TW201408325A

TW201408325A - 包含四ｇａｌｎａｃ及肽之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法

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Publication number: TW201408325A
Application number: TW102115798A
Authority: TW
Inventors: David Tellers; Steven L Colletti; Vadim Dudkin; Jeffrey Aaronson; Aaron Momose; Thomas Joseph Tucker; Yu Yuan; Kathleen B Calati; Lu Tian; Rubina G Parmar; Anthony W Shaw; Weimin Wang; Rachel Anne Storr; Marina Busuek; Robert A Kowtoniuk
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2012-05-02
Filing date: 2013-05-02
Publication date: 2014-03-01
Also published as: JP2015520743A; AU2013256341A1; US20220289785A1; AR090905A1; US20150246133A1; WO2013166155A1; US20190153016A1; US20170306324A1; US11117917B2; US10221205B2; TWI629996B; US20180079769A1; JP6259448B2; US9840531B2; JP2018083816A; EP2844662A1; EP2844662B1; CA2871150A1; EP2844662A4; US9655976B2

Abstract

本發明揭示包含以下之模組化組合物：1)寡核苷酸；2)一或多個式(I)之四GalNAc配體，其可相同或不同；視情況，3)一或多個連接體，其可相同或不同；4)一或多個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)一或多個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。

Description

包含四GALNAC及肽之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法

正在進行集中於出於治療目的以全身性方式傳送寡核苷酸之科學努力。三種用以寡核苷酸傳送之突出方法包括1)脂質奈米粒子(LNP)囊封、2)聚合物結合及3)單一化學結合。單一化學結合通常採用連接至寡核苷酸之靶向配體或脂質或增溶基團或內體裂解肽或細胞穿透肽及/或兩種或所有四種之組合。連接體可存於結合物以及其他官能基中。已知單一化學結合物且寡核苷酸連接發生於寡核苷酸之5'-或3'-端、兩端或內部。參見WO2005/041859、WO2008/036825及WO2009/126933。

大量文獻證據支持以下假說：寡核苷酸傳送之主要障礙係細胞攝取及內體逃逸。業內仍需要可提供有效傳送效率、細胞攝取及/或內體逃逸之額外單一化學結合物。

包含本文所揭示四GalNAc及肽之單一化學結合物具有有效傳送效率、細胞攝取及/或內體逃逸之驚人性質。

在一個實施例中，本文所揭示模組化組合物包含：1)單股或雙股寡核苷酸；2)一或多個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同：其中X係-O-、-S-、-CR¹R²-或-NR¹-，其中R¹及R²各自獨立地選自由氫及C1-C6烷基組成之群；n係1、2、3或4；且具有「」之鍵指示連接點；視情況，3)一或多個連接體，其可相同或不同；4)一或多個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)一或多個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。在一個實施例中，R¹及R²各自獨立地選自由氫、甲基及乙基組成之群。在另一實施例中，R¹及R²各自係氫。

在一個實施例中，四GalNAc配體具有式(II)，其中X、R¹、R²及n係如上文所定義。在另一實施例中，四GalNAc配體具有式(III)，其中X、R¹、R²及n係如上文所定義：在另一實施例中，模組化組合物包含：1)單股或雙股寡核苷酸；2)1-8個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CH₂-或-NH-；且n係1、2、3或4；3)1-24個連接體，其可相同或不同；4)1-8個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1-8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。四GalNAc配體具有式(II)，其中X、R¹、R²及n係如上文所定義。

在另一實施例中，模組化組合物包含：1)單股或雙股siRNA；2)1-8個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CH₂-或-NH-；且n係1、2、3或4；3)1-24個連接體，其可相同或不同；4)1-8個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1-8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。

在上述實施例之另一子集中，連接體在寡核苷酸或siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在寡核苷酸或siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA。

在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體及/或肽視情況經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA。

在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體及/或肽在寡核苷酸或siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在寡核苷酸或siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA；且四GalNAc配體及/或肽視情況經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA。

在上述實施例之另一子集中，式(I)、(II)或(III)之X係-O-、-S-或-CH₂-；且n係1、2或3。

在上述實施例之另一子集中，式(I)、(II)或(III)之X係-O-或-CH₂-且n係1或2。

在上述實施例之另一子集中，式(I)、(II)或(III)之X係-O-且n係1 或2。

在上述實施例之另一子集中，式(I)、(II)或(III)之X係-CH₂-且n係1或2。

在上述實施例之另一子集中，組合物包含1-6個四GalNAc配體，或更特定而言1-4個四GalNAc配體，其可相同或不同。

在上述實施例之另一子集中，組合物包含1-6個肽，或更特定而言1-4個肽，其可相同或不同。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股；且四GalNAc配體在核糖環之不同2’位置連接至寡核苷酸或siRNA之導向股或過客股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股；且四GalNAc配體在不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA之導向股或過客股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股；且四GalNAc配體在核糖環之不同2’位置及/或在不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA之導向股及過客股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股；且肽在不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA之導向股或過客股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股；且肽在核糖環之不同2’位置及/或在不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA之導向股及過客股。

在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體及肽連接至寡核苷酸或siRNA之同一股。

在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體及肽連接至寡核苷酸或siRNA之不同股。

在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體及肽經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA之同一或不同股。

在上述實施例之另一子集中，每一連接體獨立地選自表1。

在上述實施例之另一子集中，每一連接體獨立地選自表2。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股；且可選靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑連接至寡核苷酸或siRNA之同一或不同股。

在一個實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-8個式(IV)、(V)或(VI)之四GalNAc配體，其可相同或不同： 3)1-24個獨立地選自表1之連接體，其可相同或不同；4)1-8個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1-8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。

在另一實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-4個式(IV)、(V)或(VI)之四GalNAc配體，其可相同或不同；3)1-12個獨立地選自表1之連接體，其可相同或不同；4)1-4個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1-4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體及/或肽在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體及/或肽視情況經由連接體連接至siRNA。

在上述實施例之一個子集中，四GalNAc配體及肽經由連接體連接至siRNA之同一股。

在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體及肽經由連接體連接至siRNA之不同股。

在一個實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-4個式(IV)、(V)或(VI)之四GalNAc配體，其可相同或不同；3)1-12個獨立地選自表2之連接體，其可相同或不同；4)1-4個獨立地選自表4之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1-4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體及/或肽在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體及/或肽經由連接體連接至siRNA。

在上述實施例之一個子集中，四GalNAc配體及肽經由連接體連接至siRNA之不同股。

本文揭示包含以下之單一化學結合物：單股或雙股寡核苷酸；一或多個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同：其中X係-O-、-S-、-CR¹R²-或-NR¹-，其中R¹及R²各自獨立地選自由氫及C1-C6烷基組成之群；n係1、2、3或4；且具有「」之鍵指示連接點；及一或多個肽，其可相同或不同。視情況存在其他官能基，例如靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。在一個實施例中，R¹及R²各自獨立地選自由氫、甲基及乙基組成之群。在另一實施例中，R¹及R²各自係氫。

在一個實施例中，寡核苷酸係短干擾RNA(siRNA)。在另一實施例中，siRNA係單股siRNA。在另一實施例中，siRNA係雙股siRNA。

使用本文所揭示四GalNAc藉由將模組化組合物引導至特定細胞提供寡核苷酸或siRNA之有效傳送。舉例而言，靶向配體可在靶細胞表面上與分子特異性或非特異性結合且有利於配體-siRNA結合之內在化。

肽可起內體裂解、細胞穿透及/或融合劑作用。另外，肽可具有陽離子、兩性離子、中性、陰離子特徵。在模組化組合物中納入四GalNAc及肽二者可進一步改良寡核苷酸或siRNA之傳送效率。

連接體可存於每一肽與寡核苷酸之間或每一四GalNAc與寡核苷酸之間。連接體在寡核苷酸之核糖環之不同2’位置及/或末端3'及/或5'位置連接至寡核苷酸。

在一個實施例中，模組化組合物包含1)單股或雙股寡核苷酸；2)一或多個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CH₂-或-NH-；n係1、2、3或4；且具有「」之鍵指示連接點；視情況，3)一或多個連接體，其可相同或不同；4)一或多個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)一或多個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。

在另一實施例中，模組化組合物包含：1)單股或雙股寡核苷酸；2)1-8個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CH₂-或-NH-；n係1、2、3或4；3)1-24個連接體，其可相同或不同；4)1-8個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1-8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。

在另一實施例中，模組化組合物包含：1)單股或雙股siRNA；2)1-8個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CH₂-或-NH-；n係1、2、3或4；3)1-24個連接體，其可相同或不同；4)1-8個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1-8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。

在上述實施例之一個子集中，四GalNAc配體及/或肽在寡核苷酸或siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在寡核苷酸或siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA。

在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體及/或肽視情況經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA。在一個實施例中，存在連接體。

在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體及/或肽在寡核苷酸或siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在寡核苷酸或siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA；且四GalNAc配體及/或肽經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA。

在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA且連接體在核糖環之不同2’位置連接至寡核苷酸或siRNA。

在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA且連接體在寡核苷酸之不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA。

在上述實施例之另一子集中，X係-O-、-S-或-CH₂-。在另一實施例中，X係-O-或-CH₂-。在另一實施例中，n係1、2或3。在另一實施例中，X係-O-且n係1或2。在另一實施例中，X係-CH₂-且n係1或2。在另一實施例中，X係-O-且n係1。在又一實施例中，X係-CH₂-且n係1。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係單股。在另一實施例中，寡核苷酸或siRNA係雙股。

在上述實施例之另一子集中，組合物包含1-6個四GalNAc配體。在另一實施例中，組合物包含1-4個四GalNAc配體。在另一實施例中，組合物包含1-2個四GalNAc配體。在又一實施例中，組合物包含1個四GalNAc配體。

在上述實施例之另一子集中，組合物包含1-6個肽。在另一實施例中，組合物包含1-4個肽。在另一實施例中，組合物包含1-2個肽。在又一實施例中，組合物包含1個肽。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體在核糖環之不同2’位置連接至導向股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體在不同末端3’及/或5’位置連接至導向股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體在核糖環之不同2’位置連接至過客股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體在不同末端3’及/或5’位置連接至過客股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體在核糖環之不同2’位置及/或不同末端3'及/或5'位置連接至導向股及過客股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且肽在核糖環之不同2’位置連接至導向股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且肽在不同末端3’及/或5’位置連接至導向股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且肽在核糖環之不同2’位置連接至過客股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且肽在不同末端3’及/或5’位置連接至過客股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且肽在核糖環之不同2’位置及/或不同末端3'及/或5'位置連接至導向股及過客股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體及肽經由連接體連接至同一或不同股。在一個實施例中，各連接體獨立地選自表1。在另一實施例中，各連接體獨立地選自表2。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體及肽連接至同一股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體及肽連接至不同股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且視情況之靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑連接至同一或不同股。

在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且視情況之靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑經由連接體連接至同一或不同股。在一個實施例中，各連接體獨立地選自表1。在另一實施例中，各連接體獨立地選自表2。

在一個實施例中，模組化組合物包含1)單股或雙股siRNA；2)1-8個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同；其中X係-O-、-S-、-CH₂-或-NH-；且n係1、2、3或4；3)1-24個連接體，其可相同或不同；4)1-8個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1-8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體及/或肽在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體及/或肽視情況經由連接體連接至siRNA。在一個實施例中，存在連接體。在另一實施例中，X係-O-、-S-或-CH₂-，且n係1、2或3。在另一實施例中，X係-O-或-CH₂-，且n係1或2。

在另一實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-6個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同；其中X係-O-、-S-或-CH₂；且n係1、2或3；3)1-18個連接體，其可相同或不同；4)1-6個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1-6個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體及/或肽在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體及/或肽視情況經由連接體連接至siRNA。在一個實施例中，存在連接體。在另一實施例中，X係-O-、-S-或-CH₂-且n係1或2。在另一實施例中，連接體獨立地選自表1。在另一實施例中，連接體獨立地選自表2。在另一實施例中，4)之肽獨立地選自表4。

在另一實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-4個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同；其中X係-O-、-S-或-CH₂；且n係1或2；3)1-12個連接體，其可相同或不同；4)1-4個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1-4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體及/或肽在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體及/或肽經由連接體連接至siRNA。在一個實施例中，X係-O-或-CH₂-且n係1或2。在另一實施例中，連接體獨立地選自表1。在另一實施例中，連接體獨立地選自表2。在另一實施例中，肽獨立地選自表4。

在另一實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-4個式(IV)、(V)或(VI)之四GalNAc配體，其可相同或不同： 3)1-12個獨立地選自表1之連接體，其可相同或不同；4)1-4個獨立地選自表3之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1-4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體及/或肽在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體及/或肽經由連接體連接至siRNA。

在另一實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-4個式(IV)、(V)或(VI)之四GalNAc配體；3)1-12個獨立地選自表2之連接體，其可相同或不同；4)1-4個獨立地選自表4之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1-4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體及/或肽在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體及/或肽經由連接體連接至siRNA。

在上述實施例之一個子集中，四GalNAc配體及/或肽經由連接體連接至siRNA；且其中四GalNAc配體及/或肽連接至同一股。

在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體及/或肽經由連接體連接至siRNA；且其中四GalNAc配體及肽連接至不同股。

為經由草圖(cartoon)闡釋本發明，本發明之特徵在於模組化組合物，該模組化組合物包含寡核苷酸([O₁][O₂][O₃]......[O_n])、一或多個四GalNAc配體(G)、一或多個連接體(L)、一或多個肽(P)及一或多個可選脂質(X)、一或多個靶向配體(X)及/或一或多個增溶基團(X)。

在實施例中，模組化組合物可具有下式：G-L-[O₁][O₂][O₃]......[O_n]-L-P。

在另一實施例中，模組化組合物可具有下式：P-L-[O₁][O₂][O₃]......[O_n]-L-G。

包含末端結合之雙股寡核苷酸的模組化組合物之非限制性實例係：

包含內部及/或末端結合之雙股寡核苷酸的模組化組合物之非限制性實例係：

該等實例僅用作闡釋。熟習此項技術者將認識到，存在在過客股及導向股上放置期望組份之多種變更。

任何數目之連接體、且因此任何數目之肽可連接至寡核苷酸。連接體之數目範圍係1-16。連接體之更佳數目範圍係1-12，或更特定而言1-8，或甚至或特定而言1-4。

四GalNAc之數目範圍係1-8。四GalNAc之更佳數目範圍係1-6，或更特定而言1-4，或甚至或特定而言1-2。

肽之數目範圍係1-8。肽之更佳數目範圍係1-6，或更特定而言1-4，或甚至或特定而言1-2。

兩股分別含有n及n'個核苷酸。數目n及n'可相等或不同。數目係8至50範圍內之整數。較佳地，數目係12-28範圍內之整數。更佳地，數目係19-21範圍內之整數。

作為實例，含有連接體(L-P及/或L-G)之每一核苷酸[O_n]或[O_n']具有以下草圖中所示之通用結構：

對於每一核苷酸而言，1)E=氧(O)或硫(S)；2)鹼基=A、U、G或C，其可經修飾或未經修飾；3)D係核糖環與連接體L之間之連接點，D=氧(O)、硫(S、S(O)或S(O)₂)、氮(N-R，其中R=H、烷基、L-P或L-X)、碳(CH-R，其中R=H、烷基、L-P或L-X)或磷(P(O)R或P(O)(OR)，其中R=烷基、L-P或L-X)。較佳地，D=氧(O)。

兩個核苷酸[O_n-1]及[O_n]或[O_n'-1]及[O_n']經由磷酸二酯鍵或硫代-磷酸二酯鍵連接。

在寡核苷酸係雙股寡核苷酸時，「G-L」、「P-L」及脂質、靶向配體及/或增溶基團可位於同一股或不同股上。

在一些實施例中，「G-L」及「P-L」在同一股上。

在一些實施例中，「G-L」及「P-L」在過客股上。

在一些實施例中，「G-L」及「P-L」在導向股上。

在一些實施例中，「G-L」及「P-L」位於不同股上。

在一些實施例中，「G-L」在過客股上，而「P-L」在導向股上。

在一些實施例中，「G-L」與「P-L」在不同股上，但在雙股寡核苷酸之相同末端上。

在一些實施例中，「G-L」與「P-L」在不同股上，且在雙股寡核苷酸之相反末端上。

在一些實施例中，「G-L」可位於過客股或導向股中任一者之多個末端上，且「P-L」可位於過客股及導向股之剩餘末端上。

在一些實施例中，寡核苷酸中存在一個「G-L」及兩個或更多個「P-L」。

在一些實施例中，寡核苷酸中存在兩個或更多個「G-L」及兩個或更多個「P-L」。

在一些實施例中，當寡核苷酸係雙股寡核苷酸且存在多個「G-L」及/或「P-L」時，該等多個「G-L」組份及/或「P-L」可均存在於雙股寡核苷酸之一股或兩股中。

當存在多個「G-L」組份及/或「P-L」時，其可均相同或不同。

在一些實施例中，「G-L」及/或「P-L」僅在內部核苷酸上(即排除括寡核苷酸之3'及5'端)。

在另一態樣中，本發明包括傳送寡核苷酸或siRNA至細胞之方法。該方法包括(a)提供或獲得本文所揭示之模組化組合物；(b)使細胞與模組化組合物接觸；及(c)允許細胞內化模組化組合物。

該方法可在活體外、離體或在活體內實施以(例如)治療鑑別為需要寡核苷酸或siRNA之個體。需要該寡核苷酸之個體係需要一或多種基因(例如與病症有關之基因)之表現下調或沉默的個體，例如人類。

在一個態樣中，本發明提供抑制一或多種基因表現之方法。該方法包含使一或多個細胞與有效量之本發明寡核苷酸接觸，其中有效量係抑制一或多種基因表現之量。該方法可在活體外、離體或在活體內實施。

本發明之方法及組合物(例如本文所述模組化組合物)可與業內已知之任何寡核苷酸或siRNA一起使用。另外，本發明之方法及組合物可用於治療業內已知之任何疾病或病症，且用於治療任何個體，例如任何動物，任何哺乳動物，例如任何人類。熟習此項技術者亦將認識到，本發明之方法及組合物可用於治療任何將受益於使基因下調或沉默之疾病。

本發明之方法及組合物(例如本文所述模組化組合物)可與本文所述之任何劑量及/或調配物或業內已知之任何劑量或調配物一起使用。除本文所述投與路徑外，熟習此項技術者亦應瞭解，可使用其他投與路徑來投與本發明模組化組合物。

寡核苷酸

如本文所用「寡核苷酸」係雙股或單股、未經修飾或經修飾RNA或DNA。經修飾RNA之實例包括彼等對核酸酶降解之抗性比未經修飾RNA大者。其他實例包括彼等具有2'糖修飾、鹼基修飾、單股懸垂部分(例如3'單股懸垂部分)之修飾，或尤其若係單股，則為包括一或多個磷酸酯基團或一或多個磷酸酯基團類似物的5'修飾。寡核苷酸之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。

在實施例中，寡核苷酸係反義、miRNA、肽核酸(PNA)、聚-嗎啉基(PMO)或siRNA。較佳寡核苷酸係siRNA。另一較佳寡核苷酸係siRNA之過客股。另一較佳寡核苷酸係siRNA之導向股。

siRNA

siRNA經由稱作RNA干擾(RNAi)之製程引導mRNA之序列特異性沉默。該製程發生於多種有機體(包括哺乳動物及其他脊椎動物)中。已知製備及投與siRNA之方法及其用於使基因功能特異性不活化之用途。siRNA包括經修飾及未經修飾之siRNA。siRNA之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。

已知多種可用於向個體投與siRNA之例示性傳送路徑。另外，siRNA可根據業內已知之任何例示性方法調配。siRNA調配及投與之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。

片語「短干擾核酸」、「siNA」、「短干擾RNA」、「siRNA」、「短干擾核酸分子」、「寡核苷酸」、「短干擾寡核苷酸分子」或「經化學修飾短干擾核酸分子」係指任何能夠藉由調介RNA干擾(「RNAi」)或以序列特異性方式使基因沉默抑制或下調基因表現或病毒複製之核酸分子。該等術語可指個別核酸分子、複數種該核酸分子或該等核酸分子池。siNA可為雙股核酸分子包含自互補有義及反義股，其中反義股包含與靶核酸分子或其一部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列且有義股包含對應於靶核酸序列或其一部分之核苷酸序列。siNA可為具有雙螺旋、不對稱雙螺旋、髮夾或不對稱髮夾二級結構之多核苷酸，該結構自互補有義及反義區，其中反義區包含與單獨靶核酸分子或其一部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列且有義區包含對應於靶核酸序列或其一部分之核苷酸序列。siNA可為具有兩個或更多個環結構及包含自互補有義及反義區之桿的環形單股多核苷酸，其中反義區包含與靶核酸分子或其一部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列且有義區包含對應於靶核酸序列或其一部分之核苷酸序列，且其中環形多核苷酸可在活體內或活體外處理以產生能夠調介RNAi之活性siNA分子。siNA亦可包含具有與靶核酸分子或其一部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列的單股多核苷酸(例如，其中該siNA分子無需在對應於靶核酸序列或其一部分之核苷酸序列之siNA 分子內存在)，其中單股多核苷酸可進一步包含末端磷酸酯基團(例如5’-磷酸酯(例如，參見Martinez等人，2002,Cell,110,563-574及Schwarz等人，2002,Molecular Cell,10,537-568))或5’,3’-二磷酸酯。

siRNA經由稱作RNA干擾(RNAi)之製程引導mRNA之序列特異性沉默。該製程發生於多種有機體(包括哺乳動物及其他脊椎動物)中。已知製備及投與siRNA之方法及其用於使基因功能特異性不活化之用途。如本文所用，siRNA包括能夠抑制或下調基因表現之經化學修飾及未經修飾之核酸分子。siRNA之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。

連接體

模組化組合物之四GalNAc與寡核苷酸或siRNA之間及/或肽與寡核苷酸或siRNA之間之共價連接可由連接體調介。端視應用而定，此連接體可裂解或不可裂解。在某些實施例中，可使用可裂解連接體以在自內體運輸至細胞質後釋放寡核苷酸。結合或偶合相互作用之預期性質或期望生物效應可決定連接體基團之選擇。連接體基團可經組合或具支鏈以提供更複雜架構。適宜連接體包括彼等如WO2009/126933中所述者，其以引用方式併入本文中。

在一個實施例中，本發明之連接體示於表1中：表1

在另一個實施例中，較佳連接體示於表2中。

表2

市售連接體可自多個供應商(例如Pierce或Quanta Biodesign)購得，包括該等連接體之組合。另外，經由磷酸酯鍵連接之市售連接體可獨立地用作連接體或與該連接體組合使用。連接體亦可經組合以產生容納1至8個肽之更複雜具支鏈架構，如以下一個該實例中所闡釋：

肽

對於不可容易地跨越雙層膜之大分子藥物及親水性藥物分子而言，認為捕獲於細胞之內體/溶酶體室中係有效傳送至其作用位點之最大障礙。不希望受限於理論，據信使用肽將有利於寡核苷酸自該等內體/溶酶體室逃逸或寡核苷酸跨越細胞膜易位並釋放至胞質室中。在某些實施例中，本發明之肽可為聚陽離子或兩親性或聚陰離子或兩性離子或親脂性或中性肽或擬肽物質，其可顯示pH依賴性膜活性及/或融合性。擬肽物質可為經設計以模擬肽之小的蛋白質樣鏈。

在一些實施例中，肽係細胞透過劑，較佳螺旋狀細胞透過劑。該等肽通常稱作細胞穿透肽。例如，參見「Handbook of Cell Penetrating Peptides」，Langel,U.編輯；2007,CRC Press,Boca Raton,Florida。較佳地，組份係兩親性的。螺旋狀試劑較佳係α-螺旋狀試劑，其較佳具有親脂性及疏脂性相。細胞透過劑可為(例如)細胞透過肽、陽離子肽、兩親性肽或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp及 Phe組成)、樹枝狀肽、限制性肽或交聯肽。細胞穿透肽之實例包括Tat、Penetratin及MPG。對於本發明而言，據信細胞穿透肽可為「傳送」肽，其可橫跨細胞膜具有大的極性分子，包括肽、寡核苷酸及蛋白質。細胞透過肽可為線性或環狀肽，且包括D-胺基酸、「反轉(retro-inverso)」序列、非肽或擬肽連接、肽基模擬物。另外，肽及肽模擬物可經修飾，例如糖基化、聚乙二醇化或甲基化。肽之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。業內熟知肽之合成。

肽可藉由將半胱胺酸或其他含硫醇部分添加至C或N末端結合於任一端或兩端處。在未官能化於N末端上時，肽可由乙醯基封端，或可經脂質、PEG或靶向部分封端。在肽之C末端未結合或未官能化時，其可以醯胺封端，或可經脂質、PEG或靶向部分封端。可用於本文所揭示結合物中之適宜肽列舉於下表3中：

表3中所示之肽之D-胺基酸、反轉及半胱胺酸結合點變體亦適宜。

較佳肽列舉於下表4中。

表4中所示之肽之D-胺基酸、反轉及半胱胺酸結合點變體亦較佳。

靶向配體

本發明模組化組合物可包含靶向配體。在一些實施例中，此靶向配體可將模組化組合物引導至特定細胞。舉例而言，靶向配體可在靶細胞表面上與分子特異性或非特異性結合。靶向部分可為對於靶細胞具有特異性親和力之分子。靶向部分可包括抵抗靶細胞表面上發現之蛋白質之抗體或靶細胞表面上發現之分子之配體或配體之受體結合部分。靶向配體之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。

靶向配體係選自由以下組成之群：抗體、受體之配體結合部分、受體之配體、適體、D-半乳糖、N-乙醯基-D-半乳糖(GalNAc)、多價N-乙醯基-D-半乳糖、D-甘露糖、膽固醇、脂肪酸、脂蛋白、葉酸鹽、促甲狀腺素、促黑色素細胞素、表面活性劑蛋白A、黏蛋白、碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡萄糖胺、多價甘露糖、多價果糖、糖基化聚胺基酸、鐵傳遞蛋白、雙膦酸酯、多麩胺酸鹽、聚天冬胺酸鹽、增強血漿蛋白結合之親脂性部分、類固醇、膽酸、維生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模擬物、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、阿司匹林(aspirin)、葉酸鹽及其類似物及衍生物。

較佳靶向配體係選自由以下組成之群：D-半乳糖、N-乙醯基-D-半乳糖(GalNAc)、GalNAc2及GalNAc3、膽固醇、葉酸鹽及其類似物及衍生物。

脂質

親脂性部分(例如膽固醇或脂肪酸)在連接至高親水性分子(例如核酸)時可實質上增強血漿蛋白結合且因此增強循環半衰期。另外，親脂性基團可增加細胞攝取。舉例而言，脂質可結合至某些血漿蛋白，例如脂蛋白，其因此顯示可增加表現相應脂蛋白受體(例如，LDL-受體或清除劑受體SR-B1)之特定組織中之攝取。亦可將親脂性結合物視為靶向傳送方法且可藉由與內體裂解試劑組合進一步潛在地改良其細胞內運輸。

增強血漿蛋白結合之例示性親脂性部分包括(但不限於)固醇、膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂、鞘脂、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧基己基、十六烷基甘油、莰醇、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基、吩噁嗪、阿司匹林、萘普生、布洛芬、維生素E及生物素等。脂質之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。

較佳脂質係膽固醇。

增溶劑

模組化組合物可包含一或多個可增強水溶解性、循環半衰期及/或細胞攝取之其他部分/配體。該等部分/配體包括天然物質，例如蛋白質(例如，人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；或碳水化合物(例如，葡聚糖、支鏈澱粉、殼多糖、殼聚糖、菊粉、環糊精或透明質酸)。該等部分亦可為重組或合成分子，例如合成聚合物或合成聚胺基酸。實例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG，例如PEG-0.5K、PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K)、甲基-PEG(mPEG)、[mPEG]2、聚乙烯醇(PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚膦嗪。增溶劑之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。

較佳增溶基團係0.5K至30K之PEG。

治療方法

在一個態樣中，本發明之特徵在於治療處於可受益於投與本發明模組化組合物之疾病風險或患有該疾病的個體之方法。該方法包含向有需要之個體投與本發明模組化組合物，藉此治療該個體。所投與寡核苷酸將端視所治療疾病而定。對於關於特定適應症之治療之方法的其他詳細內容，參見WO2009/126933。

調配物

存在多種製備寡核苷酸化合物之結合物的方法。彼等熟習此項技術者應熟悉該等技術。該等反應之有用參考文獻係Bioconjugate Techniques,Hermanson,G.T.,Academic Press,San Diego,CA,1996。其他參考文獻包括WO2005/041859、WO2008/036825及WO2009/126933。

藉由以下實例進一步闡述本發明，但其不應視為進一步限制本發明。貫穿本申請案引用之所有參考文獻、待決專利申請案及已公開專利之內容皆係以引用方式明確併入本文中。本文所述siRNA經設計以靶向普遍表現之基因SSB(Sjogren症候群抗原B；NM_009278.4)。

連接體基團可在鍵聯連接點(LAP)處連接至寡核苷酸或siRNA股且可包括任何含碳部分，在一些實施例中其具有至少1個氧原子、至少1個磷原子及/或至少1個氮原子。在一些實施例中，磷原子構成連接體基團上之末端磷酸酯或硫代磷酸酯基團之部分，其可用作寡核苷酸股之連接點。在某些實施例中，氮原子構成連接體基團上之末端醚、酯、胺基或醯胺基(NHC(O)-)之部分，其可用作目標連接體、內體裂解單元、細胞穿透肽、增溶基團、脂質、靶向基團或其他目標連接體之連接點。該等末端連接體基團包括(但不限於)C₆己基、C₅二級-羥基、C₃硫醇或C₆硫醇部分。下述RNA序列之實例係C6己基：[(CH₂)₆NH₂]。

本文實例中所述之siRNA序列示於表5中。

如本文所用，ome=2'甲氧基；flu=2'氟；click=2'炔丙基；iB=反向無鹼基；「s」下標=硫代磷酸酯；且r=2'核糖；6amil=正己基胺基；C3SH=正丙基硫醇；且C6SH=正己基硫醇。

四GalNAc配體及四GalNAc-siRNA結合物之製備闡述於下文實例及合成反應圖中。應注意，下文siRNA繪示係出於闡釋目的。特定序列資訊可參見表5。

部分A 實例1-2 四GalNAc配體化合物A9及A10之合成

使用以下反應圖1製備四GalNAc化合物9及10。

反應圖1

(2S)-2,6-雙[雙(丙-2-炔-1-基)胺基]己酸(化合物A1)之合成

向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之2000-mL 3頸圓底燒瓶中放入(2S)-2,6-二胺基己酸(50g,342.03mmol,1.00當量)存於乙腈(1000mL)中之溶液並加熱至50℃。向此中添加氫氧化鉀(22.6g，0.4025mol，1.00當量，85%)。將所得溶液攪拌30min。隨後添加3-溴丙-1-炔(29.5mL，1.00當量)。將所得溶液於50℃下攪拌1小時。向溶液中添加其他氫氧化鉀(22.6g，0.4025mol，1.00當量)並於50℃下攪拌30min。向此中添加3-溴丙-1-炔(29.5mL，1.00當量)。將所得溶液攪拌1小時。向此中再次添加氫氧化鉀(22.6g，0.4025mol，1.00當量)。將所得溶液於50℃下攪拌30min，之後添加更多3-溴丙-1-炔(29.5mL，1.00當量)。將所得溶液攪拌1小時。向此中添加氫氧化鉀(22.6g，0.4025mol，1.00當量)。將所得溶液攪拌30min。向此中添加3-溴丙-1-炔(29.5mL，1.00當量)。將所得溶液攪拌3小時。將反應混合物用水/冰浴冷卻至25℃。濾出固體。用HCl(6M)將濾液調節至pH 4。濾出固體。在真空下濃縮濾液。將殘餘物施加至矽膠管柱上並用二氯甲烷/甲醇(100：1-25：1)洗脫。此產生淺黃色油狀(2S)-2,6-雙[雙(丙-2-炔-1-基)胺基]己酸(化合物A1)。

MS(ES,m/z)：297.2,[M-H]^- ¹HNMR(CDCl₃,500MHz，ppm)：3.62(d,J=2.0Hz,4H),3.52-3.49(m,1H),3.50(d,J=2.4Hz,4H),2.62(t,J=7.1Hz,2H),2.30(t,J=2.4Hz,2H),2.27(t,J=2.4Hz,2H),1.88-1.79(m,2H),1.60-1.53(m,2H),1.52-1.43(m,2H)。

4-甲基苯磺酸2-(2-羥基乙氧基)乙基酯(化合物A3)之合成

向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之2000-mL 3頸圓底燒瓶中放入2-(2-羥基乙氧基)乙-1-醇(A2，42.4g，399.55mmol，1.00當量)存於二氯甲烷(1000mL)及三乙胺(27.9g，275.72mmol，0.25當量)中之溶液。向上述物質中添加對甲苯磺醯氯(19.1g，100.18mmol，0.50當量)。在25℃下攪拌1h後，分別用1×500mL硫酸氫鉀水溶液(1M)及1×500mL碳酸氫鈉水溶液(5%)洗滌所得混合物。經無水硫酸鈉乾燥有機層並在真空下濃縮。將殘餘物施加至矽膠管柱上並用二氯甲烷/甲醇(100：1)洗脫。此產生無色油狀4-甲基苯磺酸2-(2-羥基乙氧基)乙基酯(化合物A3)。

2-(2-疊氮基乙氧基)乙-1-醇(化合物A4)之合成

向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之500-mL圓底燒瓶中放入4-甲基苯磺酸2-(2-[[(4-2-(2-羥基乙氧基)乙基酯(A3，50g，192.08 mmol，1.00當量)存於N,N-二甲基甲醯胺(250mL)中之溶液。之後於25℃下添加疊氮化鈉(18.79g，289.03mmol，1.50當量)。將所得溶液於100℃下在油浴中攪拌5h。冷卻並過濾反應混合物。在真空下濃縮濾液。將殘餘溶液用1000mL二氯甲烷稀釋並用1×500mL水洗滌。經無水硫酸鈉乾燥有機層並在真空下濃縮。將殘餘物施加至矽膠管柱上並用二氯甲烷/甲醇(80：1)洗脫。此產生無色油狀2-(2-疊氮基乙氧基)乙-1-醇(化合物A4)。

¹HNMR(CDCl₃,400MHz，ppm)：3.42-3.45(t,J=4.8Hz,2H),3.63-3.65(t,J=4.8Hz，2H),3.71-3.74(t,J=4.8Hz,2H),3.71-3.79(m,2H)。

(3R,4R,5R,6R)-三乙酸3-乙醯胺基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-吡喃-2,4,5-三基酯(化合物A6)之合成

向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之2000-mL 3頸圓底燒瓶中放入(3R,4R,5R,6R)-3-胺基-6-(羥基甲基)四氫-2H-吡喃-2,4,5-三醇鹽酸鹽(A5，120g，556.50mmol，1.00當量)存於吡啶(1200mL)中之溶液。之後於0℃下在攪拌下逐滴添加乙酸酐(341.6g，3.35mol，6.00當量)。將所得溶液於25℃下攪拌過夜。隨後藉由添加8000mL水/冰驟冷反應。藉由過濾收集固體。此產生白色固體狀(3R,4R,5R,6R)-三乙酸3-乙醯胺基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-吡喃-2,4,5-三基酯(化合物A6)。

(3aR,5R,6R,7R,7aR)-二乙酸5-(乙醯氧基甲基)-2-甲基-5,6,7,7a-四氫-3aH-吡喃并[3,2-d]噁唑-6,7-二基酯(化合物A7)之合成

向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之2000-mL圓底燒瓶中放入(3R,4R,5R,6R)-三乙酸3-乙醯胺基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-吡喃-2,4,5-三基酯(A6，30g，77.05mmol，1.00當量)存於二氯甲烷(1500mL)中之溶液，隨後添加氯化鐵(III)(30g，184.95mmol，2.40當量)。將所得混合物於25℃下攪拌2h。隨後藉由添加1000mL水/冰驟冷反應。將有機層用1×1000mL碳酸氫鈉水溶液及1×1000mL水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮。此產生黃色油狀(3aR,5R,6R,7R,7aR)-二乙酸5-(乙醯氧基甲基)-2-甲基-5,6,7,7a-四氫-3aH-吡喃并[3,2-d]噁唑-6,7-二基酯(化合物A7)。

¹HNMR(CDCl₃,300MHz，ppm)：2.03(s,9H),2.12(s,3H),3.97-4.27(m,4H),4.90-4.93(m,J=3.3Hz,1H),5.45-5.47(t,J=3.0Hz,1H),5.98-6.00(d,J=6.6Hz,1H)。

(2R,3R,4R,5R,6R)-二乙酸5-乙醯胺基-2-(乙醯氧基甲基)-6-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]四氫-2H-吡喃-3,4-二基酯(化合物A8)之合成

向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之500-mL圓底燒瓶中放入(3aR,5R,6R,7R,7aR)-二乙酸5-(乙醯氧基甲基)-2-甲基-5,6,7,7a-四氫-3aH-吡喃并[3,2-d]噁唑-6,7-二基酯(A7，40g，121.47mmol，1.00當量)存於1,2-二氯乙烷(200mL)、2-(2-疊氮基乙氧基)乙-1-醇(A4，23.89g，182.18mmol，1.50當量)中之溶液。向上述中添加若干4A沸石。將所得混合物於25℃下攪拌1h。隨後添加三氟甲烷磺酸三甲基矽基酯(10.8mL，0.50當量)。於25℃下攪拌過夜後，將反應混合物用500mL二氯甲烷稀釋並用1×500mL水、1×500mL碳酸氫鈉水溶液及1×500mL水洗滌。經無水硫酸鈉乾燥有機層並在真空下濃縮。將殘餘物施加至矽膠管柱上並用二氯甲烷/甲醇(100：1)洗脫。此產生無色油狀(2R,3R,4R,5R,6R)-二乙酸5-乙醯胺基-2-(乙醯氧基甲基)-6-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]四氫-2H-吡喃-3,4-二基酯(A8)。

MS(m/z)：461.1,[M+H]⁺

¹HNMR(CDCl₃,500MHz，ppm)5.78(d,J=8.90Hz,1H),5.36(d,J=2.9Hz,1H),5.22(dd,J=11.2,3.6Hz,1H),4.77(d,J=8.3Hz,1H),4.19-4.12(m,2H),4.11-4.05(m,1H),3.98-3.92(m,2H),3.82-3.78 (m,1H),3.71-3.63(m,4H),3.49-3.38(m,2H),2.16(s,3H),2.05(s,3H),2.01(s,3H),1.97(s,3H)。

(S)-2,6-雙(雙((1-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)己酸(化合物A9，四GalNAc乙酸酯)(A9)(實例1)之合成

向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之250-mL圓底燒瓶中以各別次序裝入(2S)-2,6-雙[雙(丙-2-炔-1-基)胺基]己酸(A1，1.0g，1.0當量)、(2R,3R,4R,5R,6R)-二乙酸5-乙醯胺基-2-(乙醯氧基甲基)-6-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]四氫-2H-吡喃-3,4-二基酯(A8，9.26g，6.0當量)、50mL無水THF、CuBr^.SMe₂(0.138g，0.20當量)及無水DBU(1.5ml，3.0當量)。將所得溶液於室溫下攪拌16h，用乙酸(0.75mL，4.0當量)驟冷，用MP-TMT樹脂(型號：801472，來自Biotage)(9g)處理，於室溫下陳化16h，過濾並將濾液濃縮成發泡固體。隨後將固體溶解於CH₂Cl₂(140mL)中，且用AcOH/NaCl溶液(140mL)洗滌。利用1mL AcOH及100mL 20% NaCl溶液製備AcOH/NaCl溶液。濃縮底部有機層，並在SiO₂管柱(220g)上用CH₂Cl₂/MeOH洗脫來純化。此產生白色固體狀(S)-2,6-雙(雙((1-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)己酸(化合物A9)。

MS(m/z)：2139.5,[M+H]⁺

(S)-2,6-雙(雙((1-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)己酸(化合物A10，四GalNAc)(A10)(實例2)之合成

向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之250-mL圓底燒瓶中以各別次序裝入(S)-2,6-雙(雙((1-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)己酸(A9，6.9g，1.0當量)、Na₂CO₃(6.83g，20當量)、水(56mL)及MeOH(32mL)。將反應物於室溫下陳化16h，濃縮成殘餘物，重新溶解於水(50mL)中，並在Combiflash C18金反相管柱(415g)上用水/MeCN洗脫來純化。在真空下濃縮後，將產物溶解於最少量之水中，並凍乾以獲得白色固體狀(S)-2,6-雙(雙((1-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)己酸(化合物A10)。

MS(m/z)：1657[M+Na]⁺

¹HNMR(D₂O,500MHz，ppm)：8.05(s,2H),7.91(s,2H),4.62(t,J=5.0Hz,4H),4.57(t,J=5.0Hz,4H),4.45-4.41(d,J=8.6Hz,4H),3.99-3.82(m,28H),3.80-3.61(m,28H),3.14(t,J=7.1Hz,1H),2.52(broad s,2H),1.99(s,6H),1.98(s,6H),1.73(m,2H),1.60(m,2H),1.29(m,2H)。

部分B B2至B5之製備 實例3-6

使用以下反應圖2製備B結合物(實例3-6)。

B2(實例3)之合成

將A10(86mg,0.053mmol)及DIEA(57.6μL,0.330mmol)溶解於 DMSO(500μL)中，隨後添加至HATU溶液(301μL,0.079mmol)中並攪拌15min。將起始材料過客股B1(101mg,0.013mmol)溶解於水(168μL)及DMSO(1.5mL)中。將HATU溶液添加至RNA溶液中並陳化15min。將反應混合物用水(50mL)稀釋並以水經3k膜離心透析三次。將濃縮物裝載於配備有Dionix ProPac SAX 22×250mm管柱之HPLC上。將產物以95% A(2：3 H₂O：2,2,2-三氟乙醇，20mM TEA)至40%溶劑B(2：3 H₂O：2,2,2-三氟乙醇，20mM TEA，1M CsCl)開始梯度洗脫。將各部分用水稀釋以將2,2,2-三氟乙醇含量減少至25%並以水經3k膜離心透析三次。冷凍乾燥濃縮物，以得到白色非晶形固體狀產物。預計質量：9267.5，實驗質量：9267.0

B3(實例4)之合成

向B2(606mg,0.065mmol)存於水(32mL)中之溶液中添加TEAA(1.64mL,2M)、DTT水溶液(0.65mL,1M)及TEA(0.65mL,4.69mmol)。將反應混合物陳化10min。隨後將反應混合物用水稀釋並以水經3k膜離心透析三次。濃縮物未經進一步分離繼續使用。預計質量：9177.4，實驗質量：9179.0

B4(實例5)之合成

向B3(350mg,0.038mmol)存於水(3mL)中之溶液中添加N-(2-胺基乙基)-馬來醯亞胺三氟乙酸鹽(194mg,0.763mmol)。將反應混合物陳化30min，其後藉由RP-HPLC(95：5-5：95% A：B線性梯度(A=100mM TEAA水溶液；B=100mM TEAA，存於乙腈中)Waters Phenyl xbridge管柱對其進行純化。將含有B4之部分以水經3k膜離心透析三次且凍乾濃縮物，以產生白色非晶形固體狀產物。

B5(實例6)之合成

向B4(286mg,0.031mmol)存於碳酸氫鈉水溶液(3.0mL,200mM)中之溶液中添加NHS-dPEG12-SPDP(280mg,0.307mmol)存於乙腈(0.5mL)中之溶液。將反應混合物陳化30min，其後將其用TEAA水溶液(1.0mL,2M)處理並藉由RP-HPLC(95：5-5：95% A：B線性梯度(A=100mM TEAA水溶液；B=100mM TEAA，存於乙腈中)Waters Phenyl xbridge管柱純化。將含有B5之部分以水經3K膜離心透析三次且凍乾濃縮物，以產生白色非晶形固體狀產物。量測質量=10117

實例7-8 B6-seq32之製備

使用以下反應圖3製備結合物B6-P32及B8-seq32(實例7-8)。

結合物B6-seq32(實例7)之合成

將B5(50mg,5μmol,1當量)溶解於存於2,2,2-三氟乙醇(5mL)中之50mM AcOH中。將肽Seq32(51mg,13μmol,2.5當量)溶解於胍-HCl(8M,500μL)中，用存於2,2,2-三氟乙醇(5mL)中之50mM AcOH稀釋。經5min向攪拌RNA溶液中逐滴添加肽溶液，並將反應物於室溫下靜置1小時。將反應物用甲醯胺(10mL)稀釋，且將1.5mL反應混合物之等份試樣裝載於配備有Dionex ProPac SAX-10 22×250mm管柱之HPLC上。將產物經10min以20mL/min以98%溶劑A(2：3 H₂O：2,2,2- 三氟乙醇，40mM TEA)至35%溶劑B(2：3 H₂O：2,2,2-三氟乙醇，40mM TEA，1M胍-HCl)開始梯度洗脫。將各部分用水稀釋以將2,2,2-三氟乙醇含量減少至25%並以水經10k膜離心透析三次。冷凍乾燥濃縮物，以得到白色非晶形固體狀產物。預計質量：13961.9，實驗質量：13962.0

結合物B8-seq32(實例8)之合成

將導向股(B7,17.7mg)溶解於水(5mL)中並添加至含有B6-seq 42(36.2mg)之小瓶中。將溶液徹底混合並於室溫下靜置2小時。冷凍乾燥溶液，以得到白色非晶形固體狀雙螺旋。

額外B8-肽結合物之合成

以類似於針對B8-seq32-b所用之方式之方式製備B8及肽序列之額外結合物及雙螺旋。

實例9-11 B9及B10-seq32及11-seq32之製備

使用以下反應圖4製備B9、B10-seq32及B11-seq32。

反應圖4

B9(實例9)之合成

向2,2'-二吡啶基二硫化物(29mg,0.132mmol,10當量)溶解於甲醇(5mL)中之攪拌溶液中逐滴添加存於水(5mL)中之化合物B3(120mg,0.0132mmol)。將溶液用水稀釋以使甲醇含量為20%並以水經3K膜離心透析三次。冷凍乾燥濃縮物，以得到非晶形白色固體狀產物。預計質量：9166.5，實驗質量：9165.5

B10-seq32(實例10)之合成

將B9(15mg,1.615μmol)溶解於水(150μL)中並用存於TFE(1.5mL)中之50mM AcOH稀釋。在單獨小瓶中，將P32(8.79mg,2.155μmol)溶解於8M胍HCl(60μL)中並用存於TFE(1.5mL)中之50mM AcOH稀釋，隨後添加至RNA溶液。將反應混合物陳化15min，隨後用甲醯胺稀釋並藉由AEX(95：5-55：45 A：B線性梯度(A=20mM TEA，存於60% TFE水溶液中；B=1M CsCl及20mM TEA，存於60% TFE水溶液中)Dionix Propac管柱純化。將含有B10-Seq 32之部分以水經10K膜離心透析三次且凍乾濃縮物，以產生白色非晶形固體狀產物。

B11-seq32-b(實例11)之合成

將B10-seq 32(9.68mg,0.730μmol)用B7(5.00mg,0.730μmol)溶解於PBS(500μL)中之溶液處理並陳化30min。藉由AEX純化(95：5-55：45 A：B線性梯度(A=20mM TEA，存於60% TFE水溶液中；B=1M CsCl及20mM TEA，存於60% TFE水溶液中)Dionix Propac管柱移除過量導向股。將含有B11-seq 32之部分以水經10K膜離心透析三次且凍乾濃縮物，以產生白色非晶形固體狀產物。

實例12-14 B11-肽結合物之額外合成

以類似於針對B11-seq32-b使用之方式之方式製備B11及肽序列之額外結合物及相應雙螺旋。

反應圖5

B12(實例12)之合成：

將B3(50mg,5.4μmol)溶解於水(3mL，約17mg/mL)及化合物1中，在單獨小瓶中將1,1'-(乙烷-1,2-二基)雙(1H-吡咯-2,5-二酮)(16mg,0.073mmol)溶解於DMF(1.2mL)中。將B3溶液添加至化合物1溶液中並攪拌10min。將反應物用水稀釋至15mL且隨後在3K MWCO膜上以水透析4次。隨後過濾(0.22μm注射式過濾器)並凍乾反應物，以得到白色固體B12。預計質量：9397.535。觀察質量：9400.0。

B12-seq13(實例13)之合成：關於反應程序，參見B10-seq32之合成。

B12-seq13.預計質量：13518.215

B13-seq13-b(實例14)之合成：關於反應程序，參見B11-seq32之合成。

B13-seq13-b.預計質量：20370.215

B13-肽結合物之額外合成.

以類似於針對B13-seq13使用之方式之方式製備B13及肽序列之額外結合物。

實例15-16 B15-seq32及B16-seq32-b之製備

使用反應圖6製備B16-seq32及B17-seq32-b。

B14之合成

將B3(100mg,10.9μmol)溶解於水(10mL)中並用溶解於二噁烷(3.8mL)中之雙馬來醯亞胺處理二噁烷(20mL)，以產生渾濁混合物。將反應物攪拌1.5小時，其後將其用N-甲基馬來醯亞胺(36.3mg,0.327mmol)驟冷。將反應混合物用水稀釋並以水經3K膜離心透析一次。過濾濃縮物並藉由RP-HPLC(95：5-5：95% A：B線性梯度(A=100mM TEAA水溶液；B=100mM TEAA，存於乙腈中)Waters Phenyl xbridge管柱)進行純化。透析並凍乾含有產物之部分，以產生非晶形白色固體狀B14。量測質量=9531

B15-seq32(實例15)之合成

將B14(5mg,0.524μmol)溶解於甲醯胺溶液(2M硫脲，50mM MES緩衝液，於pH 6.5下，500μL)中。在單獨小瓶中，將肽序列32 (4.28mg,1.048μmol)溶解於甲醯胺溶液(2M硫脲，50mM MES緩衝液，於pH 6.5下，500μL)中，隨後添加至RNA溶液。於室溫下陳化1小時後，將反應混合物裝載於配備有Dionex ProPac SAX-10 22×250mm管柱之HPLC上。將產物經10min以20mL/min以98%溶劑A(2：3 H₂O：2,2,2-三氟乙醇，40mM TEA)至35%溶劑B(2：3 H₂O：2,2,2-三氟乙醇，40mM TEA，1M胍-HCl)開始梯度洗脫。將各部分用水稀釋以將2,2,2-三氟乙醇含量減少至25%並以水經10K膜離心透析三次。冷凍乾燥濃縮物，以得到白色非晶形固體狀產物。

B16-seq32-b(實例16)之合成

將B15-seq 32(2.11mg,0.155μmol)用B7(1.062mg,0.155μmol)存於水(212μL)中之溶液處理並於室溫下陳化2小時。凍乾溶液以產生白色非晶形固體狀產物。

部分C 實例17-21 C1至C3、C4-seq32及C6-seq32之製備

使用以下反應圖7製備C1至C3、C4-seq32及C6-seq32。

反應圖7

C1(實例17)之合成

將1,2-二胺基十二烷(100mg,0.499mmol)溶解於氯仿(3.3mL)中並冷卻至0℃，隨後用N-甲氧基羰基-馬來醯亞胺(234mg,1.50mmol) 及四丁基硫酸氫銨(170mg,0.499mmol)處理。緩慢添加DIPEA(209μL,1.20mmol)並將反應物於0℃下陳化10分鐘。移除冰浴並將反應物用飽和碳酸氫鈉水溶液(6.6mL)處理。於室溫下陳化3.5小時後，將反應混合物用乙酸乙酯(3×15mL)萃取。將合併之有機層用硫酸鈉乾燥且隨後在真空中移除溶劑。藉由急驟層析利用100：0-0：100% A：B線性梯度(A=己烷；B=乙酸乙酯)純化粗產物。彙集並濃縮含有產物之部分，以產生微細白色粉末狀C1。¹H NMR(CDCl₃)：1.24-1.28(m,12H),1.55-1.61(m,4H),3.50(t,4HJ=7.4Hz),6.68(s,4H)。量測質量=361。

C2(實例18)之合成

步驟1. 將3' H胺基5' C6二硫化物siRNA(46.9mg,6.16μmol)溶解於9：1 DMSO/水(782μl)中。將四GalNAc(40.0mg,0.025mmol)及DIEA(26.9μl,0.154mmol)溶解於DMSO(200μl)中，隨後添加HATU(14.0mg,0.037mmol)存於DMSO(141μL)中之溶液並於RT下攪拌15分鐘。將此溶液添加至RNA溶液並陳化30分鐘。將反應物用DI水稀釋並透析一次以移除DMSO並藉由AEX(95：5-65：35 A：B線性梯度(A=20mM TEA，存於60% TFE水溶液中；B=1M CsCl及20mM TEA，存於60% TFE水溶液中)，Dionix Propac管柱)進行純化。將含有產物之部分彙集、透析並凍乾。量測質量=9233。

步驟2. 向此固體(30.8mg,3.34μmol)中添加TCEP(19.13mg,0.067mmol)及去離子水(2mL)。將反應物於RT下攪拌1小時，隨後於5℃下陳化過夜。將反應物用去離子水稀釋並以去離子水透析兩次，以產生C2之溶液，其未經分離即用於其他反應。

C3(實例19)之合成

將溶解於去離子水(37mL)中之C2(60.1mg，6.60μmol，以類似於B3之方式製備)用溶解於DMF(7mL)中之C1(23.8mg,66.0μmol)處理，以產生渾濁溶液。將反應物陳化過夜，此時添加二噁烷(18mL)以使反應混合物增溶。在陳化額外30分鐘後，將反應物用去離子水稀釋。隨後將其以去離子水透析一次，過濾並藉由RP-HPLC(95：5-5：95% A：B線性梯度(A=100mM TEAA水溶液；B=100mM TEAA，存於乙腈中)Waters Phenyl xbridge管柱)進行純化。透析並凍乾含有產物之部分以產生非晶形白色粉末狀C3。量測質量=9458。

C4-seq32(實例20)之合成

將C3(10mg,1.057μmol)溶解於經20mM MES緩衝液及2M硫脲(1mL)改質之甲醯胺中，並添加至P32(8.62mg,2.11μmol)中。20min後，LC-MS指示良好轉化成期望產物。藉由AEX(95：5-55：45 A：B線性梯度(A=20mM TEA，存於60% TFE水溶液中；B=1M CsCl及20mM TEA，存於60% TFE水溶液中)，Dionix Propac管柱)純化反應物。透析含有產物之部分以產生C4-P32。

C6-seq32-(實例21)之合成

將溶解於去離子水(3.40mL)中之C4(6.78mg,0.501μmol)用溶解於去離子水(530μL)中之導向股C5(3.44mg,0.501μmol)處理。分析型SAX指示良好雙螺旋純度，其中觀察到一些過量導向股。凍乾溶液以產生非晶形白色粉末狀C6。量測質量=過客股：13539，導向股：6869。

C6-肽結合物之額外合成.

以類似於針對C6-seq32-c使用之方式之方式製備C6及肽序列之額外結合物。

實例22-27 C7至C10、C11-P32及C12-seq32-a之製備

使用以下反應圖8製備C7至C10、C11-seq32及C12-seq32。

反應圖8

C7(實例22)之合成

將二十烷二酸(600mg,1.752mmol)懸浮於甲苯(11mL)中並用DIEA(673μL,3.85mmol)及DPPA(793μL,3.68mmol)處理。於室溫下攪拌30分鐘後，將反應物緩慢加熱至80℃，隨後輕緩回流2小時。將反應物冷卻並用tBuOH(1.675mL,17.52mmol)及碘化銅(200mg,1.051mmol)處理並加熱回流額外2小時。將反應物冷卻(觀察到沈澱)，用DCM稀釋，過濾並在真空中濃縮。藉由急驟層析利用100：0-0：50% A：B線性梯度(A=己烷；B=乙酸乙酯)純化粗產物。彙集並濃縮含有產物之部分以產生C7。量測質量=486。

C8(實例23)之合成

將C7(101mg,0.208mmol)溶解於DCM(20mL)中並用TFA(20mL)處理。將反應物陳化5分鐘，其後在真空中移除溶劑及TFA，以產生無色油性固體狀C8，其未經進一步純化即使用。量測質量=286。

C9(實例24)之合成

將C8(100.0mg,0.209mmol)懸浮於氯仿(28mL)中並用四丁基硫酸氫銨(70.9mg,0.209mmol)、N-甲氧基羰基馬來醯亞胺(98.0mg,0.631mmol)及DIEA(88.0μL,0.502mmol)處理。添加飽和碳酸氫鈉(28mL)。將反應物劇烈攪拌25小時，其後將其用3×50mL DCM萃取。將合併之有機層用硫酸鈉乾燥，隨後蒸發至乾燥。藉由急驟層析利用100：0-0：50% A：B線性梯度(A=己烷；B=乙酸乙酯)純化粗產物。合併並蒸發含有期望產物之部分以產生C9。¹H NMR(CDCl₃)：1.24-1.26(m,28H),1.55-1.59(m,4H),3.50(t,4HJ=7.4Hz),6.68(s,4H)。量測質量=445。

C10(實例25)之合成

將C2(12.0mg,1.31μmol)溶解於1：3水：二噁烷(14.4mL)中並用溶解於1.4mL二噁烷中之C9(5.8mg,13.1μmol)處理。在陳化過夜後，將反應物用N-甲基馬來醯亞胺(4.38mg,39.4μmol)驟冷並用去離子水稀釋。隨後將粗製反應物以去離子水透析一次，過濾並藉由RP-HPLC(95：5-5：95% A：B線性梯度(A=100mM TEAA水溶液；B=100mM TEAA，存於乙腈中)Waters Phenyl xbridge管柱)進行純化。將含有產物之部分以去離子水透析並凍乾以產生C10。量測質量：9546。

C11-seq32及C12-seq32-c(實例26及實例27)之合成

以類似於針對C4-seq32及C6-seq32使用之方式之方式製備結合物C11-seq32及C12-seq32-c。

C12-肽結合物之額外合成

以類似於針對C12-seq32使用之方式之方式製備C12及肽序列之額外結合物。

部分D 實例28-30 C13、C14-seq32及C15-seq32之製備

使用以下反應圖9製備C13、C14-seq32及C15-seq32-a。

反應圖9

C13(實例28)之合成

將溶解於去離子水(3.5mL)中之C2(11mg,1.22μmol)用溶解於DMF(270μL)中之C2雙馬來醯亞胺(2.69mg,12.20μmol)處理。1小時後，LC-MS指示良好轉化成期望產物。將反應物以去離子水透析3次並凍乾以產生C13。量測質量：9317。

C14-seq32(實例29)之合成

將C13(10.53mg,1.13μmol)溶解於去離子水(50μL)中並用經50mM AcOH(2.0mL)改質之TFE稀釋，隨後添加至溶解於8M胍鹽酸鹽(60μL)中之seq32(9.22mg,2.26μmol)中。將反應物陳化10分鐘。藉由AEX(95：5-55：45 A：B線性梯度(A=20mM TEA，存於60% TFE水溶液中；B=1M CsCl及20mM TEA，存於60% TFE水溶液中)，Dionix Propac管柱)純化反應物。透析含有產物之部分以產生C14-seq32。

C15-seq32-c(實例30)之合成

將C14-seq32(9.81mg,0.738μmol)溶解於去離子水(2.6mL)中並用溶解於去離子水(751μL)中之導向股C5(7.76mg,0.738μmol)處理。凍乾溶液以產生期望產物C15-seq32-c。量測質量=過客股：13396，導向股：6868

C15-肽結合物之額外合成

以類似於針對C15-seq32使用之方式之方式製備C15及肽序列之額外結合物。

實例31-33 D1、D3及D4之製備

使用以下反應圖10製備D1、D3及D4。

D1(實例31)之合成

向NHS酯(100.0mg,0.320mmol)存於0.5mL無水DCE中之溶液中添加存於0.5mL無水DCE中之疊氮基胺(253.0mg,0.480mmol)及1.5當量三乙胺。將所得溶液於室溫下攪拌1h，且將反應混合物裝載於二氧化矽管柱上，該管柱經25min用MeOH/DCM=0/100至10/90洗脫。使所收集部分經受LC-MS分析且結果指示純度>95%。

D3(實例32)之合成

在Eppendorf管中將寡核苷酸D2(10mg,1.3μmol)及疊氮化物連接體D1(5.6mg,7.8μmol)溶解於脫氣3：1 DMA/水(1000μL)中，隨後向反應混合物中添加溴化銅(I)-二甲硫醚(0.05mg,0.26μmol)存於脫氣MeCN(100μL)中之溶液。於40℃下60min後，藉由LC-MS監測D2完全消耗。將反應混合物用0.4M EDTA(5mL)稀釋並攪拌額外15min，隨後使用Millipore 3k膜以水透析並藉由RP HPLC(5%-60%存於B中之A，A：100mM TEAA，存於MeCN中，B：100mM TEAA，存於水中)進行純化。將產物部分以水透析並凍乾，以得到白色粉末狀D3。

D4(實例33)之合成

將四GalNAc A10(5.7mg,3.5μmol)、HATU(2.0mg,5.2μmol)、N,N-二異丙基乙基胺(1.8mg,14μmol)溶解於DMSO(100μL)中。10min後，將活化酯添加至存於DMF(350μL)及水(50μL)中之寡核苷酸D3(6.4mg,0.70μmol)。將所得反應混合物攪拌15min並藉由添加水驟冷，隨後藉由RP HPLC(5%-60%存於B中之A，A：100mM TEAA，存於MeCN中，B：100mM TEAA，存於水中)進行純化。將產物部分以水透析並凍乾，以得到白色粉末狀R3。

實例34-35 D5-seq32及D7-seq32之製備

使用以下反應圖11製備D5-seq32及D7-seq32。

反應圖11

D5-seq32(實例34)之合成

將存於200μL甲醯胺/pH=6.8 Tris緩衝液=3/1中之寡核苷酸D4(6.5mg,0.60μmol)用存於200μL相同緩衝液中之肽seq32(9.8mg,2.4μmol)處理並將所得反應混合物攪拌1h。藉由添加2.5mL甲醯胺稀釋反應物並藉由強陰離子交換層析在Sepax Proteomix SAX NP10,21.2× 50mm管柱(2%-30%存於A中之B，經8min，A：60：40三氟乙醇：水，40mM三乙胺，B：60：40三氟乙醇：水，40mM三乙胺，1M胍-HCl，20mL/min)上純化，以得到白色粉末狀D5-seq32。

D7-seq32(實例35)之合成

將寡核苷酸D5-seq32(5.7mg,0.304μmol)及相應反義股D6(2.0mg,0.29μmol)在無RNase之水中混合1h。凍乾反應混合物並對產物D7-seq32-d實施活體內評價。

額外D7-肽結合物之合成.

以類似於針對D7-seq32使用之方式之方式製備D7及肽序列之額外結合物。

部分E. 脂質及肽結合物之雜合物之合成 實例36-42

反應圖12

E2(實例36)之合成

在玻璃小瓶中將寡核苷酸E1(300mg,39μmol)及PEG9疊氮化物連接體(58.5mg,78μmol)溶解於脫氣3：1 DMA/水(10mL)中，隨後向反應混合物中添加溴化銅(I)-二甲硫醚(20.06mg,98μmol)存於脫氣DMSO(699μL)中之溶液。於45℃下40min後，藉由LC-MS監測E1完全消耗。將反應混合物用0.4M EDTA(20mL)稀釋並攪拌額外15min，隨後使用Millipore 3k膜以水透析並凍乾，以得到白色粉末狀E2。

E3(實例37)之合成

將四GalNAc A10(237mg,145μmol)、HATU(55.2mg,145μmol)、N,N-二異丙基乙基胺(94mg,726μmol)溶解於DMSO(700μL)中。10min後，將活化酯添加至存於DMA(7.5mL)及水(2.5mL)中之寡核苷酸E2(306mg,36μmol)。將所得反應混合物攪拌15min並藉由添加水驟冷，隨後藉由RP HPLC(5%-60%存於B中之A，A：100mM TEAA，存於MeCN中，B：100mM TEAA，存於水中)進行純化。將產物部分以水透析並凍乾，以得到白色粉末狀E3。

E4(實例38)之合成

向E3(246mg，24μmol，1當量)存於水(8000μL)中之溶液中添加TCEP-HCl(70mg，244μmol，10當量)。混合反應混合物直至TCEP-HCl完全溶解為止。將溶液於室溫下靜置2小時。將溶液以水經3k膜離心透析兩次，以得到粗製E4，其直接用於下一步驟中。

E5(實例39)之合成

向E4(244mg,24μmol)存於水(12mL)中之溶液中添加溶解於MeCN(0.5mL)中之N-(2-胺基乙基)馬來醯亞胺三氟乙酸鹽(62.2mg，0.245mmol，10當量)。將溶液於室溫下靜置1小時。LCMS指示完全轉化。將溶液以水經3k膜離心透析兩次並凍乾，以得到白色粉末狀E5。

E6(實例40)之合成

將E5(40mg，3.95μmol，1當量)溶解於4：1 DMA/水(500μL)中。向上述溶液中添加DIPEA(10.2mg，79μmol，20當量)。將膽固醇氯甲酸酯(18mg，40μmol，10當量)溶解於THF(500μL)中。將兩種溶液混合在一起，並將反應混合物於室溫下靜置1小時。LCMS指示反應完成。藉由RP HPLC(5%-95%存於A中之B，A：100mM TEAA，存於水中，B：100mM TEAA，存於MeCN中)純化反應混合物。將產物部分以水透析並凍乾，以得到白色粉末狀E6。

E7(實例41)之合成

向E6(24.5mg，2.3μmol，1當量)存於水(1000μL)中之溶液中添加存於DMF(200μL，20體積%，200當量)中之六氫吡啶。將反應混合物於室溫下靜置1小時。LCMS指示反應完成。過濾反應混合物(0.2μM)，以水透析並凍乾，以產生白色粉末狀E7。

E8(實例42)之合成

將E7(16mg，1.55μmol，1當量)溶解於新鮮製備之碳酸氫鈉水溶液(0.1M,400μL)中。將SPDP(4.85mg，0.016mmol，10當量)溶解於乙腈(400μL)中。將兩種溶液混合在一起，並將反應混合物於室溫下靜置1小時。藉由RP HPLC(5%-95%存於A中之B，A：100mM TEAA，存於水中，B：100mM TEAA，存於MeCN中)純化反應混合物。將產物部分以水透析並凍乾，以得到白色粉末狀E8。

實例43-44 E8-Seq 137及E9-Seq 137之製備

反應圖13

E9-Seq137(實例43)之合成

將100μL存於甲醯胺中之2M硫脲/20mM MES(pH 6.5)中之寡核苷酸E8(3.0mg,0.286μmol)用存於100μL相同緩衝液中之肽seq 137(2.33mg,0.572μmol)處理並將所得反應混合物於RT下靜置30min。藉由添加1mL甲醯胺稀釋反應物並藉由強陰離子層析在Propac SAX 22×250mm管柱(5%-45%存於A中之B，經15min，A：60：40三氟乙醇：水，20mM三乙胺，B：60：40三氟乙醇：水，20mM三乙胺，1M胍-HCl，20mL/min)進行純化，以得到白色粉末狀E9-seq-137。

E10-Seq137-e(實例44)之合成

將過客股E9-seq137(1.30mg,0.077μmol)及相應導向股B7(0.561 mg,0.077μmol)在無RNase之水中混合並加熱至90℃並保持1min，隨後於RT下靜置10min。凍乾雙螺旋並將所得產物分離為非晶形白色粉末。

額外E10-肽結合物之合成.

以類似於針對E10-Seq137-e使用之方式之方式製備E10及肽序列之額外結合物。

部分F. 3,13,18三肽結合物之製備 實例45-49

反應圖14

化合物F2(實例45)之合成

將化合物A10(210mg,0.129mmol)溶解於無水N-甲基-2-吡咯啶酮(3ml)中。添加HATU(48.9mg,0.129mmol)及無水二異丙基乙基胺(0.046ml,0.257mmol)，且對混合物實施超音波處理直至固體完全溶解為止。將反應物於RT下靜置5min。在單獨小瓶中，將化合物F1(500mg,0.0646mmol)溶解於水(2ml)及N-甲基-2-吡咯啶酮(5ml)中。將A10溶液添加至F1溶液中，並將反應物於RT下靜置5min。將反應混合物裝載於配備有加熱至60℃之Agilent PL-SAX 8μm 50×150mm管柱之HPLC上。藉由以100%溶劑A(4：1 H₂O：乙醇，20mM三乙基乙酸銨，pH 7.0)開始並經30min以100ml/min增加至80%溶劑B(4：1 H₂O：乙醇，20mM三乙基乙酸銨pH 7.0，1M胍鎓鹽酸鹽)對產物進行梯度洗脫。合併各部分，並藉由用水稀釋將乙醇含量減少至5%。將溶液以50ml/min泵送裝載至Waters XBridge 5μm 50×50mm管柱上，並將產物以100ml/min用水洗滌5min。藉由反轉管柱並使2：3 H₂O：乙腈以50ml/min流過管柱洗脫脫鹽產物。冷凍乾燥該部分，以得到白色非晶形固體狀F2。預計質量：9363.6，實驗質量：9363.5。

化合物F3(實例46)之合成

將F2(500mg,0.0534mmol)及疊氮基-peg9-胺(253mg,0.481mmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(5ml)及水(5ml)中。使氮氣鼓泡通過溶液達1min。在單獨小瓶中，將溴化銅(I)二甲硫醚(43.9mg,0.214mmol)溶解於乙腈(2.5ml)中。使氮氣鼓泡通過溶液達1min。將兩種溶液混合在一起，並使氮氣鼓泡通過反應混合物達1min。密封小瓶並於RT下靜置1小時。將反應混合物用EDTA溶液(0.5M,pH 8.0,1mL)驟冷並裝載至配備有Waters XBridge 5μm 50×250mm管柱之HPLC上。藉由以100%溶劑A(H₂O，0.1M三乙基乙酸銨pH 7.0)開始並經30分鐘以100ml/min增加至40%溶劑B(乙腈)對產物進行梯度洗脫。合併各部分，且藉由用水稀釋將乙腈含量減少至5%。將溶液以50ml/min泵送裝載至Waters XBridge 5μm 50×50mm管柱上，並將產物以100ml/min用水洗滌5min。藉由反轉管柱並使2：3 H₂O：乙腈以50ml/min流過管柱洗脫脫鹽產物。冷凍乾燥該部分，以得到白色非晶形固體狀F3。預計質量：10943.5，實驗質量：10943.2。

化合物F4(實例47)之合成

將F3(467mg,0.0427mmol)溶解於碳酸氫鈉溶液(0.1M,4.5mL)中。將NHS-SPDP(120mg,0.384mmol)溶解於乙腈(1mL)中。將溶液混合在一起，並將反應物於RT下靜置15min。將反應混合物裝載至配備有Waters XBridge 5μm 50×250mm管柱之HPLC上。藉由以100%溶劑A(H₂O，0.1M三乙基乙酸銨pH 7.0)開始並經30分鐘以100ml/min增加至40%溶劑B(乙腈)對產物進行梯度洗脫。合併各部分，且藉由用水稀釋將乙腈含量減少至5%。將溶液以50ml/min泵送裝載至Waters XBridge 5μm 50×50mm管柱上，並將產物以100ml/min用水洗滌5min。藉由反轉管柱並使2：3 H₂O：乙腈以50ml/min流過管柱洗脫脫鹽產物。冷凍乾燥該部分，以得到白色非晶形固體狀F4。預計質量：11535.3，實驗質量：11535.1。

F5-Seq463(實例48)之合成

將肽Seq.612(8.75mg,0.00520mmol)溶解於含有20mM乙酸之DMSO(1mL)中。在單獨小瓶中，將F4(10mg,0.000867mmol)溶解於含有20mM乙酸之DMSO(1ml)中。將兩種溶液混合在一起並於RT下靜置1小時。將反應物用N-甲基馬來醯亞胺(5.78mg,0.0520mmol)驟冷並裝載至配備有Agilent PL-SAX 10μm 25×50mm管柱之HPLC上。藉由以100%溶劑A(2：3 H₂O：2,2,2-三氟乙醇，20mM三乙胺)開始並經20min以30ml/min增加至70%溶劑B(2：3 H₂O：2,2,2-三氟乙醇，20mM三乙胺，0.5M胍鎓鹽酸鹽)對產物進行梯度洗脫。合併各部分並裝載至配備有Waters XBridge 5μm 19×250mm管柱之HPLC上。藉由以85%溶劑A(H₂O，0.1M己基乙酸銨pH 7.0)開始並經30分鐘以20ml/min增加至65%溶劑B(四氫呋喃)對產物進行梯度洗脫。合併各部分，且在真空下將四氫呋喃含量減少至小於5%。將溶液以水經10k膜離心透析一次，以含有0.1M氯化鈉之4：1 H₂O：乙醇離心透析一次，且再以水離心透析兩次。冷凍乾燥濃縮物，以得到白色非晶形固體狀F5-Seq 463。預計質量：16247.8，實驗質量：16247.9。

實例49

反應圖15

F6 Seq 463-f(實例49)之合成

將F5-Seq 463(7.75mg,0.000477mmol)及導向B7(3.27mg,0.000477mmol)溶解於H₂O(0.5mL)中。將溶液於RT下靜置1小時且隨後冷凍乾燥，以得到白色非晶形固體狀F6 Seq 463-f之雙螺旋(11mg，定量)。過客股之預計質量：16247.8，實驗質量：16247.9。導向股之預計質量：6852.5，實驗質量：6852.7。

額外F10-肽結合物及雙螺旋之合成

以類似於針對F6-Seq 463-f使用之方式之方式製備F10及肽序列之額外結合物及其雙螺旋。

部分G. 3,8,13,18四肽之製備 實例50-53

反應圖16

G2(實例50)之合成

將A10(210mg,0.129mmol)溶解於無水N-甲基-2-吡咯啶酮(3ml)中。添加HATU(48.9mg,0.129mmol)及無水二異丙基乙基胺(0.046ml,0.257mmol)，且對混合物實施超音波處理直至固體完全溶解為止。將反應物於RT下靜置5min。在單獨小瓶中，將G1(500mg,0.0643mmol)溶解於水(2ml)及N-甲基-2-吡咯啶酮(5ml)中。將A10溶液添加至G1溶液中，並將反應物於RT下靜置5min。將反應混合物裝載於配備有加熱至60℃之Agilent PL-SAX 8μm 50×150mm管柱之HPLC上。藉由以100%溶劑A(4：1 H₂O：乙醇，20mM三乙基乙酸銨，pH 7.0)開始並經30分鐘以100ml/min增加至80%溶劑B(4：1 H₂O：乙醇，20mM三乙基乙酸銨pH 7.0，1M胍鎓鹽酸鹽)對產物進行梯度洗脫。合併各部分，並藉由用水稀釋將乙醇含量減少至5%。將溶液以50ml/min泵送裝載至Waters XBridge 5μm 50×50mm管柱上，並將產物以100ml/min用水洗滌5min。藉由反轉管柱並使2：3 H₂O：乙腈以50ml/min流過管柱洗脫脫鹽產物。冷凍乾燥該部分，以得到白色非晶形固體狀G2。預計質量：9399.7，實驗質量：9399.5。

G3(實例51)之合成

將G2(483mg,0.0514mmol)及疊氮基-peg9-胺(324mg,0.617mmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(5ml)及水(5ml)中。使氮氣鼓泡通過溶液達1min。在單獨小瓶中，將溴化銅(I)二甲硫醚(50mg,0.244mmol)溶解於乙腈(2.5ml)中。使氮氣鼓泡通過溶液達1min。將兩種溶液混合在一起，並使氮氣鼓泡通過反應混合物達1min。密封小瓶並於RT下靜置1小時。將反應混合物用EDTA溶液(0.5M,pH 8.0,1mL)驟冷並裝載至配備有Waters XBridge 5μm 50×250mm管柱之HPLC上。藉由以100%溶劑A(H₂O，0.1M三乙基乙酸銨pH 7.0)開始並經30分鐘以100ml/min增加至40%溶劑B(乙腈)對產物進行梯度洗脫。合併各部分，且藉由用水稀釋將乙腈含量減少至5%。將溶液以50ml/min泵送裝載至Waters XBridge 5μm 50×50mm管柱上，並將產物以100ml/min用水洗滌5min。藉由反轉管柱並使2：3 H₂O：乙腈以50ml/min流過管柱洗脫脫鹽產物。冷凍乾燥該部分，以得到白色非晶形固體狀G3。預計質量：11506.2，實驗質量：11506.0。

G4(實例52)之合成

將G3(455mg,0.0396mmol)溶解於碳酸氫鈉溶液(0.1M,5mL)中。將NHS-SPDP(160mg,0.512mmol)溶解於乙腈(1.5mL)中。將溶液混合在一起，並將反應物於RT下靜置15min。將反應混合物裝載至配備有Waters XBridge 5μm 50×250mm管柱之HPLC上。藉由以100%溶劑A(H₂O，0.1M三乙基乙酸銨pH 7.0)開始並經30分鐘以100ml/min增加至40%溶劑B(乙腈)對產物進行梯度洗脫。合併各部分，且藉由用水稀釋將乙腈含量減少至5%。將溶液以50ml/min泵送裝載至Waters XBridge 5μm 50×50mm管柱上，並將產物以100ml/min用水洗滌5min。藉由反轉管柱並使2：3 H₂O：乙腈以50ml/min流過管柱洗脫脫鹽產物。冷凍乾燥該部分，以得到白色非晶形固體狀G4。預計質量：12295.3，實驗質量：12295.1。

G5-Seq 489(實例53)之合成

將肽Seq.Id 489(CIFGAIAGFIKNIWEGLI所有(D))(13.6mg,0.00694mmol)溶解於含有20mM乙酸之DMSO(1mL)中。在單獨小瓶中，將G4(10mg,0.000867mmol)溶解於含有20mM乙酸之DMSO(1ml)中。將兩種溶液混合在一起並於RT下靜置1小時。將反應物用N-甲基馬來醯亞胺(7.71mg,0.0694mmol)驟冷並裝載至配備有Agilent PL-SAX 10μm 25×50mm管柱之HPLC上。藉由以100%溶劑A(2：3 H₂O：2,2,2-三氟乙醇，20mM三乙胺)開始並經20min以30ml/min增加至70%溶劑B(2：3 H₂O：2,2,2-三氟乙醇，20mM三乙胺，0.5M胍鎓鹽酸鹽)對產物進行梯度洗脫。合併各部分並裝載至配備有Waters XBridge 5μm 19×250mm管柱之HPLC上。藉由以85%溶劑A(H₂O，0.1M己基乙酸銨pH 7.0)開始並經30分鐘以20ml/min增加至65%溶劑B(四氫呋喃)對產物進行梯度洗脫。合併各部分，且在真空下將四氫呋喃含量減少至小於5%。將溶液以水經10k膜離心透析一次，以含有0.1M氯化鈉之4：1 H₂O：乙醇離心透析一次，且再以水離心透析兩次。冷凍乾燥濃縮物，以得到白色非晶形固體狀G5-Seq 489。預計質量：19708.1，實驗質量：19708.0。

實例54

反應圖17

G6-Seq 489-g(實例54)之合成

將G5-Seq 489(8.5mg,0.000434mmol)及B7(2.98mg,0.000434mmol)溶解於H₂O(0.5mL)中。將溶液於RT下靜置1小時且隨後冷凍乾燥，以得到白色非晶形固體狀雙螺旋G6-Seq 489-g。過客股之預計質量：19708.1，實驗質量：19708.3。導向股之預計質量：6852.5，實驗質量：6852.6。

額外G6-肽結合物及雙螺旋之合成

以類似於針對G6-Seq 489-g使用之方式之方式製備G6及肽序列之額外結合物及其雙螺旋。

部分H. 3,8,13,18四肽之製備 實例55-58

使用以下反應圖18製備H1至H5。

H1(實例55)之合成

向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之500-mL圓底燒瓶中放入1-(第三丁基硫基)肼-1,2-二甲酸二-第三丁基酯(15g，46.8mmol，2.00當量)存於N,N-二甲基甲醯胺(30mL)中之溶液。將2-胺基乙烷硫醇鹽酸鹽(2.66g，23.4mmol，1當量)存於N,N-二甲基甲醯胺(80ml)中之溶液緩慢添加至圓底燒瓶中。之後添加三乙胺(2.36g，23.4mmol，1當量)。於RT下攪拌過夜後，白色固體發生沈澱。添加無水N,N-二甲基甲醯胺(100ml)以獲得幾乎透明之溶液。添加三乙胺直至白色固體再次發生沈澱。將反應混合物於RT下攪拌8小時。過濾溶液並在減壓下蒸發。向殘餘物中添加二乙醚(200ml)並過濾。收集白色固體並在乾燥器中乾燥。其後，將此白色固體在二乙醚(5×10ml)中溶解5次，攪拌若干分鐘並過濾。獲得白色固體狀期望產物。¹HNMR(CDCl₃,500MHz，ppm)：1.36(s,9H),3.07(t,2H),3.4(t,2H),8.3(s,2H)。

H3(實例56)之合成

將石膽酸(H2)(7gm，18.59mmol,1當量)溶解於無水二氯甲烷(200ml)中且隨後冷卻至0℃。此後，向溶液中添加N,N-二環己基碳化二亞胺(4.6g，22.31mmol，1.2當量)。於0℃下攪拌30min後，添加存於二氯甲烷(13ml)中之五氟苯酚(3.76gm，20.45mmol，1.1當量)。隨後於RT下在氬下繼續攪拌額外20h。過濾所沈澱N,N-二環己基脲並用冷二氯甲烷洗滌。隨後在減壓下蒸發合併之濾液。隨後將所得油性殘餘物用二氯甲烷(50ml)稀釋並用飽和NaCl水溶液(60ml)及水(80ml)稀釋。將有機相經Na₂SO₄乾燥，過濾並蒸發至乾燥。使用管柱層析(用CH₂Cl₂/CH₃OH,100/0-97/3洗脫)純化乾燥之化合物。MS(m/z)；566[M+Na]⁺

H4(實例57)之合成

將化合物H3(4.5gm，8.29mmol，1當量)溶解於無水二氯甲烷(15ml)中且隨後冷卻至0℃。向所得溶液中添加2-(第三丁基二硫烷基)乙胺(H1)(2.057gm，12.44mmol，1.5當量)及三乙胺(2.56gm，2.52mmol，3當量)存於二氯甲烷(7ml)中之冷混合物。將反應混合物於RT下攪拌2h。TLC確認形成產物。將反應混合物用飽和NaCl水溶液(20ml×2)及水(20ml×2)洗滌。將有機相經Na₂SO₄乾燥，過濾並經真空乾燥。經由矽膠管柱層析(用CH₂Cl₂/CH₃OH 100/0-95/5洗脫)純化粗產物，從而產生純化合物H4。MS(m/z)；524.35,[M+1]⁺

H5(實例58)之合成

將H4(3gm，5.73mmol，1當量)溶解於無水二氯甲烷(15ml)中並添加三乙胺(0.869g，8.59mmol，1.5當量)。將反應混合物冷卻至0℃。向反應混合物中逐滴添加存於無水二氯甲烷(10ml)中之2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基氯亞磷酸酯(2.71gm，11.45mmol，2當量)。將所得溶液攪拌1h。TLC確認形成產物。蒸發反應混合物並在矽膠管柱(用己烷/乙酸乙酯/三乙胺，100/0/1.5至60/40/1.5)上純化。MS(m/z)；724.46[M+1]⁺ ³¹P NMR(CDCl₃,500MHz,ppm)；146.5

實例59-66

使用以下反應圖19製備實例59至實例66。

反應圖19

H6(實例59)之合成

關於反應程序，參見B2之合成。預計質量：9609.071，實驗質量：9605。

H7(實例60)之合成

向H6(15mg，1.56μmol，1當量)存於水(1400μl)中之溶液中添加TCEP-HCl(26.8mg，0.094mmol，60當量)。混合反應混合物直至TCEP-HCl完全溶解為止。將溶液於RT下靜置過夜。將溶液以水經3K 膜離心透析兩次。預計質量：9520，實驗質量：9517。

H8(實例61)之合成

關於反應程序，參見B9之合成。預計質量：9630，實驗質量：9627。

H9-Seq32(實例62)之合成

關於反應程序，參見B10-seq32之合成。預計質量：13597，實驗質量：13598。

H7-Seq32-h(實例63)之合成

關於反應程序，參見B11-seq32之合成。

H8(實例64)之合成

關於反應程序，參見C13之合成。預計質量：9741。

H9-Seq32(實例65)之合成

關於反應程序，參見C14之合成。預計質量：13819，實驗質量：13820。

H10-Seq32-h(實例66)之合成

關於反應程序，參見C15-Seq32之合成。

H7及H10肽結合物之額外合成

以類似於針對H7-Seq32-h及H10-Seq32-h使用之方式之方式製備H7及H10及肽序列之額外結合物及其雙螺旋。

部分I. 3,13,18三酶裂解之連接體肽結合物之製備 實例67-73

反應圖20

I3(實例67)之合成

將I1(160mg,0.209mmol)及I2(48.8mg,0.219mmol)溶解於DMA(1mL)中並用N-甲基嗎啉(46μL,0.417mmol)處理。將反應物於RT下攪拌6小時，隨後藉由RP-HPLC(95：5-20：80% A：B線性梯度(A=0.1% TFA水溶液；B=0.1% TFA，存於乙腈中)Waters C18 xbridge管柱19×250mm)純化。將含有I3之部分用2：1 DCM：MeOH萃取，經Na₂SO₄乾燥，過濾並在真空中濃縮，以產生產物。量測質量=814.3

I4(實例68)之合成

將I3(88mg,0.108mmol)溶解於DMA(1mL)中並用六氫吡啶(200μL,2.02mmol)處理並於10℃下攪拌10min。添加TFA(156μL,2.02mmol)以驟冷反應物。藉由RP-HPLC(95：5-60：40% A：B線性梯度(A=0.1% TFA水溶液；B=0.1% TFA，存於乙腈中)Waters C18 xbridge管柱30×250mm)純化反應混合物。凍乾含有I4之部分以產生產物。量測質量=592.3。

I5(實例69)之合成

將I4(912mg,1.324mmol)溶解於DMSO(7.7mL)中並用L1(1.0g,1.40mmol)及DIEA(463μL,2.65mmol)處理。將反應混合物攪拌15min並藉由RP-HPLC(100：0-0：100% A：B線性梯度(A=0.1% TFA水溶液；B=0.1% TFA，存於乙腈中)Waters C18 xbridge管柱純化。凍乾含有I5之部分以產生產物。量測質量=609.5[M+2]

I7(實例70)之合成

將I6(500mg,0.065mmol)及I5(236mg,0.194mmol)溶解於pH 5.5 MES緩衝液(51.6ml,500mM)及乙腈(12.91ml)中。將溶液用氮氣脫氣10min，其後將其用CuBr.SMe₂(133mg,0.646mmol)處理並用氮氣脫氣額外5分鐘。對反應混合物實施超音波處理並攪拌30min，隨後藉由RP-HPLC(95：5-5：95% A：B線性梯度(A=100mM TEAA水溶液；B=100mM TEAA，存於乙腈中)Waters Phenyl xbridge管柱)進行純化。將含有產物之部分以0.32M EDTA(pH 6.5)經3k膜透析兩次，隨後以水透析三次。隨後將濃縮以200mM TEAA透析兩次且隨後以水透析三次。凍乾濃縮物，以產生非晶形白色固體狀產物。量測質量=11400

I8(實例71)之合成

將I7(287mg,0.025mmol)懸浮於水(100μL)中並用NMP(2.0mL)稀釋，其在靜置時產生均質溶液。將HATU(13mg,0.035mmol)溶解於NMP(200μL)中並添加至A10(62mg,0.038mmol)中。將反應混合物用NMP(200μL)稀釋且隨後用DIEA(13μL,0.076mmol)處理。隨後將HATU反應混合物一次性添加至RNA溶液中並陳化10min。將反應物用去離子水稀釋並藉由RP-HPLC(95：5-5：95% A：B線性梯度(A=100mM TEAA水溶液；B=100mM TEAA，存於乙腈中)Waters Phenyl xbridge管柱)進行純化。將含有I8之部分以水經3k膜透析三次。凍乾濃縮物，以產生非晶形白色固體狀產物。量測質量=13027。

I9-Seq 1681(實例72)之合成

將I8(20mg,1.537μmol)溶解於經50mM AcOH(2mL)改質之TFE中。在單獨小瓶中，將Seq ID 1681(8.63mg,6.15μmol)懸浮於8M Gn.HCl(400μL)中並用存於TFE(2mL)中之50mM AcOH稀釋以形成稍微渾濁之懸浮液，隨後添加至RNA溶液中。10min後，再添加Seq ID 1681(8.63mg,1.54μmol)並將反應物陳化30min，其後AEX指示幾乎完全轉化成期望產物。將反應物用N-甲基馬來醯亞胺(6.83mg,61.5μmol)驟冷並藉由AEX(0-40% 1M Gn.HCl，存於1：1水：TFE(含有40mM TEAA，pH 7.5)中，Proteomix NP10管柱加熱至60℃)純化。使用200mM HAA pH 7.5：ACN之70：30-25：75梯度及Agilent PLRP-S管柱沖洗純化物質。將純部分彙集，透析並凍乾，以產生I9-Seq 1681(6.37mg，0.302μmol，19.65%產率)。

I10-Seq 1681-f(實例73)之合成

將I9-seq 1681(3.02mg,0.143μmol)溶解於水(950μl)中並用B7(0.980mg,0.143μmol)存於水(144μl)中之溶液處理。將反應混合物陳化15min且隨後凍乾，以產生非晶形白色固體狀產物。量測質量=21107。

I10肽結合物及雙螺旋之額外合成.

以類似於針對I10-seq-1681-f使用之方式之方式製備I10及肽序列之額外結合物及其雙螺旋。

部分J. 胺基修飾之C2連接體之製備 實例74-82

反應圖21

A10B(實例74)之合成

在配備有攪拌棒之測試管中，將A10(100mg,0.061mmol)溶解於DMSO(611μl)中，之後添加Hunig鹼(133μl,0.764mmol)及HATU(76mg,0.199mmol)。20min後，添加溶解於400μL DMSO中之N-(2-胺基乙基)馬來醯亞胺三氟乙酸鹽(12.85mg,0.092mmol)。20min後，測定反應完全並用水(1.5mL)驟冷直至黃色幾乎消散。藉由反相層析(Gilson 2020，溶劑A)存於水中之0.1% TFA/溶劑B)存於ACN中之0.1% TFA，0-50%梯度達15min，40mL/min，XBridge Prep C18 5μm OBD 30×250mm)純化反應物。凍乾所得部分，以得到白色固體，A10B。[M+1，預計值]=1757.807,[M+1，觀察值]=1759.0。

J2(實例75)之合成

關於反應程序，參見B3之合成。J2[M+1，預計值]=7604.750,[M+1，觀察值]=7600.0。

J3(實例76)之合成

將A10B(10.26mg,5.84μmol)溶解於水(700μL)中並添加至1.8mL J2(29.6mg,3.89μmol)之溶液(1水：1乙酸鹽緩衝液：2甲醯胺)中。將反應物於RT下振盪20min且隨後測定完全。使用強陰離子交換層析(Gilson PLC 2020，Sepax Proteomix SAX NP10 21.2×50mm，緩衝液A：3：2三氟乙醇：水，40mM三乙胺/緩衝液B：3：2三氟乙醇：水，40mM三乙胺，1000mM胍-HCl，1%B保持3分鐘，隨後經12分鐘5%B-45%B)純化反應混合物。將各部分以水經3K膜透析三次，以得到白色固體，J3。[M+1，預計值]=9362.556,[M+1，觀察值]=9359.0。

J4(實例77)之合成

向Eppendorf小瓶中將J3(6.34mg,0.678μmol)溶解於水(250μL)中。在單獨Eppendorf小瓶中，將丙酸N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)酯(SPDP)(0.831mg,2.035μmol)溶解於DMSO(50μL)中。向RNA溶液中添加SPDP溶液。4小時後，對反應物再填裝溶解於50μL DMSO中之額外SPDP(2.77mg,6.78μmol)。24hr後，對反應物再填裝溶解於50μL DMSO中之額外SPDP(2.77mg,6.78μmol)。72hr後，在添加390μL pH 8.1碳酸氫鈉下將反應物稀釋至3mg/mL。2hr後，添加額外3當量存於50μL DMSO中之SPDP。將反應混合物以水經3K膜透析三次並凍乾，以得到白色固體，J4。[M+1，預計值]=9543.834,[M+1，觀察值]=9554.0。

J5-Seq26(實例78)之合成

關於反應程序，參見B10-Seq32之合成。J5-Seq26-觀察質量：11413。

J6-Seq26-i(實例79)之合成

關於反應程序，參見B11-Seq32-b之合成。J6-Seq26-i-觀察質量：18265。

J7(實例80)之合成

向Eppendorf小瓶中將J3(5.8mg,0.621μmol)溶解於水(250μL)中。在單獨Eppendorf小瓶中，將琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)(0.727mg,1.862μmol溶解於DMSO(50μL)中並在添加1小滴TFA下將pH調節至pH 5。向RNA溶液中添加SMCC溶液。若干小時後，在逐漸添加0.1N NaOH下將pH滴定至pH 7。18hr後，將6當量SMCC溶解於50μL DMSO中並添加至反應混合物中。4hr後，向反應物中添加額外3當量存於50μL DMSO中之SMCC。若干小時後，向反應物中添加300μL pH 8.1碳酸氫鈉溶液。將反應物以水經3K膜透析三次並凍乾，以得到白色固體，J7。[M+1，預計值]=9543.834,[M+1，觀察值]=9554.0。

J8-Seq26(實例81)之合成

關於反應程序，參見B10-Seq32之合成。J8-Seq26-觀察質量：11545。

J9-Seq26-i(實例82)之合成

關於反應程序，參見B11-Seq32之合成。J9-Seq26-I-預計質量：18397。

J6及J9肽結合物之額外合成.

以類似於針對J6-Seq26、J9-Seq26及J6-Seq26-i、J9-Seq26-i使用之方式之方式製備J6及J9及肽序列之額外結合物及其雙螺旋。

部分K. 3’雙肽連接體 實例83-87

K2(實例83)之合成

在20mL小瓶中，將3-(三苯甲基硫基)丙酸(158mg,0.454mmol)溶解於DMF(1.514mL)中，之後添加HATU(184mg,0.484mmol)及Hunig鹼(0.158mL,0.908mmol)。反應溶液之顏色變為淺黃色。5min後，添加呈固體形式之K1(100mg,0.151mmol)且反應溶液之顏色變為透明橙色。將反應物於RT下攪拌15min且隨後測定完全。

藉由反相層析(Gilson 2020，5-95% ACN/水(含有0.1% TFA改質劑)，流速：20mL/min，梯度時間：22min，管柱：XBridge prep OBD 5μm C18 19×250nm)純化反應物。凍乾所得部分以得到白色固體，K2。[M+1，預計值]=877.059,[M+1，觀察值]=877.4

K3(實例84)之合成

在Eppendorf小瓶中，將K2(10.07mg,0.011mmol)溶解於甲醯胺(0.5mL)中在15mL Falcon管中，將肽Seq ID 74(57.92mg,0.034mmol)溶解於甲醯胺(1mL)中。將肽/甲醯胺溶液添加至連接體/甲醯胺溶液中並於RT下攪拌20min。

測定反應完全並藉由反相層析(Gilson 2020，5-100% ACN/水(含有0.1% TFA改質劑)，流速：20mL/min，梯度時間：30分鐘，管柱：XBridge prep OBD 5μm C18 19×250nm)純化反應物。凍乾所得部分，以得到白色固體，K3。[M+3，預計值]=1416.03,[M+3，觀察值]=1415.0

K4(實例85)之合成

在40mL小瓶中，以體積計之0.83：0.08：0.08混合物來合併TFA(1000μL)、水(96μL)及三異丙基矽烷(96μL)之溶液並將其添加至20mL小瓶中之K3(47mg,0.011mmol)中，將其於RT下攪拌10min。添加額外500μL TFA並將反應物攪拌額外10min。測定反應完全，在減壓下濃縮，用3.5mL存於FMD及MES中之2M硫脲(pH 6.5)稀釋，並藉由反相層析(Gilson 2020，5-80% ACN/水(含有0.1% TFA改質劑)，流速：20mL/min，梯度時間：20分鐘，管柱：XBridge prep OBD 5μm C18 19×250nm)純化。凍乾所得部分以得到白色固體，K4。[M+3，預計值]=1334.34,[M+3，觀察值]=1334.4

K5-Seq 74(實例86)之合成

關於反應程序，參見B10-Seq32之合成。K5-Seq 74-預計質量：13178.103。

K6-Seq 74-b(實例87)之合成

關於反應程序，參見B10-Seq32之合成。過客股觀察質量=15907；導向股觀察質量=8744；雙螺旋=24651。

K5肽結合物及雙螺旋之額外合成.

以類似於針對K5-Seq 74及K6-Seq 74-b使用之方式之方式製備K5及肽序列之額外結合物及相應雙螺旋。

部分L. 導向股位置2’-10,15 ECL肽結合物之製備 實例88-94

L3(實例88)之合成

將((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基)胺基)-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯L1(500mg,0.652mmol)、2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙胺鹽酸鹽(153mg,0.685mmol)及N-甲基嗎啉(0.143mL,1.30mmol)溶解於N,N-二甲基乙醯胺(3mL)中。將反應混合物於RT下陳化16h並藉由反相層析在Waters Xbridge C18管柱(5μM,30×250mm)上使用5-80% ACN/水(含有0.1% TFA)之梯度經20min以40mL/min純化。凍乾產物以產生固體狀L3。MS(m/z)：814(M+1)。

L4(實例89)之合成

將((S)-3-甲基-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-((4-((((2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺基)-5-脲基戊-2-基)胺基)丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯L3(343mg,0.421mmol)及六氫吡啶(200μL,2.02mmol)溶解於N,N-二甲基乙醯胺(3mL)中。將反應混合物於RT下陳化10min，用三氟乙酸(156μL,2.02mmol)驟冷，並藉由反相層析在Waters Xbridge C18管柱(5μM,30×250mm)上使用5-40%乙腈/水(含有0.1%三氟乙酸)之梯度經20min以40mL/min純化。凍乾產物以產生固體狀L4。MS(m/z)：592(M+1)。

L6(實例90)之合成

向(2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)胺基甲酸4-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基酯L4(238mg,0.346mmol)存於二甲基亞碸(1.5mL)中之溶液中添加辛二酸雙(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯L5(509mg,1.382mmol)及三乙胺(0.096mL,0.691mmol)之溶液。將反應混合物陳化15min並在矽膠管柱(80g)上使用1-10%甲醇/二氯甲烷之梯度經30min以60mL/min純化，以產生固體狀L6。MS(m/z)：845(M+1)

L8(實例91)之合成

將RNA化合物L7(163mg,0.024mmol)及2-疊氮基乙胺鹽酸鹽(30mg,0.245mmol)溶解於氬脫氣之3：1之N,N-二甲基乙醯胺：水混合物(2mL)中。添加溴化銅(I)-二甲硫醚複合物(12mg,0.059mmol)之氬脫氣之溶液並將混合物於45℃下陳化16h。將混合物用0.5M EDTA溶液(3mL)驟冷並靜置15min。藉由以水(3×)旋轉透析分離饞，之後凍乾，以產生固體。MS(m/z)：7086。

L9(實例92)之合成

於10℃下將RNA化合物L8(46mg,6.49μmol)及N-甲基嗎啉(7.1mL,65μmol)溶解於水(250μL)及DMSO(250μL)中。向此混合物中添加8-(((S)-3-甲基-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-((4-((((2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺基)-5-脲基戊-2-基)胺基)丁-2-基)胺基)-8-側氧基辛酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯L6(18mg,21 μmol)溶解於DMSO(500μL)中之溶液。將反應混合物陳化16h，用水(1.5mL)稀釋並藉由離子配對層析在Waters Xbridge苯基管柱(5μM,19×250mm)上使用0-55%乙腈/水(含有100mM三乙基乙酸銨)之梯度經15min以20mL/min純化。藉由以水(3×)旋轉透析分離產物，之後凍乾，以產生固體。MS(m/z)：8547。

L10-Seq 463(實例93)之合成

將RNA化合物L9(11mg,1.29μmol)溶解於含有50mM乙酸之三氟乙醇(500μL)中。向此溶液中添加溶解於含有50mM乙酸之三氟乙醇(1000μL)中之肽Seq 463(8.66mg,5.15μmol)。將混合物陳化10min，用N-甲基馬來醯亞胺(1.9mg,44μmol)驟冷並藉由離子配對層析在Waters Xbridge苯基管柱(10μM,19×250mm)上使用5-95%乙腈/水(含有100mM三乙基乙酸銨)之梯度經15min以20mL/min純化。藉由以水(3×)旋轉透析分離產物，之後凍乾，以產生固體。MS(m/z)：11687。

L11-Seq 463-j(實例94)之合成

將L10-Seq 463(2.46mg,0.27μmol)溶解於去離子水(300μL)中之溶液添加至B2(3.1mg,0.27μmol)中並於90℃下加熱1min。凍乾溶液以產生白色固體狀雙螺旋。MS(m/z)過客股：9267，導向股：11686。

L10肽結合物及L11雙螺旋之額外合成.

以類似於上文詳述之方式之方式製備肽序列之額外L10結合物及相應雙螺旋L11。

部分M. 導向股位置2’-10,15二硫化物肽結合物之合成 實例95-98

反應圖24

M1(實例95)之合成

將3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸(506mg,2.35mmol)、2-疊氮基乙胺鹽酸鹽(317mg,2.59mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(496mg,2.59mmol)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(199mg,1.46mmol)及n-甲基嗎啉(0.44mL,4.7mmol)溶解於二氯甲烷(25mL)中。將混合物陳化1h，用飽和碳酸氫鈉溶液(25mL)稀釋並分離有機層。用二氯甲烷(2×25mL)萃取水層，經無水硫酸鈉乾燥合併之有機物，過濾固體並在真空中濃縮。在矽膠管柱(80g)上使用0-50%乙酸乙酯/二氯甲烷之梯度經15min以30mL/min純化混合物，以產生無色油狀M1。MS(m/z)：284。

M2(實例96)之合成

將RNA化合物L7(180mg,26μmol)及M1(59mg,208μmol)溶解於100mM pH 5.5MES緩衝液(3.6mL)及乙腈(0.9mL)中。將此混合物用氬脫氣15min。向此溶液中添加溴化銅(I)-二甲硫醚複合物(13mg,65μmol)溶解於乙腈(0.45mL)中之脫氣溶液並於RT下陳化28h。將混合物用100mM pH 8之EDTA溶液(5mL)驟冷並使其靜置15min。藉由離子配對層析在Waters Xbridge苯基管柱(5μM,30×150mm)上使用0-30%乙腈/水(含有100mM三乙基乙酸銨)之梯度經15min以30mL/min純化混合物。藉由以水(3×)旋轉透析分離產物，之後凍乾，以產生M2之固體。MS(m/z)：7481。

M3-Seq 463(實例97)之合成

將RNA化合物M2(27.3mg,3.65μmol)溶解於含有50mM乙酸之三氟乙醇(1300μL)中。向此溶液中添加溶解於含有50mM乙酸之三氟乙醇(1300μL)中之肽Seq 463(15.4mg,9.13μmol)。將混合物陳化10min，用N-甲基馬來醯亞胺(10.1mg,91μmol)驟冷並藉由離子配對層析在Waters Xbridge苯基管柱(10μM,19×250mm)上使用5-80%乙腈/水(含有100mM三乙基乙酸銨)之梯度經15min以20mL/min純化。藉由以水(3×)旋轉透析分離產物，之後凍乾，以產生M3-Seq 463之固體。MS(m/z)：10624。

M4-Seq 463-j(實例98)之合成

將B2(2.18mg,0.24μmol)溶解於去離子水(290μL)中之溶液添加至M3-Seq 463(2.5mg,0.24μmol)並於90℃下加熱1min。凍乾此溶液以產生白色固體狀雙螺旋M4-Seq 463-j。MS(m/z)過客股：9267，導向股：10621

M3肽結合物及M4雙螺旋之額外合成.

以類似於上文詳述之方式之方式製備肽序列之額外M3結合物及相應雙螺旋M4。

部分N. 導向股位置2’-15二硫化物肽結合物之合成 實例99-100

反應圖25

N3-Seq 283(實例99)之合成

將RNA化合物N2(11mg，1.54μmol；如部分M中針對二-click基質所詳述製備)溶解於含有50mM乙酸之三氟乙醇(1300μL)中。向此溶液中添加溶解於含有50mM乙酸之三氟乙醇(1300μL)中之肽seq283(3.57mg,2.31μmol)。將混合物陳化10min，並藉由離子配對層析在Waters Xbridge苯基管柱(10μM,19×250mm)上使用5-80%乙腈/水(含有100mM三乙基乙酸銨)之梯度經15min以20mL/min純化。藉由以水(3×)旋轉透析分離產物，之後凍乾，以產生固體。MS(m/z)：8600。

N4-Seq 283-k(實例100)之合成

將B2(5.65mg,0.609μmol)溶解於去離子水(423μL)中之溶液添加至N3-Seq 283(5.24mg,0.609μmol)中並於90℃下加熱1min。凍乾溶液以產生白色固體狀雙螺旋。MS(m/z)過客股：9268，導向股：8601。

N3肽結合物及N4雙螺旋之額外合成.

以類似於上文詳述之方式之方式製備肽序列之額外N3結合物及相應雙螺旋N4。

部分O. 導向股位置2’-15 ECL肽結合物之合成 實例101-103

O2(實例101)之合成

將RNA化合物O1(20.7mg，2.97μmol；以類似於L8之方式製備)溶解於100mM NaHCO₃(400μL)及DMSO(300μL)中。向此混合物中添加8-(((S)-3-甲基-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-((4-((((2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺基)-5-脲基戊-2-基)胺基)丁-2-基)胺基)-8-側氧基辛酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯L6(6.28mg,7.43μmol)溶解於DMSO(250μL)中之溶液。將反應混合物陳化15h，用水(1.5mL)稀釋並藉由離子配對層析在Waters Xbridge苯基管柱(5μM,19×250mm)上使用0-60%乙腈/水(含有100mM三乙基乙酸銨)之梯度經15min以20mL/min純化。藉由以水(3×)旋轉透析分離產物，之後凍乾，以產生固體。MS(m/z)：7696。

O2-Seq 463(實例102)之合成

將RNA化合物O2(10mg,1.30μmol)溶解於含有50mM乙酸之三氟乙醇(1000μL)中。向此溶液中添加溶解於含有50mM乙酸之三氟乙醇(500μL)中之肽Seq 463(3.28mg,1.95μmol)。將混合物陳化1h，並藉由離子配對層析在Waters Xbridge苯基管柱(5μM,19×250mm)上使用5-90%乙腈/水(含有100mM三乙基乙酸銨)之梯度經15min以20mL/min純化。藉由以水(3×)旋轉透析分離產物，之後凍乾，以產生固體。MS(m/z)：9268。

O3-Seq 463-k(實例103)之合成

將O2-Seq 463(3.02mg,0.326μmol)溶解於去離子水(303μL)中之溶液添加至B2(3.02mg,0.326μmol)中並於90℃下加熱1min。凍乾溶液以產生白色固體狀雙螺旋。MS(m/z)過客股：9267，導向股：9264。

O2肽結合物及O3雙螺旋之額外合成.

以類似於上文詳述之方式之方式製備肽序列之額外O2結合物及相應雙螺旋O3。

部分P. 導向股位置2’-15膽固醇及肽結合物之合成 實例104-106

反應圖27

P1(實例104)之合成

將RNA化合物N2(67.2mg,9.39μmol)及二異丙基乙基胺(13.1μL,75μmol)溶解於水(750μL)、N,N-二甲基乙醯胺(750μL)及四氫呋喃(1200μL)中。向此混合物中添加硫代膽固醇(30.2mg,75μmol)溶解於四氫呋喃(300μL)中之溶液。將混合物陳化30min，用2M三乙基乙酸銨(100μL)驟冷並藉由離子配對層析在Waters Xbridge苯基管柱(10μM,19×250mm)上使用5-95%乙腈/水(含有100mM三乙基乙酸銨)之梯度經15min以20mL/min純化。藉由以水(3×)旋轉透析分離產物，之後凍乾，以產生固體。MS(m/z)：7451。

P2-Seq 32-k(實例105)之合成

將P1(1.0mg,0.134μmol)溶解於去離子水(200μL)中之溶液添加至B10-Seq 32(1.86mg,0.129μmol)中並於90℃下加熱1min。凍乾溶液以產生白色固體狀雙螺旋。MS(m/z)過客股：13295，導向股：7450。

P2-Seq 32-m(實例106)之合成

亦以與實例105中上文詳述之方式相同之方式使導向股P1與過客股F6-Seq 32形成雙螺旋以提供雙螺旋P2-Seq 32-m：

部分Q. 3’酶裂解之連接體雙肽 實例107-109

Q1(實例107)之合成

在Falcon管中，將L6(13.82mg,0.016mmol)溶解於DMSO(1963μl)中並在冰浴中冷卻至10℃。在單獨Falcon管中，將B4(76.2mg,8.18μmol)溶解於pH 8.3之200mM NaHCO₃(1309μl)中。將RNA溶液添加至DMSO溶液中並5min測定反應完全。

藉由離子配對層析(GX-281，XBridge Prep苯基5μm，OBD，30×150mm，30mL/min，5-45% 100mM存於水中之TEAA/100mM存於ACN中之TEAA，20min梯度)純化反應物。在Millipore 3K、15mL管(4200rpm，4℃)上以3×水透析所得部分且隨後凍乾，以得到白色固體。預計質量：10052.834。實驗質量：10051.0。

Q2-Seq 74(實例108)之合成

關於反應程序，參見B10-Seq74之合成。Q2-Seq 74-實驗質量：13940.012。

Q3-Seq 74-b(實例109)之合成

關於反應程序，參見B11-Seq74之合成。Q3-Seq 74-b-實驗質量：20792。

部分R. 5’,3’二-脂肽結合物 實例110-112

反應圖30

R2(實例110)之合成

將L6(23.2mg)溶解於甲醯胺(300μl)及DMSO(300μl)中，隨後添加溶解於pH 8.3 200mM NaHCO₃水溶液(600μl)中之R1(50mg)。5min後，出現沈澱。添加額外DMSO(300μl)，之後大部分固體重新溶解。15min培育後，使用XBridge Prep苯基管柱(5μM，30×150mm)使用5-45% CH₃CN(100mM TEAA)/水(100mM TEAA)之梯度純化反應物，該梯度係以20mL/min經20min、於260nm下收集。將產物部分用水稀釋以將CH₃CN含量減少至低於20%並以水經3K膜離心透析四次。將滯留物冷凍並凍乾成白色固體。

R3(實例111)之合成

將R2溶解於500μl水中，將反應圖38之化合物35單獨溶解於500μl水中，隨後將GS溶液添加至PS溶液中，於RT下徹底渦旋，隨後檢查分析型SAX HPLC，確認形成雙螺旋。將溶液冷凍乾燥，以得到白色非晶形固體狀雙螺旋。

R4-Seq 27-1(實例112)之合成

將siRNA R3溶解於含有2,2,2-三氟乙醇之50mM乙酸(500μL)中。將肽溶解於含有2,2,2-三氟乙醇之50mM乙酸(500μL)中，隨後添加8M水性胍鎓鹽酸鹽(30μL)。將siRNA溶液添加至肽溶液中以產生澄清溶液。1h後，將反應混合物用甲醯胺(1mL)稀釋並在中性SAX系統(緩衝液A：1：1水：TFE 20mM MES pH 5.5，緩衝液B：1：1水：TFE 20mM MES pH 5.5 1M CsCl)上以兩輪進行純化。將產物部分用水稀釋以將TFE含量減少至低於50%並以水經3K膜透析三次。將滯留物冷凍並凍乾成白色固體。

R3肽結合物及R4雙螺旋之額外合成.

以類似於上文詳述之方式之方式製備肽序列之額外R3結合物及相應雙螺旋R4。

部分S. 替代四GalNAc配體之製備 實例113-115 四GalNAc配體化合物17a、17b及17c之合成

使用以下反應圖31製備四GalNAc化合物17a、17b及17c。

反應圖31

化合物13之合成

向5-氯-1-戊醇(3.0g,24.47mmol)化合物11存於DMF(20mL)中之溶液中添加疊氮化鈉(1.909g,29.4mmol)化合物12。於60℃下攪拌過夜後，在真空中濃縮反應混合物。藉由矽膠層析(EtOAc/己烷1：3)純化殘餘物，從而得到澄清液體狀產物化合物13。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ 3.62(m,2H),3.25(t,J=6.9Hz,2H),1.63-1.53(m,4H), 1.45-1.40(m,2H)。

化合物15之合成

將化合物13(0.796g,6.16mmol)及D-半乳糖胺五乙酸酯(2.00g,5.14mmol)化合物14懸浮於20mL DCM中，之後添加三氟甲烷磺酸(0.154g,1.027mmol)。使所得混合物回流過夜。LC-MS指示SM完全轉化，將反應混合物用EtOAc稀釋並用碳酸氫鈉洗滌並經硫酸鈉乾燥。移除溶劑並藉由ISCO DCM/MeOH經30min自100/0至90/10純化殘餘物，從而獲得白色固體狀化合物15。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ：1.97(6 H,s),2.02(6 H,s),2.06(6 H,s),2.15(6 H,s),3.28(6 H,t,J=6.89Hz),3.50(3 H,dt,J=9.63,6.66Hz),3.68(1 H,q,J=5.98Hz),3.94-3.92(7 H,m),4.16-4.15(5 H,m),4.73(2 H,d,J=8.34Hz),5.31(2 H,dd,J=11.16,3.48Hz),5.40-5.38(5 H,m)。計算質量：[M+H]⁺：C₁₉H₃₁N₄O₉,459.2；觀察值：459.4。

化合物16之合成.

將Lys-炔烴化合物A1(130mg,0.436mmol)及GalNAc疊氮化物6(999mg,2.178mmol)溶解於THF(5mL，脫氣)中。向反應混合物中一次性添加溴化銅(I)-二甲硫醚複合物(17.91mg,0.087mmol)並將THF溶液於40℃下攪拌過夜。反應物顏色變為藍色/綠色，指示出現Cu²⁺，向反應混合物中添加存於0.2mL水中之37mg新鮮抗壞血酸鈉並使其反應過夜。濃縮反應物並藉由RP HPLC 5-60 MeCN(0.5% TFA)/水(0.5% TFA)經20min純化。合併並凍乾所收集部分，從而獲得白色固體狀化合物8。計算質量：[M+3H]³⁺：C₉₄H₁₄₅N₁₈O₃₈,2134.0,m/z=711.3；觀察值：711.9。

化合物17a(實例113)之合成

於0℃下向存於5mL DCM/MeOH=1/1中之經保護四GalNAc化合物8(300mg,0.141mmol)中添加甲醇鈉(91mg,1.688mmol)。將反應物攪拌1h並藉由添加2mL水驟冷。移除揮發性溶劑，並藉由P4生物凝膠利用水純化反應混合物，且合併且凍乾所收集部分，從而獲得白色固體狀化合物9。計算質量：[M+3H]³⁺：C₇₀H₁₂₁N₁₈O₂₆,1629.9,m/z=543.3；觀察值：543.8；[M+2H]²⁺：C₇₀H₁₂₀N₁₈O₂₆,1628.9,m/z=814.5；觀察值：814.9。

化合物17b及17c(實例114及實例115)之合成

以類似於用於化合物17a之方式之方式使用適當疊氮化物來源完成具有以下結構之化合物17b及17c之合成。

實例116 四GalNAc配體之結合之反應圖

以下反應圖32顯示可用於製備四GalNAc-siRNA結合物之通用反應圖。

反應圖32

使用通用反應圖3可獲得結合物10-1、10-2、10-3、10a-1、17a-1、17b-1、17c-1。可在預形成siRNA雙螺旋或上或在單股上實施偶合程序，之後退火。或者，可利用 Bioconjug Chem. 2011,22，第1723-8頁中所概述之方案。

實例117 經由四GalNAc乙酸酯化合物A9之四GalNAc-siRNA結合物(A11-a)之合成

向四GalNAc乙酸酯(A9，58.7mg，0.027mmol)存於乙腈(1.5ml)中之溶液中添加DIPEA(2.2mg,0.055mmol)及HATU(10.44mg,0.027mmol)。將混合物於室溫下攪拌30min，經20min經由注射器幫浦轉移至siRNA(0.014mmol)存於水(1.5ml)及乙腈(1.5ml)中之溶液中，並攪拌30min，之後在真空下將其濃縮至1.5mL。隨後添加碳酸鈉(218mg,2.059mmol)，之後添加MeOH(0.50ml)。將所得溶液於室溫下攪拌16h，濃縮，經由透析純化，並凍乾，從而產生結合物A11-a。

亦可用A10替代A9實施針對A11-a所述之偶合方案。

實例118-119 結合物A11-b及A11-c(實例118及實例119)之合成

對於結合物A11-b及A11-c使用類似方案。可使用針對B11所述之方案實施具有適當反義或有義股之雙螺旋形成。

實例120 3'5'雙四GalNAc-siRNA結合物單股18之合成

向四GalNAc酸化合物10(41.2mg,0.025mmol)存於DMSO(200μL)中之溶液中添加HATU(9.6mg,0.025mmol)及DIPEA(17.6μL,0.126mmol)。將混合物於室溫下攪拌15min，轉移至二胺基-siRNA(18.8mg,2.52μmol)存於水(40μL)及DMSO(360μL)中之溶液中並攪拌30min。將混合物用水(1.5mL)稀釋並在XBridge製備型苯基管柱(5μM，19×250mm)上使用0-30% CH₃CN/含有100mM TEAA之水之梯度純化。經由透析濃縮各部分並凍乾，從而產生化合物18。

實例121 3'5'雙四GalNAc-siRNA雙螺旋結合物19-1之合成(實例121)

使用以下反應圖33製備四GalNAc-siRNA結合物19-1。

向導向siRNA(9.3mg,1.35μmol)溶解於水(100μL)中之溶液中添加3'5'雙四GalNAc-siRNA結合物18(13.7mg,1.29μmol)存於水(200μL)中之溶液並於90℃下加熱1分鐘。冷卻並凍乾所得溶液，從而產生雙螺旋19-1。

實例122 四GalNAc配體化合物24(實例122)之合成

使用以下反應圖34製備四GalNAc化合物24。

化合物22之合成

於0℃下向N-BOC-1,3-二胺基丙烷(化合物20，115mg，0.660mmol)存於1：1 CH₂Cl₂/CH₃CN(1mL)中之溶液中添加3-馬來醯亞胺丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(化合物21，185mg，0.695mmol)溶解於乙腈(4mL)及CH₂Cl₂(1mL)中之溶液。將混合物攪拌1h並在真空下濃縮。藉由矽膠層析(0-5% MeOH/CH₂Cl₂)純化殘餘物，從而得到產物化合物22。計算質量：[M+H]⁺：C₁₅H₂₄N₃O₅,326.2；觀察值：326.3。

化合物23之合成

向馬來醯亞胺化合物22(56mg,0.172mmol)存於CH₂Cl₂(1ml)中之溶液中添加4M HCl(1ml,4.00mmol)存於二噁烷中之溶液。將混合物攪拌1h並在真空下濃縮。將殘餘物與CH₂Cl₂(2×)共沸並在真空下乾燥，從而得到產物化合物23。計算質量：[M+H]⁺：C₁₀H₁₆N₃O₃,226.1；觀察值：226.3。

四GalNAc馬來醯亞胺化合物24(實例122)之合成

向四GalNAc酸化合物10(100mg,0.061mmol)存於DMF(500μL)中之溶液中添加HATU(34.9mg,0.092mmol)、Et₃N(42.6μL,0.306mmol)及N-(3-胺基丙基)-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺鹽酸鹽(16.0mg,0.061mmol)。將混合物於室溫下攪拌1.5h，用TFA酸化並藉由反相0-50% CH₃CN/含有0.1% TFA之水純化。凍乾各部分，從而產生化合物24。計算質量：[M+2H]²⁺：C₇₆H₁₂₅N₂₁O₃₂,1843.8,m/z=921.9；觀察值：922.7。

實例123 化合物26之合成

使用以下反應圖35製備化合物26。

向2'-3,17炔丙基siRNA(RNA 25,33mg,4.49μmol)及PEG9 SPDP 疊氮化物(26mg，36μmol，自市售PEG-疊氮化物及吡啶基二硫化物試劑製備)存於3：1 DMA/水(1mL)中之脫氣溶液中添加溴化銅(I)-二甲硫醚複合物之脫氣溶液(1.8mg,9.0μmol)。將混合物於室溫下攪拌72h，用水(2mL)稀釋，使用0.45μM注射式過濾器過濾並藉由透析濃縮。在XBridge製備型苯基管柱(5μM，19×250mm)上使用0-50% CH₃CN/含有100mM TEAA之水之梯度純化濃縮混合物。經由透析濃縮各部分並凍乾，從而產生化合物26。

實例124-125 化合物27及28(實例124-125)之合成

使用以下反應圖36製備化合物27及28。

反應圖36

化合物27(實例124)之合成

向2'-3,17 click PEG9 SPDP結合物26(13.2mg,1.50μmol)存於水(1mL)中之溶液中添加TCEP鹽酸鹽(9.15mg,32.2μmol)溶解於水(0.5mL)中之溶液。將混合物於RT下攪拌30min，隨後在XBridge製備型苯基管柱(5μM，19×250mm)上使用5-40% CH₃CN/含有100mM TEAA之水之梯度純化。經由透析濃縮各部分並凍乾，從而產生化合物27。

化合物28(實例125)之合成

向2'-3,17-click PEG9SH 27(3mg,0.35μmol)存於pH 6.0乙酸鹽緩衝液(100μL)中之溶液中添加四GalNAc馬來醯亞胺(5.1mg,2.77 μmol)溶解於pH 6.0乙酸鹽緩衝液(100μL)中之溶液。將混合物於室溫下攪拌30min，隨後在XBridge製備型苯基管柱(5μM，19×250mm)上使用5-40% CH₃CN/含有100mM TEAA之水之梯度純化。經由透析濃縮各部分並凍乾，從而產生化合物28。

實例126 2'-3,17雙四GalNAc-siRNA雙螺旋結合物29之合成

對於結合物19詳述之程序用於雙螺旋28以製造結合物29。

實例127 四GalNAc硫醇化合物31之合成

使用以下反應圖37製備化合物31。

向四GalNAc酸化合物10(54mg,0.033mmol)存於N,N-二甲基乙醯胺(500μl)中之溶液中添加胱胺二鹽酸鹽30(14.9mg,0.066mmol)、EDC(12.7mg,0.066mmol)、HOAT(10.2mg,0.066mmol)及DIPEA(57.7μl,0.330mmol)。將混合物於室溫下攪拌18h，隨後添加DTT(50.9mg,0.330mmol)存於N,N-二甲基乙醯胺(100μl)中之溶液。將混合物於室溫下攪拌0.5h，用TFA酸化並藉由反相0-30% CH₃CN/含有0.1% TFA之水純化。凍乾各部分，從而產生化合物31。計算質量：[M+2H]²⁺：C₆₈H₁₁₅N₁₉O₂₉S,1695.8,m/z=847.9；觀察值：848.0。

實例128-130 結合物35-37之合成

使用以下反應圖38製備結合物35-37。

化合物33之合成

向2'-click 15 GS化合物32(130mg,0.019mmol)及(2-疊氮基乙基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯(29.1mg,0.095mmol)存於3：1 DMA/水(2mL)中之脫氣溶液中添加溴化銅(I)-二甲硫醚複合物(9.72mg,0.042mmol)溶解於脫氣DMSO(0.32mL)中之溶液。將混合物於45℃下攪拌2h，冷卻至室溫，並添加pH 8 EDTA(0.5M,2mL)以驟冷反應。攪拌15min並在XBridge製備型苯基管柱(5μM，30×150mm)上使用0-45% CH₃CN/含有100mM TEAA之水之梯度純化。經由透析濃縮各部分。向存於水(3mL)中之合併物質中添加六氫吡啶之溶液(936μL,1.891mmol)。將混合物於4℃下儲存18h，用水(10mL)稀釋並經由注射式過濾器過濾固體。添加pH 8 EDTA(0.5M,2mL)，經由透析濃縮並凍乾，從而產生化合物33。

化合物34之合成

向2'-15 click C2 NH2 GS化合物33(43.6mg,6.26μmol)存於200mM NaHCO3溶液(2000μl)及甲醯胺(1000μL)中之溶液中添加N-琥珀醯亞胺基-3-[2-吡啶基二硫基]丙酸酯(17.9mg,0.057mmol)溶解於DMSO(298μL)中之溶液。將混合物於10℃下攪拌15min，用水(10mL)及甲醯胺(1mL)稀釋，並藉由透析濃縮。添加2M TEAA(200μL)並在XBridge製備型苯基管柱(5μM，19×250mm)上使用5-40% CH₃CN/含有100mM TEAA之水之梯度純化。經由透析濃縮各部分並凍乾，從而產生化合物34。

2'-15四GalNAc-siRNA結合物35(實例128)之合成

向2'-15 click C2 NH2 NHS SPDP GS化合物34(13mg,1.82μmol)存於1：1甲醯胺/水(200μl)中之溶液中添加四GalNAc SH(4.62mg,2.72μmol)存於甲醯胺(200μL)中之溶液。將混合物於室溫下攪拌3.5h，添加2M TEAA(50μL)且在XBridge製備型苯基管柱(2μM，19×250mm)上使用2-35% CH₃CN/含有100mM TEAA之水之梯度純化。經由透析濃縮各部分並凍乾。在Proteomix SAX-NP10管柱(22.1×50mm)上使用2-30%(溶劑A：60：40TFE/水與40mM Et3N，溶劑B：60：40TFE/水與40mM Et3N，1M胍HCl)純化所得固體。經由透析濃縮各部分並凍乾，從而產生結合物35。

結合物36及37(實例129及實例130)之合成

對於結合物19-1詳述之程序用於雙螺旋結合物35及適當過客股以分別製備結合物36及37。

實例131-139 結合物38-45(實例131-139)之合成

使用以下反應圖39及40製備結合物38-44。

反應圖40

反應圖40. 來自表2之用於將四GalNAc結合至siRNA之不同連接體之實例。

步驟1：過客-RNA及連接體，以脯胺酸之實例闡釋方案

向FMOC-PRO-OH(11.11mg,0.033μmol)存於120μL DMSO中之溶液中添加DIPEA(43.2μl,0.247μmol)，之後添加HATU(10.96mg,0.029μmol)。將淺黃色混合物於室溫下攪拌30min。隨後將混合物添加至寡核苷酸過客股TEAA鹽(60mg,8.24μmol)存於500μL(10% H2O/DMSO)中之溶液中，且將混合物於室溫下繼續攪拌1小時。反應混合物經由LC-MS顯示期望產物。向反應混合物中添加二乙胺(43.0μl,0.412μmol)且將混合物攪拌1小時，經由LC-MS確認期望產物。藉由離心透析使用3kDa截止膜純化反應混合物。該製程用水(每次14mL)重複三次。將所得溶液濃縮，冷凍並凍乾過夜，從而產生白色鬆散固體狀產物。LC/MS確認產物[7384.9]。

步驟2：四GalNAc-連接體-過客RNA

向四GalNAc化合物10(53.2mg,0.033μmol)存於532μL DMSO中之溶液中添加DIPEA(42.6μl,0.244μmol)，之後添加HATU(12.36mg,0.033μmol)。將淺黃色混合物於RT下攪拌30min。隨後將混合物添加至連接體-寡核苷酸過客股存於500μL DMSO中之溶液中，且將混合物於室溫下繼續攪拌2小時。LC/MS顯示期望產物。使反應混合物經受使用3kDa截止膜之離心透析。該製程用水(每次14mL)重複三次。藉由Gilson PLC 2020使用XBRIDGE苯基、10-27% CH₃CN與200μM TEAA將所得溶液純化35分鐘。經由使用3kDa截止膜之離心透析濃縮收集溶液。將所得濃縮溶液用1.0N NaCl處理並離心透析。該製程用水(每次14mL)重複五次。將所得濃縮溶液(約1.5mL)冷凍並凍乾過夜，從而產生白色鬆散固體狀產物。LC/MS確認產物[9002.5]。

步驟3：雙螺旋形成

使存於1.5mL水中之四GalNAc-連接體-RNA(18.5mg,2.055μmol)與存於1.5mL水中之ApoB導向股(14.12mg,2.055μmol)形成雙螺旋。將混合物於存在攪拌棒下於90℃下加熱5min。冷卻雙螺旋並移除攪拌棒。經2天凍乾溶液，從而產生白色鬆散固體狀期望雙螺旋結合物38。LC/MS確認產物[16048]。

所有剩餘結合物皆係使用相同通用程序製備。

實例140-142 化合物/結合物46-48之合成

使用以下反應圖41製備化合物及/或結合物46-48。

反應圖41

RNA化合物46(實例140)之合成

將SPDP酸(2.2mg,10.3μmol)溶解於DMSO 100μL中，且依序添加N,N-二異丙基乙胺(14.0μl,0.08mmol)、HATU(19.6mg,0.051mmol)。添加存於200μL DMSO：水(9：1)中之RNA(15mg,2.06μmol)且將所得反應混合物攪拌1h，藉由添加3mL水驟冷反應且透析至500μL，藉由甲醯胺稀釋至3mL且藉由SAX(緩衝液A：60%存於水中之TFE，20mM TEA，緩衝液B：60%存於水中之TFE，20mM TEA，1M CsCl，梯度A/B自100/0至35/65，經15min)純化。合併所收集部分並針對水透析並凍乾，從而獲得白色固體狀化合物46。計算質量：[M-H]^-：C₂₃₄H₃₀₀F₈N₇₂O₁₅₀P₂₃S₃,7480.1；觀察值：7483.0。

結合物47(實例141)之合成

將RNA化合物46(22mg,2.9μmol)及四GalNAc硫醇化合物31(10.0mg,5.9μmol)溶解於400μL甲醯胺：pH=6.8 Tris緩衝液(3：1)中並攪拌1h。藉由SAX(緩衝液A：60%存於水中之TFE，20mM TEA，緩衝液B：60%存於水中之TFE，20mM TEA，1M CsCl，梯度A/B自100/0至35/65，經15min)純化反應混合物。合併所收集部分並針對水透析並凍乾，從而獲得白色固體狀結合物47。計算質量：[M-H]^-：C₂₉₇H₄₁₀F₈N₉₀O₁₇₉P₂₃S₃,9063.9；觀察值：9066.2。

結合物48(實例142)之合成

將結合物47(10.9mg,1.20μmol)及導向股(7.81mg,1.14μmol)在1mL無RNAse之水中混合2h。凍乾反應混合物，從而獲得定量產率之雙螺旋結合物48。

實例143-145 化合物/結合物49-51之合成

使用以下反應圖42製備化合物及/或結合物49-51。

反應圖42

RNA化合物49(實例143)之合成

將33.3mg siRNA過客股稱重至4mL小瓶中，隨後添加1mL 100mM NaHCO3以溶解。添加0.86μL丙酸酐並於RT下攪拌。在陳化約2h後，針對水旋轉透析3×。經由玻璃料過濾並經由凍乾乾燥溶液，從而獲得RNA化合物49。

結合物50(實例144)之合成

步驟1. 向40mL小瓶中裝入2.8mg疊氮化物、25.7mg siRNA、25ml充N2之DMSO及4ml水。充入N₂。裝入2.98mL Cu/配體溶液(充入N₂，20/100μmol，存於10ml DMSO中)。在充N₂下於RT下攪動。

步驟2. 裝入化合物10及1ml DMSO。裝入6μL DIPEA並攪動2 min。裝入6mg HBTU並攪動2min。裝入步驟1之siRNA混合物。反應並不完全，因此裝入一半前述試劑進行重複。蒸發反應混合物，透析並HPLC純化(X-Bridge Phenyl，TEAA/ACN梯度)。蒸發，透析並凍乾，從而獲得結合物50。

結合物51(實例145)之合成

將10.65mg GS(結合物50)溶解於1ml水中並將10.20mg PS(結合物49)溶解於1.17ml水中。向所有結合物50中添加8.7mg結合物49以形成1：1雙螺旋。加熱至90℃並保持1min，經15min冷卻至RT。過濾溶液並經由凍乾乾燥，從而獲得白色固體狀結合物51。

螢光素酶構築體中經Lipofectamine轉染之化合物之RNA沉默活性

產生經螢光素酶載體穩定轉染之HEK293細胞，該載體含有海腎螢光素酶(renilla luciferase)之3'UTR中之siRNA之靶位點。在96孔組織培養板(Corning：編號3903)上以7.5e3個細胞/孔之密度在DMEM 10%血清培養基中接種該等細胞。隨後將細胞板於37℃/5% CO2下培育24hr。在培育後，將板用經轉染試劑Lipofectamine 2000(invitrogen：編號11668-019)共轉染之測試化合物在Opti-MEM(Gibco：編號31985)中根據製造商之方案處理。處理濃度在10nM至0.03pM範圍內。隨後將處理板於37℃/5% CO2下培育24hr。在處理培育後，使細胞裂解並根據Dual-GloTM螢光素酶分析(Promega：E2920)進行處理並在TECAN safire2板讀數器上進行讀數。

HepG2細胞中經Lipofectamine轉染之化合物之RNA沉默活性

在膠原塗佈之板(BioCoat：356649)上以7.5e3個細胞/孔之密度在10% DMEM血清培養基中接種HepG2細胞(ATCC：HB-8065)。隨後將細胞板於37℃/5% CO2下培育24hr。在培育後，將板用經轉染試劑Lipofectamine 2000(invitrogen：編號11668-019)共轉染之測試化合物在Opti-MEM(Gibco：編號31985)中根據invitrogen之方案處理。處理濃度在10nM至0.03pM範圍內。隨後將處理板於37℃/5% CO2下培育24hr。在處理培育後，根據所供應方案將細胞用PLA緩衝液(AB：4448542)裂解。使用高容量cDNA套組(AB：4368813)將所得細胞裂解物反向轉錄至cDNA並使用Life Technology 7900運行qPCR。

RNAi活性之活體內評價

以200μL體積藉由皮下注射投與CD1雌性小鼠。觀察動物之行為或生理變化。在投藥之後72hr藉由CO2窒息殺死動物，之後經由心臟穿刺進行驅血。肝試樣係作為自內葉之3mm穿孔並將其放入RNAlater管中以分離總RNA。藉由Taqman分析使用標準程序實施mRNA敲除分析。

反應圖43. 出於表6中所用之命名之闡釋性目的之一般說明。表6中所用之精確siRNA序列可參見表5。

所選化合物/結合物之活體外及活體內數據之概述示於表6及表7中。

表7. 部分E中產生之化合物之活體外及活體內活性.(起始siRNA序列資訊可參見表8)。

熟習此項技術者將易於瞭解，本發明極其適合實施該等目標並獲得所涉及及彼等存在於本文中之目的與優勢。目前代表較佳實施例之本文所述之方法及組合物係例示性的且並非意欲限制本發明之範疇。彼等熟習此項技術者將構想出本文之變化及其他用途，其涵蓋於本發明之精神中且藉由申請專利範圍之範疇界定。

Claims

一種模組化組合物，其包含：1)單股或雙股寡核苷酸；2)一或多個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同：其中X係-O-、-S-、-CR¹R²-或-NR¹-，其中R¹及R²各獨立地選自由氫及C1-C6烷基組成之群；n係1、2、3或4；且具有「」之鍵指示連接點；視情況，3)一或多個連接體，其可相同或不同；視情況，4)一或多個肽，其獨立地選自SEQ ID No.1至474、或其D-胺基酸、反轉(retro-inverso)及半胱胺酸結合點變體，其可相同或不同；及視情況，5)一或多個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
如請求項1之模組化組合物，其包含：1)單股或雙股寡核苷酸；2)1至8個式(II)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CH₂-或-NH-；且n係1、2、3或4；3)1至24個連接體，其可相同或不同；4)1至8個獨立地選自SEQ ID No.1至474之肽，其可相同或不同；及視情況，5)1至8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
一種模組化組合物，其包含：1)單股或雙股siRNA；2)1至8個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CH₂-或-NH-；且n係1、2、3或4；3)1至24個連接體，其可相同或不同；4)1至12個肽，其獨立地選自SEQ ID No.1至474、或其D-胺基酸、反轉及半胱胺酸結合點變體，其可相同或不同；及視情況，5)1至8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
如請求項3之模組化組合物，其中該等四GalNAc配體及/或該等肽在該siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在該siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至該siRNA；且其中該等四GalNAc配體及/或該等肽視情況經由連接體連接至該siRNA。
如請求項3之模組化組合物，其中式(I)、(II)或(III)之X係-O-、-S-或-CH₂-；且n係1、2或3。
如請求項3之模組化組合物，其中該組合物包含1至4個四GalNAc配體，其可相同或不同。
如請求項3之模組化組合物，其中該組合物包含1至8個肽，其可相同或不同。
如請求項3之模組化組合物，其中該siRNA係雙股；且其中該等四GalNAc配體在該siRNA之核糖環之不同2’位置連接至該siRNA之導向股(guide strand)或過客股(passenger strand)。
如請求項3之模組化組合物，其中該siRNA係雙股；且其中該等四GalNAc配體在該siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至該siRNA之導向股或過客股。
如請求項3之模組化組合物，其中該siRNA係雙股；且其中該等四GalNAc配體在該siRNA之核糖環之不同2’位置及/或不同末端3'及/或5'位置連接至該siRNA之導向股及過客股二者。
如請求項3之模組化組合物，其中該siRNA係雙股；且其中該等肽在該siRNA之核糖環之不同2’位置連接至該siRNA之導向股或過客股。
如請求項3之模組化組合物，其中該siRNA係雙股；且其中該等肽在該siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至該 siRNA之導向股或過客股。
如請求項3之模組化組合物，其中該siRNA係雙股；且其中該等肽在該siRNA之核糖環之不同2’位置及/或不同末端3'及/或5'位置連接至該siRNA之導向股及過客股二者。
如請求項3之模組化組合物，其中該等四GalNAc配體及該等肽連接至該siRNA之同一股。
如請求項3之模組化組合物，其中該等四GalNAc配體及該等肽連接至該siRNA之不同股。
如請求項3之模組化組合物，其中該等四GalNAc配體及該等肽經由連接體連接至該siRNA之同一或不同股。
如請求項16之模組化組合物，其中各連接體獨立地選自表1。
如請求項16之模組化組合物，其中各連接體獨立地選自表2。
如請求項18之模組化組合物，其中該連接體係獨立地選自表2之分支連接體。
如請求項3之模組化組合物，其中該siRNA係雙股；且其中該等視情況之靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑經由連接體連接至該siRNA之同一或不同股。
一種模組化組合物，其包含：1)雙股siRNA；2)1至8個式(IV)、(V)或(VI)之四GalNAc配體： 3)1至24個獨立地選自表1之連接體，其可相同或不同；4)1至12個肽，其獨立地選自SEQ ID No.1至474、或其D-胺基酸、反轉及半胱胺酸結合點變體，其可相同或不同；及視情況，5)1至8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
如請求項21之模組化組合物，其包含：1)雙股siRNA；2)1至4個式(V)之四GalNAc配體；3)1至12個獨立地選自表1之連接體，其可相同或不同；4)1至8個肽，其獨立地選自SEQ ID No.1至474、或其D-胺基酸、反轉及半胱胺酸結合點變體，其可相同或不同；及視情況，5)1至4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中該等四GalNAc配體及/或該等肽在該siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在該siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至該siRNA；且其中該等四GalNAc配體及/或該等肽視情況經由連接體連接至該siRNA。
如請求項21之模組化組合物，其中該等四GalNAc配體及該等肽經由連接體連接至該siRNA之同一股。
如請求項21之模組化組合物，其中該等四GalNAc配體及該等肽經由連接體連接至該siRNA之不同股。
如請求項21之模組化組合物，其包含：1)雙股siRNA；2)1至4個式(V)之四GalNAc配體；3)1至12個獨立地選自表2之連接體，其可相同或不同；4)1至8個肽，其獨立地選自SEQ ID No.2、3、5、7、11、13、19、22、27至32、55、56、63、64、69、71至74、86、90、94、95、106、137、192、200、201、228、229、266、282、333、337、407、423、436、437、461至463、467、468、470、473及474、或其D-胺基酸、反轉及半胱胺酸結合點變體，其可相同或不同；及視情況，5)1至4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中該等四GalNAc配體及/或該等肽在該siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在該siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至該siRNA；且其中該等四GalNAc配體及/或該等肽經由連接體連接至該siRNA。
如請求項25之模組化組合物，其包含獨立地選自SEQ ID No.2、3、5、7、11、13、19、22、27至32、55、56、63、64、69、71至74、86、90、94、95、106、137、192、200、201、228、229、266、282、333、337、407、423、436、437、461至463、467、468、470、473及474之肽之D-胺基酸，其可相同或不同。
如請求項25之模組化組合物，其中該等四GalNAc配體及該等肽經由連接體連接至該siRNA之同一或不同股。
如請求項25之模組化組合物，其中該等四GalNAc配體及該等肽經由連接體連接至該siRNA之不同股。
如請求項25之模組化組合物，其包含：1)雙股siRNA；2)1至4個式(V)之四GalNAc配體；3)1至12個獨立地選自表2之連接體，其可相同或不同；4)1至8個肽，其獨立地選自SEQ ID No.2、3、5、7、11、13、19、22、27至32、55、56、63、64、69、71至74、86、90、94、95、106、137、192、200、201、228、229、266、282、333、337、407、423、436、437、461至463、467、468、470、473及474、或其D-胺基酸、反轉及半胱胺酸結合點變體，其可相同或不同；及視情況，5)1至4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中該等四GalNAc配體及/或該等肽在該siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在該siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至該siRNA；且其中該等四GalNAc配體及/或該等肽經由連接體連接至該siRNA。
如請求項29之模組化組合物，其中該等四GalNAc配體及該等肽經由連接體連接至該siRNA之同一或不同股。
如請求項29之模組化組合物，其包含1個四GalNAc配體，其中該四GalNAc配體經由連接體連接至該siRNA。
如請求項29之模組化組合物，其包含1個肽，其中該肽經由連接體連接至該siRNA。
如請求項29之模組化組合物，其包含2至4個四GalNAc配體，其中該等四GalNAc配體經由連接體連接至該siRNA之同一股或不同股。
如請求項29之模組化組合物，其包含2至4個肽，其中該等肽經由連接體連接至該siRNA之同一股或不同股。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1之模組化組合物及醫藥上可接受之賦形劑。