JP2015520743A - Tetragalnacおよびペプチドを含む新規なコンジュゲートと、オリゴヌクレオチドの送達方法 - Google Patents
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Abstract
Description
G−L−[O1][O2][O3]......[On]−L−P。
P−L−[O1][O2][O3]......[On]−L−G。
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、二本鎖または一本鎖での非修飾または修飾RNAまたはDNAである。修飾RNAの例には、非修飾RNAよりヌクレアーゼ分解に対して抵抗性が高いものがある。さらなる例として、2’糖修飾、塩基修飾、一本鎖オーバーハング、たとえば3’一本鎖オーバーハングの修飾、または、特に一本鎖の場合、1つまたは複数のリン酸基または1つまたは複数のリン酸基のアナログを含む5’修飾を有するものが挙げられる。オリゴヌクレオチドの例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際公開第2009/126933号パンフレットで確認することができる。
siRNAは、RNA干渉(RNAi)と呼ばれるプロセスによりmRNAの配列特異的サイレンシングを誘導する。このプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物を含む多種多様な生物で起こる。siRNAを調製および投与するための方法、ならびに遺伝子機能を特異的に不活性化するためのその使用は、公知である。siRNAは、修飾および非修飾siRNAを含む。siRNAの例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際公開第2009/126933号パンフレットで確認することができる。
モジュール組成物のtetraGalNAcとオリゴヌクレオチドまたはsiRNAとの間、および/または、ペプチドとオリゴヌクレオチドまたはsiRNAとの間の共有結合は、リンカーを介してもよい。このリンカーは、用途に応じて切断型でもあるいは非切断型でもよい。ある種の実施形態では、切断型リンカーは、エンドソームから細胞質への輸送後にオリゴヌクレオチドを放出するのに使用してもよい。目的のコンジュゲーションまたはカップリング相互作用の性質、または所望の生物学的作用により、どのリンカー基を選ぶかが決定される。リンカー基は、より複雑な構造を得るため組み合わせても、あるいは分岐させてもよい。好適なリンカーとして、本明細書に援用する国際公開第2009/126933号パンフレットに記載されているようなものが挙げられる。
二分子膜を用意に通過できない高分子薬剤および親水性薬剤分子の場合、それらの作用部位への効果的な送達にとって、細胞内のエンドソームコンパートメント/リソソームコンパートメントに取り込まれることが、最大の障害になると考えられる。理論に拘泥するわけではないが、ペプチドを使用すると、そうしたエンドソームコンパートメント/リソソームコンパートメントからのオリゴヌクレオチドの脱出、または細胞膜を通過するオリゴヌクレオチドのトランスロケーション、および細胞質コンパートメントへの放出が促進されると考えられる。ある種の実施形態では、本発明のペプチドは、pH依存性膜活性および/または融合性を示し得るポリカチオン性または両親媒性またはポリアニオン性または両性イオン性または親油性または中性のペプチドもしくはペプチド模造物でもよい。ペプチド模倣物は、ペプチドを模倣するように設計された小さいタンパク質状の鎖であってもよい。
本発明のモジュール組成物は標的化リガンドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、この標的化リガンドは、モジュール組成物を特定の細胞に誘導することができる。たとえば、標的化リガンドは、標的細胞の表面上の分子と特異的または非特異的に結合することができる。標的化部分は、標的細胞に対して特異的親和性を有する分子であってもよい。標的化部分は、標的細胞の表面に見られるタンパク質に対する抗体、あるいは標的細胞の表面に見られる分子に対するリガンドまたはリガンドの受容体結合部を含んでもよい。標的化リガンドの例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際公開第2009/126933号パンフレットで確認することができる。
親油性部分、たとえばコレステロールまたは脂肪酸は、核酸などの高度の親水性分子に結合すると、血漿タンパク質結合を実質的に増強し、結果として循環半減期を長くすることができる。さらに、親油基は細胞取り込みを促進することもできる。たとえば、脂質は、特定の血漿タンパク質、たとえばリポタンパク質に結合でき、その結果、対応するリポタンパク質受容体(たとえば、LDL受容体またはスカベンジャー受容体SR−B1)を発現する特定の組織の取り込みを促進することが示されている。親油性コンジュゲートは、標的送達アプローチと見なすこともでき、その細胞内輸送は、エンドソーム溶解剤との組み合わせによりさらに強力に促進され得る。
モジュール組成物は、水溶解度の向上、循環半減期の延長および/または細胞取り込みの促進を行うことができる1個または複数個の他の部分/リガンドを含んでもよい。こうしたものとして、天然に存在する物質、たとえばタンパク質(たとえば、ヒト血清アルブミン(HSA)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)またはグロブリン);または炭水化物(たとえば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸)を挙げることができる。これらの部分はまた、組換え分子または合成分子、たとえば合成ポリマーまたは合成ポリアミノ酸であってもよい。例として、ポリリシン(PLL)、ポリL−アスパラギン酸、ポリL−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(L−ラクチド−co−グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG、たとえば、PEG−0.5K、PEG−2K、PEG−5K、PEG−10K、PEG−12K、PEG−15K、PEG−20K、PEG−40K)、メチル−PEG(mPEG)、[mPEG]2、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、ポリ(2エチルアクリル酸)、N−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが挙げられる。可溶化剤の例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際公開第2009/126933号パンフレットで確認することができる。
一態様では、本発明は、本発明のモジュール組成物の投与から恩恵を受け得る疾患のリスクがあるまたはそれに罹患した被検体を処置する方法を特徴とする。本方法は、本発明のモジュール組成物の投与を必要とする被検体に本発明のモジュール組成物を投与することにより、被検体を処置することを含む。投与されるオリゴヌクレオチドは、処置対象の疾患によって異なる。具体的な適応症の処置方法に関するさらなる詳細については、国際公開第2009/126933号パンフレットを参照されたい。
オリゴヌクレオチド化合物のコンジュゲートを調製するための方法は、多く存在する。その技術は、当業者によく知られているはずである。そうした反応に関する有用な参考文献として、Bioconjugate Techniques,Hermanson,G.T.,Academic Press,San Diego,CA,1996がある。他の参考文献としては、国際公開第2005/041859号パンフレット;国際公開第2008/036825号パンフレットおよび国際公開第2009/126933号パンフレットがある。
実施例1〜2
TetraGalNAcリガンド化合物A9およびA10の合成
以下のスキーム1を用いてTetraGalNAc化合物9および10を調製した。
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した2000mL 3口丸底フラスコに、(2S)−2,6−ジアミノヘキサン酸(50g、342.03mmol、1.00当量)をアセトニトリル(1000mL)に溶かした溶液を入れ、50℃に加熱した。これに水酸化カリウム(22.6g、0.4025mol、1.00当量、85%)を加えた。得られた溶液を30分間撹拌した。次いで3−ブロモプロプ−1−イン(29.5mL、1.00当量)を加えた。得られた溶液を50℃で1時間撹拌した。追加の水酸化カリウム(22.6g、0.4025mol、1.00当量)をこの溶液に加え、50℃で30分間撹拌した。これに3−ブロモプロプ−1−イン(29.5mL、1.00当量)を加えた。得られた溶液を1時間撹拌した。これに水酸化カリウム(22.6g、0.4025mol、1.00当量)を再度加えた。得られた溶液を50℃で30分間撹拌し、続いてさらに3−ブロモプロプ−1−イン(29.5mL、1.00当量)を加えた。得られた溶液を1時間撹拌した。これに水酸化カリウム(22.6g、0.4025mol、1.00当量)を加えた。得られた溶液を30分間撹拌した。これに3−ブロモプロプ−1−イン(29.5mL、1.00当量)を加えた。得られた溶液を3時間撹拌した。反応混合物を水/氷浴で25℃まで冷却した。固体を濾去した。濾液をHCl(6M)でpH4に調整した。固体を濾去した。濾液を真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムに供し、ジクロロメタン/メタノール(100:1〜25:1)で溶出した。この結果、(2S)−2,6−ビス[ビス(プロプ−2−イン−1−イル)アミノ]ヘキサン酸(化合物A1)を淡黄色の油として得た。
MS(ES,m/z):297.2,[M−H]− 1HNMR(CDCl3,500MHz,ppm):3.62(d,J=2.0Hz,4H),3.52−3.49(m,1H),3.50(d,J=2.4Hz,4H),2.62(t,J=7.1Hz,2H),2.30(t,J=2.4Hz,2H),2.27(t,J=2.4Hz,2H),1.88−1.79(m,2H),1.60−1.53(m,2H),1.52−1.43(m,2H)。
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した2000mL 3口丸底フラスコに、2−(2−ヒドロキシエトキシ)エタン−1−オール(A2、42.4g、399.55mmol、1.00当量)をジクロロメタン(1000mL)に溶かした溶液およびトリエチルアミン(27.9g、275.72mmol、0.25当量)を入れた。上記にp−トルエンスルホニルクロリド(19.1g、100.18mmol、0.50当量)を加えた。25℃で1時間撹拌後、得られた混合物を1×500mLのカリウムヒドロスルファート水溶液(1M)および1×500mLの炭酸水素ナトリウム水溶液(5%)でそれぞれで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムに供し、ジクロロメタン/メタノール(100:1)で溶出した。この結果、2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチル4−メチルベンゼンスルホネート(化合物A3)を無色油として得た。
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した500mL 丸底フラスコに、2−(2−[[(4−2−(2−ヒドロキシエトキシ)エチル4−メチルベンゼンスルホネート(A3、50g、192.08mmol、1.00当量)をN,N−ジメチルホルムアミド(250mL)に溶かした溶液を入れた。これに続いてアジ化ナトリウム(18.79g、289.03mmol、1.50当量)を25℃で加えた。得られた溶液を油浴にて100℃で5時間撹拌した。反応混合物を冷却し、濾過した。濾液を真空下で濃縮した。残液を1000mLのジクロロメタンで希釈し、1×500mLの水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムに供し、ジクロロメタン/メタノール(80:1)で溶出した。この結果、2−(2−アジドエトキシ)エタン−1−オール(化合物A4)を無色油として得た。
1HNMR(CDCl3,400MHz,ppm):3.42−3.45(t,J=4.8Hz,2H),3.63−3.65(t,J=4.8Hz,2H),3.71−3.74(t,J=4.8Hz,2H),3.71−3.79(m,2H)。
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した2000mL 3口丸底フラスコに、(3R,4R,5R,6R)−3−アミノ−6−(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ−2H−ピラン−2,4,5−トリオールヒドロクロリド(A5、120g、556.50mmol、1.00当量)をピリジン(1200mL)に溶かした溶液を入れた。これに続いて酢酸無水物(341.6g、3.35mol、6.00当量)を0℃で撹拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を一晩25℃で撹拌した。次いで8000mLの水/氷を加えて反応をクエンチした。この固体を濾過により集めた。この結果、(3R,4R,5R,6R)−3−アセトアミド−6−(アセトキシメチル)テトラヒドロ−2H−ピラン−2,4,5−トリイルトリアセテート(化合物A6)を白色固体として得た。
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した2000mL 丸底フラスコに、(3R,4R,5R,6R)−3−アセトアミド−6−(アセトキシメチル)テトラヒドロ−2H−ピラン−2,4,5−トリイルトリアセテート(A6、30g、77.05mmol、1.00当量)をジクロロメタン(1500mL)に溶かした溶液を入れ、次いで鉄(III)クロリド(30g、184.95mmol、2.40当量)を加えた。得られた混合物を25℃で2時間撹拌した。次いで1000mLの水/氷を加えて反応をクエンチした。有機層を1×1000mLの炭酸水素ナトリウム水溶液および1×1000mLの水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。この結果、(3aR,5R,6R,7R,7aR)−5−(アセトキシメチル)−2−メチル−5,6,7,7a−テトラヒドロ−3aH−ピラノ[3,2−d]オキサゾール−6,7−ジイルジアセテート(化合物A7)を黄色油として得た。
1HNMR(CDCl3,300MHz,ppm):2.03(s,9H),2.12(s,3H),3.97−4.27(m,4H),4.90−4.93(m,J=3.3Hz,1H),5.45−5.47(t,J=3.0Hz,1H),5.98−6.00(d,J=6.6Hz,1H)。
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した500mL 丸底フラスコに、(3aR,5R,6R,7R,7aR)−5−(アセトキシメチル)−2−メチル−5,6,7,7a−テトラヒドロ−3aH−ピラノ[3,2−d]オキサゾール−6,7−ジイルジアセテート(A7、40g、121.47mmol、1.00当量)を1,2−ジクロロエタン(200mL)に溶かした溶液、2−(2−アジドエトキシ)エタン−1−オール(A4、23.89g、182.18mmol、1.50当量)を入れた。上記に数個の4Aゼオライトを加えた。得られた混合物を25℃で1時間撹拌した。次いでトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(10.8mL、0.50当量)を加えた。25℃で一晩撹拌後、反応混合物を500mLのジクロロメタンで希釈し、1×500mLの水、1×500mLの炭酸水素ナトリウム水溶液および1×500mLの水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムに供し、ジクロロメタン/メタノール(100:1)で溶出した。この結果、(2R,3R,4R,5R,6R)−5−アセトアミド−2−(アセトキシメチル)−6−[2−(2−アジドエトキシ)エトキシ]テトラヒドロ−2H−ピラン−3,4−ジイルジアセテート(A8)を無色油として得た。
MS(m/z):461.1,[M+H]+
1HNMR(CDCl3,500MHz,ppm)5.78(d,J=8.90Hz,1H),5.36(d,J=2.9Hz,1H),5.22(dd,J=11.2,3.6Hz,1H),4.77(d,J=8.3Hz,1H),4.19−4.12(m,2H),4.11−4.05(m,1H),3.98−3.92(m,2H),3.82−3.78(m,1H),3.71−3.63(m,4H),3.49−3.38(m,2H),2.16(s,3H),2.05(s,3H),2.01(s,3H),1.97(s,3H)。
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した250mL 丸底フラスコに、(2S)−2,6−ビス[ビス(プロプ−2−イン−1−イル)アミノ]ヘキサン酸(A1、1.0g、1.0当量)、(2R,3R,4R,5R,6R)−5−アセトアミド−2−(アセトキシメチル)−6−[2−(2−アジドエトキシ)エトキシ]テトラヒドロ−2H−ピラン−3,4−ジイルジアセテート(A8、9.26g、6.0当量)、無水THF50mL、CuBr.SMe2(0.138g、0.20当量)、および無水DBU(1.5ml、3.0当量)をそれぞれ順番に仕込んだ。得られた溶液を室温で16時間撹拌し、酢酸(0.75mL、4.0当量)でクエンチし、MP−TMT樹脂(Part No:801472、Biotage製)(9g)で処理し、室温で16時間熟成させ、濾過し、濾液を濃縮して泡状固体とした。次いでこの固体をCH2Cl2(140mL)に溶解させ、AcOH/NaCl溶液(140mL)で洗浄した。AcOH/NaCl溶液は、1mL AcOHおよび100mL 20%NaCl溶液で調製した。下層の有機層を濃縮し、SiO2カラム(220g)で精製し、CH2Cl2/MeOHで溶出した。この結果、(S)−2,6−ビス(ビス((1−(2−(2−(((2R,3R,4R,5R,6R)−3−アセトアミド−4,5−ジアセトキシ−6−(アセトキシメチル)テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)オキシ)エトキシ)エチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)メチル)アミノ)ヘキサン酸(化合物A9)を白色固体として得た。
MS(m/z):2139.5,[M+H]+
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した250mL 丸底フラスコに、(S)−2,6−ビス(ビス((1−(2−(2−(((2R,3R,4R,5R,6R)−3−アセトアミド−4,5−ジアセトキシ−6−(アセトキシメチル)テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)オキシ)エトキシ)エチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)メチル)アミノ)ヘキサン酸(A9、6.9g、1.0当量)、Na2CO3(6.83g、20当量)、水(56mL)およびMeOH(32mL)をそれぞれ順番に仕込んだ。反応を室温で16時間熟成させ、濃縮して残渣を得、水(50mL)に再溶解させ、Combiflash C18 gold逆相カラム(415g)で精製し、水/MeCNで溶出した。真空下で濃縮後、生成物を最小量の水に溶解させ、凍結乾燥して(S)−2,6−ビス(ビス((1−(2−(2−(((2R,3R,4R,5R,6R)−3−アセトアミド−4,5−ジヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)オキシ)エトキシ)エチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)メチル)アミノ)ヘキサン酸(化合物A10)を白色固体として得た。
MS(m/z):1657[M+Na]+
1HNMR(D2O,500MHz,ppm):8.05(s,2H),7.91(s,2H),4.62(t,J=5.0Hz,4H),4.57(t,J=5.0Hz,4H),4.45−4.41(d,J=8.6Hz,4H),3.99−3.82(m,28H),3.80−3.61(m,28H),3.14(t,J =7.1Hz,1H),2.52(broad s,2H),1.99(s,6H),1.98(s,6H),1.73(m,2H),1.60(m,2H),1.29(m,2H)。
B2〜B5の調製
実施例3〜6
図5A−1〜図5Dに示したスキーム2を使用して、Bコンジュゲート(Ex.3〜6)を調製した。
A10(86mg、0.053mmol)およびDIEA(57.6μL、0.330mmol)をDMSO(500μL)に溶解させ、次いでHATU(301μL、0.079mmol)の溶液に加え、15分間撹拌した。出発材料パッセンジャー鎖B1(101mg、0.013mmol)を水(168μL)およびDMSO(1.5mL)に溶解させた。HATU溶液をRNA溶液に加え、15分間熟成させた。反応混合物を水(50mL)で希釈し、3k膜を通して水に対して3回遠心透析した。濃縮物を、Dionix ProPac SAX 22×250mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を95%A(2:3 H2O:2,2,2−トリフルオロエタノール、20mM TEA)から40%溶媒B(2:3 H2O:2,2,2−トリフルオロエタノール、20mM TEA、1M CsCl)までグラジエント溶出した。画分を水で希釈して2,2,2−トリフルオロエタノール含量を25%まで下げ、3k膜を通して水に対して3回遠心透析した。濃縮物を凍結乾燥して生成物をアモルファス固体として得た。Expected mass:9267.5,found mass:9267.0
B2(606mg、0.065mmol)を水(32mL)に溶かした溶液に、TEAA(1.64mL、2M)、DTT水溶液(0.65mL、1M)およびTEA(0.65mL、4.69mmol)を加えた。反応混合物を10分間熟成させた。次いで反応混合物を水で希釈し、3k膜を通して水に対して3回遠心透析した。濃縮物は、さらに単離することなく次に使用した。Expected mass:9177.4,found mass:9179.0
B3(350mg、0.038mmol)を水(3mL)に溶かした溶液に、N−(2−アミノエチル)−マレイミドトリフルオロアセテート塩(194mg、0.763mmol)を加えた。反応混合物を30分間熟成させ、その後反応混合物を、RP−HPLC(95:5〜5:95% A:B直線グラジエント(A=100mM TEAA水溶液;B=100mM TEAAのアセトニトリル溶液)Waters Phenyl xbridge Columnにより精製した。B4を含む画分を、3k膜を通して水に対して3回遠心透析し、濃縮物を凍結乾燥して生成物をアモルファス固体として得た。
B4(286mg、0.031mmol)を炭酸水素ナトリウム水(3.0mL、200mM)に溶かした溶液に、NHS−dPEG12−SPDP(280mg、0.307mmol)をアセトニトリル(0.5mL)に溶かした溶液を加えた。反応混合物を30分間熟成させ、その後反応混合物をTEAA水溶液(1.0mL、2M)で処理し、RP−HPLC(95:5〜5:95% A:B直線グラジエント(A=100mM TEAA水溶液;B=100mM TEAAのアセトニトリル溶液)Waters Phenyl xbridge Columnにより精製した。B5を含む画分を、3K膜を通して水に対して3回遠心透析し、濃縮物を凍結乾燥して生成物をアモルファス固体として得た。Measured mass=10117
B6−seq32の調製
図6A〜図6Bに示すスキーム3を用いてコンジュゲートB6−P32およびB8−seq32(Ex.7〜8)を調製した。
B5(50mg、5umol、1当量)を、50mM AcOHを含む2,2,2−トリフルオロエタノール(5mL)に溶解させた。ペプチドSeq32(51mg、13umol、2.5当量)をグアニジン−HCl(8M、500uL)に溶解させ、50mM AcOHを含む2,2,2−トリフルオロエタノール(5mL)で希釈した。ペプチド溶液を撹拌RNA溶液に5分にわたり滴下して加え、反応を室温で1時間放置した。反応をホルムアミド(10mL)で希釈し、反応混合物の1.5mLのアリコートを、Dionex ProPac SAX−10 22×250mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を、20mL/分で10分かけて98%溶媒A(2:3 H2O:2,2,2−トリフルオロエタノール、40mM TEA)から35%溶媒B(2:3 H2O:2,2,2−トリフルオロエタノール、40mM TEA、1M グアニジン−HCl)までグラジエント溶出した。画分を水で希釈して2,2,2−トリフルオロエタノール含量を25%まで下げ、10k膜を通して水に対して3回遠心透析した。濃縮物を凍結乾燥して生成物をアモルファス固体として得た。Expected mass:13961.9,found mass:13962.0
ガイド鎖(B7、17.7mg)を水(5mL)に溶解させ、B6−seq42(36.2mg)を含むバイアルに加えた。溶液を十分に混合し、室温で2時間放置した。溶液を凍結乾燥して二本鎖をアモルファス固体として得た。
B8およびペプチド配列および二本鎖の追加のコンジュゲートをB8−seq32−bに使用したのと類似の方法で調製した。
B9およびB10−seq32およびB11−seq32の調製
図7A、図7Bおよび図7Cに示したようなスキーム4を用いてB9、B10−seq32およびB11−seq32を調製した。
化合物B3(120mg、0.0132mmol)を含む水(5mL)を、2,2’−ジピリジルジスルフィド(29mg、0.132mmol、10当量)をメタノール(5mL)に溶解させた撹拌溶液に滴下して加えた。溶液を水で希釈してメタノール含量を20%とし、3K膜を通して水に対して3回遠心透析した。濃縮物を凍結乾燥して生成物を白色アモルファス固体として得た。Expected mass:9166.5,found mass:9165.5
B9(15mg、1.615umol)を水(150uL)に溶解させ、50mM AcOHを含むTFE(1.5mL)で希釈した。別のバイアルに、P32(8.79mg、2.155umol)を8M グアニジンHCl(60uL)に溶解させ、50mM AcOHを含むTFE(1.5mL)で希釈し、次いでRNA溶液に加えた。反応混合物を15分間熟成させ、次いでホルムアミドで希釈し、AEX(95:5〜55:45 A:B直線グラジエント(A=20mM TEAを含む60%TFE水溶液;B=1M CsClおよび20mM TEAを含む60%TFE水溶液)、Dionix Propacカラムにより精製した。B10−Seq32を含む画分を、10K膜を通して水に対して3回遠心透析し、濃縮物を凍結乾燥して生成物をアモルファス固体として得た。
B10−seq32(9.68mg、0.730umol)を、B7(5.00mg、0.730umol)をPBS(500uL)に溶解させた溶液で処理し、30分間熟成させた。過剰のガイド鎖をAEX精製(95:5〜55:45 A:B直線グラジエント(A=20mM TEAを含む60%TFE水溶液;B=1M CsClおよび20mM TEAを含む60%TFE水溶液)、Dionix Propacカラムにより除去した。B11−seq32を含む画分を、10K膜を通して水に対して3回遠心透析し、濃縮物を凍結乾燥して生成物をアモルファス固体として得た。
B11−ペプチドコンジュゲートの追加合成。
B11およびペプチド配列および対応する二本鎖の追加のコンジュゲートを、B11−seq32−bに使用したのと類似の方法で調製した。
別々のバイアルに、B3(50mg、5.4μmol)を水(3mL、約17mg/mL)に溶解させ、化合物1,1,1’−(エタン−1,2−ジイル)ビス(1H−ピロール−2,5−ジオン)、(16mg、0.073mmol)をDMF(1.2mL)に溶解させた。B3溶液を化合物1溶液に加え、10分間撹拌した。反応を水で15mLに希釈し、次いで3K MWCO膜で水に対して4回透析した。次いで反応を濾過し(0.22μmシリンジフィルター)、凍結乾燥して白色固体、B12を得た。Expected mass:9397.535。Observed mass:9400.0。
B12−seq13。Expected mass:13518.215
B13−seq13−b。Expected mass:20370.215
B13およびペプチド配列の追加のコンジュゲートをB13−seq13に使用したのと類似の方法で調製した。
B15−seq32およびB16−seq32−bの調製
図7G−1〜図7G−2に示したスキーム6を用いてB16−seq32およびB17−seq32−bを調製した。
B3(100mg、10.9μmol)を水(10mL)およびジオキサン(20mL)に溶解させ、ジオキサン(3.8mL)に溶解させたビスマレイミドで処理して濁った混合物を得た。反応を1.5時間撹拌し、その後反応をN−メチルマレイミド(36.3mg、0.327mmol)でクエンチした。反応混合物を水で希釈し、3k膜を通して水に対して1回遠心透析した。濃縮物を濾過し、RP−HPLC(95:5〜5:95% A:B直線グラジエント(A=100mM TEAA水溶液;B=100mM TEAAのアセトニトリル溶液)Waters Phenyl xbridge Column)により精製した。生成物を含む画分を透析し、凍結乾燥してB14を白色アモルファス粉末として得た。Measured mass=9531
B14(5mg、0.524μmol)をホルムアミド溶液(2M チオ尿素、50mM MES緩衝液(pH6.5)、500μL)に溶解させた。別のバイアルに、ペプチド配列32(4.28mg、1.048μmol)をホルムアミド溶液(2M チオ尿素、50mM MES緩衝液(pH6.5)、500μL)に溶解させ、次いでRNA溶液に加えた。室温で1時間熟成後、反応混合物を、Dionex ProPac SAX−10 22×250mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を、20mL/分で10分かけて98%溶媒A(2:3 H2O:2,2,2−トリフルオロエタノール、40mM TEA)から35%溶媒B(2:3 H2O:2,2,2−トリフルオロエタノール、40mM TEA、1M グアニジン−HCl)までグラジエント溶出した。画分を水で希釈して2,2,2−トリフルオロエタノール含量を25%まで下げ、10k膜を通して水に対して3回遠心透析した。濃縮物を凍結乾燥して生成物をアモルファス固体として得た。
B15−seq32(2.11mg、0.155μmol)を、B7(1.062mg、0.155μmol)を水(212μL)に溶かした溶液で処理し、室温で2時間熟成させた。溶液を凍結乾燥して生成物をアモルファス固体として得た。
実施例17〜21
C1〜C3、C4−seq32およびC6−seq32の調製
図8A〜図8Dに示したようなスキーム7を用いてC1〜C3、C4−seq32およびC6−seq32を調製した。
1,2−ジアミノドデカン(100mg、0.499mmol)をクロロホルム(3.3mL)に溶解させ、0℃まで冷却し、次いでN−メトキシカルボニル−マレイミド(234mg、1.50mmol)および硫酸水素テトラブチルアンモニウム(170mg、0.499mmol)で処理した。DIPEA(209uL、1.20mmol)をゆっくりと加え、反応を0℃で10分間熟成させた。氷浴を除去し、反応を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(6.6mL)で処理した。室温で3.5時間熟成後、反応混合物を酢酸エチルで抽出した(3×15mL)。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いで溶媒を真空除去した。粗生成物を、100:0〜0:100% A:B直線グラジエント(A=ヘキサン;B=酢酸エチル)を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含む画分をプールし、濃縮してC1を白色微粉末として得た。1H NMR(CDCl3):1.24−1.28(m,12H),1.55−1.61(m,4H),3.50(t,4H J=7.4Hz),6.68(s,4H).Measured mass=361。
ステップ1。3’Hamino5’C6ジスルフィドsiRNA(46.9mg、6.16μmol)を9:1 DMSO/水(782μl)に溶解させた。TetraGalNAc(40.0mg、0.025mmol)およびDIEA(26.9μl、0.154mmol)をDMSO(200μl)に溶解させ、次いでHATU(14.0mg、0.037mmol)をDMSO(141μL)に溶かした溶液を加え、室温で15分間撹拌した。この溶液をRNA溶液に加え、30分間熟成させた。反応をDI水で希釈し、1回透析してDMSOを除去し、AEX(95:5〜65:35 A:B直線グラジエント(A=20mM TEAを含む60%TFE水溶液;B=1M CsClおよび20mM TEAを含む60%TFE水溶液)、Dionix Propacカラム)により精製した。生成物を含む画分をプールし、透析して凍結乾燥した。Measured mass=9233。
DI水(37mL)に溶解させたC2(60.1mg、6.60umol、B3と類似の方法で調製)を、DMF(7mL)に溶解させたC1(23.8mg、66.0umol)で処理して濁った溶液を得た。反応を一晩熟成させ、この時点でジオキサン(18mL)を加えて反応混合物を可溶化した。さらに30分間熟成後、反応をDI水で希釈した。次いでそれをDI水に対して1回透析して、濾過し、RP−HPLC(95:5〜5:95% A:B直線グラジエント(A=100mM TEAA水溶液;B=100mM TEAAのアセトニトリル溶液)Waters Phenyl xbridge Column)により精製した。生成物を含む画分を透析し、凍結乾燥してC3を白色アモルファス粉末として得た。Measured mass=9458。
C3(10mg、1.057umol)を20mM MES緩衝液および2M チオ尿素で変性させたホルムアミド(1mL)に溶解させ、P32(8.62mg、2.11umol)に加えた。20分後、LC−MSにより、所望の生成物への十分な変換が確認された。反応を、AEX(95:5〜55:45 A:B直線グラジエント(A=20mM TEAを含む60%TFE水溶液;B=1M CsClおよび20mM TEAを含む60%TFE水溶液)、Dionix Propacカラム)により精製した。生成物を含む画分を透析してC4−P32を得た。
DI水(3.40mL)に溶解させたC4(6.78mg、0.501μmol)を、DI水(530μL)に溶解させたガイド鎖C5(3.44mg、0.501μmol)で処理した。分析用SAXにより、過剰のガイド鎖が若干観察されたが、二本鎖の十分な純度が確認された。溶液を凍結乾燥してC6を白色アモルファス粉末として得た。Measured mass=パッセンジャー鎖:13539,ガイド鎖:6869。
C6およびペプチド配列の追加のコンジュゲートをC6−seq32−cに使用したのと類似の方法で調製した。
C7〜C10、C11−P32およびC12−seq32−aの調製
図9A〜図9Eに示したようなスキーム8を用いてC7〜C10、C11−seq32およびC12−seq32を調製した。
イコサン二酸(600mg、1.752mmol)をトルエン(11mL)に懸濁し、DIEA(673μL、3.85mmol)およびDPPA(793uL、3.68mmol)で処理した。室温で30分間撹拌後、反応を80℃まで加熱し、次いで2時間穏やかに還流させた。反応を冷却し、tBuOH(1.675mL、17.52mmol)およびヨウ化銅(200mg、1.051mmol)で処理し、再び加熱してさらに2時間還流させた。反応を冷却し(沈殿が観察された)、DCMで希釈し、濾過し、真空中で濃縮した。粗生成物を、100:0〜0:50% A:B直線グラジエント(A=ヘキサン;B=酢酸エチル)を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含む画分をプールし、濃縮してC7を得た。Measured mass=486。
C7(101mg、0.208mmol)をDCM(20mL)に溶解させ、TFA(20mL)で処理した。反応を5分間熟成させ、その後溶媒およびTFAを真空除去してC8を無色油状固体として得て、さらに精製することなく使用した。Measured mass=286。
C8(100.0mg、0.209mmol)をクロロホルム(28mL)に懸濁し、硫酸水素テトラブチルアンモニウム(70.9mg、0.209mmol)、N−メトキシカルボニルマレイミド(98.0mg、0.631mmol)およびDIEA(88.0μL、0.502mmol)で処理した。飽和炭酸水素ナトリウム(28mL)を加えた。反応を25時間激しく撹拌し、その後反応を3×50mL DCMで抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いで蒸発乾固した。粗生成物を、100:0〜0:50% A:B直線グラジエント(A=ヘキサン;B=酢酸エチル)を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。所望の生成物を含む画分を合わせ、蒸発させてC9を得た。1H NMR(CDCl3):1.24−1.26(m,28H),1.55−1.59(m,4H),3.50(t,4H J=7.4Hz),6.68(s,4H)。Measured mass =445。
C2(12.0mg、1.31μmol)を1:3 水:ジオキサン(14.4mL)に溶解させ、1.4mL ジオキサンに溶解させたC9(5.8mg、13.1μmol)で処理した。一晩熟成後、反応をN−メチルマレイミド(4.38mg、39.4μmol)でクエンチし、DI水で希釈した。粗反応をDI水に対して1回透析し、濾過し、RP−HPLC(95:5〜5:95% A:B直線グラジエント(A=100mM TEAA水溶液;B=100mM TEAAのアセトニトリル溶液)Waters Phenyl xbridge Column)により精製した。生成物を含む画分をDI水に対して透析し、凍結乾燥してC10を得た。Measured mass:9546。
コンジュゲートC11−seq32およびC12−seq32−cをC4−seq32およびC6−seq32に使用したのと類似の方法で調製した。
C12およびペプチド配列の追加のコンジュゲートをC12−seq32に使用したのと類似の方法で調製した。
実施例28〜30
C13、C14−seq32およびC15−seq32の調製
図10A〜図10Dに示したスキーム9を用いてC13、C14−seq32およびC15−seq32−aを調製した。
DI水(3.5mL)に溶解させたC2(11mg、1.22μmol)を、DMF(270μL)に溶解させたC2ビスマレイミド(2.69mg、12.20umol)で処理した。1時間後、LC−MSにより、所望の生成物への十分な変換が確認された。反応をDI水に対して3回透析し、凍結乾燥してC13を得た。Measured mass:9317。
C13(10.53mg、1.13μmol)をDI水(50μL)に溶解させ、50mM AcOH(2.0mL)で変性させたTFEで希釈し、次いで8M 塩酸グアニジン(60μL)に溶解させたseq32(9.22mg、2.26μmol)に加えた。反応を10分間熟成させた。反応を、AEX(95:5〜55:45 A:B直線グラジエント(A=20mM TEAを含む60%TFE水溶液;B=1M CsClおよび20mM TEAを含む60%TFE水溶液)、Dionix Propacカラム)により精製した。生成物を含む画分を透析してC14−seq32を得た。
DI水(2.6mL)に溶解させたC14−seq32(9.81mg、0.738μmol)を、DI水(751μL)に溶解させたガイド鎖C5(7.76mg、0.738μmol)で処理した。溶液を凍結乾燥して所望の生成物C15−seq32−cを得た。Measured mass=パッセンジャー鎖:13396,ガイド鎖:6868
C15およびペプチド配列の追加のコンジュゲートをC15−seq32に使用したのと類似の方法で調製した。
D1、D3およびD4の調製
図11A〜図11Dに示したようなスキーム10を用いてD1、D3およびD4を調製した。
NHSエステル(100.0mg、0.320mmol)を0.5mL 無水DCEに溶かした溶液に、アジドアミン(253.0mg、0.480mmol)を含む0.5mL 無水DCEおよび1.5当量のトリエチルアミンに加えた。得られた溶液を室温で1時間撹拌し、反応混合物をシリカカラムに充填し、25分かけてMeOH/DCM=0/100〜10/90で溶出した。集めた画分をLC−MS解析に供し、その結果により、>95%純度が確認された。
オリゴヌクレオチドD2(10mg、1.3μmol)およびアジドリンカーD1(5.6mg、7.8μmol)を、エッペンドルフチューブ中の脱気3:1 DMA/水(1000μL)に溶解させ、次いでこの反応混合物に、臭化銅(I)−ジメチルスルフィド(0.05mg、0.26μmol)を脱気MeCN(100μL)に溶かした溶液を加えた。40℃で60分後、D2が完全に消費されたことがLC−MSによりモニターされた。反応混合物を0.4M EDTA(5mL)で希釈し、さらに15分間撹拌し、次いでMillipore 3K膜を使用して水に対して透析し、RP HPLC(5%〜60%Aを含むB、A:100mM TEAAを含むMeCN、B:100mM TEAAを含む水)により精製した。生成物画分を水に対して透析し、凍結乾燥してD3を白色粉末として得た。
TetraGalNAc A10(5.7mg、3.5μmol)、HATU(2.0mg、5.2μmol)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(1.8mg、14μmol)をDMSO(100μL)に溶解させた。10分後、活性化エステルを、DMF(350μL)および水(50μL)中のオリゴヌクレオチドD3(6.4mg、0.70μmol)に加えた。得られた反応混合物を15分間撹拌し、水を加えてクエンチし、次いでRP HPLC(5%〜60%Aを含むB、A:100mM TEAAを含むMeCN、B:100mM TEAAを含む水)により精製した。生成物画分を水に対して透析し、凍結乾燥してR3をより白色の粉末として得た。
D5−seq32およびD7−seq32の調製
図12A−1〜図12B−2に示したようなスキーム11を用いてD5−seq32およびD7−seq32を調製した。
オリゴヌクレオチドD4(6.5mg、0.60μmol)を含む200μL ホルムアミド/pH=6.8 トリス緩衝液=3/1を、ペプチドseq32(9.8mg、2.4μmol)を含む200μLの同じ緩衝液で処理し、反応混合物を1時間撹拌した。反応を、ホルムアミド2.5mLを加えて希釈し、Sepax Proteomix SAX NP10、21.2×50mmカラム(8分かけて2%〜30%Bを含むA、A:60:40 トリフルオロエタノール:水、40mM トリエチルアミン、B:60:40 トリフルオロエタノール:水、40mM トリエチルアミン、1M グアニジン−HCl、20mL/分)を用いた強陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製して、D5−seq32を白色粉末として得た。
オリゴヌクレオチドD5−seq32(5.7mg、0.304μmol)および対応するアンチセンス鎖D6(2.0mg、0.29μmol)を、RNaseを含まない水中で1時間混合した。反応混合物を凍結乾燥し、生成物D7−seq32−dをインビボ評価に供した。
D7およびペプチド配列の追加のコンジュゲートをD7−seq32に使用したのと類似の方法で調製した。
実施例36〜42
スキーム12を図13A〜図13H−2に示す。
オリゴヌクレオチドE1(300mg、39μmol)およびPEG9アジドリンカー(58.5mg、78μmol)を、ガラスバイアル中で脱気3:1 DMA/水(10mL)に溶解させ、次いでこの反応混合物に、臭化銅(I)−ジメチルスルフィド(20.06mg、98μmol)を脱気DMSO(699μL)に溶かした溶液を加えた。45℃で40分後、E1が完全に消費されたことがLC−MSによりモニターされた。反応混合物を0.4M EDTA(20mL)で希釈し、さらに15分間撹拌し、次いでMillipore 3K膜を用いて水に対して透析し、凍結乾燥してE2を白色粉末として得た。
TetraGalNAc A10(237mg、145μmol)、HATU(55.2mg、145μmol)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(94mg、726μmol)をDMSO(700μL)に溶解させた。10分後、活性化エステルを、オリゴヌクレオチドE2(306mg、36μmol)を含むDMA(7.5mL)および水(2.5mL)に加えた。得られた反応混合物を15分間撹拌し、水を加えてクエンチし、次いでRP HPLC(5%〜60%Aを含むB、A:100mM TEAAを含むMeCN、B:100mM TEAAを含む水)により精製した。生成物画分を水に対して透析し、凍結乾燥してE3をより白色の粉末として得た。
E3(246mg、24μmol、1当量)を水(8000μL)に溶かした溶液に、TCEP−HCl(70mg、244μmol、10当量)を加えた。反応混合物をTCEP−HClが完全に溶解するまで混合した。この溶液を室温で2時間放置した。溶液を、3K膜を通して水に対して2回遠心透析して粗E4を得、これを次のステップに直接使用した。
E4(244mg、24μmol)を水(12mL)に溶かした溶液に、MeCN(0.5mL)に溶解させたN−(2−アミノエチル)マレイミドトリフルオロアセテート塩(62.2mg、0.245mmol、10当量)を加えた。この溶液を室温で1時間放置した。LCMSにより、完全な変換が確認された。溶液を、3K膜を通して水に対して2回遠心透析し、凍結乾燥してE5を白色粉末として得た。
E5(40mg、3.95μmol、1当量)を4:1 DMA/水(500μL)に溶解させた。DIPEA(10.2mg、79μmol、20当量)を上記の溶液に加えた。コレステロールクロロホルメート(18mg、40μmol、10当量)をTHF(500μL)に溶解させた。2つの溶液を混ぜ合わせ、反応混合物を室温で1時間放置した。LCMSにより、反応が終わったことが確認された。反応混合物を、RP HPLC(5%〜95%Bを含むA、A:100mM TEAAを含む水、B:100mM TEAAを含むMeCN)により精製した。生成物画分を水に対して透析し、凍結乾燥してE6をより白色の粉末として得た。
E6(24.5mg、2.3μmol、1当量)を水(1000μL)に溶かした溶液に、ピペリジンを含むDMF(200μL、20体積%、200当量)に加えた。反応混合物を室温で1時間放置した。LCMSにより、反応が終わったことが確認された。反応混合物を濾過し(0.2uM)、水に対して透析し、凍結乾燥してE7をより白色の粉末として得た。
E7(16mg、1.55μmol、1当量)を新たに調製した炭酸水素ナトリウム水(0.1M、400μL)に溶解させた。SPDP(4.85mg、0.016mmol、10当量)をアセトニトリル(400uL)に溶解させた。2つの溶液を混ぜ合わせ、反応混合物を室温で1時間放置した。反応混合物を、RP HPLC(5%〜95%Bを含むA、A:100mM TEAAを含む水、B:100mM TEAAを含むMeCN)により精製した。生成物画分を水に対して透析し、凍結乾燥してE8をより白色の粉末として得た。
E8−Seq137およびE9−Seq137の調製
スキーム13を図14A−1〜図14B−2に示す。
2M チオ尿素/20mM MESを含むホルムアミドpH6.5 100μLに溶かしたオリゴヌクレオチドE8(3.0mg、0.286μmol)を、100μLの同じ緩衝液に溶かしたペプチドseq137(2.33mg、0.572μmol)で処理し、反応混合物を室温で30分間放置した。反応を、ホルムアミド1mLを加えて希釈し、Propac SAX 22×250mmカラム(15分かけて5%〜45%Bを含むA、A:60:40 トリフルオロエタノール:水、20mM トリエチルアミン、B:60:40 トリフルオロエタノール:水、20mM トリエチルアミン、1M グアニジン−HCl、20mL/分)を用いた強陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製してE9−seq−137を白色粉末として得た。
パッセンジャー鎖E9−seq137(1.30mg、0.077μmol)および対応するガイド鎖B7(0.561mg、0.077μmol)を、RNaseを含まない水中で混合し、1分間90℃に加熱し、次いで室温で10分間放置した。二本鎖を凍結乾燥し、得られた生成物を白色アモルファス粉末として単離した。
E10およびペプチド配列の追加のコンジュゲートをE10−Seq137−eに使用したのと類似の方法で調製した。
実施例45〜49
スキーム14を図15A〜図15E−2に示す。
化合物A10(210mg、0.129mmol)を乾燥N−メチル−2−ピロリジノン(3ml)に溶解させた。HATU(48.9mg、0.129mmol)および乾燥ジイソプロピルエチルアミン(0.046ml、0.257mmol)を加え、混合物を、固体が完全に溶解するまで音波処理した。反応を室温で5分間放置した。別のバイアルに、化合物F1(500mg、0.0646mmol)を水(2ml)およびN−メチル−2−ピロリジノン(5ml)に溶解させた。A10溶液をF1溶液に加え、反応を室温で5分間放置した。反応混合物を、60℃まで加熱したAgilent PL−SAX 8um 50×150mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を、30分かけて100ml/分で100%溶媒A(4:1 H2O:エタノール、20mM 酢酸トリエチルアンモニウム pH7.0)から80%溶媒B(4:1 H2O:エタノール、20mM 酢酸トリエチルアンモニウム pH7.0、1M グアニジニウムヒドロクロリド)としてグラジエント溶出した。画分を集めて、水で希釈してエタノール含量を5%まで下げた。この溶液を50ml/分でWaters XBridge 5um 50×50mmカラムにポンプで充填し、生成物を100ml/分で5分間水で洗浄した。この脱塩物を、カラムを反転させ、2:3 H2O:アセトニトリルを50ml/分でカラムに流して溶出した。画分を凍結乾燥してF2をアモルファス固体として得た。Expected mass:9363.6,found mass:9363.5。
F2(500mg、0.0534mmol)およびアジド−peg9−アミン(253mg、0.481mmol)を2,2,2−トリフルオロエタノール(5ml)および水(5ml)に溶解させた。この溶液に窒素を1分間バブリングした。別のバイアルに、臭化銅(I)ジメチルスルフィド(43.9mg、0.214mmol)をアセトニトリル(2.5ml)に溶解させた。この溶液に窒素を1分間バブリングした。2つの溶液を混ぜ合わせ、反応混合物に窒素を1分間バブリングした。バイアルを密封し、室温で1時間放置した。反応混合物をEDTA溶液(0.5M、pH8.0、1mL)でクエンチし、Waters XBridge 5um 50×250mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を、100ml/分で30分かけて100%溶媒A(H2O、0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム pH7.0)から40%溶媒B(アセトニトリル)としてグラジエント溶出した。画分を集めて、水で希釈してアセトニトリル含量を5%まで下げた。この溶液を50ml/分でWaters XBridge 5um 50×50mmカラムにポンプで充填し、生成物を100ml/分で5分間水で洗浄した。この脱塩物を、カラムを反転させ、2:3 H2O:アセトニトリルを50ml/分でカラムに流して溶出した。画分を凍結乾燥してF3をアモルファス固体として得た。Expected mass:10943.5,found mass:10943.2。
F3(467mg、0.0427mmol)を炭酸水素ナトリウム溶液(0.1M、4.5mL)に溶解させた。NHS−SPDP(120mg、0.384mmol)をアセトニトリル(1mL)に溶解させた。これらの溶液を混ぜ合わせて、反応を室温で15分間放置した。反応混合物を、Waters XBridge 5um 50×250mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を、100ml/分で30分かけて100%溶媒A(H2O、0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム pH7.0)から40%溶媒B(アセトニトリル)としてグラジエント溶出した。画分を集めて、アセトニトリル含量を水で希釈して5%まで下げた。この溶液を50ml/分でWaters XBridge 5um 50×50mmカラムにポンプで充填し、生成物を100ml/分で5分間水で洗浄した。この脱塩物を、カラムを反転させ、2:3 H2O:アセトニトリルを50ml/分でカラムに流して溶出した。画分を凍結乾燥してF4をアモルファス固体として得た。Expected mass:11535.3,found mass:11535.1。
ペプチドSeq.612(8.75mg、0.00520mmol)を、20mM 酢酸を含むDMSO(1mL)に溶解させた。別のバイアルに、F4(10mg、0.000867mmol)を、20mM 酢酸を含むDMSO(1ml)に溶解させた。2つの溶液を混ぜ合わせ、室温で1時間放置した。反応をN−メチルマレイミド(5.78mg、0.0520mmol)でクエンチし、Agilent PL−SAX 10um 25×50mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を、30ml/分で20分かけて100%溶媒A(2:3 H2O:2,2,2−トリフルオロエタノール、20mM トリエチルアミン)から70%溶媒B(2:3 H2O:2,2,2−トリフルオロエタノール、20mM トリエチルアミン、0.5M グアニジニウムヒドロクロリド)としてグラジエント溶出した。画分を集めて、Waters XBridge 5um 19×250mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を、20ml/分で30分かけて85%溶媒A(H2O、0.1M 酢酸ヘキシルアンモニウム pH7.0)から65%溶媒B(テトラヒドロフラン)としてグラジエント溶出した。画分を集めて、真空下でテトラヒドロフラン含量を5%未満まで下げた。溶液を、10k膜を通して水に対して1回、0.1M 塩化ナトリウムを含む4:1 H2O:エタノールに対して再び1回、および水に対してさらに2回遠心透析した。濃縮物を凍結乾燥してF5−Seq463をアモルファス固体として得た。Expected mass:16247.8,found mass:16247.9。
スキーム15を図16A−1〜図16B−2に示す。
F5−Seq463(7.75mg、0.000477mmol)およびガイドB7(3.27mg、0.000477mmol)をH2O(0.5mL)に溶解させた。溶液を室温で1時間放置し、次いで凍結乾燥してF6 Seq463−fの二本鎖をアモルファス固体(11mg、定量的)として得た。パッセンジャー鎖のExpected mass:16247.8,found mass:16247.9。ガイド鎖のExpected mass:6852.5,found mass:6852.7。
F10およびペプチド配列の追加のコンジュゲートとその二本鎖とをF6−Seq463−fに使用したのと類似の方法で調製した。
実施例50〜53
スキーム16を図17A−1〜図17D−2に示す。
A10(210mg、0.129mmol)を乾燥N−メチル−2−ピロリジノン(3ml)に溶解させた。HATU(48.9mg、0.129mmol)および乾燥ジイソプロピルエチルアミン(0.046ml、0.257mmol)を加え、混合物を、固体が完全に溶解するまで音波処理した。反応を室温で5分間放置した。別のバイアルに、G1(500mg、0.0643mmol)を水(2ml)およびN−メチル−2−ピロリジノン(5ml)に溶解させた。A10溶液をG1溶液に加え、反応を室温で5分間放置した。反応混合物を、60℃まで加熱したAgilent PL−SAX 8um 50×150mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を、100ml/分で30分かけて100%溶媒A(4:1 H2O:エタノール、20mM 酢酸トリエチルアンモニウム pH7.0)から80%溶媒B(4:1 H2O:エタノール、20mM 酢酸トリエチルアンモニウム pH7.0、1M グアニジニウムヒドロクロリド)としてグラジエント溶出した。画分を集めて、水で希釈してエタノール含量を5%まで下げた。この溶液を50ml/分でWaters XBridge 5um 50×50mmカラムにポンプで充填し、生成物を100ml/分で5分間水で洗浄した。この脱塩物を、カラムを反転させ、2:3 H2O:アセトニトリルを50ml/分でカラムに流して溶出した。画分を凍結乾燥してG2をアモルファス固体として得た。Expected mass:9399.7,found mass:9399.5。
G2(483mg、0.0514mmol)およびアジド−peg9−アミン(324mg、0.617mmol)を2,2,2−トリフルオロエタノール(5ml)および水(5ml)に溶解させた。この溶液に窒素を1分間バブリングした。別のバイアルに、臭化銅(I)ジメチルスルフィド(50mg、0.244mmol)をアセトニトリル(2.5ml)に溶解させた。この溶液に窒素を1分間バブリングした。2つの溶液を混ぜ合わせ、反応混合物に窒素を1分間バブリングした。バイアルを密封し、室温で1時間放置した。反応混合物をEDTA溶液(0.5M、pH8.0、1mL)でクエンチし、Waters XBridge 5um 50×250mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を、100ml/分で30分かけて100%溶媒A(H2O、0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム pH7.0)から40%溶媒B(アセトニトリル)としてグラジエント溶出した。画分を集めて、アセトニトリル含量を水で希釈して5%まで下げた。この溶液を50ml/分でWaters XBridge 5um 50×50mmカラムにポンプで充填し、生成物を100ml/分で5分間水で洗浄した。この脱塩物を、カラムを反転させ、2:3 H2O:アセトニトリルを50ml/分でカラムに流して溶出した。画分を凍結乾燥してG3をアモルファス固体として得た。Expected mass:11506.2,found mass:11506.0。
G3(455mg、0.0396mmol)を炭酸水素ナトリウム溶液(0.1M、5mL)に溶解させた。NHS−SPDP(160mg、0.512mmol)をアセトニトリル(1.5mL)に溶解させた。これらの溶液を混ぜ合わせて、反応を室温で15分間放置した。反応混合物を、Waters XBridge 5um 50×250mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を、100ml/分で30分かけて100%溶媒A(H2O、0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム pH7.0)から40%溶媒B(アセトニトリル)としてグラジエント溶出した。画分を集めて、アセトニトリル含量を水で希釈して5%まで下げた。この溶液を50ml/分でWaters XBridge 5um 50×50mmカラムにポンプで充填し、生成物を100ml/分で5分間水で洗浄した。この脱塩物を、カラムを反転させ、2:3 H2O:アセトニトリルを50ml/分でカラムに流して溶出した。画分を凍結乾燥してG4をアモルファス固体として得た。Expected mass:12295.3,found mass:12295.1。
ペプチドSeq.Id489(CIFGAIAGFIKNIWEGLI すべて(D))(13.6mg、0.00694mmol)を、20mM 酢酸を含むDMSO(1mL)に溶解させた。別のバイアルに、G4(10mg、0.000867mmol)を、20mM 酢酸を含むDMSO(1ml)に溶解させた。2つの溶液を混ぜ合わせ、室温で1時間放置した。反応をN−メチルマレイミド(7.71mg、0.0694mmol)でクエンチし、Agilent PL−SAX 10um 25×50mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を、30ml/分で20分かけて100%溶媒A(2:3 H2O:2,2,2−トリフルオロエタノール、20mM トリエチルアミン)から70%溶媒B(2:3 H2O:2,2,2−トリフルオロエタノール、20mM トリエチルアミン、0.5M グアニジニウムヒドロクロリド)としてグラジエント溶出した。画分を集めて、Waters XBridge 5um 19×250mmカラムを装着したHPLCに充填した。生成物を、20ml/分で30分かけて85%溶媒A(H2O、0.1M 酢酸ヘキシルアンモニウム pH7.0)から65%溶媒B(テトラヒドロフラン)としてグラジエント溶出した。画分を集めて、真空下でテトラヒドロフラン含量を5%未満まで下げた。溶液を、10k膜を通して水に対して1回、0.1M 塩化ナトリウムを含む4:1 H2O:エタノールに対して再び1回、および水に対してさらに2回遠心透析した。濃縮物を凍結乾燥してG5−Seq489をアモルファス固体として得た。Expected mass:19708.1,found mass:19708.0。
スキーム17を図18A−1〜図18B−2に示す。
G5−Seq489(8.5mg、0.000434mmol)およびB7(2.98mg、0.000434mmol)をH2O(0.5mL)に溶解させた。溶液を室温で1時間放置し、次いで凍結乾燥して二本鎖G6−Seq489−gをアモルファス固体として得た。パッセンジャー鎖のExpected mass:19708.1,found mass:19708.3。ガイド鎖のExpected mass:6852.5,found mass:6852.6。
G6およびペプチド配列の追加のコンジュゲートとその二本鎖とをG6−Seq489−gに使用したのと類似の方法で調製した。
実施例55〜58
下記スキーム18を用いてH1〜H5を調製した。
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した500mL 丸底フラスコに、ジ−tert−ブチル1−(tert−ブチルチオ)ヒドラジン−1,2−ジカルボキシレート(15g、46.8mmol、2.00当量)をN,N−ジメチルホルムアミド(30mL)に溶かした溶液を入れた。この丸底フラスコに、2−アミノエタンチオールヒドロクロリド(2.66g、23.4mmol、1当量)をN,N−ジメチルホルムアミド(80ml)に溶かした溶液をゆっくりと加えた。これに、続いてトリエチルアミン(2.36g、23.4mmol、1当量)を加えた。室温で一晩撹拌後、白色固体が沈殿していた。乾燥N,N−ジメチルホルムアミド(100ml)を加えて透明に近い溶液を得た。白色固体が再び沈殿するまでトリエチルアミンを加えた。反応混合物を室温で8時間撹拌した。溶液を濾過し、減圧下で蒸発させた。残渣にジエチルエーテル(200ml)を加え、濾過した。白色固体を集めて、乾燥機で乾燥させた。その後、この白色固体をジエチルエーテルに5回溶解させ(5×10ml)、数分間撹拌し、濾過した。所望の生成物を白色固体として得た。1HNMR(CDCl3,500MHz,ppm):1.36(s,9H),3.07(t,2H),3.4(t,2H),8.3(s,2H)。
リトコール酸(H2)(7gm、18.59mmol、1当量)を乾燥ジコロルメタン(200ml)に溶解させ、次いで0℃まで冷却した。この後、この溶液にN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド(4.6g、22.31mmol、1.2当量)を加えた。0℃で30分間撹拌後、ペンタフルオロフェノール(3.76gm、20.45mmol、1.1当量)を含むジクロロメタン(13ml)を加えた。次いでアルゴン下、室温でさらに20時間撹拌を続けた。沈殿したN,N−ジシクロヘキシル尿素を濾別し、冷ジクロロメタンで洗浄した。次いで合わせた濾液を減圧下で蒸発させた。次いで得られた油状残渣をジクロロメタン(50ml)で希釈し、飽和NaCl水溶液(60ml)および水(80ml)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固した。乾燥させた化合物をカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2/CH3OH、100/0〜97/3で溶出)を用いて精製した。MS(m/z);566[M+Na]+
化合物H3(4.5gm、8.29mmol、1当量)を乾燥ジクロロメタン(15ml)に溶解させ、次いで0℃まで冷却した。得られた溶液に、2−(tert−ブチルジスルファニル)エタンアミン(H1)(2.057gm、12.44mmol、1.5当量)およびトリエチルアミン(2.56gm、2.52mmol、3当量)をジクロロメタン(7ml)に溶かした冷混合物を加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌した。TLCにより生成物の形成が確認された。反応混合物を飽和NaCl水溶液(20ml×2)および水(20ml×2)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、真空乾燥させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2/CH3OH、100/0〜95/5で溶出)により精製して純粋な化合物H4を得た。MS(m/z);524.35,[M+1]+
H4(3gm、5.73mmol、1当量)を乾燥ジクロロメタン(15ml)に溶解させ、トリエチルアミンを加えた(0.869g、8.59mmol、1.5当量)。反応混合物を0℃まで冷却した。2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノクロロホスフィット(2.71gm、11.45mmol、2当量)を含む乾燥ジクロロメタン(10ml)を反応混合物に滴下して加えた。得られた溶液を1時間撹拌した。TLCにより生成物の形成が確認された。反応混合物を蒸発させ、シリカゲルカラム(ヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン、100/0/1.5〜60/40/1.5で溶出)で精製しした。MS(m/z);724.46[M+1]+ 31P NMR(CDCl3,500MHz,ppm);146.5
図19A〜図19I−2に示したようなスキーム19を用いてEx.59〜Ex.66を調製した。
反応手順に関するB2の合成を参照されたい。Expected mass:9609.071,found mass:9605。
H6(15mg、1.56umol、1当量)を水(1400ul)に溶かした溶液に、TCEP−HCl(26.8mg、0.094mmol、60当量)を加えた。反応混合物をTCEP−HClが完全に溶解するまで混合した。溶液を室温で一晩放置した。溶液を、3K膜を通して水に対して2回遠心透析した。Expected mass:9520,found mass:9517。
反応手順に関するB9の合成を参照されたい。Expected mass:9630,found mass:9627。
反応手順に関するB10−seq32の合成を参照されたい。Expected mass:13597,found mass:13598。
反応手順に関するB11−seq32の合成を参照されたい。
反応手順に関するC13の合成を参照されたい。Expected mass:9741。
反応手順に関するC14の合成を参照されたい。Expected mass:13819,found mass:13820。
反応手順に関するC15−Seq32の合成を参照されたい。
H7およびH10とペプチド配列との追加のコンジュゲート、ならびにその二本鎖をH7−Seq32−hおよびH10−Seq32−hに使用したのと類似の方法で調製した。
実施例67〜73
スキーム20を図20A−1〜図20E−2に示す。
I1(160mg、0.209mmol)およびI2(48.8mg、0.219mmol)をDMA(1mL)に溶解させ、N−メチルモルホリン(46μL、0.417mmol)で処理した。反応を室温で6時間撹拌し、次いでRP−HPLC(95:5〜20:80% A:B直線グラジエント(A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAを含むアセトニトリル)Waters C18 xbridge Column 19×250mm)により精製した。I3を含む画分を2:1 DCM:MeOHで抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して生成物を得た。Measured mass=814.3
I3(88mg、0.108mmol)をDMA(1mL)に溶解させ、ピペリジン(200μL、2.02mmol)で処理し、10℃で10分間撹拌した。TFA(156μL、2.02mmol)を加えて反応をクエンチした。反応混合物を、RP−HPLC(95:5〜60:40% A:B直線グラジエント(A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAを含むアセトニトリル)Waters C18 xbridge Column 30×250mm)により精製した。I4を含む画分を凍結乾燥して生成物を得た。Measured mass=592.3。
I4(912mg、1.324mmol)をDMSO(7.7mL)に溶解させ、L1(1.0g、1.40mmol)およびDIEA(463μL、2.65mmol)で処理した。反応混合物を15分間撹拌し、RP−HPLC(100:0〜0:100% A:B直線グラジエント(A=0.1%TFA水溶液;B=0.1%TFAを含むアセトニトリル)Waters C18 xbridgeカラムにより精製した。I5を含む画分を凍結乾燥して生成物を得た。Measured mass=609.5[M+2]
I6(500mg、0.065mmol)およびI5(236mg、0.194mmol)をpH5.5 MES緩衝液(51.6ml、500mM)およびアセトニトリル(12.91ml)に溶解させた。溶液を窒素で10分間脱気し、その後、これをCuBr.SMe2(133mg、0.646mmol)で処理し、窒素でさらに5分間脱気した。反応混合物を音波処理し、30分間撹拌し、次いでRP−HPLC(95:5〜5:95% A:B直線グラジエント(A=100mM TEAA水溶液;B=100mM TEAAのアセトニトリル溶液)Waters Phenyl xbridge Column)により精製した。生成物を含む画分を、3K膜を通して0.32M EDTA pH6.5に対して2回、次いで水に対して3回透析した。次いで濃縮物を200mM TEAAに対して2回、次いで水に対して3回透析した。濃縮物を凍結乾燥して生成物を白色アモルファス固体として得た。Measured mass=11400
I7(287mg、0.025mmol)を水(100uL)に懸濁し、NMP(2.0mL)で希釈し、静置すると均一溶液が得られた。HATU(13mg、0.035mmol)をNMP(200uL)に溶解させ、A10(62mg、0.038mmol)に加えた。反応混合物をNMP(200uL)で希釈し、次いでDIEA(13uL、0.076mmol)で処理した。次いでHATU反応混合物を一度にRNA溶液に加え、10分間熟成させた。反応をDI水で希釈し、RP−HPLC(95:5〜5:95% A:B直線グラジエント(A=100mM TEAA水溶液;B=100mM TEAAのアセトニトリル溶液)Waters Phenyl xbridge Column)により精製した。I8を含む画分を、3K膜を通して水に対して3回透析した。濃縮物を凍結乾燥して生成物を白色アモルファス固体として得た。Measured mass=13027。
I8(20mg、1.537μmol)を、50mM AcOH(2mL)で変性させたTFEに溶解させた。別のバイアルに、Seq ID1681(8.63mg、6.15umol)を8M Gn.HCl(400uL)に懸濁し、50mM AcOHを含むTFE(2mL)で希釈すると少し濁った懸濁液が形成され、次いでRNA溶液に加えた。10分後、さらにSeq ID1681(8.63mg、1.54umol)を加え、反応を30分熟成させ、その後AEXにより、所望の生成物にほぼ完全に変換されたことが確認された。反応をN−メチルマレイミド(6.83mg、61.5μmol)でクエンチし、AEX(0〜40% 1M Gn.HClを含む1:1 水:TFE(40mM TEAA pH7.5を含む)、60℃まで加熱したProteomix NP10 カラム)により精製した。材料を、200mM HAA pH7.5:ACNの70:30〜25:75のグラジエントおよびAgilent PLRP−Sカラムを用いて再精製した。純粋な画分をプールし、透析し、凍結乾燥してI9−Seq1681(6.37mg、0.302μmol、19.65%の収率)を得た。
I9−seq1681(3.02mg、0.143μmol)を水(950μl)に溶解させ、B7(0.980mg、0.143μmol)を水(144μl)に溶かした溶液で処理した。反応混合物を15分間熟成させ、次いで凍結乾燥して生成物を白色アモルファス固体として得た。Measured mass=21107。
I10およびペプチド配列の追加のコンジュゲートとその二本鎖とをI10−seq−1681−fに使用したのと類似の方法で調製した。
実施例74〜82
スキーム21を図21A〜図21H−2に示す。
撹拌子を備えた試験管内で、A10(100mg、0.061mmol)をDMSO(611μl)に溶解させ、続いてヒューニッヒ塩基(133μl、0.764mmol)およびHATU(76mg、0.199mmol)を加えた。20分後、400μLのDMSOに溶解させたN−(2−アミノエチル)マレイミドトリフルオロアセテート塩(12.85mg、0.092mmol)を加えた。20分後、反応が終了したことを確認し、黄色がほとんど消失するまで水(1.5mL)でクエンチした。反応を、逆相クロマトグラフィー(Gilson 2020、溶媒A)0.1%TFAを含む水/溶媒B)0.1%TFAを含むACN、15分間の0〜50%グラジエント、40mL/分、XBridge Prep C18 5μm OBD 30×250mm)により精製した。得られた画分を凍結乾燥して白色固体、A10Bを得た。[M+1,expected]=1757.807,[M+1,observed]=1759.0。
反応手順に関するB3の合成を参照されたい。J2[M+1,expected]=7604.750,[M+1,observed]=7600.0。
A10B(10.26mg、5.84μmol)を水(700μL)に溶解させ、J2(29.6mg、3.89μmol)の1.8mL溶液(水1:酢酸塩緩衝液1:ホルムアミド2)に加えた。反応を室温で20分間振盪し、次いで終了を確認した。反応混合物を、強陰イオン交換クロマトグラフィー(Gilson PLC 2020、Sepax Proteomix SAX NP10 21.2×50mm、緩衝液A:3:2 トリフルオロエタノール:水、40mM トリエチルアミン/緩衝液B:3:2 トリフルオロエタノール:水、40mM トリエチルアミン、1000mM グアニジン−HCl、1%Bを3分間保持、次いで12分かけて5%B〜45%B)を用いて精製した。画分を、3K膜を通して水に対して3回透析して白色固体、J3を得た。[M+1,expected]=9362.556,[M+1,observed]=9359.0。
エッペンドルフバイアル中で、J3(6.34mg、0.678μmol)を水(250μL)に溶解させた。別のエッペンドルフバイアル中で、N−スクシニミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)(0.831mg、2.035μmol)をDMSO(50μL)に溶解させた。SPDP溶液をRNA溶液に加えた。4時間後、反応を、50μL DMSOに溶解させた別のSPDP(2.77mg、6.78μmol)に再び仕込んだ。24時間後、反応を、50μL DMSOに溶解させた別のSPDP(2.77mg、6.78μmol)に再び仕込んだ。72時間後、390μLのpH8.1 炭酸水素ナトリウムを加えて反応を3mg/mLに希釈した。2時間後、別の3当量のSPDPを含む50μL DMSOを加えた。反応混合物を、3K膜を通して水に対して3回透析し、凍結乾燥して白色固体、J4を得た。[M+1,expected]=9543.834,[M+1,observed]=9554.0。
反応手順に関するB10−Seq32の合成を参照されたい。J5−Seq26−Mass observed:11413。
反応手順に関するB11−Seq32−bの合成を参照されたい。J6−Seq26−i−Mass observed:18265。
エッペンドルフバイアル中で、J3(5.8mg、0.621μmol)を水(250μL)に溶解させた。別のエッペンドルフバイアル中で、スクシニミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)(0.727mg、1.862μmolをDMSO(50μL)に溶解させ、1滴のTFAを加えてpHをpH5に調整した。SMCC溶液をRNA溶液に加えた。数時間後、0.1N NaOHを徐々に加えてpHをpH7に調節した。18時間後、6当量のSMCCを50μL DMSOに溶解させ、反応混合物に加えた。4時間後、別の3当量のSMCCを含む50μL DMSOを反応に加えた。数時間後、300μLのpH8.1 炭酸水素ナトリウム溶液を反応に加えた。反応を、3K膜を通して水に対して3回透析し、凍結乾燥して白色固体、J7を得た。[M+1,expected]=9543.834,[M+1,observed]=9554.0。
反応手順に関するB10−Seq32の合成を参照されたい。J8−Seq26−Mass observed:11545。
反応手順に関するB11−Seq32の合成を参照されたい。J9−Seq26−I−Mass expected:18397。
J6およびJ9とペプチド配列との追加のコンジュゲートならびにその二本鎖をJ6−Seq26、J9−Seq26およびJ6−Seq26−i、J9−Seq26−iに使用したのと類似の方法で調製した。
実施例83〜87
スキーム22を図22A−1〜図22D−2に示す。
20mL バイアル中で、3−(トリチルチオ)プロパン酸(158mg、0.454mmol)をDMF(1.514mL)に溶解させ、続いてHATU(184mg、0.484mmol)およびヒューニッヒ塩基(0.158mL、0.908mmol)を加えた。反応液の色は淡黄色になった。5分後、K1(100mg、0.151mmol)を固体として加えると、反応液の色は透明なオレンジ色になった。反応を室温で15分間撹拌し、次いで終了を確認した。
エッペンドルフバイアル中で、K2(10.07mg、0.011mmol)をホルムアミド(0.5mL)に溶解させた。15mL ファルコンチューブ中で、ペプチドSeq ID74(57.92mg、0.034mmol)をホルムアミド(1mL)に溶解させた。ペプチド/ホルムアミド溶液をリンカー/ホルムアミド溶液に加え、室温で20分間撹拌した。
40mL バイアル中で、TFA(1000μL)、水(96μL)およびトリイソプロピルシラン(96μL)を体積で0.83:0.08:0.08に混合した溶液を組み合わせて、20mL バイアル中のK3(47mg、0.011mmol)に加え、これを室温で10分間撹拌した。さらに500μLのTFAを加え、反応をさらに10分間撹拌した。反応の終了を確認し、減圧下で濃縮し、3.5mLの2M チオ尿素 pH6.5を含むFMDおよびMESで希釈し、逆相クロマトグラフィー(Gilson 2020、0.1%TFAモディファイヤーを含む5〜80%ACN/水、流速:20mL/分、グラジエント時間:20分、カラム:XBridge prep OBD 5μm C18 19×250nm)により精製した。得られた画分を凍結乾燥して白色固体、K4を得た。[M+3,expected]=1334.34,[M+3,observed]=1334.4
反応手順に関するB10−Seq32の合成を参照されたい。K5−Seq74−Expected mass:13178.103。
反応手順に関するB10−Seq32の合成を参照されたい。Observed massパッセンジャー=15907;Obsserved mass ガイド=8744;二本鎖=24651。
K5およびペプチド配列の追加のコンジュゲートならびに対応する二本鎖をK5−Seq74およびK6−Seq74−bに使用したのと類似の方法で調製した。
実施例88〜94
スキーム23を下記および図23A〜図23C−2に示す。
(9H−フルオレン−9−イル)メチル((S)−3−メチル−1−(((S)−1−((4−((((4−ニトロフェノキシ)カルボニル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)−1−オキソ−5−ウレイドペンタン−2−イル)アミノ)−1−オキソブタン−2−イル)カルバメートL1(500mg、0.652mmol)、2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エタンアミンヒドロクロリド(153mg、0.685mmol)、およびN−メチルモルホリン(0.143mL、1.30mmol)をN,N−ジメチルアセトアミド(3mL)に溶解させた。反応混合物を室温で16時間熟成させ、40mL/分で20分かけての、0.1%TFAを含む5〜80%ACN/水のグラジエントによりWaters Xbridge C18 カラム(5uM、30×250mm)を用いた逆相クロマトグラフィーによって精製した。生成物を凍結乾燥してL3を固体として得た。MS(m/z):814(M+1)。
(9H−フルオレン−9−イル)メチル((S)−3−メチル−1−オキソ−1−(((S)−1−オキソ−1−((4−((((2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エチル)カルバモイル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)−5−ウレイドペンタン−2−イル)アミノ)ブタン−2−イル)カルバメートL3(343mg、0.421mmol)およびピペリジン(200uL、2.02mmol)をN,N−ジメチルアセトアミド(3mL)に溶解させた。反応混合物を室温で10分間熟成させ、トリフルオロ酢酸(156uL、2.02mmol)でクエンチし、40mL/分で20分かけての、0.1%トリフルオロ酢酸を含む5〜40%アセトニトリル/水のグラジエントによりWaters Xbridge C18 カラム(5uM、30×250mm)を用いた逆相クロマトグラフィーによって精製した。生成物を凍結乾燥してL4を固体として得た。MS(m/z):592(M+1)。
4−((S)−2−((S)−2−アミノ−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジル(2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エチル)カルバメートL4(238mg、0.346mmol)をジメチルスルホキシド(1.5mL)に溶かした溶液に、ビス(2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オクタンジオアートL5(509mg、1.382mmol)およびトリエチルアミン(0.096mL、0.691mmol)の溶液を加えた。反応混合物を15分間熟成させ、60mL/分で30分かけての1〜10%メタノール/ジクロロメタンのグラジエントによりシリカゲルカラム(80g)で精製してL6を固体として得た。MS(m/z):845(M+1)
RNA化合物L7(163mg、0.024mmol)および2−アジドエタンアミンヒドロクロリド(30mg、0.245mmol)をN,N−ジメチルアセトアミド:水(2mL)のアルゴン脱気した3:1混合物に溶解させた。臭化銅(I)ジメチルスルフィド錯体(12mg、0.059mmol)のアルゴン脱気した溶液を加え、混合物を45℃で16時間熟成させた。混合物をEDTA(3mL)の0.5M溶液でクエンチし、15分放置した。生成物を水に対して(3回)回転透析して単離し、続いて凍結乾燥して固体を得た。MS(m/z):7086。
RNA化合物L8(46mg、6.49μmol)およびN−メチルモルホリン(7.1mL、65μmol)を10℃で水(250μL)およびDMSO(250μL)に溶解させた。この混合物に、2,5−ジオキソピロリジン−1−イル8−(((S)−3−メチル−1−オキソ−1−(((S)−1−オキソ−1−((4−((((2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エチル)カルバモイル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)−5−ウレイドペンタン−2−イル)アミノ)ブタン−2−イル)アミノ)−8−オキソオクタノアートL6(18mg、21μmol)をDMSO(500μL)に溶解させた溶液を加えた。反応混合物を16時間熟成させ、水(1.5mL)で希釈し、20mL/分で15分かけての、100mM 酢酸トリエチルアンモニウムを含む0〜55%アセトニトリル/水のグラジエントによりWaters Xbridgeフェニルカラム(5μM、19×250mm)を用いたイオン対クロマトグラフィーによって精製した。生成物を水に対して(3回)回転透析して単離し、続いて凍結乾燥して固体を得た。MS(m/z):8547。
RNA化合物L9(11mg、1.29μmol)を、50mM 酢酸を含むトリフルオロエタノール(500μL)に溶解させた。この溶液に、50mM 酢酸を含むトリフルオロエタノール(1000μL)に溶解させたペプチドSeq463(8.66mg、5.15μmol)を加えた。混合物を10分間熟成させ、N−メチルマレイミド(1.9mg、44μmol)でクエンチし、20mL/分で15分かけての、100mM 酢酸トリエチルアンモニウムを含む5〜95%アセトニトリル/水のグラジエントによりWaters Xbridgeフェニルカラム(10μM、19×250mm)を用いたイオン対クロマトグラフィーによって精製した。生成物を水に対して(3回)回転透析して単離し、続いて凍結乾燥して固体を得た。MS(m/z):11687。
L10−Seq463(2.46mg、0.27μmol)をDI水(300μL)に溶解させた溶液を、B2(3.1mg、0.27μmol)に加え、90℃で1分間加熱した。溶液を凍結乾燥して二本鎖を白色固体として得た。MS(m/z)パッセンジャー鎖:9267,ガイド鎖:11686。
ペプチド配列の追加のL10コンジュゲートおよび対応する二本鎖L11を上記に詳述したのと類似の方法で調製した。
実施例95〜98
スキーム24を図24A−1〜図24B−2に示す。
3−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロパン酸(506mg、2.35mmol)、2−アジドエタンアミンヒドロクロリド(317mg、2.59mmol)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(496mg、2.59mmol)、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール(199mg、1.46mmol)、およびn−メチルモルホリン(0.44mL、4.7mmol)をジクロロメタン(25mL)に溶解させた。混合物を1時間熟成させ、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(25mL)で希釈し、有機層を分離した。その後ジクロロメタンで水相を抽出し(2×25mL)、合わせた有機物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、固体濾別し、真空中で濃縮した。混合物を、30mL/分で15分かけての、0〜50%酢酸エチル/ジクロロメタンのグラジエントによりシリカゲルカラム(80g)を用いて精製してM1の透明な油を得た。MS(m/z):284。
RNA化合物L7(180mg、26μmol)およびM1(59mg、208μmol)を100mMのpH5.5 MES緩衝液(3.6mL)およびアセトニトリル(0.9mL)に溶解させた。この混合物をアルゴンで15分間脱気した。この溶液に、臭化銅(I)ジメチルスルフィド錯体(13mg、65μmol)をアセトニトリル(0.45mL)に溶解させた脱気した溶液に加え、室温で28時間熟成させた。混合物を、EDTA(5mL)の100mMのpH8溶液でクエンチし、15分間放置した。混合物を、30mL/分で15分かけての、100mM 酢酸トリエチルアンモニウムを含む0〜30%アセトニトリル/水のグラジエントによりWaters Xbridgeフェニルカラム(5μM、30×150mm)を用いたイオン対クロマトグラフィーによって精製した。生成物を水に対して(3回)回転透析して単離し、続いて凍結乾燥してM2の固体を得た。MS(m/z):7481。
RNA化合物M2(27.3mg、3.65μmol)を、50mM 酢酸を含むトリフルオロエタノール(1300μL)に溶解させた。この溶液に、50mM 酢酸を含むトリフルオロエタノール(1300μL)に溶解させたペプチドSeq463(15.4mg、9.13μmol)を加えた。混合物を10分間熟成させ、N−メチルマレイミド(10.1mg、91μmol)でクエンチし、20mL/分で15分かけての、100mM 酢酸トリエチルアンモニウムを含む5〜80%アセトニトリル/水のグラジエントによりWaters Xbridgeフェニルカラム(10μM、19×250mm)を用いたイオン対クロマトグラフィーによって精製した。生成物を水に対して(3回)回転透析して単離し、続いて凍結乾燥してM3−Seq463の固体を得た。MS(m/z):10624。
B2(2.18mg、0.24μmol)をDI水(290μL)に溶解させた溶液をM3−Seq463(2.5mg、0.24μmol)に加え、90℃で1分間加熱した。この溶液を凍結乾燥して二本鎖M4−Seq463−jを白色固体として得た。MS(m/z)パッセンジャー鎖:9267,ガイド鎖:10621
ペプチド配列の追加のM3コンジュゲートおよび対応する二本鎖M4を上記に詳述したのと類似の方法で調製した。
実施例99〜100
スキーム25を図25A〜図25B−2に示す。
RNA化合物N2(11mg、1.54μmol;ジ−click基質に関するセクションMに詳述するように調製)を、50mM 酢酸を含むトリフルオロエタノール(1300μL)に溶解させた。この溶液に、50mM 酢酸を含むトリフルオロエタノール(1300μL)に溶解させたペプチドseq283(3.57mg、2.31μmol)を加えた。混合物を10分間熟成させ、20mL/分で15分かけての、100mM 酢酸トリエチルアンモニウムを含む5〜80%アセトニトリル/水のグラジエントによりWaters Xbridgeフェニルカラム(10μM、19×250mm)を用いたイオン対クロマトグラフィーによって精製した。生成物を水に対して(3回)回転透析して単離し、続いて凍結乾燥して固体を得た。MS(m/z):8600。
B2(5.65mg、0.609μmol)をDI水(423μL)に溶解させた溶液を、N3−Seq283(5.24mg、0.609μmol)に加え、90℃で1分間加熱した。溶液を凍結乾燥して二本鎖を白色固体として得た。MS(m/z)パッセンジャー鎖:9268,ガイド鎖:8601。
ペプチド配列の追加のN3コンジュゲートおよび対応する二本鎖N4を上記に詳述したのと類似の方法で調製した。
実施例101〜103
スキーム26を図26A−1〜図26B−2に示す。
RNA化合物O1(20.7mg、2.97μmol;L8と類似方法で調製)を100mM NaHCO3(400μL)およびDMSO(300μL)に溶解させた。この混合物に、2,5−ジオキソピロリジン−1−イル8−(((S)−3−メチル−1−オキソ−1−(((S)−1−オキソ−1−((4−((((2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エチル)カルバモイル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)−5−ウレイドペンタン−2−イル)アミノ)ブタン−2−イル)アミノ)−8−オキソオクタノアートL6(6.28mg、7.43μmol)をDMSO(250μL)に溶解させた溶液を加えた。反応混合物を1.5時間熟成させ、水(1.5mL)で希釈し、20mL/分で15分かけての、100mM 酢酸トリエチルアンモニウムを含む0〜60%アセトニトリル/水のグラジエントによりWaters Xbridgeフェニルカラム(5μM、19×250mm)を用いたイオン対クロマトグラフィーによって精製した。生成物を水に対して(3回)回転透析して単離し、続いて凍結乾燥して固体を得た。MS(m/z):7696。
RNA化合物O2(10mg、1.30μmol)を、50mM 酢酸を含むトリフルオロエタノール(1000μL)に溶解させた。この溶液に、50mM 酢酸を含むトリフルオロエタノール(500μL)に溶解させたペプチドSeq463(3.28mg、1.95μmol)を加えた。混合物を1時間熟成させ、20mL/分で15分かけての、100mM 酢酸トリエチルアンモニウムを含む5〜90%アセトニトリル/水のグラジエントによりWaters Xbridgeフェニルカラム(5μM、19×250mm)を用いたイオン対クロマトグラフィーによって精製した。生成物を水に対して(3回)回転透析して単離し、続いて凍結乾燥して固体を得た。MS(m/z):9268。
O2−Seq463(3.02mg、0.326μmol)をDI水(303μL)に溶解させた溶液をB2(3.02mg、0.326μmol)に加え、90℃で1分間加熱した。溶液を凍結乾燥して二本鎖を白色固体として得た。MS(m/z)パッセンジャー鎖:9267,ガイド鎖:9264。
ペプチド配列の追加のO2コンジュゲートおよび対応する二本鎖O3を上記に詳述したのと類似の方法で調製した。
実施例104〜106
スキーム27を図27A−1〜図27B−2に示す。
RNA化合物N2(67.2mg、9.39μmol)およびジイソプロピルエチルアミン(13.1μL、75μmol)を、水(750μL)、N,N−ジメチルアセトアミド(750μL)およびテトラヒドロフラン(1200μL)に溶解させた。この混合物に、チオコレステロール(30.2mg、75μmol)をテトラヒドロフラン(300μL)に溶解させた溶液を加えた。混合物を30分間熟成させ、2M 酢酸トリエチルアンモニウム(100μL)で希釈し、20mL/分で15分かけての、100mM 酢酸トリエチルアンモニウムを含む5〜95%アセトニトリル/水のグラジエントによりWaters Xbridgeフェニルカラム(10μM、19×250mm)を用いたイオン対クロマトグラフィーによって精製した。生成物を水に対して(3回)回転透析して単離し、続いて凍結乾燥して固体を得た。MS(m/z):7451。
P1(1.0mg、0.134μmol)をDI水(200μL)に溶解させた溶液をB10−Seq32(1.86mg、0.129μmol)に加え、90℃で1分間加熱した。溶液を凍結乾燥して二本鎖を白色固体として得た。MS(m/z)パッセンジャー鎖:13295,ガイド鎖:7450。
実施例105で上記に詳述したのと同一の方法でガイド鎖P1をさらにパッセンジャー鎖F6−Seq32と二本鎖を形成させて二本鎖P2−Seq32−mを得た:
実施例107〜109
スキーム29を図29A−1〜図29C−2に示す。
ファルコンチューブ中で、L6(13.82mg、0.016mmol)をDMSO(1963μl)に溶解させ、氷浴で10℃まで冷却した。別のファルコンチューブ中で、B4(76.2mg、8.18μmol)をpH8.3 NaHCO3 200mM(1309μl)に溶解させた。RNA溶液をDMSO溶液に加え、5分後、反応が終了したことを確認した。
反応手順に関するB10−Seq74の合成を参照されたい。Q2−Seq74−Found mass:13940.012。
反応手順に関するB11−Seq74の合成を参照されたい。Q3−Seq74−b−Found mass:20792。
実施例110〜112
スキーム30を図30A〜図30E−3に示す。
L6(23.2mg)をホルムアミド(300μl)およびDMSO(300μl)に溶解させ、次いでpH8.3 200mM NaHCO3水溶液(600μl)に溶解させたR1(50mg)を加えた。5分後、沈殿が見られた。追加のDMSO(300μl)を加えると、大部分の固体が再溶解した。15分のインキュベーション後、反応を、20mL/分で20分の、5〜45%CH3CN(100mM TEAA)/水(100mM TEAA)グラジエントにより、XBridge Prep Phenylカラム(5uM、30×150mm)を用いて精製し、260nmで集めた。生成物画分を水で希釈してCH3CN含量を20%未満まで下げ、3K膜を通して水に対して4回遠心透析した。残留液を凍結し、白色固体に凍結乾燥した。
R2を500ulの水に溶解させ、スキーム38の化合物35を別の500ulの水に溶解させ、次いでGS溶液をPS溶液に加え、室温で十分にボルテックスし、次いで分析用SAX HPLCを点検して二本鎖の形成が確認された。溶液を凍結乾燥して二本鎖をアモルファス固体として得た。
siRNA R3を、50mM 酢酸を含む2,2,2−トリフルオロエタノール(500uL)に溶解させた。ペプチドを、50mM 酢酸を含む2,2,2−トリフルオロエタノール(500uL)に溶解させ、次いで8M グアニジニウムヒドロクロリド水溶液(30uL)を加えた。このペプチド溶液にsiRNA溶液を加えて透明な溶液を得た。1時間後、反応ミックスをホルムアミド(1mL)で希釈し、中性SAX系(緩衝液A:1:1 水:TFE20mM MES pH5.5 緩衝液B:1:1 水:TFE20mM MES pH5.5 1M CsCl)を用いて2回精製した。生成物画分を水で希釈してTFE含量を50%未満まで下げ、3K膜を通して水に対して3回透析した。残留液を凍結し、白色固体に凍結乾燥にした。
ペプチド配列の追加のR3コンジュゲートおよび対応するR4二本鎖を上記に詳述したのと類似の方法で調製した。
実施例113〜115
TetraGalNAcリガンド化合物17a、17bおよび17cの合成
以下のスキーム31を用いてTetraGalNAc化合物17a、17bおよび17cを調製した。
5−クロロ−1−ペンタノール(3.0g、24.47mmol)化合物11をDMF(20mL)に溶かした溶液にアジ化ナトリウム(1.909g、29.4mmol)化合物12を加えた。60℃で一晩撹拌した後、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン1:3)により精製して生成物化合物13を透明な液体として得た。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ3.62(m,2H),3.25(t,J=6.9Hz,2H),1.63−1.53(m,4H),1.45−1.40(m,2H)。
化合物13(0.796g、6.16mmol)およびD−ガラクトサミンペンタアセテート(2.00g、5.14mmol)化合物14を20mL DCMに懸濁し、続いてトリフルオロメタンスルホン酸(0.154g、1.027mmol)を加えた。得られた混合物を一晩還流させた。LC−MSにより、SMの変換が終了したことを確認し、反応混合物をEtOAcで希釈し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残渣を、30分かけて100/0〜90/10のISCO DCM/MeOHにより精製して化合物15を白色固体として得た。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:1.97(6H,s),2.02(6H,s),2.06(6H,s),2.15(6H,s),3.28(6H,t,J=6.89Hz),3.50(3H,dt,J=9.63,6.66Hz),3.68(1H,q,J=5.98Hz),3.94−3.92(7H,m),4.16−4.15(5H,m),4.73(2H,d,J=8.34Hz),5.31(2H,dd,J=11.16,3.48Hz),5.40−5.38(5H,m)。Calculated mass:[M+H]+:C19H31N4O9,459.2;observed:459.4。
Lys−アルキン化合物A1(130mg、0.436mmol)およびGalNAcアジド6(999mg、2.178mmol)をTHF(5mL、脱気処理)に溶解させた。反応混合物に臭化銅(I)−ジメチルスルフィド錯体(17.91mg、0.087mmol)を一度に加え、THF溶液を40℃で一晩撹拌した。反応の色がCu2+を示す青/緑に変化し、反応混合物に、新鮮なアスコルビン酸ナトリウム37mgを含む0.2mLの水を加え、一晩反応させた。反応を濃縮し、20分かけてRP HPLC 5〜60 MeCN(0.5%TFA)/水(0.5%TFA)により精製した。集めた画分を合わせて、凍結乾燥して化合物8を白色固体として得た。Calculated mass:[M+3H]3+:C94H145N18O38,134.0,m/z=711.3;observed:711.9。
保護されたTetraGalNAc化合物8(300mg、0.141mmol)を含む0℃のDCM/MeOH=1/1 5mLに、ナトリウムメトキシド(91mg、1.688mmol)を加えた。反応を1時間撹拌し、2mLの水を加えてクエンチした。揮発性の溶媒を除去し、反応混合物を、水を用いてP4バイオゲルにより精製し、集めた画分を合わせて、凍結乾燥して化合物9を白色固体として得た。Calculated mass:[M+3H]3+:C70H121N18O26,1629.9,m/z=543.3;observed:543.8;[M+2H]2+:C70H120N18O26,1628.9,m/z=814.5;observed:814.9。
TetraGalNAcリガンドのコンジュゲーションのスキーム
図31Aおよび図31Bに示したようなスキーム32は、tetraGalNAc−siRNAコンジュゲートの調製に使用することができる一般的なスキームを示す。
TetraGalNAcアセテート化合物A9によるTetraGalNAc−siRNAコンジュゲート(A11−a)の合成
tetraGalNAcアセテート(A9、58.7mg、0.027mmol)をアセトニトリル(1.5ml)に溶かした溶液に、DIPEA(2.2mg、0.055mmol)およびHATU(10.44mg、0.027mmol)を加えた。混合物を室温で30分間撹拌し、水(1.5ml)およびアセトニトリル(1.5ml)中の溶液siRNA(0.014mmol)に20分かけてシリンジポンプにより移し、30分間撹拌してから1.5mLまで真空下で濃縮した。次いで炭酸ナトリウム(218mg、2.059mmol)、続いてMeOH(0.50ml)を加えた。得られた溶液を室温で16時間撹拌し、濃縮し、透析により精製し、凍結乾燥してコンジュゲートA11−aを得た。
コンジュゲートA11−bおよびA11−c(Ex.118およびEx.119)の合成
コンジュゲートA11−bおよびA11−cについても、類似のプロトコルを使用した。適切なアンチセンス鎖またはセンス鎖を用いた二本鎖の形成は、B11に関して記載したプロトコルを用いて行うことができる。
3’5’ビスTetraGalNAc−siRNAコンジュゲート一本鎖18の合成
tetraGalNAc酸化合物10(41.2mg、0.025mmol)をDMSO(200uL)に溶かした溶液に、HATU(9.6mg、0.025mmol)およびDIPEA(17.6uL、0.126mmol)を加えた。混合物を室温で15分間撹拌し、ジアミノ−siRNA(18.8mg、2.52umol)を水(40uL)およびDMSO(360uL)に溶かした溶液に移し、30分間撹拌した。混合物を水(1.5mL)で希釈し、100mM TEAAを含む0〜30%CH3CN/水のグラジエントによりXBridge Prep Phenylカラム(5uM、19×250mm)を用いて精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物18を得た。
3’5’ビスTetraGalNAc−siRNA二本鎖コンジュゲート19−1(Ex.121)の合成
図32Aおよび図32Bに示したようなスキーム33を用いてTetraGalNAc−siRNAコンジュゲート19−1を調製した。
TetraGalNAcリガンド化合物24(Ex.122)の合成
以下のスキーム34を用いてtetraGalNAcリガンド化合物24を調製した。
N−BOC−1,3−ジアミノプロパン(化合物20、115mg、0.660mmol)を1:1 CH2Cl2/CH3CN(1mL)に溶かした0℃の溶液に、3−マレイミドプロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(化合物21、185mg、0.695mmol)をアセトニトリル(4mL)およびCH2Cl2(1mL)に溶解させた溶液を加えた。混合物を1時間撹拌し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(0〜5%MeOH/CH2Cl2により精製して生成物化合物22を得た。Calculated mass:[M+H]+:C15H24N3O5,326.2;observed:326.3。
マレイミド化合物22(56mg、0.172mmol)をCH2Cl2(1ml)に溶かした溶液に、4M HCl(1ml、4.00mmol)をジオキサンに溶かした溶液を加えた。混合物を1時間撹拌し、真空中で濃縮した。残渣をCH2Cl2で共沸し(2×)、真空下で乾燥させて生成物化合物23を得た。Calculated mass:[M+H]+:C10H16N3O3,226.1;observed:226.3。
tetraGalNAc酸化合物10(100mg、0.061mmol)をDMF(500uL)に溶かした溶液に、HATU(34.9mg、0.092mmol)、Et3N(42.6uL、0.306mmol)およびN−(3−アミノプロピル)−3−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)プロパンアミドヒドロクロリド(16.0mg、0.061mmol)を加えた。混合物を室温で1.5時間撹拌し、TFAで酸性化し、0.1%TFAを含む逆相0〜50%CH3CN/水により精製した。画分を凍結乾燥して化合物24を得た。Calculated mass:[M+2H]2+:C76H125N21O32,1843.8,m/z=921.9;observed:922.7。
化合物26の合成
図33Aおよび図33Bに示したようなスキーム35を用いて化合物26を調製した。
化合物27および28(Ex.124〜125)の合成
図34A〜図34Cに示したようなスキーム36を用いて化合物27および28を調製した。
2’−3,17click PEG9 SPDPコンジュゲート26(13.2mg、1.50μmol)を水(1mL)に溶かした溶液に、TCEPヒドロクロリド(9.15mg、32.2umol)を水(0.5mL)に溶解させた溶液を加えた。混合物を室温で30分間撹拌し、次いで100mM TEAAを含む5〜40%CH3CN/水のグラジエントによりXBridge Prep Phenylカラム(5uM、19×250mm)を用いて精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物27を得た。
2’−3,17−click PEG9SH27(3mg、0.35μmol)をpH6.0酢酸塩緩衝液(100uL)に溶かした溶液に、tetraGalNAcマレイミド(5.1mg、2.77μmol)をpH6.0酢酸塩緩衝液(100uL)に溶解させた溶液を加えた。混合物を室温で30分撹拌し、次いで100mM TEAAを含む5〜40%CH3CN/水のグラジエントを用いてXBridge Prep Phenylカラム(5uM、19×250mm)により精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物28を得た。
2’−3,17ビスTetraGalNAc−siRNA二本鎖コンジュゲート29の合成
コンジュゲート19に関連して詳述した手順を二本鎖28に使用してコンジュゲート29を製造した。
TetraGalNAcチオール化合物31の合成
下記スキーム37を用いて化合物31を調製した。
コンジュゲート35〜37の合成
図35Aおよび図35Bに示したようなスキーム38を用いてコンジュゲート35〜37を調製した。
2’−click15GS化合物32(130mg、0.019mmol)および(9H−フルオレン−9−イル)メチル(2−アジドエチル)カルバメート(29.1mg、0.095mmol)を3:1 DMA/水(2mL)に溶かした脱気した溶液に、臭化銅(I)−ジメチルスルフィド錯体(9.72mg、0.042mmol)を脱気DMSO(0.32mL)に溶解させた溶液を加えた。混合物を45℃で2時間撹拌し、室温まで冷却し、pH8 EDTA(0.5M、2mL)を加えて反応をクエンチした。15分間撹拌し、100mM TEAAを含む0〜45%CH3CN/水のグラジエントを用いてXBridge Prep Phenylカラム(5uM、30×150mm)で精製した。画分を透析により濃縮した。水(3mL)中の合わせた材料に、ピペリジン(936μL、1.891mmol)の溶液を加えた。混合物を4℃で18時間保管し、水(10mL)で希釈し、シリンジフィルターを通して固体を濾別した。pH8 EDTA(0.5 M、2mL)を加え、透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物33を得た。
2’−15click C2 NH2 GS化合物33(43.6mg、6.26μmol)を200mM NaHCO3溶液(2000μl)およびホルムアミド(1000uL)に溶かした溶液に、N−スクシニミジル−3−[2−ピリジルジチオ]プロピオネート(17.9mg、0.057mmol)をDMSO(298uL)に溶解させた溶液を加えた。混合物を10℃で15分間撹拌し、水(10mL)およびホルムアミド(1mL)で希釈し、透析により濃縮した。2M TEAA(200uL)を加え、100mM TEAAを含む5〜40%CH3CN/水のグラジエントを用いてXBridge Prep Phenylカラム(5uM、19×250mm)で精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物34を得た。
2’−15click C2 NH2 NHS SPDP GS化合物34(13mg、1.82μmol)を1:1 ホルムアミド/水(200μl)に溶かした溶液に、tetraGalNAc SH(4.62mg、2.72μmol)をホルムアミド(200uL)に溶かした溶液を加えた。混合物を室温で3.5時間撹拌し、2M TEAA(50uL)を加え、100mM TEAAを含む2〜35%CH3CN/水のグラジエントを用いてXBridge Prep Phenylカラム(5uM、19×250mm)で精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥した。得られた固体を、2〜30%(溶媒A:40mM Et3Nを含む60:40 TFE/水、溶媒B:40mM Et3N、1M グアニジンHClを含む60:40 TFE/水)のグラジエントを用いてProteomix SAX−NP10カラム(22.1×50mm)で精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥してコンジュゲート35を得た。
コンジュゲート19−1に関して詳述した手順を二本鎖コンジュゲート35および適切なパッセンジャー鎖に使用して、それぞれコンジュゲート36および37を調製した。
コンジュゲート38〜45(Ex.131〜139)の合成
図36A〜図36Bに示したようなスキーム39を用いてコンジュゲート38〜44を調製した。
FMOC−PRO−OH(11.11mg、0.033μmol)を120μL DMSOに溶かした溶液に、DIPEA(43.2μl、0.247μmol)、続いてHATU(10.96mg、0.029μmol)を加えた。この淡黄色の混合物を室温で30分間撹拌した。次いでこの混合物を、オリゴヌクレオチドパッセンジャー鎖TEAA塩(60mg、8.24μmol)を500μLの(10%H2O/DMSO)に溶かした溶液に加え、混合物を引き続き室温で1時間撹拌した。反応混合物は、LC−MSにより所望の生成物を示した。反応混合物にジエチルアミン(43.0μl、0.412μmol)を加え、混合物を1時間撹拌し、LC−MSにより所望の生成物を確認した。反応混合物を、カットオフ分子量3kDaの膜を用いた遠心透析により精製した。このプロセスを、水を用いて3回繰り返した(各回14mL)。得られた溶液を濃縮し、凍結し、一晩凍結乾燥して生成物を白色の綿状固体として得た。LC/MSから生成物[7384.9]が確認された。
TetraGalNAc化合物10(53.2mg、0.033μmol)を532μL DMSOに溶かした溶液に、DIPEA(42.6μl、0.244μmol)、続いてHATU(12.36mg、0.033μmol)を加えた。この淡黄色の混合物を室温で30分間撹拌した。次いで混合物を、リンカー−オリゴヌクレオチドパッセンジャー鎖を500μLのDMSOに溶かした溶液に加え、混合物を引き続き室温で2時間撹拌した。LC/MSにより所望の生成物が示された。反応混合物を、カットオフ分子量3kDaの膜を用いて遠心透析に供した。このプロセスを、水を用いて3回繰り返した(各回14mL)。得られた溶液を、XBRIDGE PHENYL、35分間の、200μM TEAAを含む10〜27%CH3CNを用いてGilson PLC 2020により精製した。回収溶液を、カットオフ分子量3kDaの膜を用いて遠心透析により濃縮した。得られた濃縮溶液を1.0N NaClで処理し、遠心透析した。このプロセスを、水を用いて5回繰り返した(各回14mL)。得られた濃縮溶液(約1.5mL)を凍結し、一晩凍結乾燥して生成物を白色の綿状固体として得た。LC/MSから生成物[9002.5]が確認された。
1.5mLの水中のTetraGalNAc−リンカー−RNA(18.5mg、2.055μmol)に、1.5mLの水中のApoBガイド鎖(14.12mg、2.055μmol)と二本鎖を形成させた。撹拌子を用いて混合物を90℃で5分間加熱した。二本鎖を冷却し、撹拌子を除去した。溶液を2日にわたり凍結乾燥して所望の二本鎖コンジュゲート38を白色の綿状固体として得た。LC/MSから生成物[16048]が確認された。
化合物/コンジュゲート46〜48の合成
図38A〜図38Eに示したようなスキーム41を用いて化合物および/またはコンジュゲート46〜48を調製した。
SPDP酸(2.2mg、10.3μmol)をDMSO100μLに溶解し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(14.0μl、0.08mmol)、HATU(19.6mg、0.051mmol)を連続的に加えた。RNA(15mg、2.06μmol)を含む200μLのDMSO:水(9:1)を加え、得られた反応混合物を1時間撹拌し、反応を、3mL 水を加えてクエンチし、500μLになるまで透析し、ホルムアミドにより3mLに希釈し、SAX(緩衝液A:60%TFE水溶液、20mM TEA、緩衝液B:60%TFE水溶液、20mM TEA、1M CsCl、15分かけての100/0〜35/65のA/Bグラジエント)により精製した。集めた画分を合わせて、水に対して透析し、凍結乾燥して化合物46を白色固体として得た。Calculated mass:[M−H]−:C234H300F8N72O150P23S3,7480.1;observed:7483.0。
RNA化合物46(22mg、2.9μmol)およびtetraGalNAcチオール化合物31(10.0mg、5.9μmol)をホルムアミド:pH=6.8トリス緩衝液(3:1)400μLに溶解させ、1時間撹拌した。反応混合物をSAX(緩衝液A:60%TFE水溶液、20mM TEA、緩衝液B:60%TFE水溶液、20mM TEA、1M CsCl、15分かけての100/0〜35/65のA/Bグラジエント)により精製した。集めた画分を合わせて、水に対して透析し、凍結乾燥してコンジュエート47を白色固体として得た。Calculated mass:[M−H]−:C297H410F8N90O179P23S3,9063.9;observed:9066.2。
コンジュゲート47(10.9mg、1.20μmol)およびガイド鎖(7.81mg、1.14μmol)を、RNAseを含まない水1mL中で2時間混合した。反応混合物を凍結乾燥して二本鎖コンジュゲート48を定量的収率で得た。
化合物/コンジュゲート49〜51の合成
図39A〜図39Cに示したようなスキーム42を用いて化合物および/またはコンジュゲート49〜51を調製した。
33.3mgのsiRNAパッセンジャー鎖を4mL バイアルに秤量し、次いで1mL 100mM NaHCO3を加えて溶解させた。0.86uLのプロピオン酸無水物を加え、室温で撹拌した。約2時間熟成後、水に対して3回回転透析した。フリットで濾過し、溶液を凍結乾燥により乾燥させてRNA化合物49を得た。
ステップ1。2.8mg アジド、25.7mg siRNA、25ml N2でスパージしたDMSOおよび4ml 水を40mL バイアルに仕込む。N2でスパージする。2.98mLのCu/リガンド溶液(N2でスパージ、20/100umolを含む10ml DMSO)を仕込む。スパージしたN2下、室温で撹拌する。
GS(コンジュゲート50)10.65mgを1ml 水に溶解させ、PS(コンジュゲート49)10.20mgを1.17ml 水に溶解させる。8.7mgのコンジュゲート49をコンジュゲート50のすべてに加えて1:1 二本鎖を形成した。90℃に1分間加熱し、15分にわたり室温まで冷却する。溶液を濾過し、凍結乾燥により乾燥させてコンジュゲート51を白色固体として得た。
ウミシイタケルシフェラーゼの3’UTRにsiRNAの標的部位を含むルシフェラーゼベクターを安定的にトランスフェクトしたHEK293細胞を作製した。この細胞を96ウェル組織培養プレート(Corning:#3903)に、DMEM 10%血清培地中1ウェル当たり7.5e3細胞の密度で播種した。次いで細胞プレートを37℃/5%CO2で24時間インキュベートした。インキュベーション後、製造者のプロトコルに従いOpti−MEM(Gibco:#31985)中のトランスフェクション試薬リポフェクタミン2000(invitrogen:#11668−019)を用いてコトランスフェクトした被検化合物でプレートを処理した。処理濃度は10nM〜0.03pMの範囲であった。次いで処理プレートを37℃/5%CO2で24時間インキュベートした。インキュベーション処理後、細胞を溶解させ、Dual−GloTM Luciferase Assay(Promega:E2920)に従って処理し、TECAN safire2プレートリーダーで読み取った。
HepG2細胞(ATCC:HB−8065)をコラーゲンコートプレート(BioCoat:356649)に、DMEM 10%血清培地中1ウェル当たり7.5e3細胞の密度で播種した。次いで細胞プレートを37℃/5%CO2で24時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、invitrogenのプロトコルに従いOpti−MEM(Gibco:31985)中のトランスフェクション試薬リポフェクタミン2000(invitrogen:11668−019)を用いてコトランスフェクトした被検化合物で処理した。処理濃度は10nM〜0.03pMの範囲であった。次いで処理プレートを37℃/5%CO2で24時間インキュベートした。インキュベーション処理後、提供されたプロトコルに従い細胞をPLA緩衝液(AB:4448542)で溶解させた。得られた細胞ライセートを、High Capacity cDNA Kit(AB:4368813)を用いてcDNAに逆転写し、Life Technology 7900を用いてqPCRに供した。
CD1雌マウスに200ul量で皮下注射により投与した。動物の行動の変化または生理学的変化を観察した。動物を投与から72時間後にCO2窒息により屠殺し、続いて心臓穿刺により失血させた。肝臓サンプルは中葉の3mmパンチ標本とし、RNAlaterの入ったチューブに入れて全RNAを単離した。mRNAノックダウン解析を、標準的な手順を用いてTaqman解析により行った。
Claims (35)
- 1)一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド;
2)下記式(I)、(II)または(III)の、同一でもあるいは異なっていてもよい1個または複数個のtetraGalNAcリガンド:
任意に、3)同一でもあるいは異なっていてもよい1個または複数個のリンカー;
任意に、4)配列番号1〜474から独立に選択される1個または複数個のペプチド、または同一でもあるいは異なっていてもよいそれらのD−アミノ酸変異体、レトロインベルソ型変異体およびシステインコンジュゲーション点変異体;および
任意に、5)1個または複数個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および/またはマスキング剤
を含む、モジュール組成物。 - 1)一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド;
2)同一でもあるいは異なっていてもよい、式(II)の1〜8個のtetraGalNAcリガンド(式中、Xは−O−、−S−、−CH2−または−NH−であり;nは1、2、3または4である);
3)同一でもあるいは異なっていてもよい1〜24個のリンカー;
4)同一でもあるいは異なっていてもよい、配列番号1〜474から独立に選択される1〜8個のペプチド;および
任意に、5)1〜8個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および/またはマスキング剤
を含む、請求項1に記載のモジュール組成物。 - 1)一本鎖または二本鎖siRNA;
2)同一でもあるいは異なっていてもよい、式(I)、(II)または(III)の1〜8個のtetraGalNAcリガンド(式中、Xは−O−、−S−、−CH2−または−NH−であり;nは1、2、3または4である);
3)同一でもあるいは異なっていてもよい1〜24個のリンカー;
4)配列番号1〜474から独立に選択される1〜12個のペプチド、または同一でもあるいは異なっていてもよい、それらのD−アミノ酸変異体、レトロインベルソ型変異体およびシステインコンジュゲーション点変異体;および
任意に、5)1〜8個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および/またはマスキング剤
を含む、モジュール組成物。 - 請求項3に記載のモジュール組成物であって、前記tetraGalNAcリガンドおよび/または前記ペプチドは、リボース環の異なる2’位、ならびに/または、前記siRNAの異なる3’位末端および/もしくは5’位末端で前記siRNAに結合しており;かつ前記tetraGalNAcリガンドおよび/または前記ペプチドは、任意にリンカーを介して前記siRNAに結合している、モジュール組成物。
- 請求項3に記載のモジュール組成物であって、式(I)、(II)または(III)のXは−O−、−S−または−CH2−であり;nは1、2または3である、モジュール組成物。
- 請求項3に記載のモジュール組成物であって、同一でもあるいは異なっていてもよい1〜4個のtetraGalNAcリガンドを含む、モジュール組成物。
- 請求項3に記載のモジュール組成物であって、同一でもあるいは異なっていてもよい1〜8個のペプチドを含む、モジュール組成物。
- 請求項3に記載のモジュール組成物であって、
前記siRNAは二本鎖であり;かつ
前記tetraGalNAcリガンドは前記siRNAのリボース環の異なる2’位で前記siRNAのガイド鎖またはパッセンジャー鎖に結合している
モジュール組成物。 - 請求項3に記載のモジュール組成物であって、
前記siRNAは二本鎖であり;かつ
前記tetraGalNAcリガンドは異なる3’位末端および/または5’位末端で前記siRNAのガイド鎖またはパッセンジャー鎖に結合している
モジュール組成物。 - 請求項3に記載のモジュール組成物であって、
前記siRNAは二本鎖であり;かつ
前記tetraGalNAcリガンドはリボース環の異なる2’位、ならびに/または、異なる3’位末端および/もしくは5’位末端で前記siRNAのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方に結合している
モジュール組成物。 - 請求項3に記載のモジュール組成物であって、
前記siRNAは二本鎖であり;かつ
前記ペプチドは前記siRNAのリボース環の異なる2’位で前記siRNAのガイド鎖またはパッセンジャー鎖に結合している
モジュール組成物。 - 請求項3に記載のモジュール組成物であって、
前記siRNAは二本鎖であり;かつ
前記ペプチドは異なる3’位末端および/または5’位末端で前記siRNAのガイド鎖またはパッセンジャー鎖に結合している
モジュール組成物。 - 請求項3に記載のモジュール組成物であって、
前記siRNAは二本鎖であり;かつ
前記ペプチドはリボース環の異なる2’位、ならびに/または、異なる3’位末端および/もしくは5’位末端で前記siRNAのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方に結合している
モジュール組成物。 - 請求項3に記載のモジュール組成物であって、前記tetraGalNAcリガンドおよび前記ペプチドは前記siRNAの同じ鎖に結合している、モジュール組成物。
- 請求項3に記載のモジュール組成物であって、前記tetraGalNAcリガンドおよび前記ペプチドは前記siRNAの異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
- 請求項3に記載のモジュール組成物であって、前記tetraGalNAcリガンドおよび前記ペプチドはリンカーを介して前記siRNAの同じ鎖または異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
- 請求項16に記載のモジュール組成物であって、各リンカーは独立に表1から選択される、モジュール組成物。
- 請求項16に記載のモジュール組成物であって、各リンカーは独立に表2から選択される、モジュール組成物。
- 請求項18に記載のモジュール組成物であって、前記リンカーは表2から独立に選択される分岐リンカーである、モジュール組成物。
- 請求項3に記載のモジュール組成物であって、
前記siRNAは二本鎖であり;かつ
前記任意選択の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および/またはマスキング剤はリンカーを介して前記siRNAの同じ鎖または異なる鎖に結合している
モジュール組成物。 - 請求項21に記載のモジュール組成物であって、
1)二本鎖siRNA;
2)式(V)の1〜4個のtetraGalNAcリガンド;
3)同一でもあるいは異なっていてもよい、表1から独立に選択される1〜12個のリンカー;
4)同一でもあるいは異なっていてもよい、配列番号1〜474から独立に選択される1〜8個のペプチド、またはそれらのD−アミノ酸変異体、レトロインベルソ型変異体およびシステインコンジュゲーション点変異体;および、
任意に、5)1〜4個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および/またはマスキング剤
を含み、
前記tetraGalNAcリガンドおよび/または前記ペプチドは、リボース環の異なる2’位、ならびに/または、前記siRNAの異なる3’位末端および/もしくは5’位末端で前記siRNAに結合しており;かつ
前記tetraGalNAcリガンドおよび/または前記ペプチドは、任意にリンカーを介して前記siRNAに結合している
モジュール組成物。 - 請求項21に記載のモジュール組成物であって、前記tetraGalNAcリガンドおよび前記ペプチドはリンカーを介して前記siRNAの同じ鎖に結合している、モジュール組成物。
- 請求項21に記載のモジュール組成物であって、前記tetraGalNAcリガンドおよび前記ペプチドはリンカーを介して前記siRNAの異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
- 請求項21に記載の組成物であって、
1)二本鎖siRNA;
2)式(V)の1〜4個のtetraGalNAcリガンド;
3)同一でもあるいは異なっていてもよい、表2から独立に選択される1〜12個のリンカー;
4)同一でもあるいは異なっていてもよい、配列番号2、3、5、7、11、13、19、22、27〜32、55、56、63、64、69、71〜74、86、90、94、95、106、137、192、200、201、228、229、266、282、333、337、407、423、436、437、461〜463、467、468、470、473および474から独立に選択される配列番号から独立に選択される1〜8個のペプチド、またはそれらのD−アミノ酸変異体、レトロインベルソ型変異体およびシステインコンジュゲーション点変異体;および、
任意に、5)1〜4個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および/またはマスキング剤
を含み、
前記tetraGalNAcリガンドおよび/または前記ペプチドは、リボース環の異なる2’位、ならびに/または、前記siRNAの異なる3’位末端および/もしくは5’位末端で前記siRNAに結合しており;かつ
前記tetraGalNAcリガンドおよび/または前記ペプチドは、リンカーを介して前記siRNAに結合している
モジュール組成物。 - 請求項25に記載のモジュール組成物であって、同一でもあるいは異なっていてもよい、配列番号2、3、5、7、11、13、19、22、27〜32、55、56、63、64、69、71〜74、86、90、94、95、106、137、192、200、201、228、229、266、282、333、337、407、423、436、437、461〜463、467、468、470、473および474から独立に選択される前記ペプチドのD−アミノ酸を含む、モジュール組成物。
- 請求項25に記載のモジュール組成物であって、前記tetraGalNAcリガンドおよび前記ペプチドはリンカーを介して前記siRNAの同じ鎖または異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
- 請求項25に記載のモジュール組成物であって、前記tetraGalNAcリガンドおよび前記ペプチドはリンカーを介して前記siRNAの異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
- 請求項25に記載のモジュール組成物であって、
1)二本鎖siRNA;
2)式(V)の1〜4個のtetraGalNAcリガンド;
3)同一でもあるいは異なっていてもよい、表2から独立に選択される1〜12個のリンカー;
4)同一でもあるいは異なっていてもよい、配列番号2、3、5、7、11、13、19、22、27〜32、55、56、63、64、69、71〜74、86、90、94、95、106、137、192、200、201、228、229、266、282、333、337、407、423、436、437、461〜463、467、468、470、473および474から独立に選択される1〜8個のペプチド、またはそれらのD−アミノ酸変異体、レトロインベルソ型変異体およびシステインコンジュゲーション点変異体;および、
任意に、5)1〜4個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および/またはマスキング剤
を含み、
前記tetraGalNAcリガンドおよび/または前記ペプチドは、リボース環の異なる2’位、ならびに/または、前記siRNAの異なる3’位末端および/もしくは5’位末端で前記siRNAに結合しており;かつ
前記tetraGalNAcリガンドおよび/または前記ペプチドは、リンカーを介して前記siRNAに結合している
モジュール組成物。 - 請求項29に記載のモジュール組成物であって、前記tetraGalNAcリガンドおよび前記ペプチドはリンカーを介して前記siRNAの同じ鎖または異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
- 1個のtetraGalNAcリガンドを含む請求項29に記載のモジュール組成物であって、前記tetraGalNAcリガンドはリンカーを介して前記siRNAに結合している、モジュール組成物。
- 1個のペプチドを含む請求項29に記載のモジュール組成物であって、前記ペプチドはリンカーを介して前記siRNAに結合している、モジュール組成物。
- 2〜4個のtetraGalNAcリガンドを含む請求項29に記載のモジュール組成物であって、前記tetraGalNAcリガンドはリンカーを介して前記siRNAの同じ鎖または異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
- 2〜4個のペプチドを含む請求項29に記載のモジュール組成物であって、前記ペプチドはリンカーを介して前記siRNAの同じ鎖または異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
- 請求項1に記載のモジュール組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
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