JP6373762B2 - ターゲット分子細胞内導入用ペプチド - Google Patents
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Description
本出願は、2012年12月28日に出願された、日本国特許出願第2012-287128号明細書(その開示全体が参照により本明細書中に援用される)に基づく優先権を主張する。
項1.pH依存性膜融合ペプチド及び蛋白質導入ドメイン(PTD)を有するターゲット分子細胞内導入用ペプチドであって、該膜融合ペプチドの構成アミノ酸数が21以上である、ターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
[式中、X1、X2及びX3は同一又は異なって、W、H、G、F、Y、C、L、又はTを示す]
を有する、項1に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
(1)前記膜融合ペプチドのアミノ酸配列がGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGF(配列番号1)、GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG(配列番号2)、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGY(配列番号3)、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHG(配列番号4)、LAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALY(配列番号5)、GTFTWTLSDSEGKDTPGGYCLT(配列番号6)、GTFTWTLSDSSGVENPGGYCLT(配列番号7)、AFFSWSLTDSSGKDTPGGYCL(配列番号8)、AFFSWSLTDSSGKDMPGGYCL(配列番号9)、AFFSWSLSDPKGNDMPGGYCL(配列番号10)もしくはGIFSWTITDAVGNDMPGGYCL (配列番号11)であるターゲット分子細胞内導入用ペプチド
(2)前記膜融合ペプチドのアミノ酸配列がGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGF(配列番号1)、GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG(配列番号2)、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGY(配列番号3)、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHG(配列番号4)、LAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALY(配列番号5)、GTFTWTLSDSEGKDTPGGYCLT(配列番号6)、GTFTWTLSDSSGVENPGGYCLT(配列番号7)、AFFSWSLTDSSGKDTPGGYCL(配列番号8)、AFFSWSLTDSSGKDMPGGYCL(配列番号9)、AFFSWSLSDPKGNDMPGGYCL(配列番号10)もしくはGIFSWTITDAVGNDMPGGYCL(配列番号11)で示されるアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ細胞膜透過性を有するターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
(1)前記PTDのアミノ酸配列が、YGRKKRRQRRR(配列番号12)、RRRRRRRRRRR(配列番号13)、もしくはRQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号14)であるターゲット分子細胞内導入用ペプチド
(2)前記PTDのアミノ酸配列がYGRKKRRQRRR(配列番号12)、RRRRRRRRRRR(配列番号13)もしくはRQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号14)で示されるアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ細胞膜透過性を有する該ターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
配列「YGRKKRRQRRR」は、N-YGRKKRRQRRR-C又はN-RRRQRRKKRGY-Cを示し、
配列「GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFYGRKKRRQRRR」は、N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFYGRKKRRQRRR-C又はN-YGRKKRRQRRRFGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-Cを示す。
本発明は、pH依存性膜融合ペプチド及び蛋白質導入ドメイン(PTD)を有するターゲット分子細胞内導入用ペプチドであって、該膜融合ペプチドの構成アミノ酸数が21以上である、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドを提供する。
を有するものが挙げられる。配列X1X2X3の位置としては特に限定されないが、PTDと結合する側の末端が好ましい。配列X1X2X3としては、例えば、YGF、WYG、HGY、WHG、ALY、CLT、YCL等が挙げられる。
[式中、X4はD、E、G又Nを示す。X5はD、E、G又Nを示す。X6はD、E、G又Nを示す。X7はM又はLを示す。X8はD、E、G又Nを示す。但し、(X4、X5、X6、X7、X8)=(G、G、N、M、D)の組み合わせを除く。]
からなるペプチド等を挙げることができる。より具体的には、例えば、配列GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG のうち4個を置換した配列、例えば、GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYG(下線は置換部分、配列番号22)からなるペプチド等が挙げられる。
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFYGRKKRRQRRR-C (ペプチド1、配列番号23)
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRRRQRRKKRGY-C (ペプチド2、配列番号24)
N-YGRKKRRQRRRFGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C (ペプチド3、配列番号25)
N-RRRQRRKKRGYFGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C (ペプチド4、配列番号26)
N-GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYYGRKKRRQRRR-C (ペプチド5、配列番号27)
N-GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYRRRQRRKKRGY-C (ペプチド6、配列番号28)
N-YGRKKRRQRRRYGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C (ペプチド7、配列番号29)
N-RRRQRRKKRGYYGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C (ペプチド8、配列番号30)
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRRR-C (ペプチド9、配列番号31)
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGRRRQRRKKRGY-C (ペプチド10、配列番号32)
N-YGRKKRRQRRRGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C (ペプチド11、配列番号33)
N-RRRQRRKKRGYGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C (ペプチド12、配列番号34)
N-GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYGRKKRRQRRR-C (ペプチド13、配列番号35)
N-GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGRRRQRRKKRGY-C (ペプチド14、配列番号36)
N-YGRKKRRQRRRGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C (ペプチド15、配列番号37)
N-RRRQRRKKRGYGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C (ペプチド16、配列番号38)
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRRRRRRRRRRR-C (ペプチド17、配列番号39)
N-RRRRRRRRRRRFGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C (ペプチド18、配列番号40)
N-GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYRRRRRRRRRRR-C (ペプチド19、配列番号41)
N-RRRRRRRRRRRYGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C (ペプチド20、配列番号42)
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGRRRRRRRRRRR-C (ペプチド21、配列番号43)
N-RRRRRRRRRRRGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C (ペプチド22、配列番号44)
N-GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGRRRRRRRRRRR-C (ペプチド23、配列番号45)
N-RRRRRRRRRRRGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C (ペプチド24、配列番号46)
N-GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYGRRRRRRRRRRR-C (ペプチド25、配列番号47)
N-RRRRRRRRRRRGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-C (ペプチド26、配列番号48)
N-GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYGYGRKKRRQRRR-C (ペプチド27、配列番号49)
N-GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYGRRRQRRKKRGY-C (ペプチド28、配列番号50)
N-YGRKKRRQRRRGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-C (ペプチド29、配列番号51)
N-RRRQRRKKRGYGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-C (ペプチド30、配列番号52)。
上記配列において、下線部はPTDを示し、それ以外の部分は、pH依存性膜融合ペプチドである。
本発明は、前述ターゲット分子細胞内導入用ペプチドとターゲット分子とを結合させてなるターゲット分子複合体を提供する。
本発明は、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。本発明においては、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等いずれのベクターであっても利用できる。
本発明は、前記複合体を有効成分として含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物において、有効成分である前記複合体は単独で用いることも可能であるが、投与経路に応じ、薬学的に許容し得る担体を用いて適当な剤形に製剤化することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、被験体に対し、種々の投与経路、具体的には、経口又は非経口投与(例えば静脈注射、筋肉注射、経鼻粘膜投与、経口腔粘膜投与、経皮投与、皮下投与、皮内投与、直腸投与等)で投与することができる。好ましくは静脈注射、筋肉注射、経鼻粘膜投与等どの非経口的な局所投与である。被験体としては、哺乳動物(ヒト又は非ヒト哺乳動物)等が挙げられ、非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル等が挙げられる。
本発明は、細胞に前記複合体を添加する工程を含む、ターゲット分子を細胞内に導入する方法を提供する。当該方法は、前記複合体をin vitro及びin vivoのいずれで細胞に添加してもよい。
本発明は、前述したターゲット分子細胞内導入用ペプチドを含むターゲット分子の細胞内導入剤を提供する。本発明においては、ターゲット分子細胞内導入用ペプチド自体をターゲット分子の細胞内導入剤として用いてもよく、またターゲット分子細胞内導入用ペプチドを、前述した担体等と混合し製剤化したものを用いてもよい。
東レ株式会社に依頼し、Fmoc (N-(9-フルオレニル)メトキシカルボニル)固相合成法で下記アミノ酸配列からなるペプチドを合成した:
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFYGRKKRRQRRR-C ペプチド1
合成したペプチドはアセトニトリル/H2O/トリフルオロ酢酸グラディエントによる逆相HPLCで95%以上に精製した(分子量4149.7)。
下記のアミノ酸配列からなるペプチドを合成する以外、実施例1と同様にして、ペプチドを合成した:
N-YGRKKRRQRRRFGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C(ペプチド3、分子量4149.7)
N-RRRQRRKKRGYYGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C(ペプチド8、分子量4072.6)
N-YGRKKRRQRRRGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C(ペプチド11、分子量4002.6)
N-RRRRRRRRRRRGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-C(ペプチド26、分子量4261.9)
N-YGRKKRRQRRRGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-C(ペプチド29、分子量4085.6)
上記配列において、下線部はPTDを示し、それ以外の部分は、pH依存性膜融合ペプチドである。
また、上記Fmoc固相合成法において最後のアミノ酸(ペプチド1においてはN末端のG)の伸長に、ビオチン化アミノ酸を用いてPTD側をビオチン化したこと以外、実施例1と同様にして、N末端をビオチン化したペプチドを合成した。得られた化合物を化合物1とする(分子量4394.1)。
また、上記Fmoc固相合成法において最後のアミノ酸(ペプチド1においてはN末端のG)の伸長に、ビオチン化アミノ酸を用いることによりPTD側をビオチン化した(化合物3、8、11、26)。各化合物の分子量は以下の通り:
化合物3、分子量4394.1
化合物8、分子量4316.9
化合物11、分子量4246.9
化合物26、分子量4329.9
また、下記アミノ酸配列を有しN末端をビオチン化したペプチドも同様にして合成した(化合物33)
N-GYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLGRRRRRRRRRRR-C(ペプチド33、分子量4506.2)
比較例1及び2
下記のアミノ酸配列としてからなるペプチドを合成する以外、実施例1’と同様にして、ビオチン化ペプチドを合成した(それぞれ、化合物31〜32とする):
N-RRRQRRKKRGYGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C(ペプチド31)
N-YGRKKRRQRRR-C(ペプチド32)
実施例31及び32ならびに比較例3及び4
市販のストレプトアビジン蛍光性量子ドット(QD)(QD655, invitrogen; 直径30nm)1 μmolに前述の化合物11及び26を1,2,4,8,12,16,20までの様々なモル比で反応させ、様々な数のターゲット分子細胞内導入用ペプチドをQD上に重合させた(これを価数と表現し、x価の場合、1個のQD上にx個のペプチドが結合していることになる)(価数1〜20の複合体をそれぞれ複合体11−1〜11−20及び26−1〜26−20とする)。実験では生細胞としてHeLa細胞を用い、HeLa細胞は細胞培養液X-VIVO bufferで培養した。複合体11−1〜11−20及び26−1〜26−20、50 pMをendosome染色試薬0.25%のDiOと同時に細胞に添加して1時間後に細胞を培養液で洗浄して、さらに2時間培養後に、文献1.Duan H, Nie S. J Am Chem Soc. (2007) Vol. 129,3333-8.と2.Imamura J, Suzuki Y, Gonda K, Roy CN, Gatanaga H, Ohuchi N, Higuchi H. J Biol Chem. (2011) Vol.286, 10581-92.に記載の方法に従って一分子顕微鏡で観察を行い何%のQD粒子がエンドソームに残存するか定量的に観察した。この結果、力価が2,4,8、16、20価と価数が上昇するに従い、QD粒子の取り込みの向上が観察された(図2A)。
配列番号2 膜融合ペプチド
配列番号3 膜融合ペプチド
配列番号4 膜融合ペプチド
配列番号5 膜融合ペプチド
配列番号6 膜融合ペプチド
配列番号7 膜融合ペプチド
配列番号8 膜融合ペプチド
配列番号9 膜融合ペプチド
配列番号10 膜融合ペプチド
配列番号11 膜融合ペプチド
配列番号12 蛋白質導入ドメイン
配列番号13 蛋白質導入ドメイン
配列番号14 蛋白質導入ドメイン
配列番号15 蛋白質導入ドメイン
配列番号16 蛋白質導入ドメイン
配列番号17 蛋白質導入ドメイン
配列番号18 蛋白質導入ドメイン
配列番号19 蛋白質導入ドメイン
配列番号20 蛋白質導入ドメイン
配列番号21 膜融合ペプチド
配列番号22 膜融合ペプチド
配列番号23 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号24 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号25 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号26 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号27 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号28 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号29 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号30 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号31 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号32 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号33 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号34 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号35 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号36 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号37 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号38 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号39 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号40 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号41 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号42 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号43 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号44 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号45 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号46 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号47 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号48 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号49 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号50 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号51 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号52 ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
Claims (10)
- pH依存性膜融合ペプチド及び蛋白質導入ドメイン(PTD)を有するターゲット分子細胞内導入用ペプチドであって、該膜融合ペプチドの構成アミノ酸数が21以上であり、かつ
当該ターゲット分子細胞内導入用ペプチドのアミノ酸配列が、
(1)N-YGRKKRRQRRRGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C、もしくはN-RRRRRRRRRRRGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-Cであるか、または
(2)N-YGRKKRRQRRRGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C、もしくはN-RRRRRRRRRRRGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-Cにおいて1個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されており、かつ該膜融合ペプチドのアミノ酸配列が
N-GYWGX 8 IX 7 GEWGX 6 EIFX 5 AIAX 4 FLG-C
[式中、X 4 はD、E、G又Nを示す。X 5 はD、E、G又Nを示す。X 6 はD、E、G又Nを示す。X 7 はM又はLを示す。X 8 はD、E、G又Nを示す。但し、(X 4 、X 5 、X 6 、X 7 、X 8 )=(G、G、N、M、D)の組み合わせを除く。]である、ターゲット分子細胞内導入用ペプチド。 - 当該ターゲット分子細胞内導入用ペプチドのアミノ酸配列が
(1−1)N-YGRKKRRQRRRGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C、又は
(1−2)N-RRRRRRRRRRRGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-C
である、請求項1に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチド。 - 請求項1又は2に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドとターゲット分子とを結合させてなるターゲット分子複合体。
- ターゲット分子1個に対し、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドが2個以上結合されている、請求項3に記載の複合体。
- ターゲット分子1個に対し、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドが8個以上結合されている、請求項4に記載の複合体。
- 請求項1又は2に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項3〜5のいずれか1項に記載の複合体を有効成分として含む医薬組成物。
- 細胞に請求項3〜5のいずれか1項に記載の複合体を添加する工程を含む、ターゲット分子を、in vitroで細胞内に導入するか、又は非ヒト細胞内に導入する方法。
- 請求項1又は2に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドを含む、ターゲット分子の細胞内導入剤。
- ターゲット分子の細胞内導入剤を製造するための、請求項1又は2に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドの使用。
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