、ＰＫＣの長期の活性化をもたらし得る。持続的な活性は、長期間の臨床使用に極めて望ましい。
ＰＫＣアクチベーター
ＰＫＣの活性化は、一般的に、ＤＡＧおよび／またはＰＳ結合部位に対する結合を伴う。あるいは、例えば、ホスホリパーゼ（例えば、ホスホリパーゼＣγ）を活性化することにより、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）によってＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ作用を刺激することにより、または内在性アクチベーターであるＤＡＧのレベルを増大することにより、ＰＫＣが間接的に活性化され得る。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（２００９）ｖｏｌ．３４、ｐｐ．１３６〜１４５．例えば、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビターは、内在性リガンドのジアシルグリセロールのレベルを増強し、それによりＰＫＣの活性化を生成し得る。Ｍｅｉｎｈａｒｄｔら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ（２００２）、ｖｏｌ．１３、ｐｐ．７２５〜７３３。ホルボールエステルには腫瘍促進活性があるため、最終的な薬物開発には適さない化合物である。ｌｂａｒｒｅｔａら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ（１９９９）、ｖｏｌ．１０、ｐｐ．１０３５〜１０４０）。
ここに開示する、方法、組成物、およびキットに適するＰＫＣアクチベーターは、様々な形態をとる。
１クラスのＰＫＣアクチベーターは、多価不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」）である。これらの化合物は神経系に不可欠な成分であり、多くの健康上の利点を有する。一般的に、ＰＵＦＡは膜の流動性を増大し、高度に生理活性な生成物に速やかに酸化し、様々な炎症性およびホルモンの効果を生成し、速やかに分解および代謝される。炎症効果および速やかな代謝は、これらの活性な炭素−炭素二重結合の結果である可能性がある。これらの化合物は、ＰＳ部位に結合する可能性が最も高い、ＰＫＣの強力なアクチベーターであり得る。
一態様において、ＰＵＦＡはリノール酸（下記に示す）から選択される。
別の一クラスのＰＫＣアクチベーターは、ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡ誘導体、特にシクロプロパン化誘導体である。ある種のシクロプロパン化ＰＵＦＡ、例えば、ＤＣＰＬＡ（すなわち、両方の二重結合にシクロプロパンを有するリノール酸）は、ＰＫＣ−εを選択的に活性化することができ得る。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９、２８４（５０）：３４５１４〜３４５２１を参照されたく、米国特許出願公開第２０１０／００２２６４５ Ａ１号も参照されたい。これらの親分子同様、ＰＵＦＡ誘導体は、ＰＳ部位に結合することによってＰＫＣを活性化すると考えられている。
シクロプロパン化脂肪酸は低毒性を示し、脳中に容易に移入され、そこで長い半減期（ｔ1/2）を示す。二重結合がシクロプロパン環に変換されることで酸化が妨げられ、炎症性の副生成物に代謝され、より強固なＵ形状の３Ｄ構造を作り出し、その構造がより大きなＰＫＣ活性化をもたらし得る。さらに、このＵ形状は、より大きなアイソフォームの特異性をもたらし得る。例えば、シクロプロパン化脂肪酸は、強力で選択的なＰＫＣ−εの活性化を表し得る。
シモンズ−スミスシクロプロパン化反応は、二重結合をシクロプロパン基に変換する効率的な方法である。この反応はカルベノイド中間体によって作用し、親分子のシス−立体化学を保存する。したがって、ＰＫＣを活性化する性質は増大するが、他の分子、例えば、生理活性な、エイコサノイド、トロンボキサン、またはプロスタグランジンへの代謝は妨げられる。
一クラスのＰＫＣ活性化脂肪酸は、オメガ−３ＰＵＦＡ誘導体である。一態様において、オメガ−３ＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化ドコサヘキサエン酸、シクロプロパン化エイコサペンタエン酸、シクロプロパン化ルーメン酸、シクロプロパン化パリナリン酸、およびシクロプロパン化リノレン酸（ＣＰ３形態を下記に示す）から選択される。
別の一クラスのＰＫＣ活性化脂肪酸は、オメガ−６ＰＵＦＡ誘導体である。一態様において、オメガ−６ＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化リノール酸（「ＤＣＰＬＡ」、ＣＰ２形態を下記に示す）、
シクロプロパン化アラキドン酸、シクロプロパン化エイコサジエン酸、シクロプロパン化ジホモ−ガンマ−リノレン酸、シクロプロパン化ドコサジエン酸、シクロプロパン化アドレン酸、シクロプロパン化カレンジン酸、シクロプロパン化ドコサペンタエン酸、シクロプロパン化ジャカル酸、シクロプロパン化ピノレン酸、シクロプロパン化ポドカルプ酸、シクロプロパン化テトラコサテトラエン酸、およびシクロプロパン化テトラコサペンタエン酸から選択される。
ベルノル酸は天然に存在する化合物である。しかし、これはリノール酸のエポキシル（epoxyl）誘導体であり、ゆえに、ここで用いる通り、オメガ−６ＰＵＦＡ誘導体とみなされる。ベルノル酸の他に、シクロプロパン化ベルノル酸（下記に示す）がオメガ−６ＰＵＦＡ誘導体である。
別の一クラスのＰＫＣ活性化脂肪酸は、オメガ−９ＰＵＦＡ誘導体である。一態様において、オメガ−９ＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化エイコセン酸、シクロプロパン化ミード酸、シクロプロパン化エルカ酸、およびシクロプロパン化ネルボン酸から選択される。
さらに別の一クラスのＰＫＣ活性化脂肪酸は、一不飽和脂肪酸（「ＭＵＦＡ」）誘導体である。一態様において、ＭＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化オレイン酸（下記に示す）、
およびシクロプロパン化エライジン酸（下記に示す）
から選択される。
ＰＫＣ活性化ＭＵＦＡ誘導体は、エポキシ化された化合物、例えば、トランス−９，１０−エポキシステアリン酸（下記に示す）
を含む。
別の一クラスのＰＫＣ活性化脂肪酸は、オメガ−５およびオメガ−７ＰＵＦＡ誘導体である。一態様において、オメガ−５およびオメガ−７ＰＵＦＡ誘導体は、シクロプロパン化ルーメン酸、シクロプロパン化アルファ−エロステアリン（elostearic）酸、シクロプロパン化カタルプ酸、およびシクロプロパン化プニカ酸から選択される。
別の一クラスのＰＫＣアクチベーターは、脂肪酸アルコールおよびその誘導体、例えば、シクロプロパン化ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡ脂肪アルコールである。これらのアルコールは、ＰＳ部位に結合することによってＰＫＣを活性化すると考えられている。これらのアルコールは、様々なクラスの脂肪酸に由来してもよい。
一態様において、ＰＫＣ活性化脂肪アルコールは、オメガ−３ＰＵＦＡ、オメガ−６ＰＵＦＡ、オメガ−９ＰＵＦＡ、およびＭＵＦＡ、とりわけ上記の脂肪酸に由来する。一態様において、脂肪アルコールは、シクロプロパン化リノレニルアルコール（下記に示すＣＰ３形態）
シクロプロパン化リノレイルアルコール（下記に示すＣＰ２形態）
シクロプロパン化エライジックアルコール（下記に示す）
シクロプロパン化ＤＣＰＬＡアルコール、およびシクロプロパン化オレイルアルコールから選択される。
他の一クラスのＰＫＣアクチベーターは、脂肪酸エステルおよびその誘導体、例えば、シクロプロパン化ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡ脂肪エステルである。一態様において、シクロプロパン化脂肪エステルは、オメガ−３ＰＵＦＡ、オメガ−６ＰＵＦＡ、オメガ−９ＰＵＦＡ、ＭＵＦＡ、オメガ−５ＰＵＦＡ、およびオメガ−７ＰＵＦＡに由来する。これらの化合物は、ＰＳ部位上に結合することによってＰＫＣを活性化すると考えられている。このようなエステルの一利点は、これらは遊離酸の対応物よりも安定であると一般的に考えられていることである。
一態様において、オメガ−３ＰＵＦＡに由来するＰＫＣ活性化脂肪酸エステルは、シクロプロパン化エイコサペンタエン酸メチルエステル（下記に示すＣＰ５形態）
およびシクロプロパン化リノレン酸メチルエステル（下記に示すＣＰ３形態）
から選択される。
別の一態様において、オメガ−３ＰＵＦＡエステルは、ＤＨＡ−ＣＰ６、ならびに脂肪族および芳香族アルコールのエステルから選択される。一態様において、エステルは、シクロプロパン化ドコサヘキサエン酸メチルエステル（下記に示すＣＰ６形態）
である。ＤＨＡ−ＣＰ６は、実際、１０ｎＭの濃度で効果的であることが示されている。例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２２６４５号を参照されたい。
一態様において、オメガ−６ＰＵＦＡに由来するＰＫＣ活性化脂肪エステルは、シクロプロパン化アラキドン酸メチルエステル（下記に示すＣＰ４形態）、
シクロプロパン化ベルノル酸メチルエステル（下記に示すＣＰ１形態）、
およびベルノル酸メチルエステル（下記に示す）
から選択される。
特に興味深い一クラスのエステルは、ＤＣＰＬＡ（ＣＰ６−リノール酸）である。例えば、米国仮特許出願第６１／５５９，１１７号、およびその優先権を主張する出願を参照されたい。一態様において、ＤＣＰＬＡのエステルはアルキルエステルである。ＤＣＰＬＡアルキルエステルのアルキル基は、直鎖状、分枝状、および／または環状であってもよい。アルキル基は、飽和または不飽和であってもよい。アルキル基が不飽和環状アルキル基である場合、環状アルキル基は芳香族であってもよい。アルキル基は、一態様において、メチル、エチル、プロピル（例えば、イソプロピル）、およびブチル（例えば、ｔｅｒｔ−ブチル）エステルから選択されてもよい。メチルエステル形態のＤＣＰＬＡ（「ＤＣＰＬＡ−ＭＥ」）を下記に示す。
別の一態様において、ＤＣＰＬＡのエステルはベンジルアルコールに由来する（下記に示す不飽和ベンジルアルコールエステル）。さらに別の一態様において、ＤＣＰＬＡのエステルは、芳香族アルコール、例えば、抗酸化剤として用いられるフェノール、およびプロ学習（pro-learning）能力を有する天然フェノールに由来する。いくつかの特定の例には、エストラジオール、ブチル化ヒドロキシトルエン、レスベラトロール、ポリヒドロキシ化芳香族化合物、およびクルクミンが含まれる。
別の一クラスのＰＫＣアクチベーターは、シクロプロパン化ＭＵＦＡに由来する脂肪エステルである。一態様において、シクロプロパン化ＭＵＦＡエステルは、シクロプロパン化エライジン酸メチルエステル（下記に示す）、
およびシクロプロパン化オレイン酸メチルエステル（下記に示す）
から選択される。
別の一クラスのＰＫＣアクチベーターは、ＰＵＦＡ、ＭＵＦＡ、およびこれらの誘導体に由来する、サルフェートおよびホスフェートである。一態様において、サルフェートは、ＤＣＰＬＡサルフェートおよびＤＨＡサルフェート（以下に示すＣＰ６形態）
から選択される。一態様において、ホスフェートは、ＤＣＰＬＡホスフェートおよびＤＨＡホスフェート（以下に示すＣＰ６形態）
から選択される。
別の一クラスのＰＫＣアクチベーターは、大環状ラクトン、例えば、ブリオスタチンおよびネリスタチンのクラスであり、これらはＰＫＣを刺激するように作用する。大環状ラクトン（マクロライドとしても知られる）は、１４員、１５員、または１６員のラクトン環を一般的に含んでいる。マクロライドはポリケチドクラスの天然物に属する。大環状ラクトンおよびその誘導体は、例えば、米国特許第６，１８７，５６８号、第６，０４３，２７０号、第５，３９３，８９７号、第５，０７２，００４号、第５，１９６，４４７号、第４，８３３，２５７号、および第４，６１１，０６６号、および第４，５６０，７７４号に記載されており、各々その全文が参照により本明細書に組み込まれる。これらの特許は、様々な化合物、および抗炎症または抗腫瘍剤としてのこれらの使用を含めた、大環状ラクトンに対する様々な使用を記載している。各々、全文が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓｚａｌｌａｓｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）、ｖｏｌ．２６９、ｐｐ．２１１８〜２１２４；Ｚｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９６）、ｖｏｌ．５６、ｐｐ．８０２〜８０８；Ｈｅｎｎｉｎｇｓら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（１９８７）、ｖｏｌ．８、ｐｐ．１３４３〜１３４６；Ｖａｒｔｅｒａｓｉａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０００）、ｖｏｌ．６、ｐｐ．８２５〜８２８；Ｍｕｔｔｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０００）、ｖｏｌ．８、ｐｐ．１８４１〜１８６０も参照されたい。
ブリオスタチンクラスの化合物の中では、ブリオスタチン−１が特に興味深い。ブリオスタチン−１は、腫瘍を促進せずにＰＫＣを活性化することが示されている。さらに、ブリオスタチン−１の用量反応曲線は二相性である。さらに、ブリオスタチン−１は、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−δ、およびＰＫＣ−εを含むＰＫＣのアイソフォームの、差次的な制御を実証する。この潜在性を考慮して、ブリオスタチン−１は、動物およびヒトにおける毒性および安全性試験が行われており、他の潜在的な抗癌剤の補助として、抗癌剤として積極的に調査されている。
一クラスとしてのブリオスタチンは、Ｃ１ａ部位（ＤＡＧ結合部位の１つ）に結合すると考えられており、ホルボールエステル同様転位を引き起こすが、ホルボールエステルと異なり腫瘍を促進しない。ブリオスタチン−１は、２０μｇ／週では毒性を表さないが、３５μｇ／週を超えて用いると筋肉痛を伴い得る。ラットにおいて、ブリオスタチン−１に対する急性ＬＤ50値は６８μｇ／ｋｇであり、急性ＬＤ10値は４５μｇ／ｋｇである。高用量における死亡は出血に起因する。
ブリオスタチンは、血液脳関門を横断し、脳からゆっくりと排除され、緩徐な解離動力学を示す（ｔ1/2＞１２時間）。血流中では、ブリオスタチンの半減期は短い（ｔ1/2＝１時間）。しかし、単回注射後、１００時間で開始の用量（静脈内注射による）のうち１％が血中にあり、１４日間血中で検出可能である。ブリオスタチンは、脂肪組織中に蓄積する傾向があり、ＯＨ基のグリコシル化（glycolysation）、および生体異物化合物を解毒するためのよく知られている他の経路によって解毒される可能性がある。
本開示の一態様において、大環状ラクトンはブリオスタチンである。ブリオスタチンには、例えば、ブリオスタチン−１、ブリオスタチン−２、ブリオスタチン−３、ブリオスタチン−４、ブリオスタチン−５、ブリオスタチン−６、ブリオスタチン−７、ブリオスタチン−８、ブリオスタチン−９、ブリオスタチン−１０、ブリオスタチン−１１、ブリオスタチン−１２、ブリオスタチン−１３、ブリオスタチン−１４、ブリオスタチン−１５、ブリオスタチン−１６、ブリオスタチン−１７、およびブリオスタチン−１８が含まれる。
少なくとも一つの態様において、ブリオスタチンはブリオスタチン−１である（下記に示す）。
別の一態様において、ブリオスタチンは、ブリオスタチン−２である（下記に示す、Ｒ＝ＣＯＣ7Ｈ11、Ｒ’＝Ｈ）。
本開示の一態様において、大環状ラクトンはネリスタチンである。一態様において、ネリスタチンはネリスタチン−１から選択される。別の一態様において、大環状ラクトンは、シクロプロパン化ＰＵＦＡの大環状誘導体、例えば、２４−オクタヘプタシクロノナコサン−２５−オン（環状ＤＨＡ−ＣＰ６）（下記に示す）
から選択される。
別の一態様において、大環状ラクトンはブリオログである。ブリオログ（ブリオスタチンの類似体）は、本開示における使用に適する別の一クラスのＰＫＣアクチベーターである。ブリオログは、化学的に合成、またはある種の細菌によって生成することができる。例えば、Ａ、Ｂ、およびＣ環（上記に図を示す、ブリオスタチン−１を参照されたい）、ならびに様々な置換基を修飾する、様々なブリオログが存在する。一般的な概要として、ブリオログは、ブリオスタチンよりも特異性が低く、効力が劣ると考えられているが、調製するのは容易である。Ｃ環はＰＫＣに結合するのに重要である一方、Ａ環は非腫瘍形成性に重要であることが見出された。さらに、疎水性のテイルは膜結合に重要であると思われる。
表１は、いくつかのブリオログの構造上の特徴を要約し、ＰＫＣに対するこれらの親和性における可変性（０．２５ｎＭから１０μＭまでの範囲）を実証するものである。構造的に、これらは全て似通っている。ブリオスタチン−１は、ピラン環を２個および６員環アセタールを１個有するが、殆どのブリオログでは、ブリオスタチン−１のピランの１個が２番目の６員アセタール環で置きかえられている。この修飾によりブリオログの安定性が、ブリオスタチン−１に比べて、例えば、強酸中または塩基中の両方で低減するが、生理学的ｐＨではあまり重要ではない。ブリオログはまた、ブリオスタチン−１（９８８）に比べて分子量が低く（約６００ｇ／ｍｏｌから７５５ｇ／ｍｏｌまでの範囲）、これは血液脳関門を越えた輸送を促進する性質である。
類似体１はＰＫＣに対して最も高い親和性を示す。各々、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｅｎｄｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）、ｖｏｌ．１、ｐｐ．１〜１１；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）、ｖｏｌ．９５、ｐｐ．６６２４〜６６２９；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）、ｖｏｌ．１２４、ｐｐ．１３６４８〜１３６４９。類似体１のみが、ＰＫＣに対してブリオスタチン−１よりも高い親和性を示す。類似体２は、ブリオスタチン−１のＡ環を欠き、ＰＫＣに対して高親和性を維持する最も単純な類似体である。活性のブリオログに加えて、類似体７ｄは、２６位がアセチル化されており、ＰＫＣに対する親和性が実質的にない。
Ｂ環ブリオログも、本開示において用いられてもよい。これら合成のブリオログは、低ナノモル範囲の親和性を有する。その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｅｎｄｅｒら、Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ．（２００６）、ｖｏｌ．８、ｐｐ．５２９９〜５３０２。Ｂ環ブリオログには完全に合成であるという利点があり、天然の供給源からの精製を必要としない。
第３のクラスの適切なブリオスタチン類似体は、Ａ環ブリオログである。これらのブリオログは、ブリオスタチン−１よりもわずかに低い親和性（ブリオログ３、４、および５に対して、それぞれ６．５ｎＭ、２．３ｎＭ、および１．９ｎＭ）、ならびにより低い分子量を有する。Ａ環の置換基は、非腫瘍形成性に重要である。
ブリオスタチン類似体は、例えば、米国特許第６，６２４，１８９号および第７，２５６，２８６号に記載されている。大環状ラクトンを用いて認知能力を改善する方法も、米国特許第６，８２５，２２９ Ｂ２号に記載されている。
別の一クラスのＰＫＣアクチベーターは、ＰＫＣに結合し、活性化するジアシルグリセロールの誘導体である。例えば、Ｎｉｅｄｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８３）、ｖｏｌ．８０、ｐｐ．３６〜４０；Ｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８２）、ｖｏｌ．９１、ｐｐ．４２７〜４３１；Ｋａｉｂｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）、ｖｏｌ．２５８、ｐｐ．６７０１〜６７０４を参照されたい。ジアシルグリセロールはジアシルグリセロールキナーゼおよびリパーゼにより速やかに代謝されるため、ジアシルグリセロールによるＰＫＣの活性化は一過性である。その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｓｈｏｐら、Ｊ．ＢｉｏＩ．Ｃｈｅｍ．（１９８６）、ｖｏｌ．２６１、ｐｐ．６９９３〜７０００；Ｃｈｕａｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９３）、ｖｏｌ．２６５、ｐｐ．Ｃ９２７〜Ｃ９３３。ジアシルグリセロール誘導体上の脂肪酸置換は、活性化の強度を決定する。不飽和脂肪酸を有するジアシルグリセロールが最も活性である。立体異性体の立体配置は重要であり、１，２−ｓｎ配置を有する脂肪酸は活性であるが、２，３−ｓｎ−ジアシルグリセロールおよび１，３−ジアシルグリセロールはＰＫＣに結合しない。シス−不飽和脂肪酸は、ジアシルグリセロールと相乗的であり得る。少なくとも一つの態様において、「ＰＫＣアクチベーター」の語はＤＡＧまたはＤＡＧ誘導体を明白に除外する。
別の一クラスのＰＫＣアクチベーターはイソプレノイドである。例えば、ファルネシルチオトリアゾールは、Ｋｄ２．５μＭでＰＫＣを活性化する合成イソプレノイドである。例えば、ファルネシルチオトリアゾールは、ジオレオイルグリセロールと等効力であるが、脂肪酸の加水分解性エステルを所有しない。その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）、ｖｏｌ．３４、ｐｐ．３９１６〜３９２０。ファルネシルチオトリアゾールおよび関連の化合物は、安定な、持続性のＰＫＣアクチベーターを代表する。ファルネシルチオトリアゾールの分子量は低く（３０５．５ｇ／ｍｏｌ）、荷電基がないため、血液脳関門を容易に横断することが予想される。
さらに別の一クラスのアクチベーターには、オクチリンドラクタムＶ（octylindolactam V）、グニジマクリン（gnidimacrin）、およびインゲノールが含まれる。オクチリンドラクタムＶは、テレオシジン（teleocidin）に関連する、非ホルボールプロテインキナーゼＣアクチベーターである。オクチリンドラクタムＶ（具体的に、（−）−エナンチオマー）の利点には、代謝安定性が高く、効力が高く（ＥＣ50＝２９ｎＭ）、血液脳関門を越えた輸送を促進する低分子量であることが含まれる。各々その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｕｊｉｋｉら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８７）、ｖｏｌ．４９ｐｐ．２２３〜２６４；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８２）、ｖｏｌ．１０４、ｐｐ．１１５９〜４１６６。
グニジマクリンは、０．１ｎＭ〜１ｎＭの濃度で、マウス白血病および固形腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を示す、ダフナン型ジテルペンである。グニジマクリンは、Ｋ５６２細胞において０．３ｎＭの濃度でＰＫＣアクチベーターとして作用し、Ｃｄｃ２５Ａを抑制し、引き続きサイクリン依存性キナーゼ２（Ｃｄｋ２）を阻害することにより、細胞周期の進行をＧ１／Ｓ期で制御する（５ｎｇ／ｍｌで１００％阻害）。グニジマクリンは、ブリオスタチン−１と同様の複素環天然生成物であるが、いくぶん小型である（ＭＷ＝７７４．９ｇ／ｍｏｌ）。
イリパリダール（iripallidal）は、イリスパリーダ（iris pallida）から単離される、２環トリテルペノイドである。イリパリダールは、ＮＣI６０細胞系のスクリーニングにおいて、マイクロモルからナノモルまでの範囲のＧＩ50（成長を５０％阻害するのに必要とされる濃度）値の抗増殖活性を示す。イリパリダールは、ＰＫＣαに高親和性（Ｋi＝７５．６ｎＭ）で結合する。イリパリダールは、ＲａｓＧＲＰ３依存的に、Ｅｒｋ１／２のリン酸化を誘発する。イリパリダールの分子量は４８６．７ｇ／ｍｏｌである。イリパリダールはブリオスタチン−１の約半分のサイズであり、荷電基がない。
インゲノールはホルボールに関連するジテルペノイドであるが、毒性は低い。インゲノールは、ミルクウィード（milkweed）植物であるチャボタイゲキ（Euphorbia peplus）に由来する。例えば、インゲノール３，２０−ジベンゾエートは、ＰＫＣに対する結合に対して、［３Ｈ］ホルボールジブチレートと競合する（Ｋｉ＝２４０ｎＭ）。参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）、ｖｏｌ．６０、ｐｐ．１３８１〜１３９０。インゲノール−３−アンゲラートは、局所的に使用した場合、扁平上皮癌およびメラノーマに対する抗腫瘍活性を示す。参照により本明細書に組み込まれる、Ｏｇｂｏｕｒｎｅら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ（２００７）、ｖｏｌ．１８、ｐｐ．３５７〜３６２。
別の一クラスのＰＫＣアクチベーターは、Ｎ−（ｎ−へプチル）−５−クロロ−１−ナフタレンスルホンアミド（ＳＣ−１０）およびＮ−（６−フェニルヘキシル）−５−クロロ−１−ナフタレンスルホンアミドを含む、ナフタレンスルホンアミドである。ＳＣ−１０は、ホスファチジルセリンと同様のメカニズムを用いて、カルシウム依存的にＰＫＣを活性化する。参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）、ｖｏｌ．２５、ｐｐ．４１７９〜４１８４。ナフタレンスルホンアミドは、ブリオスタチンと異なるメカニズムによって作用し、ブリオスタチンまたは別のクラスのＰＫＣアクチベーターのメンバーと相乗効果を示し得る。構造上、ナフタレンスルホンアミドは、カルモジュリン（ＣａＭ）アンタゴニストＷ−７に類似であるが、ＣａＭキナーゼに対する作用はないことが報告されている。
さらに別の一クラスのＰＫＣアクチベーターは、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビターであり、これはＰＫＣを間接的に活性化する。ジアシルグリセロールキナーゼインヒビターの例には、それだけには限定されないが、６−（２−（４−［（４−フルオロフェニル）フェニルメチレン］−１−ピペリジニル）エチル）−７−メチル−５Ｈ−チアゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−５−オン（Ｒ５９０２２）、および［３−［２−［４−（ビス−（４−フルオロフェニル）メチレン］ピペリジン−１−イル）エチル］−２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−４（１Ｈ）−キナゾリノン（Ｒ５９９４９）が含まれる。
なお別の一クラスのＰＫＣアクチベーターは、成長因子、例えば、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）およびインスリン成長因子であり、これらはＰＫＣ経路によって機能する。ＦＧＦ−１８の発現は学習において上方制御され、インスリン成長因子に対する受容体は学習に関連付けられている。これらまたは他の成長因子によるＰＫＣシグナル伝達経路の活性化は、ＰＫＣを活性化するさらなる潜在的な手段を提供する。
別の一クラスのＰＫＣアクチベーターは、成長因子、例えばＮＧＦおよびＢＤＮＦの合成および／または活性化を刺激する４−メチルカテコール誘導体、例えば、４−メチルカテコール酢酸（ＭＣＢＡ）を含めたホルモンおよび成長因子のアクチベーターであり、これらはＰＫＣ、ならびにシナプス形成および／またはニューロンの分岐を担う収束性の経路も活性化する。
ＰＫＣを活性化する組合せ
ＰＫＣを活性化する化合物を、組合せ形態においてやはり用いてもよい。ここで用いる「組合せ」は、混合物、コンジュゲート、および／または使用の組合せを意味する。これらのタイプの組合せは各々、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーター、および別のＰＫＣアクチベーター（複数可）、または他の薬剤（複数可）、例えば、レチノイドもしくはコレステロールを含む。
「混合物」は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーター、および少なくとも１つの他のＰＫＣアクチベーターまたは少なくとも１つの他の薬剤の混合を意味する。一態様において、混合物は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーター、および少なくとも１つのレチノイドを含んでもよい。
一態様において、本開示は、少なくとも２つのＰＫＣアクチベーターを含む混合物に関する。ＰＫＣアクチベーターは、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビター、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）、インスリン成長因子、ホルモン、成長因子アクチベーター、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択することができる。
一態様において、混合物はＤＣＰＬＡエステルおよびブリオスタチンを含む。別の一態様において、混合物はＤＣＰＬＡメチルエステルおよびブリオスタチン−１を含む。別の一態様において、混合物はＤＨＡ−ＣＰ６エステルおよびＤＨＡ−ＣＰ６ジアシルグリセロールエステルを含む。さらに別の一態様において、混合物はブリオスタチン−１およびＤＨＡ−ＣＰ６メチルエステルを含む。
別の一態様において、本開示は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターおよび少なくとも１つのレチノイドを含む混合物に関する。レチノイドは、ビタミンＡの任意の天然または合成の類似体である。これらの類似体には、ビタミンＡの代謝物、例えば、オールトランスレチノイン酸が含まれる。レチノイドの他の例には、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（「４−ＨＰＲ」）、４−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イルエチニル）安息香酸（「ｅｃ２３」）、９−シスレチノイン酸（下記に示す）、
１３−シスレチノイン酸（下記に示す）、
オールトランス−４−ヒドロキシレチノイン酸（下記に示す）、
オールトランス−４−オキソレチノイン酸（下記に示す）、
３，４ジデヒドロレチノイン酸（下記に示す）、
レチノール（下記に示す）、
レトロレチノール（下記に示す）、
オールトランス−４−ヒドロキシレチノール（下記に示す）、
オールトランス−４−オキソレチノール（下記に示す）、
１４−ヒドロキシ−４，１４−レトロレチノール（下記に示す）、
レチンアルデヒド（下記に示す）、
リコペン（下記に示す）、
アポ−１０’−リコペン酸（下記に示す）、
およびアシクロレチノイン酸（下記に示す）
が含まれる。当業者であれば、酸性のレチノイドにも、アルコールおよび無水物の形態があることが理解される。
一態様において、レチノイド混合物の少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターは、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビター、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）、インスリン成長因子、ホルモン、成長因子アクチベーター、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される。
一態様において、混合物はブリオスタチン−１およびレチノイン酸を含む。別の一態様において、混合物はＤＣＰＬＡメチルエステルおよびレチノイン酸を含む。さらに別の一態様において、混合物はＤＨＡ−ＣＰ６メチルエステルおよびレチノイン酸を含む。
さらに別の一態様において、本開示は、少なくとも１つのＬＤＬ粒子および少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターを含む混合物に関する。ＬＤＬ粒子は、血液脳関門を越えた薬物の輸送を媒介することができる。薬物がひとたびＬＤＬ粒子と会合すると、ＬＤＬ粒子の表面上のアポリポタンパク質受容体は、血液脳関門表面上のアポリポタンパク質受容体を標的にすると考えられている。ＬＤＬ粒子は、経細胞輸送により、内皮細胞によっておそらく吸収され、コレステロールが細胞によって吸収されると薬物は自動的に放出され、このようにして、内在性エステラーゼによる放出によって脳中の薬物の分布を増強する。人工ＬＤＬ粒子は、非毒性であるように調製することができる。輸送担体としてのＬＤＬの使用は、米国特許第７，５７６，０５５ Ｂ２号および第７，８０３，４００ Ｂ２号に記載されている。
一態様において、混合物は、少なくとも１つのＬＤＬ粒子、ならびにシクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターを含む。一態様において、混合物中の少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターは、ブリオスタチン−コレステロールコンジュゲート、ＤＣＰＬＡ−コレステロールコンジュゲート、およびレチノイド酸−コレステロールコンジュゲート（下記に記載する）から選択される。別の一態様において、混合物は、少なくとも１つのＬＤＬ粒子、少なくとも１つのブリオスタチン−コレステロールコンジュゲート、および少なくとも１つのレチノイン酸−コレステロールコンジュゲートを含む。さらなる一態様において、混合物は、少なくとも１つのＬＤＬ粒子、少なくとも１つのブリオスタチン−コレステロールコンジュゲート、および少なくとも１つのＤＣＰＬＡ−コレステロールコンジュゲートを含む。
一態様において、本開示は、脳由来神経栄養因子（「ＢＤＮＦ」）および少なくとも１つのＬＤＬ粒子を含む混合物、神経成長因子（「ＮＧＦ」）および少なくとも１つのＬＤＬ粒子を含む混合物、グリア細胞由来神経栄養因子（「ＧＤＮＦ」）および少なくとも１つのＬＤＬ粒子を含む混合物、塩基性線維芽細胞成長因子（「ｂＦＧＦ」）および少なくとも１つのＬＤＬ粒子を含む混合物、ならびにレチノイドおよび少なくとも１つのＬＤＬ粒子を含む混合物から選択される混合物に関する。
一態様において、少なくとも１つのＬＤＬ粒子は人工ＬＤＬ粒子である。別の一態様において、少なくとも１つのＬＤＬ粒子はアポリポタンパク質Ｂと会合している。さらに別の一態様において、少なくとも１つのＬＤＬ粒子はアポリポタンパク質Ｅと会合している。
「コンジュゲート」は、少なくとも１つの他の分子に共有結合している、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターを含む分子を意味する。一態様において、コンジュゲートは、一緒に結合している２つのＰＫＣアクチベーターであってもよい。別の一態様において、コンジュゲートは別の薬剤（例えば、レチノイドまたはコレステロール）に結合しているＰＫＣアクチベーターである。
コンジュゲートにおける共有結合は、多くの形態をとることができる。いくつかの形態には、それだけには限定されないが、エステル結合、エーテル結合、炭素−炭素単結合、炭素−炭素二重結合、アミド結合、イオウ結合、ホスフェート結合、または任意のリンカー分子による結合が含まれる。
一態様において、ＰＫＣを活性化するコンジュゲートは、ブリオスタチンコンジュゲート、レチノイドコンジュゲート、シクロプロパン化ＰＵＦＡコンジュゲート、およびシクロプロパン化ＭＵＦＡコンジュゲートから選択される。ブリオスタチンおよびブリオログは、ＰＫＣのＤＡＧ結合部位に結合すると考えられている。ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡは、ＰＫＣのＰＳ結合部位に結合すると考えられている。このように、これらの化合物のコンジュゲートは、ＤＡＧまたはＰＳ部位の何れか、およびおそらくは両方に結合し得る。
一態様において、ＰＫＣを活性化するコンジュゲートは、ブリオスタチン−１−レチノイン酸エステル、ブリオスタチン−１−コレステロールエステル、およびブリオスタチン−１−ＤＣＰＬＡエステル（下記に示すジ−ＤＣＰＬＡエステル）
から選択される。ブリオスタチンコンジュゲートのいくつかのさらなる態様には、それだけには限定されないが、ブリオスタチン−コレステロールコンジュゲート、蛍光性ブリオスタチン−ボディピー（bodipy）コンジュゲート、およびブリオログ−ＤＣＰＬＡコンジュゲートが含まれる。
別の一態様において、本開示は、シクロプロパン化ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡコンジュゲートに関する。一態様において、シクロプロパン化ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡは、コレステロールまたはコレステロール誘導体コンジュゲートにコンジュゲートしている。例示のコンジュゲートには、ＤＨＡ−ＣＰ６コレステリルエステル（下記に示すＣＰ６形態）および
およびＤＣＰＬＡ−コレステリルエステル（下記に示す）
が含まれる。別の一態様において、コンジュゲートは、ＤＨＡ−ＣＰ６ジアシルグリセロールエステルであり（一態様を下記に示し、Ｒ基は任意の脂肪酸鎖であってよい。一態様において、Ｒ基は、オレイン、パルミチン、アラキドン、およびドコサヘキサエンの脂肪酸鎖から選択される。
別の一態様において、コンジュゲートはＤＨＡ−ＣＰ−ＤＨＡ−ＣＰエステル（下記に示すＣＰ６−ＣＰ６形態）
である。一態様において、ＤＨＡ−ＣＰ６ジアシルグリセロールエステルは、１−パルミトイル−２−オレオイル−グリセロールのエステルであり、ＤＨＡ−ＣＰ６はグリセロールバックボーンの遊離−ＯＨ基に結合している。
別の一態様において、コンジュゲートはＤＣＰＬＡエステルコンジュゲートである。例えば、米国仮特許出願第６１／５５９，１１７号およびその優先権を主張する出願を参照されたい。一態様において、コンジュゲートはＤＣＰＬＡ−オレイルエステル（下記に示す）である。それからＤＣＰＬＡエステルが構成されてもよい脂肪アルコールの他の例には、リノレンアルコール、ドコサヘキサエンアルコール、エイコサペンタエンアルコール、およびリノールアルコールが含まれてもよい。脂肪アルコールにおける二重結合の立体化学は、シスまたはトランスであってもよい。
別の一態様において、ＤＣＰＬＡエステルは、ＤＣＰＬＡおよびシクロプロパン化ＰＵＦＡまたはＭＵＦＡアルコールに由来する。一態様において、それにＤＣＰＬＡエステルが由来してもよいシクロプロパン化脂肪アルコールには、シクロプロパン化リノールアルコール、シクロプロパン化リノレンアルコール、およびシクロプロパン化エイコサペンタエンアルコールが含まれる。炭素−炭素二重結合が全てシクロプロパン化されているシクロプロパン化リノールアルコールにエステルが由来する場合、化合物はＤＣＰＬＡ−ＤＣＰＬＡエステル（下記に示す）
である。
別の一態様において、ＤＣＰＬＡエステルはジアシルグリセロールエステルである。例えば、ＤＣＰＬＡエステルは、１−パルミトイル−２−オレオイル−グリセロール（下記に示す）
に由来する。
さらに別の一態様において、ＤＣＰＬＡエステルはＤＣＰＬＡ−ホスファチジルセリン（下記に示す）であってもよく、式中、Ｒ基は任意の脂肪酸鎖である。一態様において、Ｒ基は、オレイン、パルミチン、アラキドン、およびドコサヘキサエンの脂肪酸鎖から選択される。
一態様において、ＰＫＣを活性化するコンジュゲートはレチノイドに由来する。一態様において、コンジュゲートは、レチノール酸コレステロールエステル、およびレチノールまたはレチノイン酸を有するシクロプロパン化ＰＵＦＡから選択される。一態様において、レチノイドコンジュゲートは、ＤＨＡ−レチノールエステル（下記に示すＣＰ６形態）
である。別の一態様において、レチノイドコンジュゲートはレチノイン酸−ＤＨＡエステル（下記に示すＣＰ６形態）
である。さらに別の一態様において、レチノイドコンジュゲートは、ＤＣＰＬＡ−レチノールエステルおよびレチノイン酸−ＤＣＰＬＡエステルから選択される。
別の一態様において、ＰＫＣを活性化するコンジュゲートはＬＤＬ粒子に由来する。一態様において、コンジュゲートは、シクロプロパン化ＰＵＦＡ、シクロプロパン化ＭＵＦＡ、シクロプロパン化ＰＵＦＡアルコール、シクロプロパン化ＭＵＦＡアルコール、シクロプロパン化ＰＵＦＡエステル、シクロプロパン化ＭＵＦＡエステル、シクロプロパン化ＰＵＦＡサルフェート、シクロプロパン化ＭＵＦＡサルフェート、シクロプロパン化ＰＵＦＡホスフェート、シクロプロパン化ＭＵＦＡホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビター、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）、インスリン成長因子、ホルモン、および成長因子アクチベーターから選択されるＰＫＣアクチベーターに結合しているＬＤＬ粒子である。別の一態様において、コンジュゲートは、ブリオスタチン、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択されるＰＫＣアクチベーターに結合しているＬＤＬ粒子である。一態様において、ＬＤＬ粒子は人工である。
「使用の組合せ」は、少なくとも２つの成分、例えば、（１）ＰＫＣアクチベーター、および（２）別のＰＫＣアクチベーター（複数可）または他の薬剤（複数可）（例えば、レチノイドもしくはコレステロール）の投与を意味する。使用の組合せにおいて、少なくとも２つの成分を同じ対象に投与するが、同じ組成物において、同時に投与する必要はない。一態様において、２成分の使用の組合せにおいて、１成分を、他の成分の前に投与してもよい。別の一態様において、少なくとも２つの成分を同時に、同じ組成物において投与する。さらに別の一態様において、少なくとも２つの成分を同時に投与するが、別々の組成物中に調合されている。
この態様において、使用の組合せにおける少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターは、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビター、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）、インスリン成長因子、ホルモン、成長因子アクチベーター、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される。他の薬剤は、ＰＫＣアクチベーター、および他の化合物、例えば、レチノイドまたはコレステロールから選択される。
一態様において、使用の組合せは、同じ組成物において同時に投与される、ブリオスタチン１および／またはＤＣＰＬＡメチルエステル、ならびにレチノイン酸を含む。別の一態様において、使用の組合せは、レチノイン酸の後に投与される、ブリオスタチン１および／またはＤＣＰＬＡメチルエステルを含む。さらに別の一態様において、使用の組合せは、ブリオスタチン１および／またはＤＣＰＬＡメチルエステルを含み、レチノイン酸は同時に投与されるが異なる組成物中に調合されている。
本開示は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せ（すなわち、混合物、コンジュゲート、もしくは使用の組合せ）を用いた、処置の方法にも関する。例えば、本開示は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せを、それを必要とする患者に投与することを含む、少なくとも１つの神経変性性または神経情動性の障害または状態を処置するための方法を提供する。一態様において、神経変性障害または状態は、アルツハイマー病およびパーキンソン病から選択される。別の一態様において、少なくとも１つの神経変性疾患または状態は、少なくとも１つの神経毒性化学物質に曝露することにより引き起こされる。少なくとも１つの神経毒性化学物質は、例えば、重金属であってもよい。別の一態様において、神経情動性障害または状態は、うつ病、双極性障害、および統合失調症から選択される。なお別の一態様において、本開示は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せを、それを必要とする患者に投与することを含む、開胸手術の結果としての虚血および／または低酸素症を処置するための方法を提供し、投与は手術の前または後である。
本開示は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せを、それを必要とする患者に投与することを含む、脳卒中を処置するための方法にさらに関する。本開示は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せを、それを必要とする患者に投与することを含む、脳外傷を処置するための方法にも関する。一態様において、脳傷害は、外傷性脳傷害、および照射によって誘発される脳傷害から選択される。
本開示のさらなる一側面は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せを、それを必要とする患者に投与することを含む、学習を改善する方法に関する。別の一態様において、本開示は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せを、それを必要とする患者に投与することを含む、記憶を改善する方法に関する。
少なくとも１つのＰＫＣアクチベーター、または少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターの組合せを、それを必要とする患者に、慣例的な方法、例えば、経口、非経口、経粘膜、鼻腔内、吸入、または経皮投与により投与してもよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、くも膜下腔内、および頭蓋内投与が含まれる。
本開示は、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターまたはその組合せ、および担体を含む組成物に関する。本開示は、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターおよび担体の組成物、ならびに少なくとも１つの組合せおよび担体の組成物にさらに関し、２つの組成物は、それを必要とする患者に一緒に投与される。一態様において、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターの組成物を、それを必要とする患者に、組合せの組成物を投与する前または後に投与してもよい。
ここに記載する組成物の製剤は、当技術分野において知られている任意の適切な方法によって調製してもよい。一般的に、このような調製方法は、少なくとも１つの有効成分を担体と会合させることを含む。必要であれば、または望ましい場合には、得られる生成物を、所望の単一もしくは複数の投薬単位に形作り、または包装してもよい。
ここに提供する組成物の記載は、ヒトに倫理的に投与するのに適する組成物に主に対するものであるが、当業者であれば、このような組成物は全種類の動物に投与するのに一般的に適することが理解される。ヒトに投与するのに適する医薬組成物の修飾、または組成物を様々な動物に投与するのに適するようにする修飾は、十分に理解されており、獣医薬理学の通常の技術者であれば、あるとすれば通常の実験だけで、このような修飾をデザインし、行うことができる。本開示の組成物の投与が企図される対象には、それだけには限定されないが、ヒトおよび他の霊長動物、ならびに他の哺乳動物が含まれる。
ここで論じる通り、担体には、それだけには限定されないが、以下の１つ以上：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性な希釈剤；造粒および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味剤；香味剤；着色剤；保存剤；生理学的に分解可能な組成物、例えばゼラチン；水性のビヒクルおよび溶媒；油性のビヒクルおよび溶媒；懸濁剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤（demulcent）；バッファー；塩；増粘剤；フィラー；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；ならびに薬学的に許容されるポリマー性または疎水性の材料が含まれる。本開示の組成物に含まれてもよい他のさらなる成分は、当技術分野において一般に知られており、例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎａｒｏ，ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０ｔｈ Ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、２０００において記載されていてもよい。
一態様において、担体は、水性または親水性の担体である。さらなる一態様において、担体は、水、食塩水、またはジメチルスルホキシドであってもよい。別の一態様において、担体は疎水性の担体である。疎水性の担体には、包接複合体、分散剤（例えば、ミセル、マイクロエマルジョン、およびエマルジョン）、ならびにリポソームが含まれる。例示の疎水性の担体には、包接複合体、ミセル、およびリポソームが含まれる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ ｅｄ．、ｅｄ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ ２００３を参照されたい。さらに、他の化合物が、例えば、製剤を安定化するために、疎水性の担体または溶液の何れかにおいて含まれていてもよい。
ここに開示する組成物は、それを必要とする患者に、経口、非経口、経粘膜、鼻腔内、吸入、または経皮の経路を含めた、任意の適切な経路によって投与してもよい。非経口の経路には、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、くも膜下腔内、および頭蓋内投与が含まれる。適切な投与経路を、血液脳関門の横断を許すように選択してもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．（２００１）ｖｏｌ．４２、ｐｐ．６７８〜６８５を参照されたい。
一態様において、本明細書に記載する組成物は、経口剤形において調合されてもよい。経口投与用に、組成物は、例えば、担体、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプン、もしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）と一緒に慣例的な手段によって調製されている、錠剤またはカプセル剤の形態をとってもよい。錠剤は、当技術分野において一般的に知られている方法によってコーティングされてもよい。
別の一態様において、ここに記載された組成物は、液体調製物中に調合される。このような調製物は、例えば、溶液剤、シロップ剤、もしくは懸濁剤の形態をとってもよく、またはこれらは使用前に水もしくは他の適切なビヒクルとともに構成するための乾燥生成物として提示されてもよい。このような液体調製物は、薬学的に許容される担体、例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分留した植物油）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）とともに慣例的な手段によって調製されてもよい。調製物は、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤も適宜含んでいてもよい。一態様において、液体調製物は経口投与用である。
本開示の別の一態様において、ここにおける組成物は、非経口投与、例えば、ボーラス注射または持続注入用に調合されてもよい。注射用の製剤は、単位剤形、例えば、アンプルにおいて、またはマルチドーズ容器において、保存剤を添加して提示されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の、懸濁剤、溶液剤、分散剤、または乳剤などの形態をとってもよく、製剤用薬剤（formulatory agent）、例えば、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤を含んでいてもよい。
別の一態様において、ここの組成物は、デポー調製物として調合されてもよい。このような製剤は、埋め込みによって（例えば、皮下的に、もしくは筋肉内に）、または筋肉内注射によって投与されてもよい。例えば、組成物は、適切なポリマー性の、もしくは疎水性の材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）、もしくはイオン交換樹脂と、または難溶性誘導体として、例えば、やや難溶性の塩などとして調合されてもよい。
別の一態様において、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せは、小胞、例えば、ミセル、リポソーム、または人工の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子において送達される。例えば、米国特許第７，６８２，６２７号を参照されたい。
一態様において、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せは、少なくとも１つの神経変性障害または状態、例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病を処置し、脳卒中を処置し、脳傷害、例えば、外傷性脳傷害および照射によって誘発される脳傷害を処置し、うつ病、双極性障害、または統合失調症から選択される少なくとも１つの神経情動性障害または状態を処置するのに有効な量において、組成物中に存在する。別の一態様において、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せは、学習を改善し、記憶を改善するのに有効な量において、組成物中に存在する。
さらなる一態様において、それを必要とする患者に投与するための用量は、約１ｍｇから約１０ｇまで、例えば、約５ｍｇから約５ｇまで、約５０ｍｇから約２ｇまで、約１００ｍｇから約１．５ｇまで、約１５０ｍｇから約１ｇまで、または約２５０ｍｇから約５００ｍｇの、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せを送達するように適切に調製されてもよい。
一態様において、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せは、最終製剤の重量で、約０．０１％から約１００％まで、約０．１％から約９０％まで、約０．１％から約６０％まで、約０．１％から約３０％まで、または約１％から約１０％までの範囲の量において組成物中に存在してもよい。別の一態様において、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せは、約０．０１％から約１００％まで、約０．１％から約９５％まで、約１％から約９０％まで、約５％から約８５％まで、約１０％から約８０％まで、および約２５％から約７５％までの範囲の量において組成物中に存在してもよい。
本開示は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せを、別々に、または単一の組成物において組み合わせて、対象に投与するのに利用してもよいキットに関する。
キットは、貯蔵および／または投与のための装置を含んでいてもよい。例えば、キットは、シリンジ（複数可）、ニードル（複数可）、無針注射器（複数可）、滅菌パッド（複数可）、スワブ（複数可）、バイアル（複数可）、アンプル（複数可）、カートリッジ（複数可）、ボトル（複数可）などを含んでいてもよい。貯蔵および／または投与の装置は、例えば、体積を測定できるように目盛り付けされていてもよい。一態様において、キットは、システムにおける他の成分と別々の容器中に、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターを含んでいる。別の一態様において、キットは、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターおよび少なくとも１つの組合せを別々に、組み合わせるための手段を含んでいる。さらに別の一態様において、キットは、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターおよびその組合せを含んでいる容器を含んでいる。
キットは、１つ以上の麻酔薬、例えば、局所麻酔薬も含んでいてもよい。一態様において、麻酔薬は、使用準備済の製剤、例えば、注射用製剤（任意に１つ以上の予めローディングされたシリンジ中）または局所適用してもよい製剤中である。麻酔薬の局所製剤は、パッド、スワブ、ペーパータオル（towelette）、使い捨てナプキン、布、パッチ、包帯、ガーゼ、綿球、Ｑ−ｔｉｐ（商標）、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、液剤、または任意の他の局所的に適用される製剤に適用される麻酔薬の形態であってもよい。本開示とともに用いるための麻酔薬は、それだけには限定されないが、リドカイン、マーカイン、コカイン、およびキシロカインを含んでいてもよい。
キットは、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せの使用に関する指示書も含んでいてもよい。別の一態様において、キットは、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せの製剤を混合し、希釈し、または調製するための手順に関する指示書を含んでいてもよい。指示書は、混合後であるが投与前に、所望のｐＨもしくはｐＨの範囲、ならびに／または所望の特定の活性および／もしくはタンパク質濃度を得るために、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せの製剤を適切に希釈するための指示も含んでいてもよい。指示書は投薬情報をやはり含んでいてもよい。指示書は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターまたはその組合せで処置するための対象を選択するための方法に対する資料も含んでいてもよい。
本開示は、診断方法、ならびに／または少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターおよび少なくとも１つのレチノイドの使用に関する。例えば、本開示は：少なくとも１つのレチノイドおよび少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターを細胞に添加すること、シナプスネットワークを形成させること、シナプスネットワークを破壊する少なくとも１つの毒素を添加すること、スクリーニングしようとする少なくとも１つの薬物を添加すること、およびシナプスネットワークが少なくとも部分的に回復しているか否か、またはシナプス形成が生じているか否かを決定することを含む、少なくとも１つの薬物をスクリーニングするための方法を提供する。一態様において、スクリーニングを用いて、薬物がシナプスネットワークを少なくとも部分的に回復することができるか否か、シナプス形成を誘発することができるか否か、および／またはシナプスネットワークの破壊を防ぐことができるか否かを決定する。
一態様において、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターは、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビター、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）、インスリン成長因子、ホルモン、成長因子アクチベーター、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される。別の一態様において、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターは、ブリオスタチン１およびＤＣＰＬＡ−ＭＥから選択される。
別の一態様において、少なくとも１つのレチノイドおよび少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターは、細胞に別々に添加される。一態様において、少なくとも１つのレチノイドを、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターを添加する前に細胞に添加してもよい。あるいは、少なくとも１つのレチノイドを、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターの添加後に細胞に添加してもよい。一態様において、少なくとも１つのレチノイドおよび少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターは同時に添加される。
一態様において、本開示は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーターおよび少なくとも１つのレチノイドを含む診断キットに関する。ＰＫＣアクチベーター（複数可）およびレチノイド（複数可）を、例えば、エタノールもしくは洗剤溶液を含めた様々な形態において提供し、または例えばエマルジョンとして提供してもよい。キットは、細胞、組織培養プレート（複数可）、細胞培地（複数可）、細胞を観察するための染色剤（複数可）、および毒素（複数可）から選択される物品を含んでいてもよい。キットは、使用のための指示書をさらに含んでいてもよい。
本開示は、診断方法、および／または少なくとも１つの選択的ＰＫＣアクチベーター、またはその混合物もしくはコンジュゲートの使用にさらに関する。例えば、本開示は：少なくとも１つの選択的ＰＫＣアクチベーター、またはその混合物もしくはコンジュゲートを細胞に添加すること、シナプスネットワークを形成させること、シナプスネットワークを破壊する少なくとも１つの毒素を添加すること、スクリーニングしようとする少なくとも１つの薬物を添加すること、およびシナプスネットワークが少なくとも部分的に回復しているか否か、またはシナプス形成が生じているか否かを決定することを含む、少なくとも１つの薬物をスクリーニングするための方法を提供する。一態様において、スクリーニングを用いて、薬物がシナプスネットワークを少なくとも部分的に回復することができるか否か、シナプス形成を誘発することができるか否か、および／またはシナプスネットワークの破壊を防ぐことができるか否かを決定する。一態様において、選択的ＰＫＣアクチベーターは、シクロプロパン化ＰＵＦＡ、またはそのアルコールもしくはエステル、シクロプロパン化ＭＵＦＡ、またはそのアルコールもしくはエステルである。一態様において、選択的ＰＫＣアクチベーターは、ＤＣＰＬＡメチルエステルおよびＤＨＡ−ＣＰ６メチルエステルから選択される。
別の一態様において、少なくとも１つの選択的ＰＫＣアクチベーターの混合物は、ＤＣＰＬＡとレチノイン酸、およびＤＨＡ−ＣＰ６とレチノイン酸から選択される。さらに別の一態様において、少なくとも１つの選択的ＰＫＣアクチベーターのコンジュゲートは、ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルまたはＤＨＡ−ＣＰ６−コレステリルエステルから選択される。
別の一態様において、本開示は、少なくとも１つのＰＫＣアクチベーター、またはその混合物もしくはコンジュゲートを含む診断キットにさらに関する。ＰＫＣアクチベーター、またはその混合物もしくはコンジュゲートを、例えば、エタノールもしくは洗剤溶液を含めた様々な形態において提供し、あるいは、例えば、乳剤として提供してもよい。キットは、細胞、組織培養プレート（複数可）、細胞培地（複数可）、細胞を観察するための染色剤（複数可）、および毒素（複数可）から選択される物品を含んでいてもよい。キットは、使用のための指示書をさらに含んでいてもよい。
一態様において、診断方法は、組織培養プレートの使用を含む。例えば、細胞は、細胞型に好適である培地、例えば、ニューロンに対してニューロベーサル（neurobasal）培地、神経芽細胞腫細胞に対してＭＥＭ／Ｆ１２、または他のタイプの細胞に対して適切な添加物もしくは血清を含んでいるＤＭＥＭ中において、組織培養プレートまたはフラスコ上で培養してもよい。例えば、Ｅａｇｌｅ培地を用いてもよい。別の一態様において、細胞は、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞または一次ニューロンであってもよい。
一態様において、シナプスネットワークを破壊する少なくとも１つの毒素は、β−アミロイド、ＡＤＤＬ、およびＡＳＰＤから選択される。β−アミロイド（「Ａβ」）は、β−およびγ−セクレターゼによる、アミロイド前駆タンパク質（「ＡＰＰ」）のタンパク質分解性の切断によって生成される、４ｋＤａのペプチドである。Ａβのオリゴマーが最も毒性であると考えられている。拡散性のリガンドに由来するＡβ（ＡＤＤＬ）も毒性である。ＡＤＤＬは、以前に開示されている方法にしたがって生成してもよい。Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５：６４４８〜６４５３を参照されたい。アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）は、ＡＤＤＬよりもさらに毒性であることが示されている。ＡＳＰＤは、知られている方法にしたがって生成することができる。Ｈｏｓｈｉ、Ｍ．ら、（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００、６３７０〜６３７５、およびＮｏｇｕｃｈｉ、Ａ．、ら、（２００９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８４、３２８９５〜３２９０５を参照されたい。
別の一態様において、シナプスネットワークを破壊する少なくとも１つの毒素は、タイポキシン、オカダ酸、百日咳毒素、およびボツリヌス毒素から選択される。別の一態様において、少なくとも１つの毒素は、細胞における疾患であってよい。
さらに別の一態様において、試験薬物化合物の有効性を、電子顕微鏡法を用いて決定してもよい。試験薬物化合物の有効性のさらなる証明は、共焦点顕微鏡、電子顕微鏡、および電気生理学的記録であってもよい。
［実施例］
上記のＰＫＣアクチベーターおよびコンジュゲートが市販されていない場合、当業者に知られている方法によって調製してもよい。例えば、ブリオスタチン１は、天然の供給源から単離してもよく、または発表されている方法にしたがって調製してもよい。例えば、Ｋｅｃｋら、（２０１１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３３（４）：７４４〜７４７を参照されたい。別の一例において、ブリオスタチン−１６は、原子経済的（ａｔｏｍ-ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ）かつ化学選択的な取組みを用いて調製してもよい。例えば、Ｔｒｏｓｔら、（２００８）Ｎａｔｕｒｅ、４５６：４８５〜４８８を参照されたい。さらに、ブリオスタチンは、コケ植物が宿主である細菌によって生成することができる。
ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡは一般に市販されており、これらの化合物のシクロプロパン化は当技術分野において知られている。例えば、Ｎｅｌｓｏｎら、（２００９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７４、３４５１４〜３４５２１を参照されたい。エステルは、例えば、アルコールおよびカルボン酸のエステル化によって、当技術分野において知られている通りに調製することができる。酸中で不安定であるアルコール（例えば、レチノール、ブリオスタチン）に対して、酵素を用いてエステル化を行うことができる。
ＰＫＣアクチベーター混合物は、知られている方法を用いて調製してもよい。例えば、ＬＤＬ混合物は、米国特許第７，５７６，０５５号および第７，８０３，４００号における手順にしたがって調製してもよい。
本明細書で用いる数字は全て、全ての場合において、「約」の語によって修飾されることを理解されたい。
一般的手順
材料
細胞培養培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ（Ｆ１２Ｋ、ニューロベーサル、およびＢ２７）およびＫ．Ｄ．Ｍｅｄｉｃａｌ、ＵＳＡ（ＭＥＭ）から入手した。ブリオスタチン１はＢｉｏｍｏｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＵＳＡから購入した。オールトランスレチノイン酸（「ＲＡ」）および他の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ａβ1〜42は、Ａｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から購入した。一次抗体（ＰＫＣ−ε、ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−δ、β−アクチン、ＲＡＣＫ１、シナプトフィジン、およびＰＳＤ−９５）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ、ＵＳＡから入手した。β−チューブリンＩＩＩ、シナプシン−１、およびニューロロジン−１（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｎ−１）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡから購入した。二次抗体は全て、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡから購入した。
細胞培養物および処理
ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（ＡＴＣＣ）を、４５％Ｆ１２Ｋ、４５％最小イーグル培地、１０％ウシ胎仔血清中で培養した。細胞を、０．２７ｎＭブリオスタチン−１で、０、５、１５、３０、および６０分間インキュベートして、アイソフォーム特異的なＰＫＣ活性化を調査した。ＳＨ−ＳＹＳ５Ｙを分化させるために、細胞を２％血清で維持し、１０μＭ ＲＡで７２時間処理した。その後、細胞は、全ての以下の実験において０．２７ｎＭブリオスタチン−１で処理した。培地を３日毎に交換し、新たにＲＡを補った。１８日齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胎仔の脳からのラット海馬ニューロンを、０．５ｍＭグルタミンおよび２５μＭグルタメート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んでいるＢ−２７を補ったニューロベーサル培地中、ポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をコーティングした２４ウエルプレート上にプレーティングした。神経細胞を、３７℃に維持したインキュベーター中で１４日間、５％ＣＯ2下で増殖させた。
アミロスフェロイド（「ＡＳＰＤ」）を、Ｎｏｇｕｃｈｉら、（２００９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８４、３２８９５〜３２９０５にしたがって調製した。Ｈｏｓｈｉら、（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１００、６３７０〜６３７５も参照されたい。簡潔に述べると、Ａβ1〜42を１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール中に溶解し、４℃で一夜、次いで３７℃で３時間、インキュベートした。次いで、溶解したＡβ1〜42を、試験管１本あたり４０ｎｍｏｌの濃度で凍結乾燥した。ＡＳＰＤを調製するために、凍結乾燥したＡβ1〜42を、５０μＭ未満の濃度で、Ｃａ2+またはＭｇ2+を含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解し、４℃で１４時間回転させた。インキュベート後、Ａβ溶液を、１００ｋＤａ分子量カットオフフィルタ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて精製し、高分子量分画を蓄えて最も毒性のＡＳＰＤを得た。Ａβ由来拡散性リガンド（「ＡＤＤＬ」）を先に記載されている通りに生成した。Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５：６４４８〜６４５３を参照されたい。簡潔に述べると、Ａβ1〜42を、ジメチルスルホキシド中５ｍＭで可溶化し、Ｆ１２ｋ培地中１００μＭに希釈し、４℃で２４時間インキュベートした。溶液を４℃で１０分間、１４０００×ｇで遠心分離し、上清をＡＤＤＬとして用いた。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
調製したＡＳＰＤおよびＡＤＤＬをＳＥＣによって分離して、集合体の分子量を推定した。ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ２０００カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）に接続したＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いてＳＥＣを行った。高分子量と低分子量両方のタンパク質を用いて分子量の較正を行った。Ａβ集合体を、０．１Ｍ Ｎａ2ＰＯ4および０．１Ｍ Ｎａ2ＳＯ4を含み、Ｈ3ＰＯ4でｐＨ６．６５に調節したバッファーで、０．１ｍｌ／分で分離し、吸光度を２８０ｎｍでモニタリングした。
細胞溶解およびウエスタンブロット分析
細胞を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、および２０μＭロイペプチンを含むホモジナイズバッファー中で収集し、超音波により溶解した。ホモジネートを４℃で１５分間、１０００００×ｇで遠心分離してサイトゾル分画（上清）および膜（ペレット）を得た。ペレットを、超音波によってホモジナイズバッファー中に再懸濁した。タンパク質濃度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を用いて測定した。定量後、各試料からのタンパク質２０μｇを、４〜２０％勾配Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。次いで、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を、室温で１５分間、ＢＳＡでブロックし、４℃で一夜、一次抗体とインキュベートした。インキュベート後、これをＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、１：１００００希釈の、アルカリホスファターゼコンジュゲートした２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）と、４５分間、さらにインキュベートした。膜を、最後にＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１ステップのＮＢＴ−ＢＣＩＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を用いて展開した。ウエスタンブロットを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＲＴ−ＥＣＬ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において画像化し、デンシトメトリー定量を、ＩＭＡＬソフトウエア（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ、ＷＶ）を用いて行った。転位アッセイに対して、ＰＫＣ活性化を、膜における全タンパク質のパーセント値として表した（膜／サイトゾル＋膜）。
免疫蛍光および共焦点顕微鏡法
細胞を、２個のチャンバースライド（Ｎｕｎｃ、ＵＳＡ）中、低密度で増殖させた。免疫蛍光染色用に、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで４分間固定した。固定後、細胞をブロックし、１×ＰＢＳ中５％血清および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘで３０分間、透過処理した。細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、１：１００希釈の一次抗体と１時間、インキュベートした。次いで、インキュベーションスライドを再び、１×ＰＢＳ中で３回洗浄し、１：４００希釈のＦＩＴＣ抗ウサギＩｇＧおよびローダミン抗マウスＩｇＧと１時間インキュベートした。細胞をさらに洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２’−フェニルインドール二塩酸塩）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で処理して核を染色した。最後に、スライドを洗浄し、Ｐｒｏ Ｌｏｎｇ Ｇｏｌｄアンチフェードマウンティング溶液（antifade mounting solution）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中マウンティングし、ＬＳＭ ７１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）下、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、およびローダミンに対して、それぞれ、励起３５０ｎｍ、４９０ｎｍ、および５４０ｎｍ、ならびに発光４７０ｎｍ、５２５ｎｍ、および６２５ｎｍで観察した。各チャンネルにおける平均蛍光強度（ＭＦＩ）に対して、６３×油浸レンズ倍率で、別個の６視野を分析した。共局在の相関をＺＥＮソフトウエア（Ｚｅｉｓｓ）により生成した。
免疫共沈降
免疫共沈降を、Ｂｅｓｓｏｎらに記載されているプロトコールにしたがい、少々修飾を加えて行った。Ｂｅｓｓｏｎら、（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７、２２０７３〜２２０８４を参照されたい。ブリオスタチン−１で処理した後、細胞を、製造元のプロトコールにしたがい、１×ＰＢＳで３回洗浄し、２５ｍＭジチオビス［スクシンイミジルプロピオネート］（ＤＳＰ）と室温で３０分間インキュベートして、細胞内タンパク質を架橋結合させた。タンパク質を架橋結合させた後、細胞を、上記で言及したホモジナイズバッファー中に溶解させた。免疫沈降用に、タンパク質５００μｇを好適な抗体４μｇおよびＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）２５μｌと４℃で３時間、インキュベートした。免疫沈降物を、ホモジナイズバッファー中で３回すすぎ、上記に記載した通りウエスタンブロットにかけた。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて、製造元のプロトコールにしたがって、細胞から単離した。簡潔に述べると、全ＲＮＡ５μｇを、オリゴ（ｄＴ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて、５０℃で１時間、逆転写した。ｃＤＮＡ生成物２μｌをＰＫＣ−εに対するプライマー（フォワードプライマー−ＡＧＣＣＴＣＧＴＴＣＡＣＧＧＴＴＣＴＡＴＧＣ、リバースプライマー−ＧＣＡＧＴＧＡＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡ）およびβ−チューブリンに対するプライマー（フォワードプライマー−ＴＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧ、リバースプライマー−ＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＧＧＣ）（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて、標準のＰＣＲプロトコールにしたがって２５サイクル、およびアニーリング温度５５℃で増幅した。ＰＣＲ単位複製配列を、Ｅ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）において分析した。ゲルの画像を、Ｆｕｊｉ Ｉｍａｇｅゲルスキャナー（ＦＬＡ−９０００、Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）を用いて記録し、デンシトメトリー定量を、ＩＭＡＬソフトウエア（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ、ＷＶ）を用いて行った。データを、３回の独立した実験に対して、β−チューブリンのＯＤに対するＰＫＣ−εのＯＤ（吸光度）の標準化した比率として表した。
ＰＫＣアッセイ
ＰＫＣ活性を測定するために、サイトゾルまたは膜の何れかからのタンパク質１０μｇを、１０μＭヒストン、４．８９ｍＭ ＣａＣｌ2、１．２μｇ／μｌホスファチジル−Ｌ−セリン、０．１８μｇ／μｌ １，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ ＥＧＴＡ、４％グリセロール、８μｇ／ｍｌアプロチニン、８μｇ／ｍｌロイペプチン、２ｍＭベンズアミジン、および０．５μＣｉの［γ−32Ｐ］ＡＴＰの存在下、３７℃で１５分間、インキュベートした。［32Ｐ］リンタンパク質の形成を、以前に記載されている通り、ホスホセルロース上の吸着によって測定した。Ｎｅｌｓｏｎら、（２００９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８４、３４５１４〜３４５２１を参照されたい。ＲＡによる活性化を測定するために、ＰＫＣ活性を、Ｎｅｌｓｏｎら、（２００９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８４、３４５１４〜３４５２１によって記載されている通り、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびホスファチジルセリンの非存在下で測定した。ＰＫＣ−δおよびＰＫＣ−εを、Ｋａｎｎｏら、（２００６）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ、４７、１１４６〜１１５６によって記載されている通り、ＥＧＴＡおよびＣａＣｌ2の添加の非存在下で測定した。酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験用に、精製されたアイソザイムの形態で提供された。
シナプトソームの調製
未分化細胞および分化細胞からのシナプトソームを、以前に記載されている方法（２９）にしたがって調製した。Ｎａｇｙら、（１９８４）Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、４３、１１１４〜１１２３を参照されたい。簡潔に述べると、細胞を１×ＰＢＳ中で洗浄し、テフロン（登録商標）ホモジナイザー中、０．３２Ｍショ糖、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、および０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含むバッファー（「バッファー１」）１０容積中でホモジナイズした。ホモジネートを、１０００×ｇで１０分間、遠心分離して核分画を除去した。得られた上清を再び、４℃で２０分間、１２０００×ｇで回した。このようにして得られたペレットを、３容積のバッファー１中に再懸濁し、１００％パーコール９部および２．５Ｍショ糖１部を含む、等浸透圧パーコール保存液から調製した１６％／１０％／８．５％パーコール勾配上に層状にした。調製物を、４℃で２０分間、１５０００×ｇで遠心分離した。１０％と１６％の勾配の間の層から回収したシナプトフィジンを１×ＰＢＳで洗浄し、２００００×ｇで１５分間、遠心分離した。精製したシナプトソームを、ホモジナイズバッファー中でホモジナイズし、上記に記載した通りウエスタンブロットにかけた。
生存率アッセイ
細胞の生存率をＭＴＴアッセイによって測定した。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、生存細胞中でのみ活性であるコハク酸デヒドロゲナーゼによってホルマザンに切断されるテトラゾリウム塩である。ホルマザンを可溶化した後、色素の量を、マイクロプレートリーダーで６３０ｎｍの基準とともに５７０ｎｍで定量することができる。ＭＴＴアッセイ用に、１８日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胎仔の脳から、一次ラット海馬ニューロン５×１０４を、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングした２４ウエルプレートの各ウエル上にプレーティングした。処理後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、１ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ溶液（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）２００μｌと、３７℃で２時間、インキュベートした。次いで、ＭＴＴ溶液を除去し、細胞を、０．０４Ｍ ＨＣｌおよび１６０ｍＭ ＮａＯＨを含む２００μｌイソプロパノールで１０分間、溶解した。最後に、５７０ｎｍおよび６３０ｎｍで読み取りを行った。試料は全て３回ずつ行い、データは対照のパーセント値として表した。
統計学的分析
実験は全て３回以上ずつ行った。データは平均値±ＳＥとして表す。統計学的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウエアを用いてスチューデントのｔ検定によって行い、ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
ＤＣＰＬＡおよびＤＣＰＬＡ−ＭＥの合成
ＤＣＰ−ＬＡおよびＤＣＰＬＡ−ＭＥ（すなわち、メチル８−（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタノエート）を、以前に記載されている方法にしたがって合成した。Ｎｅｌｓｏｎら、（２００９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７４、３４５１４〜３４５２１を参照されたい。簡潔に述べると、リノール酸メチルエステル（市販されている）を、クロロヨードメタンおよびジエチル亜鉛を用い、改変シモンズ−スミス反応を用いてシクロプロパン化した。Ｔａｎａｋａら、（２００３）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、１３：１０３７〜１０４０；Ｆｕｒｕｋａｗａら、（１９６７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２４：５３〜５８；およびＤｅｎｍａｒｋら、（１９９１）Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ、５６：６９７４〜６９８１を参照されたい。
装置は全て６０℃で１時間焼き、装置を通して乾燥窒素を通過させながら火力乾燥した。撹拌子および温度プローブを入れた１００ｍｌ三頸丸底フラスコをドライアイス混合物で囲み、２５ｍｌジクロロメタン中リノール酸メチルエステル１．２５ｇ（４．２４ｍｍｏｌ）を満たし、Ｎ2気泡を通した。ヘキサン中１Ｍジエチル亜鉛溶液（５１ｍｌ、５４．９４ｍｍｏｌ）を、長さ２４インチ（６１ｃｍ）の２０ゲージニードルを用いて嫌気的に加え、溶液を−５℃に冷却した。絶えず撹拌しながら、クロロヨードメタン（ＣｌＣＨ2Ｉ、８．０２ｍｌ、１０９．８８ｍｍｏｌ）を、１滴／秒で滴下添加した。反応混合物を２℃未満に維持するのに必要である場合は、添加速度を遅くした。反応の間、反応混合物は濁り、不溶性の白色亜鉛生成物が生成した。フラスコを密閉し、混合物をさらに１時間反応させ、次いで２時間かけて徐々に室温に戻した。
フード中で爆発性残渣が形成するのを防ぐために、ジエチル亜鉛は蒸発除去しなかった。混合物を、撹拌しながら水１００ｍｌ中にゆっくりと注いで、過剰のジエチル亜鉛を分解した。エタンを放出させた。混合物を、ガラス遠心管中５０００ｒｐｍで遠心分離し、上層の水層を廃棄した。白色沈殿物をＣＨ2Ｃｌ2で抽出し、有機相と合わせた。有機相を水で洗浄し、遠心分離した。生成物を、ヘキサン＋１％酢酸エチルを用いてＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ Ｇ ＴＬＣによって分析し、ｎ−ヘキサン中増大濃度の１〜１０％酢酸エチルを用いてシリカゲル上クロマトグラフィーによって精製し、窒素下で蒸発させ、無色油状のＤＣＰＬＡ−ＭＥが残った。シモンズ−スミス反応により、出発材料の立体化学が保存された。
ＤＣＰＬＡを得るために、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ０．１５ｇを１Ｎ ＬｉＯＨ １ｍｌおよびジオキサン１ｍｌ中に溶解した。ジオキサンおよびメタノールを、これが均一になるまで加え、溶液を一夜から３日、６０℃で撹拌した。生成物はＣＨ2Ｃｌ2中に抽出され、遠心分離された。水層および白色界面を水で再抽出し、白色層が形成しなくなるまで洗浄した。生成物をＮ2下で蒸発させ、シリカゲル上クロマトグラフィーによって精製した。無色油状の生成物を、ｎ−ヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃ中で、溶出した。この純度を、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン中ＴＬＣにより、移動相として９５％アセトニトリルを用いて、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣにより、２０５ｎｍでＵＶ検出してチェックした。
Ｈ3−ＤＣＰＬＡ−ＭＥの合成：
３Ｈ−リノール酸のメチル化：リノール酸［９，１０，１２，１３］3Ｈ（１２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、２ｍｌＲｅａｃｔｉＶｉａｌ中で蒸発乾固した。チオニルクロリド（０．５ｍｌ）を直ちに加え、密封したバイアルを６０℃で一夜、インキュベートした。メタノール（１ｍｌ）を加え、混合物を蒸発させ、ジクロロメタン中に溶解させた。
シクロプロパン化：
シモンズ−スミスシクロプロパン化を、上記に記載した通りＣｌＣＨ2Ｉを用いて行い、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ生成物をＣＨ2Ｃｌ2中に抽出し、カラムクロマトグラフィーによって精製した。放射性の脂質分画を合わせ、蒸発させ、放射性分解を防ぐために１００μｌＥｔＯＨ中に貯蔵した。
カラムクロマトグラフィー：
粗いフリットを有するガラスカラム（内径２２ｍｍ×長さ２００ｍｍ、または内径３６ｍｍ×長さ２００ｍｍ）に、１３０〜２７０メッシュ、６０オングストローム、孔体積０．７４ｃｍ3／ｇのシリカゲルを充填した。試料を適用し、ヘキサン５０ｍｌで洗浄した。極性を徐々に増大した溶媒（ヘキサン、その後ヘキサン中増大濃度の酢酸エチル、次いでエタノール）５０ｍｌを連続して加えることにより、生成物を溶出した。生成物を含む分画を、窒素下で蒸発させた。
薄層クロマトグラフィー：
ＴＬＣを、蛍光指示薬を含む５×２０ｃｍシリカゲルＧ ＴＬＣプレート上で行った。溶媒は、ヘキサン＋１％酢酸エチルであった。検出は、ＵＶ吸収、Ｉ2および炭化での着色検出（１０％Ｈ2ＳＯ4を噴霧し、その後加熱）によるものであった。
ＤＨＡ−ＣＰ６の合成：
３−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチル−シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）プロパン酸（「ＤＨＡ−ＣＰ６」）を、ドコサヘキサエン酸メチルエステル（市販されている）をリノール酸メチルエステルの代わりに用いたこと以外は、ＤＣＰＬＡの調製に対する上記の手順にしたがって調製した。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００９、２７４、３４５１４〜３４５２１を参照されたい。
ＤＣＰＬＡエチルエステルの合成：
リノール酸メチル（２ｇ）を、無水エタノール（２０ｍｌ）、ＫＯＨ（０．２ｇ）、およびモレキュラーシーブ４ｇと、撹拌しながら６０℃で２０分間、インキュベートした。反応混合物を酢酸で中和し、リノール酸エチル生成物を酢酸エチルで抽出した。リノール酸エチルを、シモンズ−スミス反応を用いて、上記に記載した通りにシクロプロパン化してＤＣＰＬＡ−エチルエステルを生成した。反応は全て、窒素雰囲気下で行った。
ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルの合成：
リノール酸イソプロピル（市販されている）を、コンデンサーを付けた５０ｍｌ丸底フラスコ中、リノール酸メチル（３ｇ）を、イソプロパノール（２０ｍｌ）および水酸化リチウム（１ｇ）と一緒に２時間還流することにより調製した。生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。得られたリノール酸イソプロピルを、次いで、上記に記載したシモンズ−スミス反応にかけてＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルを産生した。
ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルの代替的合成：
リノール酸メチル（２ｇ）を、窒素雰囲気化、密閉ボトル中６０℃で、モレキュラーシーブ４ｇ上、イソプロパノール（２０ｍｌ）およびＫＯＨ（０．２ｇ）と反応させることにより、エステル交換した。２０分後、混合物を酢酸で中和し、リノール酸イソプロピル生成物を酢酸エチル中に抽出した。得られたリノール酸イソプロピルを、次いで、上記に記載したシモンズ−スミス反応にかけてＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルを生成した。
ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成：
ＤＣＰＬＡ（１００ｍｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド ジ−ｔｅｒｔ−ブチルアセタール（０．２５ｍｌ）を、６０℃で数日間、トルエン（０．４ｍｌ）とインキュベートした。得られたＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルをヘキサンで抽出し、フラッシュクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）により精製した。
ＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステルの合成：
リノール酸オレイルを、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）および濃Ｈ2ＳＯ4（１０μｌ）中、リノール酸（１ｇ）およびオレイルアルコール（１ｍｌ）を一夜還流することにより調製した。生成物はかすかに桃色であり、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。得られたリノール酸オレイルを、上記に記載したシモンズ−スミス手順にかけて、ＤＣＰＬＡ−オレイルエステルを産生した。
ＤＣＰＬＡ−レチニルエステルの合成：
ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（５０ｍｇ）およびレチノール（５０ｍｇ）を蒸発乾固した。ヘキサン（１ｍｌ）を、カンジダアンタークティカ（Candida antarctica）（０．２ｇ）からのリパーゼアクリル酸ビーズ（lipase acrylic bead）と一緒に加え、混合物を、光線から保護して、６０℃で一夜インキュベートした。生成物を、ヘキサン５０：酢酸エチル５：アセトン５を用いて薄層クロマトグラフィーによって精製した。
ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルおよびコレステリルリノレエートの合成：
ＤＣＰＬＡ（１ｇ）、コレステロール（１ｇ）、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）、および濃Ｈ2ＳＯ4（１μｌ）を合わせ、一夜還流した。生成物をリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０、５ｍｌ）で洗浄し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製してＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルを得た。リノール酸（１ｇ）、コレステロール（１ｇ）、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）、および濃Ｈ2ＳＯ4（２０μｌ）を合わせ、一夜還流した。生成物をリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０、５ｍｌ）で洗浄し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製してコレステリルリノレエートを得た。
ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルの代替の合成：
ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（０．１ｇ）、コレステロール（０．１ｇ）、ヘキサン（１０ｍｌ）、およびカンジダアンタークティカのリパーゼアクリル酸ビーズ（１ｇ）を合わせ、６０℃で一夜、インキュベートしてもよい。生成物をリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０、５ｍｌ）で洗浄してもよく、フラッシュクロマトグラフィーによって精製してＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルを得てもよい。
ＤＣＰＬＡ−ブリオスタチンエステルの合成：
ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１ｍｇ）およびブリオスタチン−１（１ｍｇ）を蒸発乾固してもよい。ヘキサン（１ｍｌ）を、カンジダアンタークティカからのリパーゼアクリル酸ビーズ（０．２ｇ）と一緒に加えてもよく、混合物を６０℃で一夜、インキュベートしてもよい。生成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製してもよい。
ＡＳＰＤの合成：
アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）を、Ｈｏｓｈｉ，Ｍ．、ら、（２００３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１００、６３７０〜６３７５、およびＮｏｇｕｃｈｉ，Ａ．、ら、（２００９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８４、３２８９５〜３２９０５にしたがって調製した。簡潔に述べると、Ａβ1〜42を、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール中に溶解し、４℃で一夜、次いで３７℃で３時間、インキュベートした。次いで、溶解したＡβ1〜42を、１．５ｍｌポリプロピレン遠心管中、１本あたり４０ｎｍｏｌの濃度で凍結乾燥した。ＡＳＰＤを調製するために、凍結乾燥したＡβを、５０μＭ未満の濃度でＣａ2+またはＭｇ2+を含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解し、４℃で１４時間、回転させた。インキュベート後、Ａβ溶液を、１００ｋＤａ分子量カットオフフィルタ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて精製し、高分子量分画を蓄えて最も毒性のＡＳＰＤを得た。
例１
ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＤＣＰＬＡおよびＤＨＡ−ＣＰ６よりＰＫＣδに対する阻害効果が劣っていた
（Ａ）培養細胞中全ＰＫＣ活性の測定
培養培地を除去した後、細胞を０．２ｍｌホモジナイズバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、および０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に掻き取り、細胞培養プレート中、Ｍａｒｓｏｎｉｘマイクロプローブ超音波処理器（５秒、１０Ｗ）において超音波処理することにより直ちにホモジナイズした。超音波処理後、直ちにアリコートを０．５ｍｌ遠心管に移し、−８０℃で凍結させた。
（Ｂ）ＰＫＣ活性化の測定
ＰＫＣを測定するために、細胞ホモジネートまたは精製したＰＫＣアイソフォーム１０μｌを、１０μＭヒストン、４．８９ｍＭ ＣａＣｌ2、１．２μｇ／μｌホスファチジル−Ｌ−セリン、０．１８μｇ／μｌ １，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ ＥＧＴＡ、４％グリセロール、８μｇ／ｍｌアプロチニン、８μｇ／ｍｌロイペプチン、および２ｍＭベンズアミジンの存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（０．５μＣｉ）を加え、以前に記載されている通り、ホスホセルロース上への吸着によって、３２Ｐ−リンタンパク質の形成を測定した。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５、６５： ２３５０〜２３５７を参照されたい。
（Ｃ）ＰＫＣアクチベーターによるＰＫＣアイソザイムの活性化の測定
各化合物のＰＫＣ活性を、ジアシルグリセロールおよびホスファチジルセリンの非存在下で測定し、ＰＫＣ−δおよびＰＫＣ−εを、Ｋａｎｎｏら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２００６、４７：１１４６〜１１５６によって記載されている通り、ＥＧＴＡおよびＣａＣｌ2添加の非存在下で測定した。高濃度のＣａ2+はＰＫＣホスファチジルセリン結合部位と相互作用することがあり、活性化を妨害することから、低濃度のＣａ2+が必要とされた。試料を１回超凍結−溶解するとＰＫＣ活性および活性化の度合いを大幅に低減することが見出されたため、試料の１回超の凍結−溶解を避けた。これらのＰＫＣアイソフォームの特異性を決定するために、化合物を、精製したアイソフォームのＰＫＣと５分間プレインキュベートし、ＰＫＣ活性を放射測定した。
ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＰＫＣ−ε（ＰＫＣ−αまたはＰＫＣ−δではなく）を活性化することが見出された。図１は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥが０．１および１μＭで最大の活性を生成し、ＰＫＣ−εに比較的特異的であることを示すものである。実際、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、同濃度のＰＫＣ−αまたはＰＫＣ−δの何れかに対して大きな効果がなかった。ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＰＫＣ−εを０．０１〜１０μＭの範囲において５０％を超えて活性化し、１００ｎＭおよび１μＭ濃度で最大活性であった。このピークでは、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＰＫＣ−εを、対照の１９０％まで、活性化した。
さらに、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＤＨＡ−ＣＰ６およびＤＣＰＬＡよりも、ＰＫＣ−δに対する阻害効果が劣っていた。ジアシルグリセロール部位（例えば、ホルボールエステル）に結合するＰＫＣアクチベーターによりＰＫＣ−δが下方制御されると腫瘍促進効果がもたらされ得るので、これは重要な利点であり得る。さらに、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−δは、一般にアンタゴニスト効果を有することから、ＰＫＣ−δの阻害は、薬物の有効性に寄与し得るため、望ましいことがある。一般に、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−δは、多くの経路においてアンタゴニスト活性を有する。そのようなわけで、ＰＫＣ−εを活性化し、一方でＰＫＣ−δの活性化を最小にし、下方制御するのは、望ましいことがある。
例２
ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルおよびＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステルによるＰＫＣの活性化
例１の手順にしたがって、ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルおよびＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステルの、活性化およびＰＫＣアイソフォーム特異性を測定した（図２）。ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルは、ＰＫＣ−αとＰＫＣ−εの両方を対照の最大４０％活性化し、ＰＫＣ−δをほんのわずかに活性化した。最大の活性化は１０ｎＭで見られた。ＤＣＰＬＡ−シクロプロパン化オレイルエステルはＰＫＣ−εに相対的に特異的であることが見出され、対照の１４０％の活性化を示した。最大の活性化は１０ｎＭで見られた。
例３
ＤＣＰＬＡ−エチルエステル、ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、およびＤＣＰＬＡ−レチニルエステルのＰＫＣ活性化
ＤＣＰＬＡ−エチルエステルの、活性化およびＰＫＣアイソザイム特異性を、例１（Ｂ）および（Ｃ）における手順にしたがって測定したが、精製したアイソザイム９ｎｇを用い、室温で５分間プレインキュベートしたことが異なった（図３）。ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルおよびＤＣＰＬＡ−レチニルエステルによるＰＫＣ−εの活性化を、ＤＣＰＬＡ−エチルエステルと同様に測定した（図３）。
例４
ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルはコレステリルリノレエートよりも大幅にＰＫＣ−εを活性化した
例１における手順にしたがって、ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルおよびコレステリルリノレエートの、活性化およびＰＫＣアイソフォーム特異性を測定した（図４）。ＤＣＰＬＡ−コレステリルエステルは、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−δを、二相性の様式で、対照の最高１３０％活性化した。ＰＫＣ−αは全濃度で阻害された。このエステルは、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−δに対してとりわけ高い親和性を示した。最大活性は０．０１ｎＭで見られ、これは知られているＰＫＣアクチベーターであるブリオスタチン−１よりも１８倍強力である。コレステリルリノレエートは、対照的に、ＰＫＣ−εの活性化を殆どまたは全く生成せず、ＰＫＣ−αを２０％だけ活性化した。
例５
選択されたＤＣＰＬＡエステルのＥＣ50値、特異性、および活性化
選択された数のＤＣＰＬＡエステルのＥＣ50値、ＰＫＣ特異性、および活性化を決定した（表１を参照されたい）。ＥＣ50値は、最大活性化の５０％を活性化する最小濃度を測定することによって決定した。一般的に、ＥＣ50値が低い薬物ほど強力であると考えられている。表１において見ることができる通り、ＤＣＰＬＡのエステルは、対応する酸であるＤＣＰＬＡよりもはるかに低いＥＣ50値を示す。ＤＣＰＬＡの様々なエステルによるＰＫＣの特異性および活性化を、ＰＫＣアイソザイムの活性化の測定値から算出した。
様々なＤＣＰＬＡの活性化データを全体的に考慮すると、ＤＣＰＬＡエステルは２つのグループに分けられると思われる：一般的に１００〜１０００ｎＭでＰＫＣ−εを活性化する低親和性アクチベーター（例えば、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、レチニルエステル、およびシクロプロパン化オレイルエステル）、ならびに一般的に０．１〜１ｎＭでＰＫＣ−εを活性化する、高親和性アクチベーター（例えば、ＤＣＰＬＡ−イソプロピルエステルおよびコレステリルエステル）。化合物は一般的に二相性の応答を示し、ＰＫＣ−εを低濃度で活性化し、ＰＫＣ−εおよび他のアイソフォームを高濃度で阻害した。
ＤＣＰＬＡエステル（例えば、ＤＣＰＬＡ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルおよびコレステリルエステル）には二峰性の活性化を示したものもあり、活性化対濃度のプロットにおけるＰＫＣ活性化に２つの別個のレベルがあることを表しており、ＰＫＣ−εは親和性の異なる２つのホスファチジルセリン結合部位を所有し得ることを示唆している。
例６
ＤＣＰＬＡ−ＭＥはホスファチジルセリン（Ｃ２）結合部位に結合する
ＤＣＰＬＡ−ＭＥの結合部位を決定するために、3Ｈ−ＤＣＰＬＡ−ＭＥを、既知のＣ１およびＣ２競合物の非存在および存在下、ラット脳切片とインキュベートした。より具体的に、ラット脳切片をホルムアルデヒドで固定し、スライスし、（１）3Ｈ−ＤＣＰＬＡ−ＭＥ単独、（２）3Ｈ−ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびＤＣＰＬＡ；（３）3Ｈ−ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびホルボールエステル；または（４）3Ｈ−ＤＣＰＬＡ−ＭＥおよびブリオスタチン１とインキュベートした。インキュベート後、切片を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４中、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および０．１％ウシ血清アルブミンで作製したバッファーで洗浄し、乾燥させ、フィルム−オートラジオグラフィーで分析した。
表２は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥがＤＣＰ−ＬＡと同じ部位に結合することを示しており、結合は高濃度のジアシルグリセロール（Ｃ１−結合部位）アゴニストによってほんのわずかに阻害されることから、Ｋａｎｎｏら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２００６、４７：１１４６〜１１５６によって同定された結合部位はホスファチジルセリン（Ｃ２）部位であり、Ｃ１ＡまたはＣ１Ｂではないことが裏づけられる。
例７
ＡＳＰＤおよびＡＤＤＬの生成およびサイズ決定
合成ＡＳＰＤおよびＡＤＤＬを、上記に記載した通りに調製した。１００ｋＤａ保持物（すなわち、ＡＳＰＤ）およびＡＤＤＬのサイズをＳＥＣによって確認した。これらＡＳＰＤのサイズは、ＳＥＣにかけたサイズ標準物質と比べた場合、およそ１７５ｋＤａであることが見出され、一方ＡＤＤＬは１８、１６、および８ｋＤａにピークを示した。
例８
様々なＡβ1〜42オリゴマーの神経毒性効果（ＡＳＰＤ、ＡＳＰＤの１００ｋＤａ未満のろ液、およびＡＤＤＬ）
様々なサイズのオリゴマーの神経毒性効果を評価するために、ラット一次海馬ニューロンを、可変濃度のこれらＡβ1〜42種と、２０時間処理した。処理した細胞の生存率を、ＭＴＴアッセイを用いて、非処理細胞と比べた。
図５に示す通り、１μＭ濃度のＡβモノマーはニューロンの生存率に影響を及ぼさず（９７．６％±１．３）、一方１μＭ ＡＤＤＬ（モノマーを平均６．５個含む）はニューロンを有意に死滅させた（５０．９８±３．８％、ｐ＝０．００１３）。ＡＳＰＤ（モノマーを平均３９個含む）は、５０ｎＭで生存率における有意な低下を引き起こした（５７．１±４．９％、ｐ＝０．００２８）。ＯＡβ＜１００ｋＤａろ液（モノマーを平均１２個含む）は、５０ｎＭで有意に細胞毒性であったが、インタクトのＡＳＰＤより毒性は低かった。さらに、ＡＳＰＤは２ｎＭ、５ｎＭ、および１０ｎＭの極めて低濃度で生存率の有意な喪失を引き起こし得ることが見出された（表３）。
データは、ＡＳＰＤが最も毒性のオリゴマー種であり、５０ｎＭのＡＳＰＤは、１μＭＡＤＤＬまたは１μＭの＜１００ｋＤａのＡＳＰＤのろ液（ＯＡβ）によって引き起こされる傷害に等しい傷害を引き起こすことを示唆している。モノマーに関して言うと、ＡＳＰＤは、ＡＤＤＬよりも６倍毒性であり、Ａβモノマーより１０倍毒性であることが示された。
さらなる実験は全て、別段の指摘がなければ、５０ｎＭ濃度のＡＳＰＤを用いた。
例９
ブリオスタチン−１、ＤＣＰＬＡ、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ誘導性の神経毒性から保護した
ＰＫＣアクチベーターは、ＴＡＣＥ（腫瘍壊死因子−α変換酵素）、およびＡβ分解酵素、例えば、エンドセリン変換酵素、インスリン分解酵素、もしくはネプリライシンをおそらく活性化することにより、またはシナプス形成を刺激することにより、Ａβからの神経保護をもたらすことが報告されている。
ブリオスタチン−１、ＤＣＰＬＡ、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥを、ＡＳＰＤ誘発性細胞毒性に対して試験して、これらの神経保護効果を決定した。試験したＰＫＣ−εアクチベーターは、一次ニューロンにおいて、ＡＳＰＤでの２０時間処理から神経保護した（図６Ａ）。５０ｎＭ ＡＳＰＤで処理した一次ニューロンは、５７．６±１．６％の生存率を示した。ブリオスタチン−１（０．２７ｎＭ）、ＤＣＰＬＡ（１０μＭ）、およびＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）処理により、生存率は、それぞれ７３．２３±３．６％（ｐ＝０．００８３、ｎ＝６）、８１．４３±２．７６％（ｐ＝０．０００９、ｎ＝６）、および８９．１６±２．２７％（ｐ＝０．０００２、ｎ＝６）に回復した。細胞にＤＣＰＬＡ−ＭＥを加えると、ＰＫＣ−ε転位インヒビターペプチド［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］がＤＣＰＬＡ−ＭＥの保護効果を阻止し、Ａβに対する神経保護はＰＫＣ−ε活性化により媒介されることが示唆された。
ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理した細胞は、ＤＣＰＬＡ処理およびブリオスタチン−１処理した細胞よりも、８％および１６％生存可能であった。データは、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＤＣＰＬＡおよびブリオスタチン−１に比べてより良好な神経保護をもたらしたことを示す。
ＡＳＰＤおよびＤＣＰＬＡ−ＭＥの、分化したヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対する効果も試験した（図６Ｂ）。ＡＳＰＤ処理細胞において、生存率は、非処理細胞に比べて７７．１５±０．４９％（ｐ＜０．０００１、ｎ＝６）であった。ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＡＳＰＤから保護し、生存率を９３．８±０．５７％に回復した（ｐ＜０．０００１、ｎ＝６）。
例１０
ＡＳＰＤ処理はＰＫＣ−εを低減した
ＰＫＣ−εには神経保護効果があることが報告されており、シナプス構造を維持／回復することが知られている。例えば、Ｎｅｌｓｏｎ、Ｔ．Ｊ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２００９、３４：１３６〜１４５；Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ、Ｊ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１１、３１：６３０〜６４３；Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ、Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７、１０４：１９５７１〜１９５７６；およびＳｕｎ、Ｍ．Ｋ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１０、１２７：６６〜７７を参照されたい。ゆえに、ＡＳＰＤがＰＫＣ−εに対して阻害作用を有するか否かを評価するために、ＡＳＰＤ処理後のＰＫＣ−εレベルを測定した。
ＡＳＰＤ処理は、一次ニューロンにおいて、ＰＫＣ−ε免疫蛍光レベルを、対照に比べて６０．８１±５．８５％に低減し（ｐ＝０．０００８、ｎ＝６）（図７Ａ）、これはウエスタンブロットによってさらに確認された。β−アクチンを含めた他の対照タンパク質は、ＡＳＰＤによる影響を受けなかった。これは、Ａβ多量体の毒性効果は、一部にはＰＫＣの低減により媒介され得ることを示唆している。
ＡＳＰＤのＰＫＣ−ε活性化に対する効果を、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞における膜への酵素の転位を測定することによって分析した（図７Ｂ）。ＡＳＰＤはＰＫＣ−εの膜転位を３０％低減し（６９．９８±３．２７％、ｐ＝０．０００６、ｎ＝３）、一方２０倍高濃度のＡＤＤＬはＰＫＣ−εを２０％だけ低減した（８０．８２±４．０２５％、ｐ＝０．００５８、ｎ＝３）。Ａβ1〜42モノマーは、１μＭでは転位に影響を及ぼさなかった。これは、低濃度のＡＳＰＤは、上流のシグナル伝達経路に干渉することによりＰＫＣ−εを標的とし、ＰＫＣ−εの分解および活性の低減をもたらすことを示している。ＤＣＰＬＡ−ＭＥの添加は、ＰＫＣ−εの転位を正常に回復した（図８Ｄ）。
例１１
ＤＣＰＬＡ−ＭＥはＰＫＣ−εの活性化を誘発し、神経保護をもたらした
基本のＰＫＣ−εレベルおよび酵素の活性化は、神経毒性を誘発したＡβオリゴマーによる影響を受け、それをＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理することで細胞が生存する助けとなった。ＤＣＰＬＡ−ＭＥの、ＰＫＣ−εタンパク質レベルおよび活性化に対する効果を次に評価した。
一次ニューロンを、ＡＳＰＤおよび／またはＤＣＰＬＡ−ＭＥで処理した。ＰＫＣ−εのｍＲＮＡを、上記に記載した通り、ＲＴ−ＰＣＲにより定量した。対照、および処理した培養一次ラット海馬ニューロンから調製したＲＮＡを単離し、逆転写した。個々のｃＤＮＡを、ＰＫＣ−εおよびβ−アクチンに対して増幅した。ＰＫＣ−ε発現を、β−アクチンに対して標準化した。
一次ニューロンにおいて、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、対照とＡＳＰＤ処理した細胞の両方においてＰＫＣ−ε転写物レベルを増大し（図８Ａ）、一方ＡＳＰＤ単独はＰＫＣ−εのｍＲＮＡを有意に変更しなかった。ＤＣＰＬＡ−ＭＥも、ＰＫＣ−εタンパク質レベルを正常に回復させた（図８Ｂ）。この保護は、５μＭ ＰＫＣ−ε転位インヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］によって完全に阻止された（図８Ｃ）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞において、ＡＳＰＤはＰＫＣ−ε転位を４６％低減した。ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＰＫＣ−ε転位を正常に回復させた（図８Ｄ）。
例１２
ＡＳＰＤはシナプス損傷を引き起こした
ＡＳＰＤによって引き起こされる、一次海馬ニューロンに対するシナプス損傷を推定するために、シナプトフィジン（シナプス前マーカー）およびＰＳＤ−９５（シナプス後マーカー）の発現を、免疫蛍光染色によって測定した。チャンバースライド上で増殖させた細胞を、ビヒクル（対照）、Ａβモノマー（１μＭ）、ＡＤＤＬ（１μＭ）、およびＡＳＰＤ（５０ｎＭ）で処理した。２０時間のインキュベート期間後、細胞を、核、ＰＳＤ−９５、およびシナプトフィジンに対して染色した。発現レベルを、非処理細胞に比べた平均蛍光強度におけるパーセント値の変化として算出した。
対照に比べて、５０ｎＭ ＡＳＰＤはシナプトフィジン強度における４０％の低減を引き起こし（６２．４５±６．７４％、ｐ＝０．００７１）、１μＭ ＡＤＤＬは２５％の低減を引き起こした（７５．６４±４．８４％、ｐ＝０．０３３）（図９Ａおよび９Ｃ）。ＰＳＤ−９５発現も、ＡＳＰＤ処理細胞において４２％（±１０％）低減した（図Ａおよび９Ｂ）。１μＭ濃度のＡβ1〜42モノマーは、シナプトフィジンまたはＰＳＤ−９５の発現を変更しなかった。これは、ＡＳＰＤは、ナノモル濃度でもシナプスの完全性を破壊することを示すものである。
例１３
ＤＣＰＬＡ−ＭＥはニューロンをＡＳＰＤ誘発性シナプス喪失から保護した
処理および非処理の一次ニューロンを、ＭＡＰ−２、シナプトフィジン、およびＰＳＤ−９５に対して免疫染色して、シナプスの完全性を決定した。チャンバースライド上で増殖させた細胞を、ビヒクル（対照）、５０ｎＭ ＡＳＰＤ、５０ｎＭ ＡＳＰＤ、および１００ｎＭ ＤＣＰＬＡ−ＭＥ、ならびに５０ｎＭ ＡＳＰＤと１００ｎＭ ＤＣＰＬＡ−ＭＥと５μＭ ＰＫＣ−ε転位インヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］で処理した。ＰＫＣ−εインヒビターを加えた３０分後に、ＡＳＰＤおよびＤＣＰＬＡ−ＭＥを加えた。２０時間のインキュベート期間後、細胞を、上記に記載した通り、ＭＡＰ−２、ＰＳＤ−９５、およびシナプトフィジンに対して染色した。
ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの神経突起の染色はＡＳＰＤ処理後に低減したが、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理は神経突起分岐におけるその染色を増大したことが見出された（図１０Ａ）。
ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理は、ＡＳＰＤ処理細胞におけるＭＡＰ−２の発現（平均蛍光強度）を４０．７±６．２％から６８．８７±２．０％（ｐ＝０．０００７、ｎ＝５）に、シナプトフィジンを６３．３±３．８％から８７．４８±３．７５％（ｐ＝０．０００５、ｎ＝５）に、ＰＳＤ−９５を６７．６３±７．２４％から９９．２±１１．３％（ｐ＝０．０２、ｎ＝５）に増大した（図１０Ｂ）。これらの結果は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ＡＳＰＤ細胞を細胞死から保護するだけでなく、シナプスネットワークにおけるシナプトフィジン、ＰＳＤ−９５、およびＭＡＰ−２の発現の増大によるシナプス損傷も防いだことを示唆する。シナプトフィジンの発現はウエスタンブロットによって確認され、ＡＳＰＤは発現を２６％低減し（７３．３０％±３．３１９、ｐ＝０．００３５，ｎ＝３）、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理により発現が対照と同様に維持されたことが示された（図１０Ｃ）。
例１４
ＤＣＰＬＡ−ＭＥはＡＳＰＤ処理一次ニューロンにおいてＧＳＫ−３βを不活化した
抗ホスホ−Ｓｅｒ−９のウエスタンブロットにおけるシグナルの増大によって証明された通り、ＡＳＰＤ処理細胞をＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理することにより、ＧＳＫ−３βのＳｅｒ−９残基のリン酸化は正常レベルまで回復した（図１１）。ＧＳＫ−３βは、過剰リン酸化されたタウタンパク質の生成における主要な酵素であり、Ｓｅｒ−９残基のリン酸化はＧＳＫ−３βの阻害を引き起こすので、ＰＫＣによる、Ｓｅｒ−９のＧＳＫ−３βのリン酸化の増大は、ＤＣＰＬＡ−ＭＥの保護効果をやはり増強し得る。
例１５
ＤＣＰＬＡ−ＭＥはヒト皮質ニューロンにおいてシナプス形成をもたらす［２０１２年１１月８日に受理された書面から図２３］
ＰＫＣ−ε活性化の効果を調べるために、無血清人工培地中、培養ヒトニューロンを、５０％の培地を置きかえて、３日毎に添加した１００ｎＭ ＤＣＰＬＡ−ＭＥまたは０．２７ｎＭブリオスタチン−１に、４０日間曝露した。より具体的には、ヒト一次皮質ニューロンを、神経細胞増殖サプリメント（neuronal growth supplement）（ＮＧＳ）（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌカタログ番号＃１５６２）を含んでいる、神経細胞用培地（Neuronal Medium）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌカタログ番号＃１５２１）中で増殖させた。
ＮＧＳの組成−５００ｍｌボトルのＮＭにＮＧＳを補充する場合、サプリメント成分１ミリリットルあたりの最終濃度は、１００ｕｇＢＳＡ、２．５ｕｇ／ｍＬカタラーゼ、１ｕｇ／ｍＬグルタチオン（還元型）、４ｕｇ／ｍＬインスリン、０．００２６ｕＭ Ｔ３、２ｕｇ／ｍＬ Ｌ−カルニチン、１６ｕＭエタノールアミン、１５ｕｇ／ｍＬガラクトース、１６．１ｕｇ／ｍＬプトレシン、０．０１４３５ｕｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、０．０２ｕｇ／ｍＬコルチコステロン、０．０２ｕＭプロゲステロン、３．５ｎＭリノール酸、１ｕｇ／ｍＬリノレン酸、０．２ｕＭリポイクアコド（Lipoic Acod）、０．０１ｕｇ／ｍＬレチニル酢酸、０．１ｕｇ／ｍＬ Ｄ，Ｌ−アルファ−酢酸トコフェロール、および０．１％エタノールである。
細胞を、ポリ−ｌ−リジン（０．００１％）コーティングしたプレート上、１００００超の細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。培地の半分を、３日毎に新たな培地によって置きかえた。ＤＣＰＬＡ−ＭＥまたはブリオスタチンを、１００％エタノール中に溶解し、最終濃度（ＤＣＰＬＡ−ＭＥは１００ｎＭ、ブリオスタチンは０．２７ｎＭ）に添加した。培地交換の間、３日毎に、新鮮なＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン（０．２７ｎＭ）を加えた。実験を４０日間続けた。
ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、ニューロンの生存を、２０日から、４０日を超えて増大した。ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理した神経突起陽性細胞は、非処理群の１３０±８に比べて、３６０±４５個／視野であった。ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、シナプスを示す、シナプトフィジンおよびＰＳＤ−９５の共局在する点状の数を、対照の２３０％に増大し（図１２）、ＰＫＣ−εの活性化はヒトニューロンにおけるシナプス形成を誘発し得ることが示された。フラクタル次元の１．２７±０．０２から１．４０±０．０３の増大によって証明される通り、神経突起の分岐も増大した（ｐ＝０．０３）（図１２）。ＰＫＣ−εの活性化により、ヒトニューロンにおけるネットワークの連結性および複雑性における著しい成長がもたらされる。このように、ＤＣＰＬＡエステル、例えば、ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、様々な神経学的障害における顕著な治療的利点を提供し得る。
例１６
ＤＣＰＬＡ−ＭＥは、感覚運動能力または動機づけに影響を及ぼさずに、用量依存的に学習および記憶保持を改善した
水迷路空間学習および記憶タスク（訓練試行２回／日を４日間）を用いて、経口ＤＣＰＬＡ−ＭＥの、ラットにおける学習および記憶に対する効果を評価した。可視プラットホーム試験（visible platform test）を、実験が終わった後に行って、処置が感覚運動性活動および回避動機づけの変更をもたらし得たか否かを評価した。
成年オスＷｉｓｔａｒラット（２００〜２５０ｇ）を、温度制御した部屋（２０〜２４℃）に一週間収容し、餌および水を自由に摂取させ、１２時間の明／暗周期を維持した。ラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔し（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）、定位装置（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｕｊｕｎｇａ、ＣＡ）中に配置した。ラットの深部体温をモニタリングし、加温光およびパッドで一定（３８±０．５℃）に維持した。ステンレススチール製ガイドカニューレ２個を、無菌条件下、座標（前〜後０．５ｍｍ、側面１．５ｍｍ、水平３．２ｍｍ）に位置付けた先端部とともに配置した。外科手術の終わりに、好適な麻酔下、ラットに、乳酸／リンゲル溶液中バナミン（banamine）（１ｍｇ／ｋｇ）およびケトプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）を投与（ｓ．ｃ．）した。任意のさらなる実験の前に、７日の回復期間をおいた。
実験初日、全てのラットを異なる群に無作為に割り当て、１．５（直径）×０．６ｍ（深さ）のプール（２２±１℃）中で２分間泳がせた。翌日、ラットを、連続４日間の、１日あたり２つの試行において訓練した。各訓練試行は最高２分間続き、その間、ラットは、固定された位置に水面下１ｃｍに浸水して配置された隠れたプラットホームを見つけることにより、水から回避することを学習した。ラットの進路決定（navigation）をビデオカメラによって追跡した。ラットがプールを横切ってプラットホームまで泳ぐ、回避の待ち時間および経路を記録した。最後の訓練試行の２４時間後、プラットホームを除去した後に、四分円試験（１分）を行った。
ＤＣＰＬＡ−ＭＥを、５．３または１６．０ｍｇ／ｋｇの何れかで投与した（胃内、２回／週、合計８用量、水迷路タスク前に最初の６用量、ならびに訓練１日目および３日目の第２の試行０．５時間後に第７および第８用量）。図１３に示すように、試行にわたって回避潜伏期が短くなることにより証明される通り、全部のラットが水迷路タスクを学習した。（Ｆ７、１９１＝１９．７２４、ｐ＜０．００１）。群間で有意差が存在し（Ｆ２，１９１＝７．７１７、ｐ＜０．００１）、用量１６．０ｍｇ／ｋｇと対照群との間に有意差が存在し（Ｆ１，１２７＝１３．３８９、ｐ＜０．００１）、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ投与時に学習成績が改善したことが示された。学習成績はＤＣＰＬＡ−ＭＥ用量５．３ｍｇ／ｋｇと対照群の間で改善したが、改善は有意レベルに到達しなかった（Ｆ１、１２７＝０．６５７、ｐ＞０．０５）。
記憶保持試験において、全てのラットが標的の四分円の好みを示した（図１４）。データを、標的の四分円比を用いて分析した（プローブ試験の間、標的の四分円の距離を、非標的の四分円値の平均によって除す、図１４Ｄ）。データは、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ用量１６．０ｍｇ／ｋｇと対照群の間に、標的の四分円比における有意差を示したが（Ｆ１、１５＝４．９８１、ｐ＞０．０５）、用量５．３ｍｇ／ｋｇと対照群の間には有意差はなかった（Ｆ１、１５＝０．３９７、ｐ＞０．０５）。
実験の終わりに、ラットを可視プラットホーム試験においてさらに試験して、処置が感覚運動性活動および回避動機付けの変更をもたらし得たかどうかを評価した。この試験において群間に有意差はなく(Ｆ３、３１＝１．１２７、ｐ＞０．０５、示さず）、経口ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処置は、ラットの感覚運動性能力および回避に対する動機づけに影響を及ぼさなかったことを示していた。
例１７
ＤＣＰＬＡ−ＭＥによるＰＫＣ−ε特異的活性化は、一次ヒトニューロンを経時的に変性から保護する
推奨される方法にしたがい、ヒト一次ニューロン（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を解凍し、ポリ−Ｌ−リジンコーティングしたプレート上に１００００細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングし、神経細胞用培地中に維持した。（ＤＭＥＭ＋高グルコース＋神経細胞増殖サプリメント、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）。一次ヒトニューロンを、次いで、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１００ｎＭ）またはブリオスタチン−１（０．２７ｎＭ）の何れかで、４０日間処理した。３日毎に新鮮な薬物を加え、５０％の培地を交換した。
ＤＣＰＬＡ−ＭＥまたはブリオスタチン−１の何れかで処理した細胞は、神経突起の分岐および連結を有する良好な生存を示した（図１５Ａ）。非処理細胞は２０日後に変性を示したが、処理した細胞は少なくとも４０日間健全であった（図１５Ｂ）。ＰＫＣ−ε、ＰＳＤ−９５、およびシナプトフィジンの発現レベルは、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理細胞において、対照またはブリオスタチン−１処理細胞に比べて有意に高かった（図１５Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）。
ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンの点状の共局在は、シナプスの指標として受け入れられる。例えば、Ｂａｒｋｅｒら、（２００８）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２８、８１５０〜８１６０；Ｉｐｐｏｌｉｔｏら、（２０１０）Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ、１６（４５）、２２７０を参照されたい。図１５Ｈは、シナプスの数がＤＣＰＬＡ−ＭＥ処理細胞において有意に増大したことを示し、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−ε活性化はシナプス形成およびシナプスの維持を増強することを示唆するものである。
例１８
ブリオスタチン−１は、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−αを膜に転位させた
ブリオスタチン−１のアイソフォーム特異性を調べるために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をブリオスタチン−１（０．２７ｎＭ）で０、５、１５、３０、および６０分間処理し、上記「一般的手順」の下に記載した通り、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に調製した。ウエスタンブロットを、上記に記載した通り、試料に対して行った。サイトゾルと膜の両方の分画に対して、等量のタンパク質を各レーンにローディングした（２０μｇ）。ＰＫＣの活性化を、膜における全ＰＫＣのパーセント値として算出した（膜／サイトゾル＋膜）。
ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−αは、０、５、１５、および３０分に、転位における著しい増大を示した（図１６）。ＰＫＣ−αは６０分にベースラインまで下りてきたが、ＰＫＣ−εは６０分に活性化されたままだった。３つの独立した実験を各試料に対して行い、グラフにおけるデータは平均値±ＳＥを表す。データは、０．２７ｎＭのブリオスタチン−１は、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−αに対するアイソフォーム特異性を示すことを指摘している。
例１９
ブリオスタチン−１は、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−αの、ＲＡＣＫ１との相互作用を誘発した
細胞をチャンバースライドにプレーティングし、０．２７ｎＭブリオスタチン−１で０、５、１５、および３０分間処理し、次いで、上記に記載した通り、共焦点分析用に調製した。図１７Ａに示す通り、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−αは膜に再配置し、ブリオスタチン−１で処理した場合、ＲＡＣＫ１との会合を示した。ＰＫＣ−ε−ＲＡＣＫ１は、５分（Ｒ＝０．７１）および１５分（Ｒ＝０．７２）に、対照（Ｒ＝０．３４）に比べて、共局在の相関における有意な増大を示した。ＰＫＣ−αは、１５分（Ｒ＝０．５８）に、ＲＡＣＫ１との共局在における最大の増大を示した。ＰＫＣ−εとＲＡＣＫ１の間の会合は、ＰＫＣ−αとＲＡＣＫ１より明白だった。膜におけるＰＫＣ−εおよびＲＡＣＫ１の共局在は、酵素活性の活性化と同じ時間経過をたどった（５分でｐ＝０．０１４０）。ＰＫＣ−αの共局在は３０分で低減した。ＰＫＣ−β−ＲＡＣＫ１とＰＫＣ−δ−ＲＡＣＫ１の間の共局在の補正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）における有意な増大は観察されなかった（データは示さず）。
次に、細胞を、上記で論じた免疫共沈降法にしたがって調製した。ＲＡＣＫ１免疫沈降は、ブリオスタチン−１誘導性の活性化時、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−αのＲＡＣＫ１との会合を示した（図１７Ｂ）。ＰＫＣ−ε−ＲＡＣＫ１の相互作用は、５、１５、および３０分に有意に増大した一方、ＰＫＣ−α−ＲＡＣＫ１相互作用は１５分に増大したが、３０分に対照レベル未満に低減した。結果は、ＰＫＣ−β−ＲＡＣＫ１とＰＫＣ−δ−ＲＡＣＫ１の間の共局在の補正における有意な増大が存在しなかったという上記の知見を確認するものであった。
全体的に、このデータは、０．２７ｎＭのブリオスタチン−１は、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−α、とりわけＰＫＣ−εに対するアイソフォーム特異性を示すことをさらに実証する。
さらに、ＲＡＣＫ１は、ＰＫＣ−εとインテグリンβ鎖の間の相互作用を媒介し、グリオーマ細胞の接着、拡散、および運動性をもたらすことが報告されている。Ｂｅｓｓｏｎら、（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７、２２０７３〜２２０８４を参照されたい。上記のデータを、これら以前の報告と組み合わせると、ブリオスタチン−１媒介性のＰＫＣ−εのＲＡＣＫ１との会合は、接着に関与し、神経突起の形成を増強し得ることが示唆される。
例２０
ＲＡおよびブリオスタチン−１での処理によりＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞は分化し、シナプスネットワークがもたらされる
ＰＫＣ−εアクチベーターは、訓練、低酸素、加齢、および毒性ＡＤタンパク質であるＡβの増大レベルの条件下、樹状突起棘およびシナプスの数を増大し、かつ／または喪失を防ぐ、強力な神経保護物質であることが報告されている。Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、（２０１１）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１、６３０〜６４３を参照されたい；Ｎｅｌｓｏｎら、（２００９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ、３４、１３６〜１４５も参照されたい。したがって、ＲＡを用いてＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を分化させ、次いで上記に記載した通り、ブリオスタチン−１で処理された。ＲＡで前処理した細胞を０．２７ｎＭブリオスタチンとインキュベートすると、非処理細胞、ＲＡのみ、およびブリオスタチン−１のみで処理した細胞に比べて、２４時間で、広範な神経突起の伸長、および細胞間ネットワークを示した（データは示さず）。実際、ＲＡ処理細胞、ならびにＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞の共焦点画像は、７２時間で広範な神経突起および細胞間ネットワークを示した（図１８）。画像は、ＰＫＣ−εおよびＲＡＣＫ１は、神経突起中に共局在することをさらに示した。
例２１
ブリオスタチン−１およびＲＡで処理した細胞は、シナプスマーカータンパク質の発現の増大を示した
非処理の一次細胞（対照細胞）、ＲＡで処理した細胞、ならびにＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞を、顕微鏡法およびウエスタンブロット分析用に調製した。３つのシナプス前ニューロンマーカー（シナプトフィジン、バスーン、およびシナプシン）、ならびに２つのシナプス後マーカー（ＰＳＤ−９５およびニューロリジン１）の発現を、記載した通り、免疫蛍光染色によって測定した。神経突起、ＭＡＰ−２、およびβ−チューブリンＩＩＩの発現および局在も分析した。
免疫蛍光染色した細胞の共焦点画像法は、ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞においてＭＡＰ−２に対する著しい変化を示さなかったが、β−チューブリンＩＩＩは１．５倍増大した（図１９Ａ）。画像法はまた、非処理およびＲＡ処理した細胞に比べて（ｐ＜０．０００１）、ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞におけるシナプトフィジンの３．５倍の有意な増大（ｐ＜０．０００１）を示した（図１９Ｂ）。ＲＡおよびブリオスタチンでの処理はまた、ＰＳＤ−９５の発現を、対照（ｐ＝０．０００３）およびＲＡ処理した細胞（ｐ＜０．００１）に比べて４．５倍増大した（図１９Ｂ）。シナプシン、バスーン、およびニューロリジン１の発現における同様の増大も、７２時間に、ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞において注目された（図２０）。分化した細胞において、マーカーが神経突起に局在することが見出された。
免疫ブロット分析（図２１）は、７２時間後に、ＲＡおよびブリオスタチン−１（０．２７ｎＭ）で処理した細胞において、非処理またはＲＡ処理した細胞に比べて、シナプトフィジン発現の２倍の増大およびβ−チューブリン発現の１．５倍の増大を示し（ｐ＜０．００５）、免疫蛍光データを確証した。ブリオスタチン−１単独は、シナプトフィジン発現を５０％増大した。
シナプス前と後の両方のタンパク質における増大は、ＲＡおよびブリオスタチン−１での処理時のシナプスの形成における劇的な増大を示すものである。ＲＡのみで処理した細胞はシナプトフィジンまたはＰＳＤ−９５における大幅な変化を示さなかったことから、これらの観察は、ＲＡおよびＰＫＣは、分化、およびシナプスの形成、およびシナプスネットワークに対して相乗的に作用することを示唆している。
例２２
ＲＡおよびブリオスタチン−１はＰＫＣ−εの活性化を延長した
４つの別々な実験を行った：（１）非処理（対照）、ＲＡ処理、ブリオスタチン−１処理、ならびに上記に記載した通りＲＡおよびブリオスタチン−１処理に対してＲＴ−ＰＣＲを行って、ＰＫＣ−εのｍＲＮＡレベルを推定した；（２）非処理細胞、ＲＡ処理細胞、ならびにＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞を、上記に記載したＰＫＣアッセイにかけた；（３）ＲＡ処理細胞を上記に記載した通り、特異的なアイソフォームと一緒にＰＫＣアッセイにかけた；ならびに（４）ＲＡ処理した細胞、ならびにＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞の、ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−αの転位を、β−チューブリンをローディング対照として免疫ブロットにより測定した。
図２２Ａは、ＰＫＣ−εの転写はＲＡによって増強され、ＰＫＣ−εのブリオスタチン−１による活性化はこの効果を増大することを示す。より具体的に、ＲＡのみ、およびブリオスタチン−１のみで処理した細胞は、ＰＫＣ−εのｍＲＮＡレベルを２倍増大したが、ＲＡおよびブリオスタチン−１での処理はＰＫＣ−εのｍＲＮＡレベルを３．５倍増大した（ｐ＝０．０００３）。ＰＫＣ−αまたはＰＫＣ−δのｍＲＮＡにおける変化はなかった（データは示さず）。ＲＡのみの細胞においてｍＲＮＡレベルの増大がなかったという事実は、ＲＡがＰＫＣ−εの転写を増大するという以前の報告と一致する。Ｍａｄｅｎ，Ｍ．、（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、８、７５５〜７６５を参照されたい。
図２２Ｂは、膜において、７２時間で、対照に比べて、ＲＡ処理、ならびにＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞における全ＰＫＣ活性が有意に増大した（ｐ＜０．００５）ことを示す。より具体的に、膜におけるＰＫＣ活性は、全ＰＫＣ活性のパーセント値として算出して（サイトゾル＋膜）、ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞において、非処理細胞に比べてほぼ１３４％の増大を、ＲＡ処理細胞に比べて３８％の増大を示した。ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞の膜における全ＰＫＣ活性は７２時間後でも維持されたが、サイトゾル中のＰＫＣ活性は経時的に低減した（ｐ＜０．０００５）。
図２２Ｃは、ＰＫＣ−ε、ＰＫＣ−α、およびＰＫＣ−δは、ＲＡ単独によって活性化されないことを示す。図２２Ｄは、ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞は、ＰＫＣ−αの有意な活性化を示さず、最大は４８時間で１２％増大したことを示す。一方、ＰＫＣ−ε活性化は１２時間（２８％）、２４時間（４２％）、４８時間（５０％）、および７２時間でさえ（５０％）有意に増大した。ＰＫＣ−εおよびＲＡＣＫ１に対して７２時間後、ＲＡ処理、ならびにＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞の免疫蛍光染色によって、長時間の活性化が確認された。
これらの試験を分析する上で、結果は、ＲＡおよびブリオスタチン−１での処理は、ＰＫＣ、特にＰＫＣ−εの活性化を延長したことを示す。図２２Ｂに示す通り、全ＰＫＣ活性は７２時間まで観察された。ＰＫＣ−εを具体的に観察した場合に同じことが当てはまった（図２２Ｄ、図１８も参照されたい）。これは、わずか１時間でＰＫＣ−εの速やかな低下を示した、ブリオスタチン−１単独の活性化と顕著な対照をなす（図１６）。
ＲＡのみで処理した細胞において、ＰＫＣ−εの転写は増大し（図２２Ａ）、全ＰＫＣ活性は増大した（図２２Ｂ）。しかし、ＲＡはＰＫＣ−εを活性化しなかった（図２２Ｃ）。
ブリオスタチン−１処理した細胞の場合に見られた速やかな下方制御は、おそらく、プロテアソームの活性によるＰＫＣの分解によるものである。Ｌｅｅ、（１９９７）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、５１、４３９〜４４７を参照されたい。したがって、ＲＡはＰＫＣ−εを活性化しないことから、ＲＡがプロテアソームの分解を阻止するように働いている可能性があり得る。さらに、ＰＫＣ−εの転写が増大することから、ＲＡが、分解が起こっているとしても活性が延長するように、ＰＫＣ−εの一定のプールを作り出している可能性がある。ＲＡおよびブリオスタチン−１の使用によって生じる活性の持続は、長期間の臨床使用に極めて望ましい。
さらに、ＰＫＣ−ε−ＲＡＣＫ１の神経突起における共局在（図１８）、および膜におけるＰＫＣ−εの持続的な存在（図２２Ｄ）の成果に基づいて、ＲＡＣＫ１がＰＫＣ−εを膜および神経突起に局在化させ、そこでインテグリンβ鎖と相互作用し、接着、拡散、および運動性をもたらし得（Ｂｅｓｓｏｎら、（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７７、２２０７３〜２２０８４を参照されたい）、他のアイソフォームが結合することができないＦ−アクチンフィラメントとやはり結合する（Ｐｒｅｋｅｒｉｓ、ら、（１９９６）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３２、７７〜９０；４９．Ｚｅｉｄｍａｎら、（２００２）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ、１３、１２〜２４；Ｐｒｅｋｅｒｉｓら、（１９９８）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７３、２６７９０〜２６７９８；およびＳａｉｔｏｈら、（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９８、１４０１７〜１４０２１を参照されたい）ことが推測され得る。これらの相互作用は、神経突起の伸長、ならびにシナプス構造の再編成およびスパイン形成（spinogenesis）に必要とされる細胞骨格修飾をもたらし得る。
例２３
ＲＡおよびブリオスタチン−１での処理によりシナプトソームにおけるＰＫＣ−εおよびシナプトフィジンが増大した
シナプトソームを、上記「一般的手順」において記載した通り、非処理（対照）、ならびにＲＡ（１０μＭ）、ブリオスタチン−１（０．２７ｎＭ）（Ｂｒｙ）、またはＲＡおよびブリオスタチン−１で（０．２７ｎＭ）処理した細胞から調製した。７２時間後にウエスタンブロット分析を行った。
ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞のシナプトソームは、非処理細胞（ｐ＝０．００２１）およびＲＡ−処理細胞（ｐ＝０．００２７）に比べて、ＰＫＣ−εレベルにおける大幅な増大（３倍）を示した（図２３Ａ）。ブリオスタチン−１自体は、シナプトソーム中の全ＰＫＣ−εを２倍増大し、これは膜に転位したものより５０％多く（図２３）、ブリオスタチン−１は、ＰＫＣ−εをシナプトソームに局在化させ、シナプトソームでシナプス形成に必要とされる重要なシナプスタンパク質をリン酸化し得ることが示唆された。ＲＡ＋ブリオスタチン−１処理は、シナプトソームにおいて、ＰＳＤ−９５染色を３倍を超えて増大した（図２３Ｂ）。
シナプトフィジンはまた、ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞のシナプトソームにおいて２．５倍増大し（図２３Ｃ）、ＲＡは、シナプスの構造および機能を維持する上で、一部にはＰＫＣ−εの活性化によって作用することが示唆された。ＰＫＣ−εとシナプトフィジンの両方の発現が、ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞のシナプトソームにおいて増大することから、データは、ＰＫＣ−εは、シナプトソームにおいてシナプス活性を増強するのに必要であることを示唆している。
データに基づき、ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した神経芽細胞腫細胞のＰＫＣ−ε媒介性の分化は、成熟ニューロンの良好かつ機能的なモデルを提供し、ニューロンの特徴的なマーカー、例えば、シナプトソームにおけるシナプトフィジン発現の増大およびＰＳＤ−９５発現の増大を実証する。
例２４
ＲＡおよびＰＫＣアクチベーターでの処理により、一次ニューロン細胞は分化し、シナプスネットワークがもたらされる
７日齢のラット海馬ニューロンを、ＲＡ、ブリオスタチン−１、ＲＡおよびブリオスタチン−１、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（ＰＫＣ−ε特異的アクチベーター、１００ｎＭ）、またはＲＡおよびＤＣＰＬＡＭＥで、４８時間、処理した。ＲＡおよびＰＫＣアクチベーター（ブリオスタチン−１またはＤＣＰＬＡ−ＭＥの何れか）での処理は、ＲＡ処理した細胞、または対応するＰＫＣアクチベーター単独で処理した細胞に比べて、ニューロンを分化させる上で、より効果的だった（図２４）。樹状分岐は、ＭＡＰ−２染色によって証明される通り、ＲＡおよびＰＫＣアクチベーターで処理した細胞において増大した。同様に、シナプスの小胞のプールの増大も、シナプトフィジンの増大によって見られた。
例２５
ＲＡおよびブリオスタチン−１での処理は、オリゴマーのＡβから神経保護的であった
チャンバースライド上で増殖させたラット海馬一次ニューロンを、ビヒクル、；ＲＡ；ＡＳＰＤ；ＡＳＰＤおよびＲＡ；ＡＳＰＤおよびブリオスタチン−１；ＡＳＰＤ、ＲＡ、およびブリオスタチン−１；ＡＳＰＤ、ＲＡ、およびＤＣＰＬＡＭＥ；ＰＫＣインヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］、ＡＳＰＤ、ＲＡ、およびブリオスタチン−１；またはＰＫＣインヒビター［ＥＡＶＳＬＫＰＴ］、ＡＳＰＤ、およびＲＡで処理した。全ての試験に５０ｎＭＡＳＰＤを用いた。細胞の生存率をＭＴＴアッセイによって測定した。
ＲＡおよびブリオスタチン−１での処理は、ブリオスタチン−１処理した細胞に比べた場合、ＡＳＰＤ処理したニューロンに対して、より神経保護的であることが見出された（図２４Ｃ）。ＡＳＰＤ処理した細胞は極めて毒性であることが示され、生存率を５７．６１％±１．５９（ｐ＜０．００５）まで低減した。ブリオスタチン−１処理した細胞は生存率を７１．３８％±２．３４まで回復し、一方、ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞はさらにより大きな神経保護を示した（生存率８１．９９％±３．４５）。ブリオスタチン−１とＤＣＰＬＡ−ＭＥの両方ともＰＫＣアクチベーターである。しかし、ＲＡを添加すると、ＲＡと組み合わせて用いられるＰＫＣアクチベーターの濃度に応じて、神経保護効果を増大し得る。
２０時間のインキュベート後、ＡＳＰＤ処理細胞、ならびにＡＳＰＤ、ＲＡ、およびブリオスタチン−１で処理した細胞を、ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンに対して染色した。ＲＡおよびブリオスタチンでの処理は、ＡＳＰＤ処理一次ニューロンにおいて、ＰＳＤ−９５およびシナプトフィジンのレベルを有意に回復した（図２４Ａおよび図２４Ｂ）。ＡＳＰＤ処理した細胞におけるＰＳＤ−９５の平均蛍光強度は、ビヒクル処理（対照）細胞（１５．４２±２．２）に比べて５０％低減したが（８．１６±１．２１）、ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理した細胞において回復した（１４．２６±１．７２）。同様に、対照におけるシナプトフィジン（１７．５±１．２）はＡＳＰＤ（９．７４±２．５）によって低減したが、ＲＡおよびブリオスタチン−１での処理はシナプトフィジンレベルを１４．３５±１．６７まで回復した。
図２４に示すデータは、このように、ＲＡおよびブリオスタチン−１は、ＲＡまたはブリオスタチン何れかの単独よりも良好な神経保護的な性質を有することを示唆するものである。
例２６
ＲＡおよびブリオスタチン−１で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の電流固定
ホールセル電流固定記録を、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ａコンピュータ制御微小電極増幅器、およびｐＣＬＡＭＰ ９．０ソフトウエア付Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２デジタイザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。先端抵抗２〜８メガオームを有する微小電極を、１．５ｍｍホウケイ酸ガラスから引いた。データを、２０〜４０ｋＨｚのサンプリングレートで収集し、１０〜２０ｋＨｚでフィルターにかけ、いくつかの痕跡を、Ｇｎｕｐｌｏｔ（ｖ３．７；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｎｕｐｌｏｔ．ｉｎｆｏ／）に実装された平滑化手順（smoothing procedure）によって加工した。いくつかのデータをより高いサンプリングレートで収集して、活動電位振幅に対するサンプリングの効果を取り除いた。
ホールセル記録用のピペットに、グルコン酸カリウム（１３０ｍＭ）、ＮａＣｌ（４ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（２ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ（１０ｍＭ）、ＥＧＴＡ（０．２ｍＭ）、およびＮａＡＴＰ（２ｍＭ）を充填した。記録は全て室温で行った。ステップ電流を、処理した神経芽細胞腫細胞中に注入することにより、活動電位を誘発し、活動電位は非処理の神経芽細胞腫細胞において観察されなかった。細胞が静止膜電位にあるリスニングプロトコール（ゼロ電流注入）を用いて、処理した神経芽細胞腫細胞に対して、自発的興奮性／抑制性シナプス後電位（Ｅ／ＩＰＳＰ）を記録した（Ｃｈｉｒｉｌａら、Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００７、Ｏｃｔ １；５８４（Ｐｔ１）：１６７〜９０．Ｅｐｕｂ、２００７、Ａｕｇ ９）。
この実験の目標は、神経芽細胞腫細胞を、機能的なシナプスを形成することができるニューロン様細胞に変換することであった。図２５は、整流が生じていることを示すが、これは活動電位を示し得る。これらのデータは非常に予備的であるので、機能的なシナプスの示度を評価することができず、これらの技術を用いてさらに記録することで、これらの連結の機能性の信用できる尺度が提供され得る。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏの状況で機能的なシナプスを作り出すのは、とりわけ貴重であり得る。これは、動物実験を必要とする現在の方法に比べて、シナプスを再生する潜在的な薬物の能力を試験するための、単純かつ安価な手段を提供し得る。
例２７
ＰＫＣ−εのノックダウンは、ＲＡ＋ブリオスタチン−１媒介性の分化を妨げる
ＰＫＣ−εの、ＲＡ＋ブリオスタチン−１媒介性分化における役割を確認するために、ｓｉＲＮＡ媒介性ＰＫＣ−εノックダウン細胞を用いた。ＰＫＣε−ｓｉＲＮＡ細胞（「ＰＫＣεＫＯ」）はＰＫＣ−εの発現を５０％低減した（図２６Ａ）。ＲＡ＋ブリオスタチン−１で処理したＰＫＣ−εノックダウン細胞（「ＰＫＣεＫＯ＋ＲＡ＋Ｂｒｙ」）は、シナプトフィジンおよびＰＳＤ−９５染色の低減を示した（図２６Ｂ、Ｄ、Ｅ、およびＦ）。ＰＫＣ−εの過剰発現（「ＰＫＣεＯＥ」）はシナプトフィジンを増大した（図２６ＣおよびＥ）。ＲＡ＋ブリオスタチン−１は、非処理細胞におけるシナプトフィジン染色を増大したが、ＰＫＣ−εＫＯ細胞では増大しなかった（図２６Ｅ）。同様の効果がＰＳＤ−９５に見られた（図２６Ｆ）。これらの結果は、ＲＡ＋ブリオスタチン−１によるシナプス前および後のタンパク質の誘導にＰＫＣ−εが必要とされることを指摘している。
例２８
ＲＡ＋ブリオスタチン−１はラット一次ニューロンにおける分化を増強する
ＲＡ＋ブリオスタチン−１の、一次ニューロンの発達に対する効果も調査した。７日齢のラット海馬ニューロンを、ＲＡ、ブリオスタチン−１、ＲＡ＋ブリオスタチン−１、ＤＣＰＬＡ−メチルエステル（「ＤＣＰＬＡ−ＭＥ」）、またはＲＡ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥで、４８時間、処理した。ＲＡ＋ブリオスタチンは、ＲＡまたはブリオスタチン単独よりも、ＭＡＰ２およびシナプトフィジンのより大きな増大を生成した（図２７ＡおよびＣ）。
フラクタル次元の測定により、ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１．４０±０．０３）、ＲＡ＋ブリオスタチン−１（１．４５±０．０３５）、およびＲＡ＋ＤＣＰＬＡ−ＭＥ（１．３６±０．０１）で処理した細胞における樹状分岐の有意な増大が示された（図２７Ｂ）。シナプトフィジン染色はＲＡおよびＤＣＰＬＡ−ＭＥにより増大し、シナプス小胞のプールにおける増大が示唆された（図２７Ｃ）。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸大環状ラクトン、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される化合物。
［２］
シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸大環状ラクトン、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される少なくとも１つの化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、少なくとも１つの神経変性または神経情動性の障害または状態を処置するための方法。
［３］
前記少なくとも１つの神経変性障害または状態がアルツハイマー病およびパーキンソン病から選択される、［２］に記載の方法。
［４］
前記少なくとも１つの神経変性障害または状態が、少なくとも１つの神経毒性化学物質への曝露によって引き起こされる、［２］または［３］３の何れか一に記載の方法。
［５］
前記少なくとも１つの神経毒性化学物質が重金属である、［４］に記載の方法。
［６］
前記少なくとも１つの神経情動性障害が、うつ病、双極性障害、および統合失調症から選択される、［２］に記載の方法。
［７］
シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸大環状ラクトン、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される少なくとも１つの化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、脳卒中を処置するための方法。
［８］
シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸大環状ラクトン、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される少なくとも１つの化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、脳傷害を処置するための方法。
［９］
前記脳傷害が、外傷性脳傷害および照射によって誘発される脳傷害から選択される、［８］に記載の方法。
［１０］
シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸大環状ラクトン、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される少なくとも１つの化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、学習を改善する方法。
［１１］
シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸大環状ラクトン、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される少なくとも１つの化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、記憶を改善する方法。
［１２］
少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターおよび少なくとも１つのレチノイドを含む組成物。
［１３］
前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターが、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビター、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）、インスリン成長因子、ホルモン、成長因子アクチベーター、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される、［１２］に記載の組成物。
［１４］
前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターが、ブリオスタチン、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸アルコール、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される、［１２］に記載の組成物。
［１５］
前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターがブリオスタチン−１である、［１２］に記載の組成物。
［１６］
前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターがＤＣＰＬＡエステルである、［１２］に記載の組成物。
［１７］
前記エステルが、メチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、およびオレイルエステルから選択される、［１６］に記載の組成物。
［１８］
前記少なくとも１つのレチノイドが、レチノイン酸、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド、４−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イルエチニル）安息香酸、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、オールトランス−４−ヒドロキシレチノイン酸、オールトランス−４−オキソレチノイン酸、３，４−ジデヒドロレチノイン酸、レチノール、レトロレチノール、オールトランス−４−ヒドロキシレチノール、オールトランス−４−オキソレチノール、１４−ヒドロキシ−４，１４−レトロレチノール、レチンアルデヒド、リコペン、アポ−１０’−リコペン酸（lycopenoic acid）、およびアシクロレチン酸から選択される、［１２］〜［１７］の何れか一に記載の組成物。
［１９］
前記少なくとも１つのレチノイドがレチノイン酸である、［１２］〜［１７］の何れか一に記載の組成物。
［２０］
少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターおよび少なくとも１つのＬＤＬ粒子を含む組成物。
［２１］
前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターが、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビター、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）、インスリン成長因子、ホルモン、成長因子アクチベーター、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される、［２０］に記載の組成物。
［２２］
前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターが、ブリオスタチン、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸アルコール、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される、［２０］に記載の組成物。
［２３］
前記ＬＤＬ粒子が人工である、［２０］〜［２２］の何れかに記載の組成物。
［２４］
少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターおよび少なくとも１つのレチノイドを、それを必要とする患者に投与することを含む、少なくとも１つの神経変性または神経情動性の障害または状態を処置するための方法。
［２５］
前記少なくとも１つの神経変性障害または状態が、アルツハイマー病およびパーキンソン病から選択される、［２４］に記載の方法。
［２６］
前記少なくとも１つの神経変性障害または状態が、少なくとも１つの神経毒性化学物質への曝露によって引き起こされる、［２４］または［２５］の何れか一に記載の方法。
［２７］
前記少なくとも１つの神経毒性化学物質が重金属である、［２６］に記載の方法。
［２８］
前記少なくとも１つの神経情動性障害または状態が、うつ病、双極性障害、および統合失調症から選択される、［２４］に記載の方法。
［２９］
少なくともプロテインキナーゼＣアクチベーターおよび少なくとも１つのレチノイドを、それを必要とする患者に投与することを含む、脳卒中を処置するための方法。
［３０］
少なくともプロテインキナーゼＣアクチベーターおよび少なくとも１つのレチノイドを、それを必要とする患者に投与することを含む、脳傷害を処置するための方法。
［３１］
前記脳傷害が、外傷性脳傷害および照射によって誘発される脳傷害から選択される、［３０］に記載の方法。
［３２］
少なくともプロテインキナーゼＣアクチベーターおよび少なくとも１つのレチノイドを、それを必要とする患者に投与することを含む、学習を改善する方法。
［３３］
少なくともプロテインキナーゼＣアクチベーターおよび少なくとも１つのレチノイドを、それを必要とする患者に投与することを含む、記憶を改善する方法。
［３４］
少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターが、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビター、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）、インスリン成長因子、ホルモン、成長因子アクチベーター、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される、［２４］、［２５］、および［２８］〜［３３］の何れか一に記載の方法。
［３５］
前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターが、ブリオスタチン、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸アルコール、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される、［２４］、［２５］、および［２８］〜［３３］の何れか一に記載の方法。
［３６］
前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターがブリオスタチン−１である、［２４］、［２５］、および［２８］〜［３３］の何れか一に記載の方法。
［３７］
前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターがＤＣＰＬＡエステルおよびＤＨＡ−ＣＰ６エステルから選択される、［２４］、［２５］、および［２８］〜［３３］の何れか一に記載の方法。
［３８］
ＤＣＰＬＡまたはＤＨＡ−ＣＰ６の前記エステルが、メチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、およびオレイルエステルから選択される、［３７］に記載の方法。
［３９］
前記少なくとも１つのレチノイドが、レチノイン酸、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（「４−ＨＰＲ」）、４−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イルエチニル）安息香酸（「ｅｃ２３」）、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、オールトランス−４−ヒドロキシレチノイン酸、オールトランス−４−オキソレチノイン酸、３，４ジデヒドロレチノイン酸、レチノール、レトロレチノール、オールトランス−４−ヒドロキシレチノール、オールトランス−４−オキソレチノール、１４−ヒドロキシ−４，１４−レトロレチノール、レチンアルデヒド、リコペン、アポ−１０’−リコペン酸、およびアシクロレチン酸から選択される、［２４］、［２５］、および［２８］〜［３３］の何れか一に記載の方法。
［４０］
前記少なくとも１つのレチノイドがレチノイン酸である、［２４］、［２５］、および［２８］〜［３３］の何れか一に記載の方法。
［４１］
前記少なくとも１つのレチノイドが、それを必要とする患者に、前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターの投与前に投与される、［２４］、［２５］、および［２８］〜［３３］の何れか一に記載の方法。
［４２］
前記少なくとも１つのレチノイドが、それを必要とする患者に、前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターの投与後に投与される、［２４］、［２５］、および［２８］〜［３３］の何れか一に記載の方法。
［４３］
前記少なくとも１つのレチノイドおよび前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターが同時である、［２４］、［２５］、および［２８］〜［３３］の何れか一に記載の方法。
［４４］
少なくとも１つのレチノイドおよび少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターを細胞に添加すること、シナプスネットワークを形成させること、シナプスネットワークを破壊する少なくとも１つの毒素を添加すること、スクリーニングしようとする少なくとも１つの薬物を添加すること、ならびにシナプスネットワークが少なくとも部分的に回復しているか否か、またはシナプス形成が生じているか否かを決定することを含む、少なくとも１つの薬物をスクリーニングするための方法。
［４５］
前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターが、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸ホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビター、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）、インスリン成長因子、ホルモン、成長因子アクチベーター、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸コンジュゲート、シクロプロパン化一不飽和脂肪酸コンジュゲート、ブリオスタチンコンジュゲート、ブリオログコンジュゲート、およびレチノイン酸コンジュゲートから選択される、［４４］に記載の方法。
［４６］
前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターがブリオスタチン−１である、［４４］に記載の方法。
［４７］
前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターがＤＣＰＬＡエステルである、［４４］に記載の方法。
［４８］
前記エステルが、メチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、およびオレイルエステルから選択される、［４７］に記載の方法。
［４９］
前記少なくとも１つのレチノイドが、レチノイン酸、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（「４−ＨＰＲ」）、４−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イルエチニル）安息香酸（「ｅｃ２３」）、９−シスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、オールトランス−４−ヒドロキシレチノイン酸、オールトランス−４−オキソレチノイン酸、３，４ジデヒドロレチノイン酸、レチノール、レトロレチノール、オールトランス−４−ヒドロキシレチノール、オールトランス−４−オキソレチノール、１４−ヒドロキシ−４，１４−レトロレチノール、レチンアルデヒド、リコペン、アポ−１０’−リコペン酸、およびアシクロレチン酸から選択される、［４４］〜［４８］の何れか一に記載の方法。
［５０］
前記少なくとも１つのレチノイドがレチノイン酸である、［４４］〜［４８］の何れか一に記載の方法。
［５１］
前記細胞が、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞および一次ニューロンから選択される、［４４］に記載の方法。
［５２］
毒素が、β−アミロイド、Ａβ由来拡散性リガンド、アミロスフェロイド、タイポキシン、オカダ酸、百日咳毒素、ボツリヌス毒素から選択される、［４４］に記載の方法。
［５３］
前記シナプスネットワークの回復が、電子顕微鏡法および／または電気生理学的測定によって決定される、［４４］に記載の方法。
［５４］
前記少なくとも１つのレチノイドが、前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターの添加前に前記細胞に添加される、［４４］に記載の方法。
［５５］
前記少なくとも１つのレチノイドが、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターの添加後に前記細胞に添加される、［４４］に記載の方法。
［５６］
前記少なくとも１つのレチノイドおよび前記少なくとも１つのプロテインキナーゼＣアクチベーターが、前記細胞に同時に添加される、［４４］に記載の方法。

Claims (16)

  1. シクロプロパン化多価不飽和または一不飽和脂肪酸が少なくとも１つの他の分子と、前記シクロプロパン化多価不飽和または一不飽和脂肪酸のカルボキシル基と前記少なくとも１つの他の分子の水酸基との間に形成されたエステル結合を介して共有結合した脂肪酸エステルであって、
    前記シクロプロパン化多価不飽和または一不飽和脂肪酸が、シクロプロパン化オレイン酸、シクロプロパン化エライジン酸、シクロプロパン化リノレン酸、シクロプロパン化ドコサヘキサエン酸、シクロプロパン化リノール酸、シクロプロパン化アラキドン酸、およびシクロプロパン化エイコサペンタエン酸から選択され、
    前記少なくとも１つの他の分子が、ブリオスタチン、ブリオログ、コレステロ−ル、レチノール、多価不飽和脂肪アルコール、一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、およびシクロプロパン化一不飽和脂肪アルコールから選択され、
    前記ブリオログが、式１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択された化合物であり、
    前記多価不飽和脂肪アルコール、一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和または一不飽和脂肪酸が、オレイルアルコール、シクロプロパン化オレイルアルコール、リノレンアルコール、シクロプロパン化リノレンアルコール、ドコサヘキサエンアルコール、シクロプロパン化ドコサヘキサエンアルコール、エイコサペンタエンアルコール、シクロプロパン化エイコサペンタエンアルコール、リノールアルコール、およびシクロプロパン化リノールアルコールから選択される、
    脂肪酸エステル。
  2. 前記少なくとも１つの他の分子がブリオスタチン−１である、請求項１に記載の脂肪酸エステル。
  3. 前記少なくとも１つの他の分子がコレステロ−ルである、請求項１に記載の脂肪酸エステル。
  4. 前記少なくとも１つの他の分子がレチノ−ルである、請求項１に記載の脂肪酸エステル。
  5. 前記シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸が３−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチル−シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）プロパン酸(ＤＨＡ−ＣＰ６)である請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の脂肪酸エステル。
  6. シクロプロパン化多価不飽和または一不飽和脂肪酸が少なくとも１つの他の分子と、前記シクロプロパン化多価不飽和または一不飽和脂肪酸のカルボキシル基と前記少なくとも１つの他の分子の水酸基との間に形成されたエステル結合を介して共有結合した脂肪酸エステルを含む、神経変性疾患もしくは状態、神経情動性疾患もしくは障害、脳卒中、または脳傷害を治療するための医薬組成物であって、
    前記シクロプロパン化多価不飽和または一不飽和脂肪酸が、シクロプロパン化オレイン酸、シクロプロパン化エライジン酸、シクロプロパン化リノレン酸、シクロプロパン化ドコサヘキサエン酸、シクロプロパン化リノール酸、シクロプロパン化アラキドン酸、およびシクロプロパン化エイコサペンタエン酸から選択され、
    前記少なくとも１つの他の分子が、ブリオスタチン、ブリオログ、コレステロ−ル、レチノール、多価不飽和脂肪アルコール、一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、およびシクロプロパン化一不飽和脂肪アルコールから選択され、
    前記ブリオログが、式１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択された化合物であり、
    前記多価不飽和脂肪アルコール、一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和または一不飽和脂肪酸が、オレイルアルコール、シクロプロパン化オレイルアルコール、リノレンアルコール、シクロプロパン化リノレンアルコール、ドコサヘキサエンアルコール、シクロプロパン化ドコサヘキサエンアルコール、エイコサペンタエンアルコール、シクロプロパン化エイコサペンタエンアルコール、リノールアルコール、およびシクロプロパン化リノールアルコールから選択され、
    それを必要とする患者に投与される医薬組成物。
  7. 前記少なくとも１つの神経変性障害または状態がアルツハイマー病およびパーキンソン病から選択される、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記少なくとも１つの神経変性障害または状態が、少なくとも１つの神経毒性化学物質への曝露によって引き起こされる、請求項６または７の何れか一項に記載の組成物。
  9. 前記少なくとも１つの神経毒性化学物質が重金属である、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記神経情動性障害または状態が、うつ病、双極性障害、および統合失調症から選択される、請求項８に記載の組成物。
  11. 前記脳傷害が、外傷性脳傷害および照射によって誘発される脳傷害から選択される、請求項８に記載の組成物。
  12. シクロプロパン化多価不飽和または一不飽和脂肪酸が少なくとも１つの他の分子と、前記シクロプロパン化多価不飽和または一不飽和脂肪酸のカルボキシル基と前記少なくとも１つの他の分子の水酸基との間に形成されたエステル結合を介して共有結合した脂肪酸エステルを含む、学習および／または記憶を改善するための医薬組成物であって、
    前記シクロプロパン化多価不飽和または一不飽和脂肪酸が、シクロプロパン化オレイン酸、シクロプロパン化エライジン酸、シクロプロパン化リノレン酸、シクロプロパン化ドコサヘキサエン酸、シクロプロパン化リノール酸、シクロプロパン化アラキドン酸、およびシクロプロパン化エイコサペンタエン酸から選択され、
    前記少なくとも１つの他の分子が、ブリオスタチン、ブリオログ、コレステロ−ル、レチノール、多価不飽和脂肪アルコール、一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、およびシクロプロパン化一不飽和脂肪アルコールから選択され、
    前記ブリオログが、式１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択された化合物であり、
    前記多価不飽和脂肪アルコール、一不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和または一不飽和脂肪酸が、オレイルアルコール、シクロプロパン化オレイルアルコール、リノレンアルコール、シクロプロパン化リノレンアルコール、ドコサヘキサエンアルコール、シクロプロパン化ドコサヘキサエンアルコール、エイコサペンタエンアルコール、シクロプロパン化エイコサペンタエンアルコール、リノールアルコール、およびシクロプロパン化リノールアルコールから選択され、
    それを必要とする患者に投与される医薬組成物。
  13. 前記少なくとも１つの他の分子がブリオスタチン−１である請求項６〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記少なくとも１つの他の分子がコレステロールである請求項６〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記少なくとも１つの他の分子がレチノールである請求項６〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸が３−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチル−シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）プロパン酸(ＤＨＡ−ＣＰ６)である請求項６から請求項１５のいずれか１項に記載の組成物。
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