CN116194119A - 用于抑制MARC1表达的RNAi构建体和方法 - Google Patents

用于抑制MARC1表达的RNAi构建体和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于降低MARC1基因表达的RNAi构建体。还描述了使用此类RNAi构建体治疗或预防肝纤维化和脂肪肝病诸如非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪性肝炎的方法。

Description

用于抑制MARC1表达的RNAi构建体和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年8月13日提交的美国临时申请号63/065,190和于2021年6月23日提交的美国临时申请号63/214,016的权益，两者的内容通过引用以其全文并入本文。
电子提交的文本文件的说明
本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且将其通过引用以其全文并入本文。2021年8月3日创建的序列表的计算机可读格式副本命名为A-2664-WO-PCT_ST25，并且大小为1,064千字节。
技术领域
本发明涉及用于调节线粒体偕胺肟还原组分1(mARC1)蛋白质的肝脏表达的组合物及方法。特别地，本发明涉及通过RNA干扰降低MARC1基因表达的基于核酸的治疗剂、及利用这类基于核酸的治疗剂来降低循环脂质水平以及治疗或预防脂肪肝病和肝纤维化的方法。
背景技术
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)构成一系列肝脏病变，为世界上最常见的慢性肝病，其患病率在过去20年中翻倍，且如今据估计影响了约20％-30％世界人口。在一些个体中，肝脏中异位脂肪的积累(称为脂肪变性)触发炎症和肝细胞损伤，导致更晚期疾病，称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NASH被定义为脂质积累，具有细胞损伤、炎症和不同程度的瘢痕或纤维化的迹象。截至2015年，预计7500万至1亿名美国人患有NAFLD，而NASH占NAFLD诊断的大约10％-30％。
mARC1蛋白质是线粒体外膜中的含钼蛋白，对N-氧合分子的还原进行催化(Klein等人,J Biol Chem[生物化学杂志],第287卷(51):42795-42803,2012；Ott等人,J BiolInorg Chem[生物无机化学杂志],第20卷(2):265-275,2015)。它是最突出的生物转化酶之一(CYP450)的高效对应物，并且参与偕胺肟前药的活化以及含有N-羟基化官能团的其他药物的灭活(Neve等人,PLoS One[公共科学图书馆·综合],第10卷(9):e0138487,2015；Ott等人,2015,同上)。最近，据报道，MARC1基因的预测功能丧失变体与降低的血液胆固醇和肝酶水平、降低的肝脏脂肪和肝硬化保护相关。参见Emdin等人,bioRxiv 594523；//doi.org/10.1101/594523,2019；以及Emdin等人,PLoS Genet[PLoS遗传学],第16卷(4):e1008629,2020。具体而言，对8个队列中12,361例全因肝硬化病例和790,095例对照进行分析，mARC1编码区的A165T错义变体与全因肝硬化的保护、计算机断层成像的肝脂肪水平较低、医生诊断的脂肪肝的几率较低以及丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、总胆固醇和LDL胆固醇的低血液水平相关(Emdin等人,2020,同上)。另外还鉴定出了与较低的胆固醇水平、肝酶水平和降低的肝硬化风险相关的MARC1等位基因(M187K错义突变和R200Ter截短突变)(Emdin等人，2020年，同上)。这些数据表明，mARC1酶的缺乏保护免于慢性肝病和肝硬化。因此，靶向mARC1功能的治疗剂代表了降低胆固醇水平(例如非HDL胆固醇或LDL-胆固醇水平)和肝纤维化，以及治疗或预防肝病(特别是NAFLD和NASH)的新方法。
发明内容
本发明部分基于靶向MARC1基因且降低其在肝细胞中的表达的RNAi构建体的设计和产生。MARC1基因表达的序列特异性抑制可用于治疗或预防与血脂水平升高和肝脂肪相关的病症，诸如心血管疾病和脂肪肝病。因此，在一个实施例中，本发明提供一种包含有义链和反义链的RNAi构建体，其中该反义链包含具有与mARC1 mRNA序列基本上互补的序列的区域。例如，在一些实施例中，反义链包含与人mARC1 mRNA序列(SEQ ID NO:1)的区域的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补(有不超过1、2或3个错配)的序列。在某些实施例中，反义链包含具有来自表1或表2中列出的反义序列的至少15个连续核苷酸的区域。
在一些实施例中，本文所述的RNAi构建体的有义链包含与反义链的序列充分互补以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的序列。在这些和其他实施例中，有义链和反义链的长度各自独立地为约19至约30个核苷酸。在一些实施例中，RNAi构建体包含一个或两个平端。在其他实施例中，RNAi构建体包含一个或两个核苷酸突出端。此类核苷酸突出端可包含1至6个未配对核苷酸，且可位于有义链3'端、反义链3'端、或有义链和反义链两者的3'端。在某些实施例中，RNAi构建体在有义链3'端和反义链3'端包含具有两个未配对核苷酸的突出端。在其他实施例中，RNAi构建体在反义链3'端包含具有两个未配对核苷酸的突出端，且在有义链3'端/反义链5'端包含平端。
本发明的RNAi构建体可包含一种或多种经修饰的核苷酸，包括对核糖环、核碱基或磷酸二酯主链具有经修饰的核苷酸。在一些实施例中，RNAi构建体包含一种或多种2'-修饰的核苷酸。此类2'-修饰的核苷酸可包括2'-氟修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、二环核酸(BNA)、脱氧核糖核苷酸、或其组合。在一个特定实施例中，RNAi构建体包含一个或多个2'-氟修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、或其组合。在一些实施例中，RNAi构建体的有义链和反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。无碱基核苷酸可掺入本发明的RNAi构建体中，例如，作为有义链的3'端、5'端、或3'端和5'端的末端核苷酸。在此类实施例中，无碱基核苷酸可以是反向的，例如通过3'-3'核苷酸间键或5'-5'核苷酸间键附接至相邻核苷酸。
在一些实施例中，RNAi构建体包含至少一个主链修饰，例如经修饰的核苷酸间或核苷间键。在某些实施例中，本文所述的RNAi构建体包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在特定实施例中，硫代磷酸酯核苷酸间键可位于有义链和/或反义链的3'或5'端。例如，在一些实施例中，反义链在3'端和5'端两者的末端核苷酸之间包含两个连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些此类实施例中，有义链在其3'端的末端核苷酸之间包含一个或两个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在某些实施例中，本发明的RNAi构建体的反义链和/或有义链可包含来自表1或表2中列出的反义和有义序列的序列或由其组成。在某些此类实施例中，RNAi构建体可为表1至24中任一个所列出的双链体化合物中的任一种。在一些实施例中，RNAi构建体是D-1044、D-1061、D-1062、D-1067、D-1083、D-1090、D-1092、D-1093、D-1095、D-1138、D-1139、D-1143、D-1170、D-1177、D-1180、D-1191、D-1245、D-2000、D-2002、D-2003、D-2004、D-2011、D-2026、D-2028、D-2032、D-2033、D-2034、D-2035、D-2036、D-2042、D-2044、D-2045、D-2046、D-2050、D-2078、D-2079、D-2081、D-2182、D-2196、D-2238、D-2241、D-2243、D-2246、D-2255、D-2356、D-2258、D-2301、D-2316、D-2317、D-2329、D-2332、D-2341、D-2344、D-2357、D-2399或D-2510。在某些实施例中，RNAi构建体是D-2079、D-2081、D-2196、D-2238、D-2241、D-2255、D-2258、D-2317、D-2332、D-2357或D-2399。
在一些实施例中，本发明的RNAi构建体可靶向人mARC1 mRNA转录物(例如SEQ IDNO:1中所述的人mARC1 mRNA转录物序列)的特定区域。例如，在某些实施例中，RNAi构建体包含有义链和反义链，其中该反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1205至1250中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。在其他实施例中，反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1209至1239中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。在又其他实施例中，反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1345至1375中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。在仍其他实施例中，反义链包含具有与SEQID NO:1的核苷酸2039至2078中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。在某些其他实施例中，反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸2048至2074中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。在上述任一实施例中，反义链的序列可与人mARC1转录物(SEQ ID NO:1)的特定区域的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补，在反义链的序列与人mARC1转录物的特定区域的序列之间有不超过1、2或3个错配。在反义链的序列与靶mARC1 mRNA序列的序列之间发生错配的一些此类实施例中，错配可位于靶mARC1mRNA序列与反义链5'端的位置6和/或位置8处的核苷酸之间。在其他实施例中，反义链的序列可与人mARC1转录物(SEQ ID NO:1)的特定区域的至少15个连续核苷酸的序列完全互补。
本发明的RNAi构建体可进一步包含配体，以促进RNAi构建体向特定组织或细胞(诸如肝细胞)的递送或摄取。在某些实施例中，配体靶向该RNAi构建体向肝细胞的递送。在这些和其他实施例中，配体可以包含半乳糖、半乳糖胺、或N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)。在某些实施例中，配体包含多价半乳糖或多价GalNAc部分，如三价或四价半乳糖或GalNAc部分。该配体可以任选地通过接头共价附于RNAi构建体有义链的5'或3'端。在一些实施例中，RNAi构建体包含具有根据本文所述的式I至IX中任一项所述的结构的配体和接头。在某些实施例中，RNAi构建体包含具有根据式VII的结构的配体和接头。在其他实施例中，RNAi构建体包含具有根据式IV的结构的配体和接头。
本发明还提供了包含本文所述的RNAi构建体之一和药学上可接受的载体、赋形剂/或稀释剂的药物组合物。此类药物组合物对于降低MARC1基因在有需要的患者的细胞(例如肝细胞)中的表达特别有用。可施用本发明药物组合物的患者可包括被诊断出心血管疾病、脂肪肝病、肝纤维化或肝硬化或者有患这些疾病的风险的患者，以及血液胆固醇(例如，总胆固醇、非HDL胆固醇或LDL胆固醇)水平升高的患者。因此，本发明包括在有需要的患者中治疗、预防脂肪肝病(例如NAFLD、NASH、酒精性脂肪肝病或酒精性脂肪性肝炎)、肝纤维化、或心血管疾病或减少发展这些的风险的方法，其包括施用本文所述的RNAi构建体或药物组合物。在某些实施例中，本发明提供了用于在有需要的患者中降低血液胆固醇(例如总胆固醇、非HDL胆固醇或LDL胆固醇)水平(血清或血浆)的方法，其包括施用本文所述的RNAi构建体或药物组合物。
特别考虑了mARC1靶向RNAi构建体在本文所述的任何方法中的用途或用于制备根据本文所述的方法施用的药物的用途。例如，本发明包括在用于在有需要的患者中治疗、预防脂肪肝病(例如NAFLD、NASH、酒精性脂肪肝病或酒精性脂肪性肝炎)、肝纤维化、或心血管疾病或减少发展这些的风险的方法中使用的mARC1靶向RNAi构建体。本发明还包括在用于在有需要的患者中降低血液胆固醇(例如总胆固醇、非HDL胆固醇或LDL胆固醇)水平(血清或血浆)的方法中使用的mARC1靶向RNAi构建体。
本发明还涵盖mARC1靶向RNAi构建体在制备用于在有需要的患者中治疗、预防脂肪肝病(例如NAFLD、NASH、酒精性脂肪肝病或酒精性脂肪性肝炎)、肝纤维化、或心血管疾病或减少发展这些的风险的药物中的用途。在某些实施例中，本发明提供了mARC1靶向RNAi构建体在制备用于在有需要的患者中降低血液胆固醇(例如总胆固醇、非HDL胆固醇或LDL胆固醇)水平(血清或血浆)的药物中的用途。
附图说明
图1显示了人MARC1基因的转录物的核苷酸序列(Ensembl转录物编号ENST00000366910.9；SEQ ID NO:1)。该转录物序列被描绘为互补DNA(cDNA)序列，胸腺嘧啶碱基替代尿嘧啶碱基。
图2A和2B是显示了接受皮下注射缓冲液、mARC1 siRNA(双链编号D-1000)或对照siRNA(双链编号D-1002)(每两周一次，持续六周)的ob/ob小鼠中mARC1 mRNA(图2A)和mARC2 mRNA(图2B)的肝脏表达的条形图。在六周时，通过qPCR评估mRNA水平，并相对于仅接受缓冲液注射的动物的mRNA水平表示。
图3A-3H是描绘了接受皮下注射缓冲液、mARC1 siRNA(双链编号D-1000)或对照siRNA(双链编号D-1002)(每两周一次，持续六周)的ob/ob小鼠中的总胆固醇(CHOL；图3A)、LDL胆固醇(LDL；图3B)、HDL胆固醇(HDL；图3C)、甘油三酯(TG；图3D)、丙氨酸转氨酶(ALT；图3E)、天冬氨酸转氨酶(AST；图3F)、C反应蛋白(CRP；图3G)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1；图3H)的血清水平的图。在六周时间点，使用临床分析仪测量不同分析物的血清水平。显示了平均值±平均值的标准误差(SEM)。*＝p<0.05；**＝p<0.01，对比缓冲液对照组。
图4A和4B是显示了接受皮下注射缓冲液、mARC1 siRNA(双链编号D-1000)或对照siRNA(双链编号D-1002)(每两周一次，持续六周)的ob/ob小鼠中在六周时的甘油三酯(肝脏TG；图4A)或总胆固醇(肝脏TC；图4B)的肝脏水平的图。显示了平均值±SEM。***＝p<0.001，对比缓冲液对照组。
图5A和5B是显示了在进行标准饲料饮食(饲料对照)或0.2％胆固醇饮食(TD190883)的c57BL/6小鼠中mARC1 mRNA(图5A)和mARC2 mRNA(图5B)的肝脏表达的条形图。进行0.2％胆固醇饮食的小鼠接受每两周一次皮下注射缓冲液(TD190883对照)、mARC1siRNA(双链编号D-1000)或对照siRNA(双链编号D-1002)，持续24周。在24周时，通过qPCR评估mRNA水平，且相对于饲料对照动物中的mRNA水平表示。
图6A-6F是描绘了进行标准饲料饮食(饲料对照)或0.2％胆固醇饮食(TD190883)的c57BL/6小鼠中天冬氨酸转氨酶(AST；图6A)、丙氨酸转氨酶(ALT；图6B)、总胆固醇(图6C)、LDL胆固醇(LDL-c；图6D)、HDL胆固醇(HDL-c；图6E)和甘油三酯(图6F)的血清水平的图。进行0.2％胆固醇饮食的小鼠接受每两周一次皮下注射缓冲液(TD190883对照)、mARC1siRNA(双链体编号D-1000)或对照siRNA(双链体编号D-1002)，持续24周。在给药后的指示时间，使用临床分析仪测量不同分析物的血清水平。显示了平均值±平均值的标准误差(SEM)。*＝p<0.05；**＝p<0.01，***＝p<0.001，对比TD190883对照组。
图7A-7D是显示了进行标准饲料饮食(饲料对照)或0.2％胆固醇饮食(TD190883)的c57BL/6小鼠在24周时的体重(图7A)、肝脏重量(图7B)、肝脏甘油三酯水平(图7C)和肝脏总胆固醇水平(图7D)的图。进行0.2％胆固醇饮食的小鼠接受每两周一次皮下注射缓冲液(TD190883对照)、mARC1 siRNA(双链体编号D-1000)或对照siRNA(双链体编号D-1002)，持续24周。显示了平均值±SEM。
图8A-8F是在单次皮下注射3mg/kg剂量的GalNAc缀合mARC1siRNA分子D-2241(图8A和8B)、D-2081(图8C和8D)和D-2258(图8E和8F)后食蟹猴中的反义链和有义链血清浓度-时间曲线。图8A、8C和8E描绘了给药后0.083至24小时的浓度-时间曲线，而图8B、8D和8F描绘了给药后0.083至1056小时的浓度-时间曲线。
具体实施方式
本发明涉及用于调节细胞或哺乳动物中MARC1基因的表达的组合物和方法。在一些实施例中，本发明的组合物包含RNAi构建体，其靶向从MARC1基因(特别是人MARC1基因)转录的mRNA，并降低细胞或哺乳动物中mARC1蛋白质的表达。此类RNAi构建体可用于降低血清脂质水平(例如，总胆固醇和LDL胆固醇水平)，治疗或预防各种形式的心血管疾病和脂肪肝病(诸如NAFLD和NASH)，以及降低肝纤维化和进展为肝硬化的风险。
如本文使用的，术语“RNAi构建体”是指包含RNA分子的药剂，当被引入细胞中时该药剂能够利用RNA干扰机制下调靶基因(例如MARC1基因)的表达。RNA干扰是核酸分子以序列特异性方式，例如经过RNA诱导的沉默复合体(RISC)通路，来诱导靶RNA分子(例如信使RNA或mRNA分子)的裂解和降解的过程。在一些实施例中，RNAi构建体包含双链RNA分子，其包含连续核苷酸的两条反平行链，其彼此充分互补以杂交形成双链体区。“杂交(hybridize)”或“杂交(hybridization)”是指互补多核苷酸的配对，典型地是通过在两个多核苷酸中的互补碱基之间的氢键合(例如Watson-Crick氢键合、Hoogsteen氢键合、或反向Hoogsteen氢键合)而配对。包含具有与靶序列(例如靶mRNA)基本上互补的序列的区域的链被称为“反义链”或“指导链”。“有义链”或“过客链”是指包括与反义链的区域基本上互补的区域的链。在一些实施例中，有义链可包含具有与靶序列基本上相同的序列的区域。
双链RNA分子可包括对核糖核苷酸的化学修饰，包括对核糖核苷酸的核糖、碱基或主链组分的修饰，例如本文所述或本领域已知那些。为了本披露的目的，术语“双链RNA”涵盖在双链RNA分子(例如siRNA、shRNA等)中所采用的任何这类修饰。
如本文使用的，如果包含第一序列的多核苷酸可以在某些条件(如生理条件)下与包含第二序列的多核苷酸杂交形成双链体区，则第一序列与第二序列为“互补”。其他这些条件可包括本领域普通技术人员已知的中等或严格杂交条件。若在一个或两个核苷酸序列的整个长度上包含第一序列的多核苷酸与包含第二序列的多核苷酸碱基配对而无任何错配，则认为第一序列与第二序列完全互补(100％互补)。若序列与靶序列至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％互补，则序列与靶序列“基本上互补”。互补百分比可以通过将第一序列中与第二或靶序列中相应位置处的碱基互补的碱基数除以第一序列的总长度来计算。当使两个序列杂交时，如果在30个碱基对双链体区上存在不超过5个、4个、3个或2个的错配，则一个序列也可以说与另一序列基本上互补。通常，若存在如本文所定义的任何核苷酸突出端，则在确定两个序列之间的互补程度时不考虑这些突出端的序列。举例来说，杂交而形成在各链的3'端具有2个核苷酸突出端的19个碱基对双链体区的、长度为21个核苷酸的有义链与长度为21个核苷酸的反义链将会被认为如本文所使用术语那样完全地互补。
在一些实施例中，反义链的区域包含与靶RNA序列(例如mARC1mRNA序列)的区域基本上或完全互补的序列。在此类实施例中，有义链可包含与反义链的序列完全互补的序列。在其他此类实施例中，有义链可包含与反义链的序列基本上互补的序列，例如，在由有义链和反义链形成的双链体区中有1、2、3、4或5个错配。在某些实施例中，优选的是任何错配发生在末端区内(例如，在链的5'和/或3'端的6、5、4、3、或2个核苷酸内)。在一个实施例中，在由有义链和反义链形成的双链体区中的任何错配发生在反义链的5'端的6、5、4、3、或2个核苷酸内。
在某些实施例中，双链RNA的有义链和反义链可以是两个单独的分子，这两个分子杂交而形成双链体区，否则是未连接的。由两条单独链形成的这类双链RNA分子被称为“小干扰RNA”或“短干扰RNA”(siRNA)。因此，在一些实施例中，本发明的RNAi构建体包含siRNA。
在其他实施例中，杂交形成双链体区的有义链和反义链可为单个RNA分子的一部分，即有义链和反义链为单个RNA分子的自身互补区的一部分。在此类情况下，单个RNA分子包含双链体区(还称为茎区)和环区。有义链的3'端经由未配对核苷酸的连续序列而连接至反义链的5'端，这将形成环区。环区典型地具有足够的长度以允许RNA分子自身向后折叠，使得反义链可以与有义链碱基配对以形成双链体或茎区。环区可包含从约3至约25、从约5至约15、或从约8至约12个未配对核苷酸。具有至少部分地自我互补区的这类RNA分子被称为“短发夹RNA”(shRNA)。在某些实施例中，本发明的RNAi构建体包含shRNA。单个的至少部分自我互补的RNA分子的长度可以是约40个核苷酸至约100个核苷酸、约45个核苷酸至约85个核苷酸、或约50个核苷酸至约60个核苷酸，并且包含双链体区和环区，各区具有本文所列举的长度。
在一些实施例中，本发明的RNAi构建体包含有义链和反义链，其中反义链包含具有与mARC1信使RNA(mRNA)序列基本上或完全互补的序列的区域。如本文所用，“mARC1 mRNA序列”是指任何信使RNA序列，包括编码mARC1蛋白质的等位基因变体和剪接变体，包括来自任何物种(例如非人灵长类动物、人)的mARC1蛋白质变体或同种型。该MARC1基因(也称为MTARC1或MOSC1)编码线粒体偕胺肟还原组分1酶(也称为含MOCO硫磺酶C-末端结构域的酶1(MOCO sulphurase C-terminal domain containing 1enzyme))。在人类中，该MARC1基因在染色体1上在基因座1q41发现。
mARC1 mRNA序列还包括表达为其互补DNA(cDNA)序列的转录物序列。cDNA序列是指表达为DNA碱基(例如鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶)而非RNA碱基(例如鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶)的mRNA转录物的序列。因此，本发明的RNAi构建体的反义链可以包含具有与靶mARC1 mRNA序列或mARC1 cDNA序列基本上或完全互补的序列的区域。mARC1mRNA或cDNA序列可包括但不限于Ensembl基因组或美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中的任何mARC1 mRNA或cDNA序列，诸如人序列：Ensembl转录物编号ENST00000366910.9(图1，SEQ ID NO:1)和NCBI参考序列NM_022746.4；食蟹猴序列：NCBI参考序列XR_001490722.1、XR_001490722.1、XR_001490723.1、XR_001490726.1、XR_273285.2、XM_005540901.2、XR_273286.2、XM_005540898.2和XM_005540899.2；恒河猴序列：NCBI参考序列XM_015115809.2、XM_015115815.2、XM_001102192.4和XM_001102284.3；黑猩猩序列：NCBI参考序列XM_009441519.3、XM_001172926.4和XM_009441521.3；大鼠序列：NCBI参考序列XM_017598938.1；和小鼠序列：NCBI参考序列XM_006497192.4。在某些实施例中，mARC1mRNA序列是图1中列出的人转录物(SEQ ID NO:1)。
反义链的区域可以与mARC1 mRNA序列的至少15个连续核苷酸基本上互补或完全互补。在某些实施例中，反义链的区域包含与mARC1 mRNA序列(例如人mARC1 mRNA序列(SEQID NO:1))的区域的至少15、至少16、至少17、至少18或至少19个连续核苷酸的序列基本上互补(有不超过1、2或3个错配)的序列。在相关实施例中，反义链包含具有与mARC1 mRNA序列的区域的至少15、至少16、至少17、至少18、或至少19个连续核苷酸的序列基本上互补(有不超过1个错配)的区域。在反义链序列未与靶mARC1 mRNA序列完全互补并含有错配的实施方案中，错配可发生于靶mARC1mRNA序列与反义链5'端的位置6和/或位置8处的核苷酸之间。在一些实施例中，反义链包含与之互补区域的mARC1 mRNA序列的靶区域的范围可以为约15至约30个连续核苷酸、约16至约28个连续核苷酸、约18至约26个连续核苷酸、约17至约24个连续核苷酸、约19至约30个连续核苷酸、约19至约25个连续核苷酸、约19至约23个连续核苷酸或约19至约21个连续核苷酸。在某些实施例中，包含与mARC1 mRNA序列基本上或完全互补的序列的反义链的区域可以包含来自表1或表2中列出的反义序列的至少15个连续核苷酸。在其他实施例中，反义链的序列包含来自表1或表2中列出的反义序列的至少16、至少17、至少18或至少19个连续核苷酸。
RNAi构建体的有义链典型地包含与反义链的序列充分互补，使得两条链在生理条件下杂交以形成双链体区的序列。“双链体区”是指在两个互补或基本上互补的多核苷酸中的区域，这些多核苷酸通过沃森-克里克碱基配对或其他氢键合相互作用而相互形成碱基对，从而在两个多核苷酸之间形成双链体。RNAi构建体的双链体区应具有足够的长度以允许RNAi构建体进入RNA干扰途径，例如通过使用Dicer酶和/或RISC复合物。例如，在一些实施例中，双链体区的长度为约15至约30个碱基对。在该范围内的双链体区的其他长度也是合适的，例如约15至约28个碱基对、约15至约26个碱基对、约15至约24个碱基对、约15至约22个碱基对、约17至约28个碱基对、约17至约26个碱基对、约17至约24个碱基对、约17至约23个碱基对、约17至约21个碱基对、约19至约25个碱基对、约19至约23个碱基对、或约19至约21个碱基对。在某些实施例中，双链体区的长度为约17至约24个碱基对。在其他实施例中，双链体区的长度为约19至约21个碱基对。在一个实施例中，双链体区的长度为约19个碱基对。在另一个实施例中，双链体区的长度为约21个碱基对。
对于其中有义链和反义链为两个单独分子(例如RNAi构建体包含siRNA)的实施例，有义链和反义链的长度不需要与双链体区的长度相同。例如，一条或两条链可能比双链体区更长，并且具有在双链体区侧面的一个或多个未配对核苷酸或错配。因此，在一些实施例中，RNAi构建体包含至少一个核苷酸突出端。如本文使用的，“核苷酸突出端”是指延伸超过在链末端的双链体区的未配对的一个或多个核苷酸。当一条链的3'端延伸超过另一条链的5'端时或者当一条链的5'端延伸超过另一条链的3'端时，典型地形成核苷酸突出端。核苷酸突出端的长度通常是在1与6个核苷酸之间、1与5个核苷酸之间、1与4个核苷酸之间、1与3个核苷酸之间、2与6个核苷酸之间、2与5个核苷酸之间、或2与4个核苷酸之间。在一些实施例中，核苷酸突出端包含1、2、3、4、5或6个核苷酸。在一个特定实施例中，核苷酸突出端包含1至4个核苷酸。在某些实施例中，核苷酸突出端包含2个核苷酸。在某些其他实施例中，核苷酸突出端包含单个核苷酸。
突出端中的核苷酸可以是如本文所述的核糖核苷酸或经修饰的核苷酸。在一些实施例中，突出端中的核苷酸是2'-修饰的核苷酸(例如2'-氟修饰的核苷酸，2'-O-甲基修饰的核苷酸)、脱氧核糖核苷酸、无碱基核苷酸、反向核苷酸(例如反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸)、或其组合。例如，在一个实施例中，突出端中的核苷酸是脱氧核糖核苷酸，例如脱氧胸苷。在另一个实施例中，突出端中的核苷酸是2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、或其组合。在其他实施例中，突出端包含5'-尿苷-尿苷-3'(5'-UU-3')二核苷酸。在这类实施例中，UU二核苷酸可以包含核糖核苷酸或经修饰的核苷酸，例如2'-修饰的核苷酸。在其他实施例中，突出端包含5'-脱氧胸苷-脱氧胸苷-3'(5'-dTdT-3')二核苷酸。当核苷酸突出端存在于反义链中时，突出端中的核苷酸可以与靶基因序列互补，形成与靶基因序列的错配或包含一些其他序列(例如聚嘧啶或聚嘌呤序列，如UU、TT、AA、GG等)。
核苷酸突出端可以在一条或两条链的5'端或3'端。例如，在一个实施例中，RNAi构建体在反义链的5'端和3'端包含核苷酸突出端。在另一个实施例中，RNAi构建体在有义链的5'端和3'端包含核苷酸突出端。在一些实施例中，RNAi构建体在有义链的5'端和反义链的5'端包含核苷酸突出端。在其他实施例中，RNAi构建体在有义链的3'端和反义链的3'端包含核苷酸突出端。
RNAi构建体可以在双链RNA分子的一端处包含单个核苷酸突出端且在另一个末端包含平端。“平端”意味着有义链与反义链在分子末端完全地碱基配对，并且不存在延伸超出双链体区的未配对核苷酸。在一些实施例中，RNAi构建体在有义链的3'端包含核苷酸突出端，而在有义链的5'端和反义链的3'端包含平端。在其他实施例中，RNAi构建体在反义链的3'端包含核苷酸突出端，且在反义链的5'端和有义链的3'端包含平端。在某些实施例中，RNAi构建体在双链RNA分子两端处包含平端。在此类实施例中，有义链和反义链具有相同长度，且双链体区的长度与有义链和反义链相同(即，该分子在其整个长度上为双链的)。
本发明的RNAi构建体中的有义链和反义链可以各自独立地为约15至约30个核苷酸的长度、约19至约30个核苷酸的长度、约18至约28个核苷酸的长度、约19至约27个核苷酸的长度、约19至约25个核苷酸的长度、约19至约23个核苷酸的长度、约19至约21个核苷酸的长度、约21至约25个核苷酸的长度、或约21至约23个核苷酸的长度。在某些实施例中，有义链和反义链的长度各自独立地为约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、或约25个核苷酸。在一些实施例中，有义链和反义链具有相同的长度，但形成短于这些链使得RNAi构建体具有两个核苷酸突出端的双链体区。例如，在一个实施例中，RNAi构建体包含(i)长度各自为21个核苷酸的有义链和反义链、(ii)长度为19个碱基对的双链体区、和(iii)在有义链的3'端和反义链的3'端的具有2个未配对核苷酸的核苷酸突出端。在另一个实施例中，RNAi构建体包含(i)长度各自为23个核苷酸的有义链和反义链、(ii)长度为21个碱基对的双链体区、和(iii)在有义链的3'端和反义链的3'端的具有2个未配对核苷酸的核苷酸突出端。在其他实施例中，有义链和反义链具有相同长度且在其整个长度上形成双链体区，使得在双链分子的任一端上不存在核苷酸突出端。在一个此类实施例中，RNAi构建体为平端的(例如具有两个平端)且包含(i)其长度各自为21个核苷酸的有义链和反义链和(ii)长度为21个碱基对的双链体区。在另一个此类实施例中，RNAi构建体为平端的(例如具有两个平端)且包含(i)其长度各自为23个核苷酸的有义链和反义链和(ii)长度为23个碱基对的双链体区。在仍另一个此类实施例中，RNAi构建体为平端的(例如具有两个平端)且包含(i)其长度各自为19个核苷酸的有义链和反义链和(ii)长度为19个碱基对的双链体区。
在其他实施例中，有义链或反义链长于另一条链，且两条链形成长度等于较短链长度使得RNAi构建体包含至少一个核苷酸突出端的双链体区。例如，在一个实施例中，RNAi构建体包含(i)长度为19个核苷酸的有义链、(ii)长度为21个核苷酸的反义链、(iii)长度为19个碱基对的双链体区、和(iv)在反义链的3'端的具有2个未配对核苷酸的核苷酸突出端。在另一个实施例中，RNAi构建体包含(i)长度为21个核苷酸的有义链、(ii)长度为23个核苷酸的反义链、(iii)长度为21个碱基对的双链体区、和(iv)在反义链的3'端的具有2个未配对核苷酸的核苷酸突出端。
本发明的RNAi构建体的反义链可包含表1或表2中列出的反义序列中的任一个的序列、这些反义序列中任一个中的核苷酸1-19的序列、或这些反义序列中任一个中的核苷酸2-19的序列或由其组成。因此，在一些实施例中，反义链包含选自SEQ ID NO:671-1339、2072-2803、2906-3061或3321-3655的序列或由其组成。在其他实施例中，反义链包含SEQID NO:671-1339、2072-2803、2906-3061或3321-3655中任一个的核苷酸1-19的序列或由其组成。在仍其他实施例中，反义链包含SEQ ID NO:671-1339、2072-2803、2906-3061或3321-3655中任一个的核苷酸2-19的序列或由其组成。在某些实施例中，反义链包含选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO:715；SEQ ID NO:725；SEQ ID NO:732；SEQ ID NO:733；SEQ IDNO:737；SEQ ID NO:738；SEQ ID NO:739；SEQ ID NO:745；SEQ ID NO:754；SEQ ID NO:757；SEQ ID NO:758；SEQ ID NO:761；SEQ ID NO:762；SEQ ID NO:763；SEQ ID NO:764；SEQ IDNO:766；SEQ ID NO:767；SEQ ID NO:768；SEQ ID NO:770；SEQ ID NO:782；SEQ ID NO:784；SEQ ID NO:801；SEQ ID NO:809；SEQ ID NO:810；SEQ ID NO:811；SEQ ID NO:814；SEQ IDNO:818；SEQ ID NO:821；SEQ ID NO:837；SEQ ID NO:841；SEQ ID NO:842；SEQ ID NO:845；SEQ ID NO:847；SEQ ID NO:848；SEQ ID NO:850；SEQ ID NO:851；SEQ ID NO:855；SEQ IDNO:856；SEQ ID NO:860；SEQ ID NO:861；SEQ ID NO:862；SEQ ID NO:865；SEQ ID NO:875；SEQ ID NO:884；SEQ ID NO:886；SEQ ID NO:891；SEQ ID NO:899；SEQ ID NO:901；SEQ IDNO:907；SEQ ID NO:914；SEQ ID NO:916；SEQ ID NO:920；SEQ ID NO:927；SEQ ID NO:937；SEQ ID NO:1056；SEQ ID NO:1057；SEQ ID NO:1058；SEQ ID NO:1059；SEQ ID NO:1078；SEQ ID NO:2917；SEQ ID NO:2919；SEQ ID NO:2926；SEQ ID NO:2946；SEQ ID NO:2949；SEQ ID NO:2951；SEQ ID NO:2953；和SEQ ID NO:2956。在一些实施例中，反义链包含选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO:715；SEQ ID NO:732；SEQ ID NO:733；SEQ ID NO:737；SEQ ID NO:738；SEQ ID NO:739；SEQ ID NO:745；SEQ ID NO:754；SEQ ID NO:757；SEQ IDNO:761；SEQ ID NO:762；SEQ ID NO:763；SEQ ID NO:764；SEQ ID NO:766；SEQ ID NO:767；SEQ ID NO:784；SEQ ID NO:801；SEQ ID NO:809；SEQ ID NO:810；SEQ ID NO:811；SEQ IDNO:814；SEQ ID NO:841；SEQ ID NO:842；SEQ ID NO:845；SEQ ID NO:848；SEQ ID NO:851；SEQ ID NO:856；SEQ ID NO:860；SEQ ID NO:862；SEQ ID NO:914；SEQ ID NO:916；SEQ IDNO:927；SEQ ID NO:937；SEQ ID NO:1056；SEQ ID NO:1057；SEQ ID NO:1058；SEQ ID NO:1059；SEQ ID NO:1078；SEQ ID NO:2917；SEQ ID NO:2919；SEQ ID NO:2926；SEQ ID NO:2946；SEQ ID NO:2949；SEQ ID NO:2951；SEQ ID NO:2953；和SEQ ID NO:2956。在其他实施例中，反义链包含选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO:715；SEQ ID NO:732；SEQ IDNO:733；SEQ ID NO:738；SEQ ID NO:754；SEQ ID NO:761；SEQ ID NO:763；SEQ ID NO:764；SEQ ID NO:766；SEQ ID NO:809；SEQ ID NO:810；SEQ ID NO:814；SEQ ID NO:841；SEQ IDNO:848；SEQ ID NO:851；SEQ ID NO:862；SEQ ID NO:916；SEQ ID NO:1057；SEQ ID NO:1078；SEQ ID NO:2919；SEQ ID NO:2926；SEQ ID NO:2946；SEQ ID NO:2949；SEQ ID NO:2953；和SEQ ID NO:2956。
在这些和其他实施例中，本发明的RNAi构建体的有义链可包含表1或表2中列出的有义序列中任一个的序列、这些有义序列中任一个中的核苷酸1-19的序列、或这些有义序列中任一个中的核苷酸2-19的序列或由其组成。因此，在一些实施例中，有义链包含选自SEQ ID NO:2-670、1340-2071、2804-2905或3062-3320的序列或由其组成。在其他实施例中，有义链包含SEQ ID NO:2-670、1340-2071、2804-2905或3062-3320中任一个的核苷酸1-19的序列或由其组成。在仍其他实施例中，有义链包含SEQ ID NO:2-670、1340-2071、2804-2905或3062-3320中任一个的核苷酸2-19的序列或由其组成。在某些实施例中，有义链包含选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:68；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:76；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:92；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:95；SEQ IDNO:97；SEQ ID NO:98；SEQ ID NO:99；SEQ ID NO:101；SEQ ID NO:113；SEQ ID NO:115；SEQID NO:132；SEQ ID NO:140；SEQ ID NO:141；SEQ ID NO:142；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:149；SEQ ID NO:152；SEQ ID NO:168；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:173；SEQ ID NO:176；SEQID NO:178；SEQ ID NO:179；SEQ ID NO:181；SEQ ID NO:182；SEQ ID NO:186；SEQ ID NO:187；SEQ ID NO:191；SEQ ID NO:192；SEQ ID NO:193；SEQ ID NO:196；SEQ ID NO:206；SEQID NO:215；SEQ ID NO:217；SEQ ID NO:222；SEQ ID NO:230；SEQ ID NO:232；SEQ ID NO:238；SEQ ID NO:245；SEQ ID NO:247；SEQ ID NO:251；SEQ ID NO:258；SEQ ID NO:268；SEQID NO:387；SEQ ID NO:388；SEQ ID NO:389；SEQ ID NO:390；SEQ ID NO:391；SEQ ID NO:392；SEQ ID NO:409；SEQ ID NO:2808；和SEQ ID NO:2820。在某些其他实施例中，有义链包含选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:68；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:76；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:88；SEQ IDNO:92；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:98；SEQ IDNO:115；SEQ ID NO:132；SEQ ID NO:140；SEQ ID NO:141；SEQ ID NO:142；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:173；SEQ ID NO:176；SEQ ID NO:179；SEQ ID NO:182；SEQ IDNO:187；SEQ ID NO:191；SEQ ID NO:193；SEQ ID NO:245；SEQ ID NO:247；SEQ ID NO:258；SEQ ID NO:268；SEQ ID NO:387；SEQ ID NO:388；SEQ ID NO:389；SEQ ID NO:390；SEQ IDNO:391；SEQ ID NO:392；SEQ ID NO:409；SEQ ID NO:2808；和SEQ ID NO:2820。在又某些实施例中，有义链包含选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:63；SEQ IDNO:64；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:92；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:95；SEQ IDNO:97；SEQ ID NO:140；SEQ ID NO:141；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:179；SEQ ID NO:182；SEQ ID NO:193；SEQ ID NO:247；SEQ ID NO:388；SEQ ID NO:390；SEQ IDNO:391；SEQ ID NO:409；SEQ ID NO:2808；和SEQ ID NO:2820。
在本发明的某些实施例中，RNAi构建体包含(i)包含选自SEQ ID NO:2-670、1340-2071、2804-2905或3062-3320的序列或由其组成的有义链和(ii)包含选自SEQ ID NO:671-1339、2072-2803、2906-3061或3321-3655的序列或由其组成的反义链。在一些实施例中，RNAi构建体包含(i)包含选自以下的序列或由其组成的有义链：SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:68；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:70；SEQ IDNO:76；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:92；SEQ ID NO:93；SEQ IDNO:94；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:98；SEQ ID NO:99；SEQ ID NO:101；SEQID NO:113；SEQ ID NO:115；SEQ ID NO:132；SEQ ID NO:140；SEQ ID NO:141；SEQ ID NO:142；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:149；SEQ ID NO:152；SEQ ID NO:168；SEQ ID NO:172；SEQID NO:173；SEQ ID NO:176；SEQ ID NO:178；SEQ ID NO:179；SEQ ID NO:181；SEQ ID NO:182；SEQ ID NO:186；SEQ ID NO:187；SEQ ID NO:191；SEQ ID NO:192；SEQ ID NO:193；SEQID NO:196；SEQ ID NO:206；SEQ ID NO:215；SEQ ID NO:217；SEQ ID NO:222；SEQ ID NO:230；SEQ ID NO:232；SEQ ID NO:238；SEQ ID NO:245；SEQ ID NO:247；SEQ ID NO:251；SEQID NO:258；SEQ ID NO:268；SEQ ID NO:387；SEQ ID NO:388；SEQ ID NO:389；SEQ ID NO:390；SEQ ID NO:391；SEQ ID NO:392；SEQ ID NO:409；SEQ ID NO:2808；和SEQ ID NO:2820以及(ii)包含选自以下的序列或由其组成的反义链：SEQ ID NO:715；SEQ ID NO:725；SEQID NO:732；SEQ ID NO:733；SEQ ID NO:737；SEQ ID NO:738；SEQ ID NO:739；SEQ ID NO:745；SEQ ID NO:754；SEQ ID NO:757；SEQ ID NO:758；SEQ ID NO:761；SEQ ID NO:762；SEQID NO:763；SEQ ID NO:764；SEQ ID NO:766；SEQ ID NO:767；SEQ ID NO:768；SEQ ID NO:770；SEQ ID NO:782；SEQ ID NO:784；SEQ ID NO:801；SEQ ID NO:809；SEQ ID NO:810；SEQID NO:811；SEQ ID NO:814；SEQ ID NO:818；SEQ ID NO:821；SEQ ID NO:837；SEQ ID NO:841；SEQ ID NO:842；SEQ ID NO:845；SEQ ID NO:847；SEQ ID NO:848；SEQ ID NO:850；SEQID NO:851；SEQ ID NO:855；SEQ ID NO:856；SEQ ID NO:860；SEQ ID NO:861；SEQ ID NO:862；SEQ ID NO:865；SEQ ID NO:875；SEQ ID NO:884；SEQ ID NO:886；SEQ ID NO:891；SEQID NO:899；SEQ ID NO:901；SEQ ID NO:907；SEQ ID NO:914；SEQ ID NO:916；SEQ ID NO:920；SEQ ID NO:927；SEQ ID NO:937；SEQ ID NO:1056；SEQ ID NO:1057；SEQ ID NO:1058；SEQ ID NO:1059；SEQ ID NO:1078；SEQ ID NO:2917；SEQ ID NO:2919；SEQ ID NO:2926；SEQ ID NO:2946；SEQ ID NO:2949；SEQ ID NO:2951；SEQ ID NO:2953；和SEQ ID NO:2956。在其他实施例中，RNAi构建体包含(i)包含选自以下的序列或由其组成的有义链：SEQ IDNO:46；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:68；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:70；SEQ IDNO:76；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:92；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94；SEQ IDNO:95；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:98；SEQ ID NO:115；SEQ ID NO:132；SEQ ID NO:140；SEQID NO:141；SEQ ID NO:142；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:173；SEQ ID NO:176；SEQ ID NO:179；SEQ ID NO:182；SEQ ID NO:187；SEQ ID NO:191；SEQ ID NO:193；SEQID NO:245；SEQ ID NO:247；SEQ ID NO:258；SEQ ID NO:268；SEQ ID NO:387；SEQ ID NO:388；SEQ ID NO:389；SEQ ID NO:390；SEQ ID NO:391；SEQ ID NO:392；SEQ ID NO:409；SEQID NO:2808；和SEQ ID NO:2820以及(ii)包含选自以下的序列或由其组成的反义链：SEQID NO:715；SEQ ID NO:732；SEQ ID NO:733；SEQ ID NO:737；SEQ ID NO:738；SEQ ID NO:739；SEQ ID NO:745；SEQ ID NO:754；SEQ ID NO:757；SEQ ID NO:761；SEQ ID NO:762；SEQID NO:763；SEQ ID NO:764；SEQ ID NO:766；SEQ ID NO:767；SEQ ID NO:784；SEQ ID NO:801；SEQ ID NO:809；SEQ ID NO:810；SEQ ID NO:811；SEQ ID NO:814；SEQ ID NO:841；SEQID NO:842；SEQ ID NO:845；SEQ ID NO:848；SEQ ID NO:851；SEQ ID NO:856；SEQ ID NO:860；SEQ ID NO:862；SEQ ID NO:914；SEQ ID NO:916；SEQ ID NO:927；SEQ ID NO:937；SEQID NO:1056；SEQ ID NO:1057；SEQ ID NO:1058；SEQ ID NO:1059；SEQ ID NO:1078；SEQ IDNO:2917；SEQ ID NO:2919；SEQ ID NO:2926；SEQ ID NO:2946；SEQ ID NO:2949；SEQ IDNO:2951；SEQ ID NO:2953；和SEQ ID NO:2956。在仍其他实施例中，RNAi构建体包含(i)包含选自以下的序列或由其组成的有义链：SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQID NO:69；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:92；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:97；SEQID NO:140；SEQ ID NO:141；SEQ ID NO:145；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:179；SEQ ID NO:182；SEQ ID NO:193；SEQ ID NO:247；SEQ ID NO:388；SEQ ID NO:390；SEQ ID NO:391；SEQID NO:409；SEQ ID NO:2808；和SEQ ID NO:2820以及(ii)包含选自以下的序列或由其组成的反义链：SEQ ID NO:715；SEQ ID NO:732；SEQ ID NO:733；SEQ ID NO:738；SEQ ID NO:754；SEQ ID NO:761；SEQ ID NO:763；SEQ ID NO:764；SEQ ID NO:766；SEQ ID NO:809；SEQID NO:810；SEQ ID NO:814；SEQ ID NO:841；SEQ ID NO:848；SEQ ID NO:851；SEQ ID NO:862；SEQ ID NO:916；SEQ ID NO:1057；SEQ ID NO:1078；SEQ ID NO:2919；SEQ ID NO:2926；SEQ ID NO:2946；SEQ ID NO:2949；SEQ ID NO:2953；和SEQ ID NO:2956。
在某些实施例中，本发明的RNAi构建体包含：(i)包含SEQ ID NO:46的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:715的序列或由其组成的反义链；(ii)包含SEQ ID NO:63的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:732的序列或由其组成的反义链；(iii)包含SEQ ID NO:64的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:733的序列或由其组成的反义链；(iv)包含SEQ ID NO:69的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:738的序列或由其组成的反义链；(v)包含SEQ ID NO:85的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:754的序列或由其组成的反义链；(vi)包含SEQ ID NO:92的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:761的序列或由其组成的反义链；(vii)包含SEQ ID NO:94的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:763的序列或由其组成的反义链；(viii)包含SEQ ID NO:95的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:764的序列或由其组成的反义链；(ix)包含SEQID NO:97的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:766的序列或由其组成的反义链；(x)包含SEQ IDNO:140的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:809的序列或由其组成的反义链；(xi)包含SEQ ID NO:141的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:810的序列或由其组成的反义链；(xii)包含SEQ ID NO:145的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:814的序列或由其组成的反义链；(xiii)包含SEQ ID NO:172的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:841的序列或由其组成的反义链；(xiv)包含SEQ ID NO:179的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:848的序列或由其组成的反义链；(xv)包含SEQID NO:182的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:851的序列或由其组成的反义链；(xvi)包含SEQ ID NO:193的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:862的序列或由其组成的反义链；或(xvii)包含SEQ ID NO:247的序列或由其组成的有义链和包含SEQ IDNO:916的序列或由其组成的反义链。
在某些其他实施例中，本发明的RNAi构建体包含：(i)包含SEQ ID NO:409的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:1078的序列或由其组成的反义链；(ii)包含SEQ IDNO:388的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:1057的序列或由其组成的反义链；(iii)包含SEQ ID NO:2808的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:2926的序列或由其组成的反义链；(iv)包含SEQ ID NO:2820的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:2946的序列或由其组成的反义链；(v)包含SEQ ID NO:391的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:2949的序列或由其组成的反义链；(vi)包含SEQ ID NO:390的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:2956的序列或由其组成的反义链；(vii)包含SEQ ID NO:179的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:2919的序列或由其组成的反义链；(viii)包含SEQ ID NO:388的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:2953的序列或由其组成的反义链；或(ix)包含SEQ ID NO:388的序列或由其组成的有义链和包含SEQ ID NO:1057的序列或由其组成的反义链。
在一些实施例中，本发明的RNAi构建体包含：(i)包含根据SEQ ID NO:2009的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2741的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(ii)包含根据SEQ ID NO:2011的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2743的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(iii)包含根据SEQ ID NO:2012的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2744的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(iv)包含根据SEQ ID NO:2013的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2745的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(v)包含根据SEQ ID NO:2020的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2752的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(vi)包含根据SEQ ID NO:2035的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2767的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(vii)包含根据SEQ ID NO:2037的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2769的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(viii)包含根据SEQ ID NO:2041的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2773的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(ix)包含根据SEQ ID NO:2042的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2774的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(x)包含根据SEQ ID NO:2043的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2775的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(xi)包含根据SEQ IDNO:2044的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2776的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(xii)包含根据SEQ ID NO:2045的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2777的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(xiii)包含根据SEQ ID NO:2051的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2783的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(xiv)包含根据SEQ ID NO:2053的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQID NO:2785的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(xv)包含根据SEQ ID NO:2054的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2786的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(xvi)包含根据SEQ ID NO:2055的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2787的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；或(xvii)包含根据SEQ ID NO:2059的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:2791的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链。
在其他实施例中，本发明的RNAi构建体包含：(i)包含根据SEQ ID NO:3078的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:3337的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(ii)包含根据SEQ ID NO:3080的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:3339的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(iii)包含根据SEQ ID NO:3163的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:3441的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(iv)包含根据SEQ ID NO:3183的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:3469的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(v)包含根据SEQ ID NO:3076的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:3472的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(vi)包含根据SEQ ID NO:3077的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:3484的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(vii)包含根据SEQ ID NO:2051的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:3545的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(viii)包含根据SEQ ID NO:3080的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:3481的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(ix)包含根据SEQ ID NO:3188的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:3339的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；(x)包含根据SEQ ID NO:3080的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:3476的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链；或(xi)包含根据SEQ IDNO:3223的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的有义链和包含根据SEQ ID NO:3517的经修饰的核苷酸的序列或由其组成的反义链。
本发明的RNAi构建体可以是表1至24中列出的任何双链体化合物(包括该化合物的未经修饰的核苷酸序列和/或经修饰的核苷酸序列)。在一些实施例中，RNAi构建体是表1中列出的任何双链体化合物。在其他实施例中，RNAi构建体是表2中列出的任何双链体化合物(包括该化合物的未经修饰的核苷酸序列和/或经修饰的核苷酸序列)。在某些实施例中，RNAi构建体是D-1044、D-1061、D-1062、D-1067、D-1083、D-1090、D-1092、D-1093、D-1095、D-1138、D-1139、D-1143、D-1170、D-1177、D-1180、D-1191、D-1245、D-2000、D-2002、D-2003、D-2004、D-2011、D-2026、D-2028、D-2032、D-2033、D-2034、D-2035、D-2036、D-2042、D-2044、D-2045、D-2046、D-2050、D-2078、D-2079、D-2081、D-2182、D-2196、D-2238、D-2241、D-2243、D-2246、D-2255、D-2258、D-2301、D-2316、D-2317、D-2329、D-2332、D-2341、D-2344、D-2356、D-2357、D-2399或D-2510。在某些其他实施例中，RNAi构建体是D-2079、D-2081、D-2196、D-2238、D-2241、D-2255、D-2258、D-2317、D-2332、D-2357或D-2399。
在某些实施方案中，本发明的RNAi构建体可以靶向人mARC1转录序列的特定区域。如实例4所述和表23所总结，发现与具有与转录物的其他区域互补的反义链的RNAi构建体相比，含设计为具有与人mARC1转录物(SEQ ID NO:1)的某些区域互补的序列的反义链的某些RNAi构建体在体内表现出优越的人mARC1 mRNA体内敲除活性。因此，在本发明的一些实施例中，特别适合于抑制细胞中人MARC1基因的表达的RNAi构建体包含杂交以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的有义链和反义链，其中该反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1205至1250中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。在一个实施例中，反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1209至1239中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。在另一个实施例中，反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1211至1236中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。在一些此类实施例中，反义链具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1205至1250、核苷酸1209至1239、或核苷酸1211至1236中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补(有不超过1、2或3个错配)的序列。在其他实施例中，反义链具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1205至1250、核苷酸1209至1239、或核苷酸1211至1236中的至少15个连续核苷酸的序列完全互补的序列。靶向人mARC1转录物的核苷酸1205至1250的RNAi构建体包括但不限于D-2063、D-2066、D-2076、D-2077、D-2078、D-2080、D-2081、D-2108、D-2113、D-2142、D-2240、D-2241、D-2243、D-2245、D-2246、D-2248、D-2250、D-2251、D-2253、D-2255、D-2256、D-2258、D-2259、D-2261、D-2264、D-2265、D-2268、D-2269、D-2270、D-2271、D-2301、D-2309、D-2311、D-2312、D-2314、D-2316、D-2317、D-2319、D-2321、D-2322、D-2324、D-2326、D-2327、D-2329、D-2331、D-2332、D-2334、D-2336、D-2337、D-2339、D-2341、D-2342、D-2344、D-2346、D-2347、D-2349、D-2351、D-2352、D-2354、D-2356、D-2357、D-2376、D-2380、D-2393、D-2395、D-2396、D-2431、D-2436、D-2437、D-2440、D-2441、D-2444、D-2445、D-2447、D-2453、D-2518、D-2519、D-2520、D-2521、D-2522、D-2523、D-2524、D-2525、D-2526、D-2527、D-2528、D-2529、D-2530、D-2531、D-2532、D-2533、D-2534和D-2535。在一些实施例中，靶向人mARC1转录物的核苷酸1205至1250的RNAi构建体是D-2063、D-2066、D-2076、D-2077、D-2078、D-2080、D-2081、D-2108、D-2113、D-2142或D-2301。在某些实施例中，靶向SEQ ID NO:1的核苷酸1205至1250、特别是核苷酸1211至1236的RNAi构建体包含含有5'-CAUCUAAUAUUCCAG-3'序列(SEQ ID NO:3656)的反义链。
在其他实施例中，本发明的RNAi构建体包含杂交以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的有义链和反义链，其中该反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1345至1375中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。在一个实施例中，反义链包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1345至1375中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补(有不超过1、2或3个错配)的序列。在另一个实施例中，反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1345至1375中的至少15个连续核苷酸的序列完全互补的序列。靶向人mARC1转录物的核苷酸1345-1375的示例性RNAi构建体包括但不限于D-2042、D-2043、D-2047、D-2052、D-2158、D-2162、D-2169、D-2182、D-2183、D-2184、D-2185、D-2186、D-2187、D-2189、D-2211、D-2213、D-2304、D-2305、D-2306、D-2307、D-2308、D-2384、D-2384、D-2385、D-2386、D-2387、D-2388、D-2389、D-2390、D-2391、D-2392、D-2399、D-2400、D-2401、D-2402、D-2403、D-2488、D-2494、D-2500、D-2506、D-2512、D-2538、D-2539、D-2540和D-2541。在一些实施例中，靶向人mARC1转录物的核苷酸1345-1375的RNAi构建体是D-2042、D-2043、D-2047、D-2052、D-2304、D-2305、D-2306、D-2307或D-2308。在某些实施例中，靶向SEQ ID NO:1的核苷酸1345至1375、特别是核苷酸1350至1375的RNAi构建体包含含有5'-UGGGACAUUGAAGCA-3'序列(SEQID NO:3657)的反义链。
在仍其他实施例中，本发明的RNAi构建体包含杂交以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的有义链和反义链，其中该反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸2039至2078中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。在一个实施例中，反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸2048至2074中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。在一些此类实施例中，反义链具有与SEQ ID NO:1的核苷酸2039至2078或核苷酸2048至2074中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补(有不超过1、2或3个错配)的序列。在其他实施例中，反义链具有与SEQ ID NO:1的核苷酸2039至2078或核苷酸2048至2074中的至少15个连续核苷酸的序列完全互补的序列。靶向人mARC1转录物的核苷酸2039-2078的RNAi构建体包括但不限于D-2045、D-2065、D-2079、D-2082、D-2105、D-2106、D-2137、D-2143、D-2166、D-2173、D-2193、D-2242、D-2247、D-2252、D-2257、D-2260、D-2262、D-2266、D-2272、D-2273、D-2302、D-2303、D-2310、D-2313、D-2315、D-2318、D-2320、D-2323、D-2325、D-2328、D-2330、D-2333、D-2335、D-2338、D-2340、D-2343、D-2345、D-2348、D-2350、D-2353、D-2355、D-2358、D-2394、D-2397、D-2454、D-2455、D-2456、D-2457、D-2458、D-2459、D-2460、D-2463、D-2465、D-2465、D-2468、D-2470、D-2472、D-2473、D-2477、D-2487、D-2493、D-2499、D-2505、D-2511、D-2552、D-2553、D-2554、D-2555、D-2556和D-2557。在某些实施方案中，靶向人mARC1转录物的核苷酸2039-2078的RNAi构建体是D-2045、D-2065、D-2079、D-2082、D-2105、D-2106、D-2137、D-2143、D-2302或D-2303。在某些实施例中，靶向SEQ ID NO:1的核苷酸2039至2078、特别是核苷酸2048至2074的RNAi构建体包含含有5'-AUCAGAUCUUAGAGU-3'序列(SEQ ID NO:3658)的反义链。
本发明的RNAi构建体可包含一种或多种经修饰的核苷酸。“经修饰的核苷酸”是指具有针对核苷、核碱基、戊糖环、或磷酸基团的一个或多个经化学修饰的核苷酸。如本文使用的，经修饰的核苷酸不涵盖含有腺苷单磷酸酯、鸟苷单磷酸酯、尿苷单磷酸酯、和胞苷单磷酸酯的核糖核苷酸。然而，该RNAi构建体可包含经修饰的核苷酸和核糖核苷酸的组合。将经修饰的核苷酸并入双链RNA分子的一条或两条链中，可以例如通过降低分子对核酸酶和其他降解过程的敏感性来改善RNA分子的体内稳定性。还可通过掺入经修饰的核苷酸来增强RNAi构建体降低靶基因表达的效力。
在某些实施例中，经修饰的核苷酸具有核糖的修饰。这些糖修饰可以包括在戊糖环的2'和/或5'位置的修饰、以及二环糖修饰。2'-修饰的核苷酸是指具有戊糖环的核苷酸，该戊糖环在2'位置具有除OH以外的取代基。此类2'-修饰包括但不限于2'-H(例如脱氧核糖核苷酸)、2'-O-烷基(例如-O-C1-C10或-O-C1-C10经取代的烷基)、2'-O-烯丙基(-O-CH2CH＝CH2)、2'-C-烯丙基、2'-脱氧-2'-氟(也称为2'-F或2'-氟)、2'-O-甲基(-OCH3)、2'-O-甲氧基乙基(-O-(CH2)2OCH3)、2'-OCF3、2'-O(CH2)2SCH3、2'-O-氨基烷基、2'-氨基(例如-NH2)、2'-O-乙胺和2'-叠氮基。在戊糖环的5'位置的修饰包括但不限于5'-甲基(R或S构型)；5'-乙烯基、和5'-甲氧基。
“二环糖修饰”是指戊糖环的修饰，其中桥将环的两个原子连接而形成第二环从而得到二环糖结构。在一些实施例中，二环糖修饰包含在戊糖环的4'和2'碳之间的桥。包含具有双环糖修饰的糖部分的核苷酸在本文中称为双环核酸或BNA。示例性的二环糖修饰包括但不限于α-L-亚甲基氧基(4'-CH2—O-2')二环核酸(BNA)；β-D-亚甲基氧基(4'-CH2—O-2')BNA(也称为锁核酸或LNA)；乙烯氧基(4'-(CH2)2—O-2')BNA；氨基氧基(4'-CH2—O—N(R)-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基)BNA；氧氨基(4'-CH2—N(R)—O-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基)BNA；甲基(亚甲基氧基)(4'-CH(CH3)—O-2')BNA(也称为受限乙基或cEt)；亚甲基-硫基(4'-CH2—S-2')BNA；亚甲基-氨基(4'-CH2-N(R)-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基)BNA；甲基碳环(4'-CH2—CH(CH3)-2')BNA；丙烯碳环(4'-(CH2)3-2')BNA；和甲氧基(乙烯氧基)(4'-CH(CH2OMe)-O-2')BNA(也称为受限MOE或cMOE)。可以掺入本发明的RNAi构建体中的这些和其他经糖修饰的核苷酸描述于美国专利号9,181,551、美国专利公开号2016/0122761以及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology[化学和生物学],第19卷:937-954,2012，所有这些文献均通过引用以其全文特此并入。
在一些实施例中，RNAi构建体包含一个或多个2'-氟修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、二环核酸(BNA)、脱氧核糖核苷酸、或其组合。在某些实施例中，RNAi构建体包含一个或多个2'-氟修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、或其组合。在一个特定实施例中，RNAi构建体包含一个或多个2'-氟修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、或其组合。
RNAi构建体的有义链和反义链均可包含一个或多个经修饰的核苷酸。例如，在一些实施例中，有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个经修饰的核苷酸。在某些实施例中，有义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。在一些实施例中，反义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个经修饰的核苷酸。在其他实施例中，反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。在某些其他实施例中，有义链中的所有核苷酸和反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。在这些和其他实施例中，经修饰的核苷酸可以是2'-氟修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、或其组合。
在某些实施例中，并入本发明RNAi构建体的一条或两条链中的经修饰的核苷酸具有核碱基(在本文中也称为“碱基”)的修饰。“经修饰的核碱基”或“经修饰的碱基”是指除天然存在的嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)以外的碱基。经修饰的核碱基可以是合成的或天然存在的修饰，并且包括但不限于通用碱基、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤(X)、次黄嘌呤(I)、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤，以及腺嘌呤和鸟嘌呤的其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
在一些实施例中，经修饰的碱基为通用碱基。“通用碱基”是指在不改变所得到的双链体区的双螺旋结构的情况下，与RNA和DNA中的全部天然碱基不加选择地形成碱基对的碱基类似物。通用碱基对于本领域技术人员而言是已知的，包括但不限于：肌苷、C-苯基、C-萘基和其他芳香族衍生物、唑酰胺类、和硝基唑衍生物(如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚)。
可以并入本发明RNAi构建体中的其他合适的经修饰碱基包括在Herdewijn,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.[反义核酸药物开发],第10卷:297-310,2000和Peacock等人,J.Org.Chem.[有机化学杂志],第76卷:7295-7300,2011中所描述的，这些文献特此通过引用以其全文并入。本领域普通技术人员充分了解到鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶可被其他核碱基替代，例如上述经修饰的核碱基，而基本上不改变包含携带此置换核碱基的核苷酸的多核苷酸的碱基配对特性。
在一些实施例中，RNAi构建体的有义链和反义链可以包含一个或多个无碱基核苷酸。“无碱基核苷酸”或“无碱基核苷”是在核糖的1'位置处缺少核碱基的核苷酸或核苷。在某些实施例中，将无碱基核苷酸并入RNAi构建体的有义链和/或反义链的末端。在一个实施例中，有义链在其3'端、其5'端、或其3'和5'端两者处包含作为末端核苷酸的无碱基核苷酸。在另一个实施例中，反义链在其3'端、其5'端、或其3'和5'端两者处包含作为末端核苷酸的无碱基核苷酸。在其中无碱基核苷酸是末端核苷酸的这类实施例中，其可以是反向核苷酸-即通过3'-3'核苷酸间键(当在链的3'端时)或5'-5'核苷酸间键(当在链的5'端时)(不是天然的3'-5'核苷酸间键)与相邻核苷酸连接。无碱基核苷酸也可以包含糖修饰，如以上所述的任何糖修饰。在某些实施例中，无碱基核苷酸包含2'-修饰，如2'-氟修饰、2'-O-甲基修饰、或2'-H(脱氧)修饰。在一个实施例中，无碱基核苷酸包含2'-O-甲基修饰。在另一个实施例中，无碱基核苷酸包含2'-H修饰(即脱氧无碱基核苷酸)。
在某些实施例中，本发明的RNAi构建体可包含根据特定模式(诸如WIPO公开号WO2020/123410中描述的模式)的并入有义和反义链的经修饰的核苷酸，将其通过引用以其全文并入本文。已经显示出具有此类化学修饰模式的RNAi构建体具有改善的体内基因沉默活性。在一个实施例中，本发明的RNAi构建体包含含有彼此充分互补以形成至少15个碱基对的双链体区的序列的有义链和反义链，其中：
·在反义链(从5'端开始计数)的位置2、7、和14处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸；
·在有义链的与反义链(从5'端开始计数)中的位置8至11和13配对的位置处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸；和
·有义链或反义链均不具有超过7个的总的2'-氟修饰的核苷酸。
在其他实施例中，本发明的RNAi构建体包含含有彼此充分互补以形成至少19个碱基对的双链体区的序列的有义链和反义链，其中：
·在反义链(从5'端开始计数)的位置2、7、和14处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸，位置4、6、10、和12(从5'端开始计数)处的核苷酸任选地是2'-氟修饰的核苷酸，并且反义链中所有其他的核苷酸是除2'-氟修饰的核苷酸之外的经修饰的核苷酸；和
·在有义链的与反义链(从5'端开始计数)中的位置8至11和13配对的位置处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸，在有义链的与反义链(从5'端开始计数)中的位置3和5配对的位置处的核苷酸任选地是2'-氟修饰的核苷酸；且有义链中的所有其他核苷酸是除2'-氟修饰的核苷酸之外的经修饰的核苷酸。
在这类实施例中，除2'-氟修饰的核苷酸之外的经修饰的核苷酸可以选自2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、BNA、和脱氧核糖核苷酸。在这些和其他实施例中，有义链的3'端、5'端、或3'端和5'端两者处的末端核苷酸可以是无碱基核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在这类实施例中，无碱基核苷酸或脱氧核糖核苷酸可以是反向的-即通过3'-3'核苷酸间键(当在链的3'端时)或5'-5'核苷酸间键(当在链的5'端时)(不是天然的3'-5'核苷酸间键)与相邻核苷酸连接。
在上述任何实施例中，在反义链(从5'端开始计数)的位置2、7、12、和14处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸。在其他实施例中，在反义链(从5'端开始计数)的位置2、4、7、12、和14处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸。在又其他实施例中，在反义链(从5'端开始计数)的位置2、4、6、7、12、和14处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸。在仍其他实施例中，在反义链(从5'端开始计数)的位置2、4、6、7、10、12、和14处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸。在替代性实施例中，在反义链(从5'端开始计数)的位置2、7、10、12、和14处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸。在某些其他实施例中，在反义链(从5'端开始计数)的位置2、4、7、10、12、和14处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸。
在上述任何实施例中，在有义链的与反义链(从5'端开始计数)中的位置3、8至11和13配对的位置处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸。在一些实施例中，在有义链的与反义链(从5'端开始计数)中的位置5、8至11和13配对的位置处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸。在其他实施例中，在有义链的与反义链(从5'端开始计数)中的位置3、5、8至11和13配对的位置处的核苷酸是2'-氟修饰的核苷酸。
在一些实施例中，本发明的RNAi构建体包含由式(A)表示的结构：
5'-(NA)x NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NM NL NM NL NT(n)y-3'
3'-(NB)z NL NL NL NL NL NF NL NM NL NM NL NL NF NM NL NM NL NF NL-5'
(A)
在式(A)中，按5'至3'方向列出的上链是该有义链并且按3'至5'方向列出的下链是该反义链；每个NF代表2'-氟修饰的核苷酸；每个NM独立地代表选自以下的经修饰的核苷酸：2'-氟修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、BNA和脱氧核糖核苷酸；每个NL独立地代表选自以下的经修饰的核苷酸：2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、BNA和脱氧核糖核苷酸；并且NT代表选自以下的经修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、BNA和脱氧核糖核苷酸。X可以是0至4的整数，条件是当x是1、2、3、或4时，这些NA核苷酸中的一个或多个是独立地选自以下的经修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、BNA和脱氧核糖核苷酸。这些NA核苷酸中的一个或多个可以与该反义链中的核苷酸互补。Y可以是0至4的整数，条件是当y是1、2、3、或4时，一个或多个n核苷酸是不与该反义链中的核苷酸发生碱基配对的经修饰的或未经修饰的突出端核苷酸。Z可以是0至4的整数，条件是当z是1、2、3、或4时，这些NB核苷酸中的一个或多个是独立地选自以下的经修饰的核苷酸：2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、BNA和脱氧核糖核苷酸。这些NB核苷酸中的一个或多个可以与NA核苷酸互补(当NA核苷酸存在于该有义链中时)，或者可以是不与该有义链中的核苷酸发生碱基配对的突出端核苷酸。
在其中RNAi构建体包含由式(A)表示的结构的一些实施例中，在有义链的3'端处有核苷酸突出端-即y是1、2、3、或4。在一个这类实施例中，y是2。在其中在有义链的3'端处有2个核苷酸的突出端(即y是2)的实施例中，x是0并且z是2或x是1并且z是2。在其中RNAi构建体包含由式(A)表示的结构的其他实施例中，RNAi构建体包含在有义链的3'端和反义链的5'端的平端(即y是0)。在其中有义链的3'端处无核苷酸突出端(即y是0)的这类实施例中：(i)x是2并且z是4，(ii)x是3并且z是4，(iii)x是0并且z是2，(iv)x是1并且z是2，或者(v)x是2并且z是2。在其中x大于0的任何实施例中，NA核苷酸(有义链的5'端的末端核苷酸)可以是反向核苷酸，如反向无碱基核苷酸或反向脱氧核糖核苷酸。
在其中该RNAi构建体包含由式(A)表示的结构的某些实施例中，在从5'端开始计数的该反义链中的位置4和12处的该NM各自为2'-氟修饰的核苷酸。在其他实施例中，在从5'端开始计数的该反义链中的位置4、6、和12处的该NM各自为2'-氟修饰的核苷酸。在又其他实施例中，在从5'端开始计数的该反义链中的位置4、6、10、和12处的该NM各自为2'-氟修饰的核苷酸。在其中该RNAi构建体包含由式(A)表示的结构的替代性实施例中，在从5'端开始计数的该反义链中的位置10和12处的该NM各自为2'-氟修饰的核苷酸。在相关的实施例中，在从5'端开始计数的该反义链中的位置4、10、和12处的该NM各自为2'-氟修饰的核苷酸。在其中该RNAi构建体包含由式(A)表示的结构的其他替代性实施例中，在从5'端开始计数的该反义链中的位置4、6、和10处的该NM是2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且在从5'端开始计数的该反义链中的位置12处的该NM是2'-氟修饰的核苷酸。在其中RNAi构建体包含由式(A)表示的结构的一些实施例中，有义链中的每个NM是2'-O-甲基修饰的核苷酸。在其他实施例中，有义链中的每个NM是2′-氟修饰的核苷酸。在其中RNAi构建体包含由式(A)表示的结构的仍其他实施例中，在有义链和反义链两者中的每个NM均是2'-O-甲基修饰的核苷酸。
在其中RNAi构建体包含由式(A)表示的结构的上述任何实施例中，在有义链和反义链两者中的每个NL均可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸。在这些实施例和以上所述的任何实施例中，式(A)中的NT可以是反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、或2'-O-甲基修饰的核苷酸。
在本发明的其他实施例中，本发明的RNAi构建体包含由式(B)表示的结构：
5'-(NA)x NL NL NL NL NM NL NF NF NF NF NL NL NL NL NL NL NL NL NT(n)y-3'
3'-(NB)z NL NL NL NM NL NF NL NM NL NL NM NM NM NM NL NM NL NF NL-5'
(B)
在式(B)中，按5′至3′方向列出的上链是该有义链并且按3′至5′方向列出的下链是该反义链；每个NF代表2'-氟修饰的核苷酸；每个NM独立地代表选自以下的经修饰的核苷酸：2'-氟修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、BNA和脱氧核糖核苷酸；每个NL独立地代表选自以下的经修饰的核苷酸：2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、BNA和脱氧核糖核苷酸；并且NT代表选自以下的经修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、BNA和脱氧核糖核苷酸。X可以是0至4的整数，条件是当x是1、2、3、或4时，这些NA核苷酸中的一个或多个是独立地选自以下的经修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、BNA和脱氧核糖核苷酸。这些NA核苷酸中的一个或多个可以与该反义链中的核苷酸互补。Y可以是0至4的整数，条件是当y是1、2、3、或4时，一个或多个n核苷酸是不与该反义链中的核苷酸发生碱基配对的经修饰的或未经修饰的突出端核苷酸。Z可以是0至4的整数，条件是当z是1、2、3、或4时，这些NB核苷酸中的一个或多个是独立地选自以下的经修饰的核苷酸：2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、BNA和脱氧核糖核苷酸。这些NB核苷酸中的一个或多个可以与NA核苷酸互补(当NA核苷酸存在于该有义链中时)，或者可以是不与该有义链中的核苷酸发生碱基配对的突出端核苷酸。
在其中RNAi构建体包含由式(B)表示的结构的一些实施例中，在有义链的3'端处有核苷酸突出端-即y是1、2、3、或4。在一个这类实施例中，y是2。在其中在有义链的3'端处有2个核苷酸的突出端(即y是2)的实施例中，x是0并且z是2或x是1并且z是2。在其中RNAi构建体包含由式(B)表示的结构的其他实施例中，RNAi构建体包含在有义链的3'端和反义链的5'端的平端(即y是0)。在其中有义链的3'端处无核苷酸突出端(即y是0)的这类实施例中：(i)x是2并且z是4，(ii)x是3并且z是4，(iii)x是0并且z是2，(iv)x是1并且z是2，或者(v)x是2并且z是2。在其中x大于0的任何实施例中，NA核苷酸(有义链的5'端的末端核苷酸)可以是反向核苷酸，如反向无碱基核苷酸或反向脱氧核糖核苷酸。
在其中该RNAi构建体包含由式(B)表示的结构的某些实施例中，在从5'端开始计数的该反义链中的位置4、6、8、9和16处的该NM各自为2'-氟修饰的核苷酸并且在从5'端开始计数的该反义链中的位置7和12处的NM各自为2'-O-甲基修饰的核苷酸。在其他实施例中，在从5'端开始计数的该反义链中的位置4和6处的该NM各自为2'-氟修饰的核苷酸并且在从5'端开始计数的该反义链中的位置7至9处的NM各自为2'-O-甲基修饰的核苷酸。在仍其他实施例中，在从5'端开始计数的该反义链中的位置4、6、8、9和16处的该NM各自为2'-O-甲基修饰的核苷酸并且在从5'端开始计数的该反义链中的位置7和12处的NM各自为2'-氟修饰的核苷酸。在其中该RNAi构建体包含由式(B)表示的结构的替代性实施例中，在从5'端开始计数的该反义链中的位置4、6、8、9和12处的该NM各自为2'-O-甲基修饰的核苷酸并且在从5'端开始计数的该反义链中的位置7和16处的NM各自为2'-氟修饰的核苷酸。在其中该RNAi构建体包含由式(B)表示的结构的某些其他实施例中，在从5'端开始计数的该反义链中的位置7、8、9和12处的该NM各自为2'-O-甲基修饰的核苷酸并且在从5'端开始计数的该反义链中的位置4、6、和16处的NM各自为2'-氟修饰的核苷酸。在其中RNAi构建体包含由式(B)表示的结构的这些和其他实施例中，有义链中的NM是2′-氟修饰的核苷酸。在替代性实施例中，有义链中的NM是2'-O-甲基修饰的核苷酸。
在其中RNAi构建体包含由式(B)表示的结构的上述任何实施例中，在有义链和反义链两者中的每个NL均可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸。在这些实施例和以上所述的任何实施例中，式(B)中的NT可以是反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、或2'-O-甲基修饰的核苷酸。
本发明的RNAi构建体还可以包含一个或多个经修饰的核苷酸间键。如本文使用的，术语“经修饰的核苷酸间键”是指除天然3'至5'磷酸二酯键以外的核苷酸间键。在一些实施例中，经修饰的核苷酸间键是含磷的核苷酸间键，如磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、烷基膦酸酯(例如甲基膦酸酯、3'-亚烷基膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(例如3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、和硼烷磷酸酯。在一个实施例中，经修饰的核苷酸间键是2'至5'磷酸二酯键。在其他实施例中，经修饰的核苷酸间键为不含磷核苷酸间键，且因此可称为经修饰的核苷间键。此类不含磷的键包括但不限于吗啉键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷键(—O—Si(H)2—O—)；硫化物、亚砜和砜键；甲酰基和硫代甲酰基键；含烯的骨架；氨基磺酸盐骨架；亚甲基甲亚氨基(—CH2—N(CH3)—O—CH2—)和亚甲基肼键；磺酸盐和磺酰胺键；酰胺键；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他。在一个实施例中，经修饰的核苷间键为产生肽核酸或PNA的基于肽的键(例如氨基乙基甘氨酸)，例如美国专利号5,539,082、5,714,331、和5,719,262中所述的那些。可以在本发明的RNAi构建体中使用的其他合适的经修饰的核苷酸间和核苷间键描述于美国专利号6,693,187、美国专利号9,181,551、美国专利公开号2016/0122761以及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology[化学和生物学],第19卷:937-954,2012，所有这些文献均通过引用以其全文特此并入。
在某些实施例中，本发明的RNAi构建体包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯核苷酸间键可以存在于RNAi构建体的有义链、反义链或两条链中。例如，在一些实施例中，有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。在其他实施例中，反义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。在仍其他实施例中，两条链包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。RNAi构建体可以在有义链、反义链、或两条链的3'-端、5'-端、或者3'-和5'-端两者包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，在某些实施例中，RNAi构建体在有义链、反义链、或两条链的3'端包含约1至约6或更多个(例如，约1、2、3、4、5、6或更多个)连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在其他实施例中，RNAi构建体在有义链、反义链或两条链的5'-端处包含约1至约6或更多(例如，约1、2、3、4、5、6或更多)个连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个特定实施例中，反义链包含至少1个但不超过6个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且该有义链包含至少1个但不超过4个硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个特定实施例中，反义链包含至少1个但不超过4个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且该有义链包含至少1个但不超过2个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，RNAi构建体包含在有义链的3'端的末端核苷酸之间的单个硫代磷酸酯核苷酸间键。在其他实施例中，RNAi构建体包含在有义链的3'端的末端核苷酸之间的两个连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施例中，RNAi构建体包含在有义链的3'端的末端核苷酸之间的单个硫代磷酸酯核苷酸间键和在反义链的3'端的末端核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个实施例中，RNAi构建体在反义链的3'端的末端核苷酸之间的包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键(即，在反义链的3'端的第一和第二核苷酸间键处的硫代磷酸酯核苷酸间键)。在另一个实施例中，RNAi构建体在反义链的3'端和5'端两者的末端核苷酸之间均包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在又另一个实施例中，RNAi构建体在反义链的3'端和5'端两者的末端核苷酸之间均包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键并且在有义链的5'端包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在仍另一个实施例中，RNAi构建体在反义链的3'端和5'端两者的末端核苷酸之间均包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键，在有义链的3'端末端核苷酸之间包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个实施例中，RNAi构建体在反义链的3'端和5'端两者的末端核苷酸之间均包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键并且在有义链的3'端和5'端两者的末端核苷酸之间均包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键(即，在反义链的5'端和3'端两者的第一和第二核苷酸间键处的硫代磷酸酯核苷酸间键和在有义链的5'端和3'端两者的第一和第二核苷酸间键处的硫代磷酸酯核苷酸间键)。在又另一个实施例中，RNAi构建体在反义链的3'端和5'端两者的末端核苷酸之间均包含两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键并且在有义链的3'端末端核苷酸之间包含单个硫代磷酸酯核苷酸间键。在其中一个或两条链包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键的任何实施例中，链内的其余核苷酸间键可以是天然的3'至5'磷酸二酯键。例如，在一些实施例中，有义链和反义链的各核苷酸间键选自磷酸二酯和硫代磷酸酯，其中至少一个核苷酸间键为硫代磷酸酯。
在RNAi构建体包含核苷酸突出端的实施例中，突出端中的两个或更多个未配对核苷酸可通过硫代磷酸酯核苷酸间键来连接。在某些实施例中，在反义链和/或有义链的3'端的核苷酸突出端中的所有未配对核苷酸是经由硫代磷酸酯核苷酸间键而连接。在其他实施例中，在反义链和/或有义链的5'端的核苷酸突出端中的所有未配对核苷酸是经由硫代磷酸酯核苷酸间键而连接。在仍其他实施例中，任何核苷酸突出端中的所有未配对核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键来连接。
硫代磷酸酯核苷酸间键的掺入在寡核苷酸的磷原子上引入了额外的手性中心，且因此在每个硫代磷酸酯核苷酸间键上产生了非对映体对(Rp和Sp)。非对映体或非对映异构体是化合物的具有相同分子式和键合原子序列但其原子在空间中的三维方向不同的不同构型。与对映体不同，非对映体不是彼此的镜像图像。每个手性磷酸盐原子可以为“R”构型(Rp)或“S”构型(Sp)。在某些实施例中，本发明的RNAi构建体可包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中手性磷酸盐选择为主要处于Rp或Sp构型。例如，在RNAi构建体具有一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键的一些实施例中，至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％的手性磷酸盐为Sp构型。在该RNAi构建体具有一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键的其他实施例中，至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％的手性磷酸盐为Rp构型。RNAi构建体中的所有手性磷酸盐可以为Sp构型或Rp构型(即RNAi构建体为立体纯)。在一个特定实施例中，RNAi构建体中的所有手性磷酸盐为Sp构型。在另一个特定实施例中，RNAi构建体中的所有手性磷酸盐为Rp构型。
在某些实施例中，RNAi构建体中的手性磷酸盐在有义链或反义链中的不同位置可具有不同构型。在RNAi构建体在反义链的5'端包含一个或两个硫代磷酸酯核苷酸间键的一个此类实施例中，反义链的5'端的手性磷酸盐可以为Rp构型。在RNAi构建体在反义链的3'端包含一个或两个硫代磷酸酯核苷酸间键的另一个此类实施例中，反义链的3'端的手性磷酸盐可以为Sp构型。在某些实施例中，RNAi构建体包含反义链3'和5'端的末端核苷酸之间的两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键以及有义链3'端的末端核苷酸之间的两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键，其中位于反义链5'端的手性磷酸盐为Rp构型，位于反义链3'端的手性磷酸盐为Sp构型，且位于有义链3'端的手性磷酸盐可为Rp或Sp构型。在某些其他实施例中，RNAi构建体包含反义链3'和5'端的末端核苷酸之间的两个连续硫代磷酸酯核苷酸间键以及有义链3'端的末端核苷酸之间的单个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中位于反义链5'端的手性磷酸盐为Rp构型，位于反义链3'端的手性磷酸盐为Sp构型，且位于有义链3'端的手性磷酸盐可为Rp或Sp构型。在寡核苷酸合成期间控制硫代磷酸酯键的立体化学的方法是本领域技术人员已知的且可以包括以下中描述的方法：Nawrot和Rebowska,Curr Protoc NucleicAcid Chem.[核酸化学当前方案]2009,第4章:.doi:10.1002/0471142700.nc0434s362009；Jahns等人,Nat.Commun[自然通讯],第6卷:6317,2015；Knouse等人,Science[科学],第361卷:1234-1238,2018；和Sakamuri等人,Chembiochem[化学生物学和生物化学],第21卷(9):1304-1308,2020。
在本发明的RNAi构建体的一些实施例中，有义链、反义链或反义链和有义链的5'端包含磷酸酯部分。如本文使用的，术语“磷酸酯部分”是指包含未经修饰的磷酸酯(—O—P＝O)(OH)OH)以及经修饰的磷酸酯的末端磷酸酯基。经修饰的磷酸酯包括如下的磷酸酯，其中一个或多个O和OH基被H、O、S、N(R)或烷基(例如C1至C12)所替代，其中R是H、氨基保护基或者未经取代或经取代的烷基(例如C1至C12)。示例性的磷酸酯部分包括但不限于：5'-单磷酸酯；5'-二磷酸酯；5'-三磷酸酯；5'-鸟苷帽(7-甲基化的或非甲基化的)；5'-腺苷帽或任何其他经修饰的或未经修饰的核苷酸帽结构；5'-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯)；5'-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯)；5'-α-硫代三磷酸酯；5'-γ-硫代三磷酸酯、5'-氨基磷酸酯；5'-乙烯基磷酸酯；5'-烷基膦酸酯(例如，烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等)；和5'-烷基醚膦酸酯(例如，烷基醚＝甲氧基甲基、乙氧基甲基等)。
可掺入本发明的RNAi构建体中的经修饰的核苷酸可具有本文所述的多于一种化学修饰。例如，经修饰的核苷酸可以具有对核糖的修饰以及对核碱基的修饰。举例来说，经修饰的核苷酸可包含2'糖修饰(例如2'-氟或2'-O-甲基)并且包含经修饰的碱基(例如5-甲基胞嘧啶或假尿嘧啶)。在其他实施例中，经修饰的核苷酸可包含糖修饰组合针对5'磷酸酯的修饰，当将经修饰的核苷酸并入多核苷酸中时这将会形成经修饰的核苷酸间键或核苷间键。例如，在一些实施例中，经修饰的核苷酸可包含糖修饰，诸如2'-氟修饰、2'-O-甲基修饰或二环糖修饰、以及5'硫代磷酸酯基。因此，在一些实施例中，本发明的RNAi构建体的一条或两条链包含2'修饰的核苷酸或BNA与硫代磷酸酯核苷酸间键的组合。在某些实施例中，本发明的RNAi构建体的有义链和反义链两者均包含2'-氟修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、与硫代磷酸酯核苷酸间键的组合。包含经修饰的核苷酸和核苷酸间键的示例性RNAi构建体显示在表2中。
本发明的RNAi构建体可使用本领域已知的技术，例如使用常规核酸固相合成来容易地制成。RNAi构建体的多核苷酸可使用标准核苷酸或核苷前体(例如亚磷酰胺)在合适的核酸合成仪上组装。自动核酸合成仪是由若干供应商商业销售，包括来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)(福斯特城，加利福尼亚州)的DNA/RNA合成仪、来自生物自动化公司(BioAutomation)(欧文市，德克萨斯州)的MerMade合成仪、和来自GE保健生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences)(匹兹堡市，宾夕法尼亚州)的OligoPilot合成仪。实例2中描述了合成本发明的RNAi构建体的示例性方法。
2'甲硅烷基保护基可以在核糖核苷的5'位置与酸不稳定的二甲氧基三苯甲基(DMT)结合使用，从而利用亚磷酰胺化学来合成寡核苷酸。已知最终脱保护条件不会显著降解RNA产物。所有合成均可在任何自动或手动合成仪中以大、中、小规模进行。合成还可以在多个孔板、柱或载玻片中进行。
可以通过暴露于氟离子来去除2'-O-甲硅烷基，这些氟离子可以包括任何氟离子源，例如含有与无机反离子配对的氟离子的盐(例如氟化铯和氟化钾)、或者含有与有机反离子配对的氟离子的盐(例如氟化四烷基铵)。冠醚催化剂可以与无机氟化物组合用于脱保护反应中。示例性氟离子源为四丁基氟化铵或氨基氢氟化物(例如，将HF水溶液与三乙胺组合在偶极非质子溶剂如二甲基甲酰胺中)。
选择用于亚磷酸三酯和磷酸三酯上的保护基团可以改变三酯对氟化物的稳定性。磷酸三酯或亚磷酸三酯的甲基保护可以稳定与氟离子的键联且改善过程产率。
因为核糖核苷具有反应性2'羟基取代基，所以可能理想的是用与5'-O-二甲氧基三苯甲基保护基垂直的保护基(例如，一个对使用酸的处理为稳定的保护基)来保护RNA中的反应性2'位置。甲硅烷基保护基团符合该标准，且可以在最终的氟化物去保护步骤中容易地除去，这可以导致最少RNA降解。
四唑催化剂可用于标准亚磷酰胺偶联反应。示例性催化剂包括例如：四唑、S-乙基-四唑、苄基巯基四唑、对硝基苯基四唑。
如本领域普通技术人员可以理解的，合成本文所述的RNAi构建体的其他方法对于普通本领域普通技术人员而言为显而易见的。另外地，各种合成步骤可以交替序列或顺序进行，以得到所需化合物。其他合成化学转化、保护基团(例如，对于碱基上存在的羟基、氨基等)和可用于合成本文所述RNAi构建体的保护基团方法(保护和去保护)为本领域已知的且包括例如以下中描述的那些：R.Larock,Comprehensive Organic Transformations[全面有机转换],VCH Publishers[VCH出版社](1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,ProtectiveGroups in Organic Synthesis[有机合成中的保护基团],第2版,John Wiley and Sons[约翰威立父子公司],(1991)；L.Fieser和M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents forOrganic Synthesis[费塞尔和用于有机合成的费塞尔试剂],John Wiley and Sons[约翰威立父子公司](1994)；以及L.Paquette编辑,Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis[有机合成试剂百科全书],John Wiley and Sons[约翰威立父子公司](1995)，及其后续版本。RNAi构建体的定制合成还可自若干商业供货商处获得，包括Dharmacon公司(Dharmacon,Inc.)(拉斐特，科罗拉多州)、Axo实验室股份有限公司(AxoLabs GmbH)(库尔姆巴赫，德国)和Ambion公司(Ambion,Inc.)(福斯特城，加利福尼亚州)。
本发明的RNAi构建体可包含配体。如本文使用的，“配体”是指能够与另一种化合物或分子直接地或间接地相互作用的任何化合物或分子。配体与另一种化合物或分子的相互作用会引起生物反应(例如引发信号转导级联反应、诱导受体介导的内吞作用)或者仅仅是物理结合。配体可以修改所附接的双链RNA分子的一种或多种特性，例如RNA分子的药效学、药动学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除特性。
配体可包括血清蛋白(例如，人血清白蛋白、低密度脂蛋白、球蛋白)、胆固醇部分、维生素(生物素、维生素E、维生素B12)、叶酸部分、类固醇、胆汁酸(例如胆酸)、脂肪酸(例如，棕榈酸、肉豆蔻酸)、碳水化合物(例如，右旋糖酐、支链淀粉、甲壳素、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)、糖苷、磷脂、或者抗体或其结合片段(例如将RNAi构建体靶向到特定细胞类型(如肝脏)的抗体或其结合片段)。配体的其他实例包括染料、插入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、得克萨卟啉(Texaphyrin)、Sapphyrin)、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、亲脂性分子(例如金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、牻牛儿基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽(例如黑腹果蝇触足肽、Tat肽、RGD肽)、烷化剂、聚合物(如聚乙二醇(PEG)(例如PEG-40K))、聚氨基酸和聚胺(例如精胺、亚精胺)。
在某些实施例中，配体具有内体溶解特性。内体溶解配体促进内体裂解和/或本发明的RNAi构建体或其组分自细胞的内体转运到细胞质。内体溶解配体可以是显示pH依赖性膜活性和融合性的多聚阳离子肽或肽模拟物。在一个实施例中，内体溶解配体在内体pH下呈现其活性构象。“活性”构象是其中内体溶解配体促进内体的溶解和/或本发明的RNAi构建体或其组分从内体到细胞质的转运的构象。示例性的内体溶解配体包括GALA肽(Subbarao等人,Biochemistry[生物化学],第26卷:2964-2972,1987)、EALA肽(Vogel等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学社杂志]第118卷:1581-1586,1996)、及它们的衍生物(Turk等人,Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报],第1559卷:56-68,2002)。在一个实施例中，内体溶解组分可含有化学基团(例如氨基酸)，其响应于pH的变化将经历电荷或质子化的变化。内体溶解组分可为直链或支链的。
在一些实施例中，配体包含脂质或其他疏水分子。在一个实施例中，配体包含胆固醇部分或其他类固醇。曾有报道胆固醇缀合寡核苷酸比它们的未缀合寡核苷酸更具活性(Manoharan,Antisense Nucleic Acid Drug Development[反义核酸药物开发],第12卷:103-228,2002)。包含胆固醇部分的配体和用于缀合至核酸分子的其他脂质也已经描述于美国专利号7,851,615；7,745,608；和7,833,992，所有这些均通过引用以其全文特此并入。在另一个实施例中，配体包含叶酸部分。与叶酸部分缀合的多核苷酸可以经由经受体介导的胞吞作用途径被细胞摄取。这类叶酸-多核苷酸缀合物在美国专利号8,188,247中有描述，该专利特此通过引用以其全文并入。
在某些实施例中，希望将本发明的RNAi构建体特异性地递送至肝细胞以降低mARC1蛋白质在肝中的特异性表达。因此，在某些实施例中，使用如下文更详细描述的各种方法使配体靶向RNAi构建体至肝细胞(例如肝细胞)的特异性递送。在某些实施例中，将RNAi构建体靶向至具有配体的肝细胞，该配体结合表面表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)或其组分(例如ASGR1，ASGR2)。
在一些实施例中，RNAi构建体可以通过使用与肝细胞表面上表达的蛋白质结合或相互作用的配体而特异性靶向肝脏。例如，在某些实施例中，配体可包含与在肝细胞上所表达受体(如去唾液酸糖蛋白受体或LDL受体)特异性结合的抗原结合蛋白(例如抗体或其结合片段(例如Fab、scFv))。在一个特定的实施例中，配体包含特异性结合ASGR1和/或ASGR2的抗体或其结合片段。在另一个实施例中，配体包含特异性结合ASGR1和/或ASGR2的抗体的Fab片段。“Fab片段”由一个免疫球蛋白轻链(即轻链可变区(VL)和恒定区(CL))以及一个免疫球蛋白重链的CH1区和可变区(VH)构成。在另一个实施例中，配体包含特异性结合ASGR1和/或ASGR2的抗体的单链可变抗体片段(scFv片段)。“scFv片段”包含抗体的VH和VL区，其中这些区存在于单个多肽链中，并且任选地在VH和VL区之间包含肽接头，该肽接头使Fv能形成所需的抗原结合结构。特异性结合ASGR1的可以用作用于将本发明的RNAi构建体靶向至肝脏的配体的示例性抗体及其结合片段描述于WIPO公开号WO 2017/058944中，将其通过引用以其全文并入本文。特异性结合ASGR1、LDL受体、或其他肝脏表面表达的蛋白质的适用于用作本发明的RNAi构建体中的配体的其他抗体及其结合片段是可商购的。
在某些实施例中，配体包含碳水化合物。“碳水化合物”是指由具有至少6个碳原子的一个或多个单糖单元(可以是线性的、分支的或环状的)所组成的化合物，其中氧、氮或硫原子键合至各碳原子。碳水化合物包括但不限于糖(例如，单糖、二糖、三糖、四糖和含有约4、5、6、7、8或9个单糖单元的寡糖)和多糖，例如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。在一些实施例中，掺入配体中的碳水化合物为选自戊糖、己糖或庚糖的单糖和包括此类单糖单元的二糖和三糖。在其他实施例中，掺入配体中的碳水化合物为氨基糖，例如半乳糖胺、葡糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺和N-乙酰葡糖胺。
在一些实施例中，配体包含己糖或己糖胺。己糖可选自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖或果糖。己糖胺可选自果糖胺、半乳糖胺、葡糖胺或甘露糖胺。在某些实施例中，配体包含葡萄糖、半乳糖、半乳糖胺或葡糖胺。在一个实施例中，配体包含葡萄糖、葡糖胺或N-乙酰葡糖胺。在另一个实施例中，配体包含半乳糖、半乳糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺。在特定实施例中，配体包含N-乙酰基-半乳糖胺。包括葡萄糖、半乳糖、和N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)的配体在将化合物靶向至肝细胞方面特别有效，因为这类配体与在肝细胞表面表达的ASGR结合。参见，例如，D'Souza和Devarajan,J.Control Release[控制释放杂志],第203卷:126-139,2015。可以掺入本发明的RNAi构建体中的含GalNAc或半乳糖的配体的实例描述于美国专利号7,491,805；8,106,022；和8,877,917；美国专利公开号20030130186；和WIPO公开号WO 2013166155，所有这些文献均通过引用以其全文特此并入。
在某些实施例中，配体包含多价碳水化合物部分。如本文使用的，“多价碳水化合物部分”是指包含能够独立地与其他分子结合或相互作用的两个或更多个碳水化合物单元的部分。例如，多价碳水化合物部分包含两个或更多个由碳水化合物组成的结合结构域，其可以结合两个或更多个不同分子或同一分子上的两个或更多个不同位点。碳水化合物部分的化合价表示该碳水化合物部分内的单个结合结构域的数目。例如，关于碳水化合物部分的术语“一价”、“二价”、“三价”和“四价”分别是指具有一个、两个、三个和四个结合域的碳水化合物部分。多价碳水化合物部分可包含多价乳糖部分、多价半乳糖部分、多价葡萄糖部分、多价N-乙酰基-半乳糖胺部分、多价N-乙酰基-葡糖胺部分、多价甘露糖部分、或多价岩藻糖部分。在一些实施例中，配体包含多价半乳糖部分。在其他实施例中，配体包含多价N-乙酰基-半乳糖胺部分。在这些和其他实施例中，多价碳水化合物部分可以是二价、三价或四价的。在此类实施例中，多价碳水化合物部分可为双触角或三触角的。在一个特定实施例中，多价N-乙酰基-半乳糖胺部分为三价或四价的。在另一个特定实施例中，多价半乳糖部分为三价或四价的。用于掺入本发明的RNAi构建体中的示例性含三价和四价GalNAc的配体在下文详细描述。
配体可以直接或间接地附接或缀合到RNAi构建体至RNA分子上。例如，在一些实施例中，配体直接共价附接至RNAi构建体的有义链或反义链。在其他实施例中，配体经由接头共价附接至RNAi构建体的有义链或反义链。配体可以附接到本发明的RNAi构建体的多核苷酸(例如有义链或反义链)的核碱基、糖部分或核苷酸间键。与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合或附接可发生在包括环内和环外原子在内的任何位置。在某些实施例中，嘌呤核碱基的2位置、6位置、7位置或8位置附接至配体。与嘧啶核碱基或其衍生物的缀合或附接还可发生在任何位置处。在一些实施例中，嘧啶核碱基的2位置、5位置和6位置可以附接至配体。与核苷酸的糖部分的缀合或附接可以发生在任何碳原子处。可以附接至配体的糖部分的示例性碳原子包括2'、3'、和5'碳原子。1'位置也可以附接至配体，如在无碱基核苷酸中。核苷酸间键还可以支持配体附接。对于含磷键(例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)，配体可直接附接至磷原子或与磷原子键合的O、N或S原子上。对于含胺或酰胺的核苷间键(例如PNA)，配体可附接至胺或酰胺的氮原子或附接至相邻碳原子。
在一些实施例中，配体可以附接至有义链或反义链的3'或5'端。在某些实施例中，配体共价附接至有义链的5'端。在这类实施例中，配体附接至有义链的5'-末端核苷酸。在这些和其他实施例中，配体是在有义链的5'-末端核苷酸的5'-位置附接。在实施例中，其中反向无碱基核苷酸是有义链的5'-末端核苷酸并且经由5'-5'核苷酸间键附接至相邻核苷酸，该配体可以在反向无碱基核苷酸的3'-位置处附接。在其他实施例中，配体共价附接至有义链的3'端。例如，在一些实施例中，配体附接至有义链的3'-末端核苷酸。在某些这类实施例中，配体是在有义链的3'-末端核苷酸的3'-位置附接。在实施例中，其中反向无碱基核苷酸是有义链的3'-末端核苷酸并且经由3'-3'核苷酸间键附接至相邻核苷酸，该配体可以在反向无碱基核苷酸的5'-位置处附接。在替代性实施例中，配体是在有义链的3'端附近附接，但在一个或多个末端核苷酸之前(即在1、2、3或4个末端核苷酸之前)。在一些实施例中，配体是在有义链的3'-末端核苷酸的糖的2'-位置附接。在其他实施例中，配体是在有义链的5'-末端核苷酸的糖的2'-位置附接。
在某些实施例中，配体经由接头附接至有义链或反义链。“接头”是使配体共价连接至RNAi构建体的多核苷酸组分的原子或基团。接头可为约1至约30个原子的长度、约2至约28个原子的长度、约3至约26个原子的长度、约4至约24个原子的长度、约6至约20个原子的长度、约7至约20个原子的长度、约8至约20个原子的长度、约8至约18个原子的长度、约10至约18个原子的长度、以及约12至约18个原子的长度。在一些实施例中，接头可包含双官能连接部分，其通常包含具有两个官能团的烷基部分。选择一个官能团以结合目的化合物(例如RNAi构建体的有义链或反义链)，且选择另一个官能团以基本上结合任何选定基团，例如本文所述的配体。在某些实施例中，接头包含重复单元，例如乙二醇或氨基酸单元的链结构或寡聚物。典型地用于双官能连接部分的官能团的实例包括但不限于用于与亲核基团反应的亲电子试剂和用于与亲电子基团反应的亲核试剂。在一些实施例中，双官能连接部分包括氨基、羟基、羧酸、硫醇、不饱和度(例如，双键或三键)等。
可用于将配体附接至本发明RNAi构建体中的有义链或反义链的接头包括但不限于：吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯、6-氨基己酸、经取代的C1-C10烷基、经取代的或未经取代的C2-C10烯基、或者取代的或未取代的C2-C10炔基。此类接头的合适的取代基包括但不限于羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些实施例中，接头为可裂解的。可裂解接头为在细胞外足够稳定，但是在进入靶细胞后经裂解以释放接头保持在一起的两个部分的接头。在一些实施例中，可裂解接头在靶细胞中或在第一参考条件下(其可以例如经选择以模拟或代表细胞内条件)中比在受试者血液中或在第二参考条件下(其可以例如经选择以模拟或代表在血液或血清中发现的条件)裂解快至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多、或至少100倍。
可裂解接头易受裂解剂影响，例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在。通常，裂解剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性被发现。此类降解剂的实例包括：经选择用于特定底物或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂，诸如硫醇，其可通过还原来使氧化还原可裂解接头降解；酯酶；可形成酸性环境的内体或药剂，例如产生pH 5或更低的那些；通过充当一般酸来使酸可裂解接头水解或降解的酶、肽酶(可为底物特异性的)、和磷酸酶。
可裂解的接头可包含对pH敏感的部分。人血清的pH为7.4，而平均细胞内pH略低，范围为从约7.1-7.3。内体具有更高酸性pH，在5.5-6.0范围内，且溶酶体具有约5.0的甚至更高酸性pH。一些接头将具有可裂解基团，其在优选pH下裂解，从而将RNA分子自配体释放到细胞内，或进入细胞的所需区室。
接头可包括可由特定酶裂解的可裂解基团。掺入接头中的可裂解基团的类型可取决于待靶向的细胞。例如，肝靶向配体可以通过包括酯基的接头连接至RNA分子。肝细胞富含酯酶，且因此该接头在肝细胞中将比在不富含酯酶的细胞类型中更有效地裂解。富含酯酶的其他类型的细胞包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。当靶向富含肽酶的细胞(例如肝细胞和滑膜细胞)时，可以使用含有肽键的接头。
通常，可以通过测试降解剂(或条件)裂解候选接头的能力来评估候选可裂解接头的适用性。还期望还测试候选可裂解接头在血液中或当与其他非靶组织接触时抵抗裂解的能力。因此，可以确定第一条件与第二条件之间对裂解的相对易感性，其中第一条件经选择为指示靶细胞中的裂解，而第二条件经选择为指示其他组织或生物流体(例如血液或血清)中的裂解。评估可以在无细胞系统、细胞、细胞培养物、器官或组织培养物或整个动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初步评估且通过对整个动物进行进一步评估来确认可能是有用的。在一些实施例中，有用候选接头在细胞中(或者在被选择用于模拟细胞内条件的体外条件下)的裂解，与在血液或血清中(或者在模拟细胞外条件的体外条件下)相比，至少快2、4、10、20、50、70或100倍。
在其他实施例中，使用氧化还原可裂解接头。氧化还原可裂解接头在还原或氧化时裂解。可还原裂解基团的实例是二硫连接基团(-S-S-)。为了确定候选可裂解接头是否是合适的“可还原裂解接头”或者例如是否适合与特定RNAi构建体和特定配体一起使用，可以采用本文所述的一种或多种方法。例如，可以通过与二硫苏糖醇(DTT)或本领域已知的其他还原剂一起孵育来评估候选接头，其模拟将在细胞(例如靶细胞)中观察到的裂解速率。候选接头还可以在经选择以模拟血液或血清条件的条件下进行评估。在特定实施例中，候选接头在血液中裂解至多10％。在其他实施例中，有用候选接头在细胞中(或者在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的降解，与在血液中(或者在被选择以模仿细胞外条件的条件下)相比，至少快2、4、10、20、50、70、或100倍。
在又其他实施例中，采用被降解或水解磷酸酯基的药剂裂解的基于磷酸酯的可裂解接头来将配体共价附接至RNAi构建体的有义链或反义链。水解细胞中的磷酸酯基团的试剂的实例为酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的可裂解基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、和-O-P(S)(Rk)-S-，其中Rk可以是氢或C1-C10烷基。特定实施例包括-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、和-O-P(S)(H)-S-。另一具体实施例为-O-P(O)(OH)-O-。这些候选接头可以使用与上述那些类似的方法评估。
在其他实施例中，接头可包含酸可裂解基团，这些基团为在酸性条件下裂解的基团。在一些实施例中，酸可裂解基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中裂解，或通过试剂诸如可充当一般酸的酶裂解。在细胞中，特定的低pH细胞器，例如内体和溶酶体，可以为酸可裂解基团提供裂解环境。酸可裂解连接基团的实例包括但不限于腙、酯和氨基酸酯。酸可裂解基团可具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。当附接至酯的氧(烷氧基)的碳是芳基时，特定实施例是经取代的烷基或叔烷基(如二甲基、戊基或叔丁基)。这些候选物可以使用与上述那些类似的方法评估。
在其他实施例中，接头可包含基于酯的可裂解基团，这些基团通过细胞中的酶，例如酯酶和酰胺酶来裂解。基于酯的可裂解基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可裂解基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。这些候选接头可以使用与上述那些类似的方法评估。
在其他实施例中，接头可以包含基于肽的可裂解基团，这些基团通过细胞中的酶，例如肽酶和蛋白酶来裂解。基于肽的可裂解基团为在氨基酸之间形成的肽键，以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽。基于肽的可裂解基团包括酰胺基(-C(O)NH-)。酰胺基可以在任何的亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键为在氨基酸之间形成的特殊类型的酰胺键，以产生肽和蛋白质。基于肽的裂解基团通常限于在产生肽的氨基酸和蛋白质之间所形成的肽键(即，酰胺键)。基于肽的可裂解连接基具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的侧链。这些候选物可以使用与上述那些类似的方法评估。
适合于将配体附接到本发明的RNAi构建体中的有义链或反义链的其他类型的接头为本领域已知的，且可以包括以下中描述的接头：美国专利号7,723,509；8,017,762；8,828,956；8,877,917；和9,181,551，所有这些均通过引用以其全文特此并入。
在某些实施例中，共价附接至本发明的RNAi构建体的有义链或反义链的配体包含GalNAc部分，例如多价GalNAc部分。在一些实施例中，多价GalNAc部分是三价GalNAc部分，并且附接至有义链的3'端。在其他实施例中，多价GalNAc部分是三价GalNAc部分，并且附接至有义链的5'端。在又其他实施例中，多价GalNAc部分是四价GalNAc部分，并且附接至有义链的3'端。在仍其他实施例中，多价GalNAc部分是四价GalNAc部分，并且附接至有义链的5'端。
在某些实施例中，本发明的RNAi构建体包含具有以下结构([结构1])的配体：
Figure BDA0004113300310000561
在优选的实施例中，将具有此结构的配体经由接头(诸如本文所述的接头)共价附接至有义链的5'端(例如附接至有义链的5'末端核苷酸)。在一个实施例中，接头是氨基己基接头。
以下结构式I-IX中提供了可以附接至本发明的RNAi构建体中的双链RNA分子的示例性三价和四价GalNAc部分和接头。本文列出的式中的“Ac”代表乙酰基。
在一个实施例中，RNAi构建体包含具有以下式I的结构的配体和接头，其中每个n独立地是1至3，k是1至3，m是1或2，j是1或2，并且将配体附接至双链RNA分子(由实的波浪线表示)的有义链的3'端：
Figure BDA0004113300310000571
在另一个实施例中，RNAi构建体包含具有以下式II的结构的配体和接头，其中每个n独立地是1至3，k是1至3，m是1或2，j是1或2，并且将配体附接至双链RNA分子(由实的波浪线表示)的有义链的3'端：
Figure BDA0004113300310000572
在又另一个实施例中，RNAi构建体包含具有以下式III的结构的配体和接头，其中将配体附接至双链RNA分子(由实的波浪线表示)的有义链的3'端：
Figure BDA0004113300310000581
在仍另一个实施例中，RNAi构建体包含具有以下式IV的结构的配体和接头，其中将配体附接至双链RNA分子(由实的波浪线表示)的有义链的3'端：
Figure BDA0004113300310000582
在某些实施例中，RNAi构建体包含具有以下式V的结构的配体和接头，其中每个n独立地是1至3，k是1至3，并且将配体附接至双链RNA分子(由实的波浪线表示)的有义链的5'端：
Figure BDA0004113300310000591
在其他实施例中，RNAi构建体包含具有以下式VI的结构的配体和接头，其中每个n独立地是1至3，k是1至3，并且将配体附接至双链RNA分子(由实的波浪线表示)的有义链的5'端：
Figure BDA0004113300310000592
在一个特定的实施例中，RNAi构建体包含具有以下式VII的结构的配体和接头，其中X＝O或S并且其中将配体附接至双链RNA分子(由弯曲线表示)的有义链的5'端：
Figure BDA0004113300310000601
在一些实施例中，RNAi构建体包含具有以下式VIII的结构的配体和接头，其中每个n独立地是1至3并且将配体附接至双链RNA分子(由实的波浪线表示)的有义链的5'端：
Figure BDA0004113300310000602
在某些实施例中，RNAi构建体包含具有以下式IX的结构的配体和接头，其中将配体附接至双链RNA分子(由实的波浪线表示)的有义链的5'端：
Figure BDA0004113300310000603
硫代磷酸酯键可以由式I-IX中任一个所示的磷酸二酯键取代，以将配体和接头共价附接至核酸链。
本发明还包括药物组合物和配制品，其包含本文所述的RNAi构建体和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。此类组合物和配制品可用于在有需要的患者中降低MARC1基因的表达。当考虑临床应用时，将以适合于预期应用的形式制备药物组合物和配制品。通常，这将需要制备基本上不含热原以及可能对人或动物有害的其他杂质的组合物。
短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指在施用于动物或人类时不产生不良反应、过敏反应或其他不利反应的分子实体和组合物。如本文使用的，“药学上可接受的载体、赋形剂、或稀释剂”包括可接受的用于配制药物(如适合于向人施用的药物)的溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途为本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与本发明的RNAi构建体不兼容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可以并入组合物中，只要它们不使组合物的RNAi构建体失去活性。
用于配制药物组合物的组合物和方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、待治疗的疾病或障碍的类型和程度、或施用剂量。在一些实施例中，基于预期递送途径配制药物组合物。例如，在某些实施例中，配制药物组合物以用于肠胃外递送。肠胃外递送形式包括静脉内、动脉内、皮下、鞘内、腹膜内或肌内注射或输注。在一个实施例中，配制药物组合物以用于静脉内递送。在此实施例中，药物组合物可包括基于脂质的递送媒介物。在另一个实施例中，配制药物组合物以用于皮下递送。在这类实施例中，药物组合物可包含靶向配体(例如本文所述的含有GalNAc或含有抗体的配体)。
在一些实施例中，药物组合物包含有效量的本文所述RNAi构建体。“有效量”是足以产生有益或期望的临床结果的量。在一些实施例中，有效量是足以减少患者的特定组织或细胞类型(例如肝或肝细胞)中MARC1基因表达的量。本发明的RNAi构建体的有效量可为约0.01mg/kg体重至约100mg/kg体重，且可每日、每周、每月施用或以更长的间隔施用。准确确定有效量和施用频率可以基于若干因素，包括患者大小、年龄和一般状况、待治疗的障碍类型(例如脂肪肝病、肝纤维化或心血管疾病)、使用的特定RNAi构建体和施用途径。
施用本发明的药物组合物可以经由任何常规途径，只要靶组织可经由该途径获得。这类途径包括但不限于：肠胃外(例如，皮下、肌内、腹膜内或静脉内)、口腔、鼻腔、颊部、皮内、透皮和舌下途径、或者通过直接注射入肝组织中或经过肝门静脉而递送。在一些实施例中，肠胃外施用药物组合物。例如，在某些实施例中，静脉内施用药物组合物。在其他实施例中，皮下施用药物组合物。
胶体分散系统(如大分子复合体、纳米胶囊、微球、珠粒)和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、微团、混合微团和脂质体)可用作本发明RNAi构建体的递送媒介物。适于递送本发明的核酸的市售脂肪乳剂包括：
Figure BDA0004113300310000621
(百特国际有限公司(BaxterInternational Inc.))、/>
Figure BDA0004113300310000622
(雅培制药公司(Abbott Pharmaceuticals))、
Figure BDA0004113300310000623
II(赫升瑞公司(Hospira))、/>
Figure BDA0004113300310000624
III(赫升瑞公司)、Nutrilipid(贝朗医疗公司(B.Braun Medical Inc.))、和其他类似的脂质乳剂。用作体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(即，人工膜囊)。本发明的RNAi构建体可被包封于脂质体内或者可与其形成复合体，特别是阳离子脂质体。可替代地，本发明的RNAi构建体可以与脂质复合，特别是与阳离子脂质复合。合适的脂质和脂质体包括中性(例如，二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC))、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、及阴性(例如，二豆蔻酰磷脂酰甘油基甘油(DMPG)、和阳离子型(例如，二油酰基四曱基氨基丙基(DOTAP)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOTMA))。这类胶体分散系统的制备和使用在本领域中是众所周知的。示例性的配制品还披露于美国专利号5,981,505；美国专利号6,217,900；美国专利号6,383,512；美国专利号5,783,565；美国专利号7,202,227；美国专利号6,379,965；美国专利号6,127,170；美国专利号5,837,533；美国专利号6,747,014；和WIPO公开号WO 03/093449。
在一些实施例中，本发明的RNAi构建体被完全地封装于脂质配制品中，例如，以形成SNALP或其他核酸-脂质颗粒。如本文使用的，术语“SNALP”是指稳定的核酸-脂质颗粒。SNALP典型地含有阳离子脂质、非阳离子脂质、和防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALP对于全身应用特别有用，因为它们在静脉注射后展现出循环寿命延长，并且在远端部位(例如，与施用部位物理分离的部位)累积。核酸-脂质颗粒典型地具有约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、或约70nm至约90nm的平均直径，且基本上无毒。另外，核酸当存在于核酸-脂质颗粒中时在水溶液中对用核酸酶的降解具有抗性。核酸-脂质颗粒及其制备方法披露于例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；和WIPO公开号WO 96/40964。
适于可注射使用的药物组合物包括例如无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。通常，这些制剂为无菌的且流动到易于注射的程度。制剂在制造和储存条件下应保持稳定，且应防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。合适的溶剂或分散介质可包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和植物油。恰当流动性可例如通过使用衣料诸如卵磷脂、在分散液情况下通过保持所需粒度且通过使用表面活性剂来保持。对微生物作用的防止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过将活性化合物按需要以适当量与任何其他成分(例如以上列举的)一起掺入溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将各种灭菌活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散液，该无菌媒介物含有基础分散介质和所需其他成分，例如，如上所列举的。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末情况下，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术产生一种或多种活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉末。
本发明的组合物通常可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括例如衍生自无机酸(例如盐酸或磷酸)或衍生自有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)的酸加成盐(由游离氨基形成)。用游离羧基形成的盐还可衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。药学上可接受的盐详细描述于Berge等人,J.Pharmaceutical Sciences[药物科学杂志],第66卷:1-19,1977。
例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，通常将溶液适当地缓冲，且首先例如用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。此类水溶液可用于例如静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优选地，如本领域普通技术人员已知的，特别是根据本披露，使用无菌含水介质。举例说明，可将单剂量溶于1ml等渗NaCl溶液中，且添加到1000ml皮下注射液中或在所建议输注部位注射(参见例如“Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿制药科学]”第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。对于人类施用，制剂应符合FDA标准所要求的无菌、产热原性、一般安全性和纯度标准。在某些实施例中，本发明的药物组合物包含无菌盐水溶液和本文所述的RNAi构建体或由其组成。在其他实施例中，本发明的药物组合物包含本文所述的RNAi构建体和无菌水(例如注射用水，WFI)或由其组成。在仍其他实施例中，本发明的药物组合物包含本文所述的RNAi构建体和磷酸盐缓冲盐水(PBS)或由其组成。
在一些实施例中，本发明的药物组合物与用于施用的装置一起包装或储存于该装置内。用于注射配制品的装置包括但不限于：注射口、预充式注射器、自动注射器、注射泵、随身注射器、和注射笔。用于雾化或粉末配制品的装置包括但不限于吸入器、吹入器、吸气器等。因此，本发明包括施用装置，其包含本发明的用于治疗或预防一种或多种本文所述疾病或障碍的药物组合物。
本发明提供了通过将细胞与本文所述的任何一种RNAi构建体接触来减少或抑制细胞(例如肝细胞)中MARC1基因的表达，从而减少或抑制mARC1蛋白质的产生的方法。该细胞可以是体外或体内的。mARC1表达可通过测量mARC1 mRNA、mARC1蛋白质或另一种与mARC1表达相关的生物标记物的量或水平来评估，该生物标记物诸如胆固醇、LDL胆固醇或肝酶(诸如丙氨酸转氨酶(ALT))的血清水平。可以相对于未用RNAi构建体处理或用对照RNAi构建体处理的细胞或动物中的mARC1表达来确定用本发明的RNAi构建体处理的细胞或动物中的mARC1表达的降低。例如，在一些实施例中，通过以下步骤来评估mARC1表达的降低：(a)测量用本发明的RNAi构建体处理的肝细胞中的mARC1 mRNA的量或水平、(b)测量用对照RNAi构建体(例如，针对未在肝细胞中表达的RNA分子的RNAi构建体或具有无义或乱序序列的RNAi构建体)处理或不用构建体处理的肝细胞中的mARC1 mRNA的量或水平、和(c)比较来自(a)中的经处理细胞的经测量mARC1 mRNA水平与来自(b)中的对照细胞的经测量mARC1mRNA水平。在比较之前，可将处理细胞和对照细胞中的mARC1 mRNA水平相对于对照基因(例如18S核糖体RNA或管家基因)的RNA水平归一化。mARC1 mRNA水平可通过多种方法测量，包括Northern印迹分析、核酸酶保护测定、荧光原位杂交(FISH)、逆转录酶(RT)-PCR、实时RT-PCR、定量PCR、液滴数字PCR等。
在其他实施例中，通过以下步骤来评估mARC1表达的降低：(a)测量用本发明的RNAi构建体处理的肝细胞中的mARC1蛋白质的量或水平、(b)测量用对照RNAi构建体(例如，针对未在肝细胞中表达的RNA分子的RNAi构建体或具有无义或乱序序列的RNAi构建体)处理或不用构建体处理的肝细胞中的mARC1蛋白质的量或水平、和(c)比较来自(a)中的经处理细胞的经测量mARC1蛋白质水平与来自(b)中的对照细胞的经测量mARC1蛋白质水平。测量mARC1蛋白质水平的方法为本领域普通技术人员已知，包括免疫印迹、免疫测定(例如ELISA)和流式细胞术。任何能够测量mARC1 mRNA或mARC1蛋白质的方法可用于评估本发明的RNAi构建体的功效。
在一些实施例中，评估mARC1表达水平的方法在体外在天然表达mARC1的细胞(例如肝细胞)或已经工程化以表达mARC1的细胞中进行。在某些实施例中，这些方法在体外在肝细胞中进行。合适的肝细胞包括但不限于：原代肝细胞(例如人或非人灵长类动物的肝细胞)、HepAD38细胞、HuH-6细胞、HuH-7细胞、HuH-5-2细胞、BNLCL2细胞、Hep3B细胞或HepG2细胞。在一个实施例中，肝细胞为HuH-7细胞。在另一个实施例中，肝细胞为人原代肝细胞。在又另一个实施例中，肝细胞为Hep3B细胞。
在其他实施例中，评估mARC1表达水平的方法在体内进行。RNAi构建体和任何对照RNAi构建体可以施用至动物且在治疗后，在自动物收获的肝组织中评估mARC1 mRNA或mARC1蛋白质水平。可替代地或另外地，可以在经治疗的动物中评估与mARC1表达相关的生物标记物或功能表型。例如，MARC1功能丧失变体与血清总胆固醇、LDL胆固醇和肝酶水平降低有关(参见Emdin等人,PLoS Genet[PLoS遗传学],第16卷(4):e1008629,2020)。因此，可以在使用本发明RNAi构建体治疗的动物中测量胆固醇、LDL胆固醇或肝酶(例如ALT)的血清或血浆水平，以评估降低mARC1表达的功能功效。用于测量血清或血浆胆固醇或酶水平的示例性方法描述于实例1、4和5中。
在某些实施例中，本发明的RNAi构建体将mARC1 mRNA或蛋白质在肝细胞中的表达降低了至少40％、至少45％、或至少50％。在一些实施例中，本发明的RNAi构建体将mARC1mRNA或蛋白质在肝细胞中的表达降低了至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、或至少85％。在其他实施例中，本发明的RNAi构建体将mARC1 mRNA或蛋白质在肝细胞中的表达降低了约90％或更多，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更多。mARC1表达的降低百分比可通过本文所述的任何方法以及本领域已知的其他方法测量。
本发明提供用于在有需要的患者中降低或抑制MARC1基因的表达并由此降低mARC1蛋白质的产生的方法，以及治疗或预防与mARC1表达或活性相关的病症、疾病或障碍的方法。“与mARC1表达相关的病症、疾病或障碍”是指其中mARC1表达水平发生改变或mARC1表达水平升高与发展病症、疾病或障碍的风险增加相关的病症、疾病或障碍。与mARC1表达相关的病症、疾病或障碍也可包括由脂蛋白代谢异常变化导致的病症、疾病或障碍，诸如导致胆固醇、脂质、甘油三酯等水平异常或升高或这些分子的清除障碍的变化。最近的遗传学研究报告了MARC1基因的功能丧失变体与降低的血液胆固醇和肝酶水平、降低的肝脏脂肪和肝硬化保护之间的关联(Spracklen等人,Hum Mol Genet.[人类分子遗传学],第26卷(9):1770-178,2017；Emdin等人,bioRxiv 594523；//doi.org/10.1101/594523,2019；和Emdin等人,PLoS Genet[PLoS遗传学],第16卷(4):e1008629,2020)。参见Emdin等人,bioRxiv 594523；//doi.org/10.1101/594523,2019；和Emdin等人,PLoS Genet[PLoS遗传学],Vol.16(4):e1008629,2020)。因此，在某些实施例中，本发明的RNAi构建体对于治疗或预防脂肪肝病(例如NAFLD和NASH)和心血管疾病(例如冠状动脉疾病和心肌梗死)以及降低肝纤维化和血清胆固醇水平特别有用。
根据本发明的方法可治疗或预防的与mARC1表达相关的病症、疾病和障碍包括但不限于脂肪肝病，诸如酒精性脂肪肝病、酒精性脂肪性肝炎、NAFLD和NASH；慢性肝病；肝硬化；心血管疾病，诸如心肌梗死、心力衰竭、中风(缺血性和出血性)、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、外周血管疾病(例如外周动脉疾病)、脑血管疾病、易损斑块和主动脉瓣狭窄；家族性高胆固醇血症；静脉血栓形成；高胆固醇血症；高脂血症；和血脂异常(表现为例如，总胆固醇升高、低密度脂蛋白(LDL)升高、非常低密度脂蛋白(VLDL)升高、甘油三酯升高、和/或高密度脂蛋白(HDL)的低水平)。
在某些实施例中，本发明提供一种用于在有需要患者中降低mARC1蛋白质表达的方法，其包括向该患者施用本文所述的任何RNAi构建体。如本文所用，术语“患者”是指哺乳动物，包括人，且可与术语“受试者”互换使用。优选地，与未接受该RNAi构建体的患者中的mARC1表达水平或与施用该RNAi构建体之前患者中的mARC1表达水平相比，在施用RNAi构建体后，患者肝细胞中的mARC1表达水平降低。在一些实施例中，在施用本发明的RNAi构建体之后，患者中的mARC1表达减少至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少为55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。mARC1表达的降低百分比可通过本文所述的任何方法以及本领域已知的其他方法测量。在某些实施例中，根据本文所述的方法，通过评估患者中的血清或血浆生物标记物水平(诸如总胆固醇、LDL胆固醇或肝酶(例如ALT)水平)来确定mARC1表达的减少百分比。
在一些实施例中，需要减少mARC1表达的患者是有患心肌梗死的风险的患者。有患心肌梗死的风险的患者可能是有心肌梗死病史的患者(例如，以前患过心肌梗死)。有患心肌梗死的风险的患者也可能是有心肌梗死家族史或有一个或多个心肌梗死风险因素的患者。此类风险因素包括但不限于高血压、非HDL胆固醇水平升高、甘油三酯水平升高、糖尿病、肥胖、或自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、狼疮)史。在一个实施例中，有患心肌梗死的风险的患者是患有或被诊断出冠状动脉疾病的患者。通过向患者施用本文所述的任何RNAi构建体，可以降低这些和其他患者的心肌梗死的风险。因此，本发明提供了一种用于降低有需要的患者中的心肌梗死的风险的方法，其包括向该患者施用本文所述的RNAi构建体。在一些实施例中，本发明包括本文所述的任何RNAi构建体在制备用于在有需要的患者中降低心肌梗死的风险的药物中的用途。在其他实施例中，本发明提供了在用于在有需要的患者中降低心肌梗死的风险的方法中使用的mARC1靶向RNAi构建体。
在某些实施例中，需要减少mARC1表达的患者是诊断出心血管疾病或有患心血管疾病的风险的患者。因此，本发明包括通过施用本发明的任何RNAi构建体治疗或预防有需要的患者的心血管疾病的方法。在一些实施例中，本发明包括本文所述的任何RNAi构建体在制备用于在有需要的患者中治疗或预防心血管疾病的药物中的用途。在其他实施例中，本发明提供了在用于在有需要的患者中治疗或预防心血管疾病的方法中使用的mARC1靶向RNAi构建体。心血管疾病包括但不限于心肌梗死、心力衰竭、中风(缺血性和出血性)、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、外周血管疾病(例如外周动脉疾病)、脑血管疾病、易损斑块和主动脉瓣狭窄。在一些实施例中，根据本发明的方法治疗或预防的心血管疾病是冠状动脉疾病。在其他实施例中，根据本发明的方法治疗或预防的心血管疾病是心肌梗死。在又其他实施例中，根据本发明的方法治疗或预防的心血管疾病是中风。在仍其他实施例中，根据本发明的方法治疗或预防的心血管疾病是外周动脉疾病。在某些实施例中，施用本文所述RNAi构建体降低了心脏病患者发生非致命性心肌梗死、致命性和非致命性中风、某些类型的心脏手术(例如血管成形术、搭桥术)、心力衰竭住院、胸痛的风险，和/或已确定心脏病患者的心血管事件(例如，既往心肌梗死、既往心脏手术和/或有动脉阻塞的迹象的胸痛)。在一些实施例中，根据本发明的方法施用本文所述的RNAi构建体可用于降低复发性心血管事件的风险。
在一些实施例中，根据本发明的方法待治疗的患者是具有易损斑块(也称为不稳定斑块)的患者。易损斑块是巨噬细胞和主要含有胆固醇的脂质的堆积，位于动脉壁内皮衬里下方。这些易损斑块会破裂，导致形成血块，从而可能会阻碍动脉血液流动，导致心肌梗死或中风。易损斑块可通过本领域已知的方法鉴定，包括但不限于血管内超声和计算机断层扫描(参见Sahara等人,European Heart Journal[欧洲心脏杂志],第25卷:2026-2033,2004；Budhoff,J.Am.Coll.Cardiol.[美国心脏病学会杂志],第48卷:319-321,2006；Hausleiter等人,J.Am.Coll.Cardiol.[美国心脏病学会杂志],第48卷:312-318,2006)。
在其他实施例中，需要降低mARC1表达的患者是血液胆固醇水平(例如总胆固醇、非HDL胆固醇或LDL胆固醇)升高的患者。因此，在一些实施例中，本发明提供了用于在有需要的患者中降低血液胆固醇水平(例如，血清或血浆)的方法，其包括向该患者施用本文所述的任何RNAi构建体。在一些实施例中，本发明包括本文所述的任何RNAi构建体在制备用于在有需要的患者中降低血液胆固醇水平(例如血清或血浆)的药物中的用途。在其他实施例中，本发明提供了在用于在有需要的患者中降低血液胆固醇水平(例如血清或血浆)的方法中使用的mARC1靶向RNAi构建体。在某些实施例中，根据本发明方法降低的胆固醇为LDL胆固醇。在其他实施例中，根据本发明方法降低的胆固醇为非HDL胆固醇。非HDL胆固醇是所有含胆固醇的促动脉粥样硬化脂蛋白的量度，包括LDL胆固醇、极低密度脂蛋白、中密度脂蛋白、脂蛋白(a)、乳糜微粒和乳糜微粒残余物。据报道，非HDL胆固醇是心血管风险的良好预测因子(Rana等人,Curr.Atheroscler.Rep.[动脉粥样硬化通讯],第14卷:130-134,2012)。非HDL胆固醇水平可以通过从总胆固醇水平中减去HDL胆固醇水平来计算。
在一些实施例中，待根据本发明的方法治疗的患者是具有升高的非HDL胆固醇水平(例如，升高的血清或血浆非HDL胆固醇水平)的患者。理想情况下，任何给定患者的非HDL胆固醇水平应比LDL胆固醇水平的目标高出约30mg/dL。在特定实施例中，如果患者具有约130mg/dL或更大的非HDL胆固醇水平，则向患者施用本发明的RNAi构建体。在一个实施例中，如果患者具有约160mg/dL或更大的非HDL胆固醇水平，则向患者施用本发明的RNAi构建体。在另一个实施例中，如果患者具有约190mg/dL或更大的非HDL胆固醇水平，则向患者施用本发明的RNAi构建体。在仍另一个实施例中，如果患者具有约220mg/dL或更大的非HDL胆固醇水平，则向患者施用本发明的RNAi构建体。在某些实施例中，根据2013ACC/AHA心血管风险评估指南，如果患者有患心血管疾病的高风险或极高风险(Goff等人,ACC/AHAguideline on the assessment of cardiovascular risk:a report of the AmericanCollege of Cardiology/American Heart Association Task Force on PracticeGuidelines[ACC/AHA心血管风险评估指南:美国心脏病学会/美国心脏协会实践指南工作组的一份报告].J Am Coll Cardiol[美国心脏病学会杂志],第63卷:2935-2959,2014)且具有约100mg/dL或更大的非HDL胆固醇水平，则向患者施用本发明的RNAi构建体。
在本发明方法的某些实施例中，根据2013ACC/AHA心血管风险评估指南，如果患者有患心血管疾病的中等风险或更高风险，则向患者施用本文所述的RNAi构建体(本文称为“2013指南”)。在某些实施例中，如果该患者的LDL胆固醇水平大于约160mg/dL，则向患者施用本发明的RNAi构建体。在其他实施例中，如果患者的LDL胆固醇水平大于约130mg/dL且根据2013年指南，患者有患心血管疾病的中等风险，则向患者施用本发明的RNAi构建体。在仍其他实施例中，如果患者的LDL胆固醇水平大于100mg/dL且根据2013年指南，该患者有患心血管疾病的高风险或极高风险，则向患者施用本发明的RNAi构建体。
在其他实施例中，需要降低mARC1表达的患者是诊断出脂肪肝病或有患脂肪肝病的风险的患者。因此，本发明包括用于在有需要的患者中治疗、预防脂肪肝病或减少发展脂肪肝病的风险的方法，其包括向该患者施用本发明的任何RNAi构建体。在一些实施例中，本发明包括本文所述的任何RNAi构建体在制备用于在有需要的患者中治疗、预防脂肪肝病或减少发展脂肪肝病的风险的药物中的用途。在其他实施例中，本发明提供了在用于在有需要的患者中治疗、预防脂肪肝病或减少发展脂肪肝病的风险的方法中使用的mARC1靶向RNAi构建体。脂肪肝病是脂肪在肝脏中积聚的病症。有两种主要类型的脂肪肝病：第一类与大量饮酒有关(酒精性脂肪性肝炎)，第二类与饮酒无关(非酒精性脂肪肝病(NAFLD))。NAFLD的典型特征在于肝脏中存在脂肪积聚，但很少或没有炎症或肝细胞损伤。NAFLD可以进展到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其特征在于肝脏炎症和细胞损伤，两者又可以导致肝纤维化且最终肝硬化或肝癌。在某些实施例中，待根据本发明方法治疗、预防或减少发展风险的脂肪肝病是NAFLD。在其他实施例中，待根据本发明方法治疗、预防或减少发展风险的脂肪肝病是NASH。在仍其他实施例中，待根据本发明方法治疗、预防或减少发展风险的脂肪肝病是酒精性脂肪性肝炎。在一些实施例中，需要根据本发明的方法治疗或预防脂肪肝病的患者或有发展脂肪肝病的风险的患者已被诊断出2型糖尿病、代谢障碍或肥胖(例如体重指数≥30.0)。在其他实施例中，需要根据本发明的方法治疗或预防脂肪肝病的患者或有发展脂肪肝病的风险的患者具有升高的非HDL胆固醇或甘油三酯水平。取决于特定患者和患者可能具有的其他风险因素，升高的非HDL胆固醇水平可能为约130mg/dL或更高、约160mg/dL或更高、约190mg/dL或更高、或约220mg/dL或更高。升高的甘油三酯水平可以是约150mg/dL或更大、约175mg/dL或更大、约200mg/dL或更大、或约250mg/dL或更大。
在某些实施例中，需要减少mARC1表达的患者是诊断出肝纤维化或肝硬化或者有患肝纤维化或肝硬化的风险的患者。因此，本发明涵盖用于在有需要的患者中治疗、预防或减少肝纤维化的方法，其包括向该患者施用本发明的任何RNAi构建体。在一些实施例中，本发明包括本文所述的任何RNAi构建体在制备用于在有需要的患者中治疗、预防或减少肝纤维化的药物中的用途。在其他实施例中，本发明提供了在用于在有需要的患者中治疗、预防或减少肝纤维化的方法中使用的mARC1靶向RNAi构建体。在一些实施例中，有发展肝脏纤维化或肝硬化的风险的患者被诊断出NAFLD。在其他实施例中，有发展肝脏纤维化或肝硬化的风险的患者被诊断出NASH。在又其他实施例中，有发展肝脏纤维化或肝硬化的风险的患者被诊断出酒精性脂肪性肝炎。在仍其他实施例中，有发展肝脏纤维化或肝硬化的风险的患者被诊断出肝炎。在某些实施例中，施用本发明的RNAi构建体预防或延迟患者肝硬化的发展。
以下实例，包括所进行的实验和所实现的结果，仅用于说明目的，且不应解释为限制所附权利要求的范畴。
实例
实例1.Ob/Ob动物中mARC1表达的抑制调节脂质水平
遗传学研究报告了MARC1基因的A165T错义突变与血清低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇和总胆固醇水平降低之间的关联(Spracklen等人,Hum Mol Genet.[人类分子遗传学],第26卷(9):1770-178,2017；Emdin等人,bioRxiv 594523；//doi.org/10.1101/594523,2019；和Emdin等人,PLoS Genet[PLoS遗传学],第16卷(4):e1008629,2020)。该突变以及MARC1基因的其他功能丧失变体最近也与较低的肝脂肪水平、降低的肝酶水平和降低的肝硬化风险相关起来(Emdin等人,2019和Emdin等人,2020)。为了评估抑制mARC1表达是否可以降低在MARC1 A165T变体等位基因的人载体中观察到的血清胆固醇水平，向老年肥胖小鼠(ob/ob)施用靶向小鼠Marc1基因的siRNA分子或对照siRNA分子。Ob/ob小鼠肥胖且脂质水平升高，因此这些小鼠常被用作II型糖尿病和其他代谢障碍的模型。
18-20周龄的雄性ob/ob动物(杰克逊实验室(The Jackson Laboratory))喂食标准饲料(Harlan，2020×Teklad global无大豆蛋白膨化啮齿动物饲料)。通过皮下注射，小鼠以3mg/kg体重接受单独缓冲液(磷酸盐缓冲盐水)(n＝8)、在0.2ml缓冲液中的mARC1靶向siRNA(双链编号D-1000；n＝8)或对照siRNA(双链编号D-1002；n＝8)，每两周一次，持续六周。合成siRNA分子且将其与三价GalNAc部分(式VII所示结构)缀合，如下实例2中所述。每种siRNA分子的结构提供在下表1和2中。动物禁食且在第6周收获以用于进一步分析。将来自收获的动物的肝脏总RNA用于qPCR分析，并通过临床分析仪(AU400化学分析仪，奥林巴斯公司(Olympus))测量血清参数。首先将每个肝脏样品中的mRNA水平相对于18S核糖体RNA水平归一化，且然后与单独缓冲液组中的表达水平进行比较。在单独缓冲液组中，数据表示为相对过表达倍数。肝组织均质化并用异丙醇提取以测量总胆固醇和总甘油三酯(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)，Infinity胆固醇和Infinity甘油三酯试剂)。所有动物饲养条件和研究方案均由安进机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。小鼠被安置在指定的无病原体、AAALAC、Intl认证的在通风微型隔离器中的设施中。在12:12的黑暗:光周期下，对程序和安置室进行正向加压和调节。所有动物都通过自动浇水系统随意接受反渗透纯化水。
与仅接受缓冲液注射的动物相比，用mARC1靶向siRNA治疗的动物表现出肝脏中的mARC1表达减少大约80％(图2A)。由于mARC2mRNA的肝脏表达不受影响，siRNA分子降低mARC1表达是特异性的(图2B)。mARC1靶向siRNA治疗降低血清高密度脂蛋白(HDL)、LDL和总胆固醇水平以及丙氨酸转氨酶(ALT)和C反应蛋白(CRP)的血清水平(图3A-3H)。接受mARC1靶向siRNA的ob/ob动物中的肝脏甘油三酯水平也降低(图4A和4B)。与该动物模型中的缓冲液注射动物相比，接受mARC1靶向siRNA的动物的肝纤维化基因表达没有显著改变(数据未显示)。
该系列实验的结果显示，用mARC1靶向siRNA分子特异性抑制肝脏中的mARC1表达降低了血清胆固醇、LDL胆固醇、ALT水平和肝甘油三酯，证明mARC1在肝细胞中的脂质调节中的因果作用。在用mARC1靶向siRNA治疗的ob/ob动物中观察到的血清胆固醇、LDL胆固醇和ALT水平的降低与在MARC1 A165T变体等位基因的人载体中观察到的这些分析物水平的降低一致。因此，用siRNA分子(诸如本文所述的那些)抑制mARC1表达可用于降低高胆固醇血症或高脂血症患者的胆固醇和甘油三酯水平，且可用于治疗其他肝脏障碍，诸如非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝病、酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化。
实例2.mARC1 siRNA分子的设计和合成
利用对人MARC1转录物的生物信息学分析，确定了用于设计靶向人MARC1基因的治疗性siRNA分子的候选序列，其序列在本文中作为SEQ ID NO:1提供(Ensembl转录物编号ENST00000366910.9；见图1)。使用内部siRNA设计算法分析序列，如果满足某些标准，则选择。生物信息学分析分两阶段进行。在第一阶段，评估序列的各种特征，包括与食蟹猴MARC1转录物的交叉反应性(食蟹猴(Macaca fascicularis)；NCBI参考序列号：XR_001490722.1、XR_001490722.1、XR_001490723.1、XR_001490726.1、XR_273285.2、XM_005540901.2、XR_273286.2、XM_005540898.2和XM_005540899.2)，与其他人、食蟹猴和啮齿动物基因序列的序列同一性，以及与已知人单核苷酸多态性的重叠。在第二阶段，调整选择标准，以包括仅对人MARC1转录物具有特异性的序列，且评估序列的种子区与人微RNA(miRNA)序列的匹配情况，以预测脱靶效应。基于生物信息学分析的结果，选择665个序列用于初始合成和体外测试。
使用固相亚磷酰胺化学方法合成RNAi构建体。在MerMade12或MerMade192X(生物自动化公司)仪器上进行合成。将各种化学修饰，包括2'-氟修饰的核苷酸、2′-O-甲基修饰的核苷酸、反向核苷酸和硫代磷酸酯核苷酸间键，并入分子中。当在无突出端的情况下(双平端物)或在反义链和/或有义链的3'端处具有2个核苷酸的一个或两个突出端的情况下退火时，RNAi构建体通常被格式化为具有19-21个碱基对的双链体。对于体内研究，如下进一步所述，将RNAi构建体的有义链与三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分缀合。
材料
乙腈(DNA合成分级，AXO152-2505，EMD)
封端试剂A(80:10:10(v/v/v)四氢呋喃/二甲基吡啶/醋酸酐，BIO221/4000，EMD)
封端试剂B(16％1-甲基咪唑/四氢呋喃，BIO345/4000，EMD)
激活剂溶液(乙腈中的0.25M的5-(乙硫基)-1H-四唑(ETT)，BIO152/0960，EMD)
脱三苯甲基试剂(二氯甲烷中的3％的二氯乙酸，BIO830/4000，EMD)
氧化试剂(70:20:10(v/v/v)四氢呋喃/吡啶/水中的0.02M的碘，BIO420/4000，EMD)
二乙胺溶液(乙腈中的20％的DEA，NC0017-0505，EMD)
巯基化试剂(在吡啶中的0.05M的5-N-[(二甲基氨基)亚甲基]氨基-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(BIOSULII/160K))
5'-氨基己基接头亚磷酰胺和腺苷、鸟苷和胞嘧啶的2'-甲氧基和2'-氟亚磷酰胺(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))，经Molecular Trap Packs(0.5g/30mL，生物自动化公司(Bioautomation))的乙腈中的0.10M
2'-甲氧基-尿苷磷酰胺(赛默飞世尔科技公司)，经Molecular Trap Packs(0.5g/30mL，生物自动化公司)的90:10(v/v)乙腈/DMF中的0.10M
2'-脱氧-反向无碱基磷酰胺(化学基因公司(ChemGenes))，经Molecular TrapPacks(0.5g/30mL，生物自动化公司)的乙腈中的0.10M
CPG Support(Hi-Load Universal Support，500A(BH5-3500-G1)，79.6μmol/g，0.126g(10μmol))或1μmol通用合成柱，500A，Pipette Style Body(MM5-3500-1，生物自动化公司)
氢氧化铵(浓缩的，吉提贝可公司)
合成
将试剂溶液、亚磷酰胺溶液和溶剂附接到MerMade12或MerMade192X仪器上。将固体支持物添加至每个柱(具有顶部和底部玻璃料的4mL SPE管，为10μmol)，且将柱固定到仪器上。将柱用乙腈洗涤两次。冲洗亚磷酰胺和试剂溶液管线。使用Poseidon软件开启合成。通过重复去保护/偶联/氧化/封端合成循环来完成合成。特别地，向固体支持物中添加脱三苯甲基试剂以除去5'-二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基。用乙腈洗涤固体支持物。向该支持物中添加亚磷酰胺和激活剂溶液，然后孵育以使进入的核苷酸与游离的5’-羟基偶联。用乙腈洗涤支持物。向该支持物中添加氧化或巯基化试剂，以将亚磷酸三酯转化为磷酸三酯或硫代磷酸酯。向该支持物中添加封端试剂A和B以终止任何未反应的寡核苷酸链。用乙腈洗涤支持物。在最终的反应循环后，用二乙胺溶液洗涤树脂以除去2-氰基乙基保护基。将支持物用乙腈洗涤并在真空下干燥。
GalNAc缀合
用5'-氨基己基接头制备用于缀合至三价GalNAc部分的有义链(下式VII所示结构)。在自动合成后，将柱从仪器取出并且转移到罩中的真空歧管中。在真空过滤下，通过用二氯甲烷(DCM)中的1％三氟乙酸(TFA)的2mL等分试样连续处理来从固体支持物上除去5'-单甲氧基三苯甲基(MMT)保护基。当洗脱液中不再观察到橙色/黄色时，用二氯甲烷洗涤树脂。用5mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的10％的二异丙基乙胺洗涤树脂。在单独的小瓶中，用1,1,3,3-四甲基鎓四氟硼酸酯(TATU，12.83mg，40μmol)和二异丙基乙胺(DIEA，13.9μL，80μmol)来制备GalNAc3-Lys2-Ahx(67mg，40μmol)在DMF(0.5mL)中的溶液，其结构和合成在下文描述。将激活的偶联溶液添加至树脂并且将柱加盖并在室温下孵育过夜。将树脂用DMF，DCM洗涤，并在真空下干燥。
裂解
将合成柱从合成器或真空歧管中移除，并转移到裂解装置中。向固体支持物中添加4x 1mL(针对10μmol)或4x 250μL(针对1μmol)浓氢氧化铵。通过重力或轻真空过滤将洗脱液分别收集到24孔或96孔深孔板中。将板密封，用螺栓紧固到裂解卡盘(生物自动化公司)中，且在55℃下将混合物加热4h。将板移到冰箱中冷却20分钟，然后打开罩中的裂解卡盘。
分析和纯化
分析一部分裂解液并且通过阴离子交换色谱法纯化。将合并的级分通过尺寸排阻色谱法脱盐并且通过离子对反相高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)分析。将合并的级分冻干以获得白色无定形粉末。
分析型阴离子交换色谱法(AEX)：
柱：Thermo DNAPac PA200RS(4.6x 50mm，4μm)
仪器：安捷伦公司(Agilent)1100HPLC
缓冲液A：20mM磷酸钠，10％乙腈，pH 8.5
缓冲液B：20mM磷酸钠，10％乙腈，pH 8.5，1M溴化钠流速：40℃下1mL/min
梯度：6.2min内20％-65％ B
制备型阴离子交换色谱法(AEX)：
柱：Tosoh TSK Gel SuperQ-5PW，21x 150mm，13μm
仪器：安捷伦公司1200HPLC
缓冲液A：20mM磷酸钠，10％乙腈，pH 8.5
缓冲液B：20mM磷酸钠，10％乙腈，pH 8.5，1M溴化钠
流速：8mL/min
注射体积：5mL
梯度：35％-55％ B经40分钟用于有义链，50％-100％ B经40分钟用于反义链
制备型尺寸排阻色谱法(SEC)：
柱：3x GE Hi-Prep 26/10串联
仪器：GE AKTA Pure
缓冲液：水中的20％的乙醇
流速：10mL/min
注射体积：45mL(使用样品装载泵)
离子对反相(IP-RP)HPLC：
柱：Water Xbridge BEH OST C18，2.5μm，2.1x 50mm
仪器：安捷伦公司1100HPLC
缓冲液A：15.7mM DIEA，水中的50mM己氟异丙醇(HFIP)
缓冲液B：15.7mM DIEA，50:50水/乙腈中的50mM HFIP
流速：0.5mL/min
梯度：10％-30％ B经6min
退火
将少量的有义链和反义链称重到单独的小瓶。向小瓶中添加磷酸盐缓冲盐水(PBS，吉博科公司(Gibco))，浓度约为2mM(基于干重)。在NanoDrop One上测量实际样品浓度(ssDNA，消光系数＝33μg/OD260)。然后将两条链以等摩尔比混合，并且将样品在90℃的培养箱中加热5分钟并且允许缓慢冷却至室温。通过AEX分析样品。如下文实例3和4更详细描述的，注册并提交双链体以进行体外和体内测试。
GalNAc3-Lys2-Ahx的制备
式VII
Figure BDA0004113300310000801
其中X＝O或S。弯曲线代表与RNAi构建体的有义链的5'末端核苷酸的附接点。GalNAc部分附接至有义链的5'末端核苷酸的5'碳上，但反向无碱基(invAb)脱氧核苷酸为5'端核苷酸并通过5'-5'核苷酸间键连接至相邻核苷酸的情况除外，在这种情况下，该GalNAc部分附接至反向无碱基脱氧核苷酸的3'碳上。
向50mL的falcon管中添加在DCM(30mL)中的Fmoc-Ahx-OH(1.13g，3.19mmol)，随后是DIEA(2.23mL，12.78mmol)。将该溶液添加至50mL离心管中的2-Cl三苯甲基氯树脂(3.03g，4.79mmol)中并加载到振荡器上2h。将溶剂排干并且将树脂用17:2:1DCM/MeOH/DIEA(30ml x2)，DCM(30mL x4)洗涤并干燥。通过在290nm用UV分光光度检测，将负载确定为0.76mmol/g。
将3g负载的2-Cl三苯甲基树脂悬浮在DMF(20mL)中的20％4-甲基哌啶中，并且在30min后排干溶剂。再重复该过程一次，并且用DMF(30mL x3)和DCM(30mL x3)洗涤树脂。
向Fmoc-Lys(ivDde)-OH(3.45g，6mmol)在DMF(20mL)中的溶液中添加TATU(1.94g，6mmol)，随后是DIEA(1.83mL，10.5mmol)。然后将溶液添加至以上去保护的树脂，并且将悬浮液在振荡器上放置过夜。排干溶剂并且用DMF(30mL x3)和DCM(30mL x3)洗涤树脂。
用DMF(15mL)中的20％4-甲基哌啶处理树脂，并且在10min后，排干溶剂。再重复该过程一次并且用DMF(15mL x4)和DCM(15mL x4)洗涤树脂。
向Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(3.54g，6mmol)在DMF(20mL)中的溶液中添加TATU(1.94g，6mmol)，随后是DIEA(1.83mL，10.5mmol)。然后将溶液添加至以上去保护的树脂并且将悬浮液在振荡器上放置过夜。排干溶剂并且用DMF(30mL x3)和DCM(30mL x3)洗涤树脂。
用DMF(20mL)中的5％肼处理树脂，并且在5min后，排干溶剂。再重复该过程四次并且用DMF(30mL x4)和DCM(30mL x4)洗涤树脂。
向5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酸(4.47g，10mmol)在DMF(40mL)中的溶液中添加TATU(3.22g，10mmol)，并且将溶液搅拌5min。将DIEA(2.96mL，17mmol)添加至该溶液，并且然后将混合物添加至以上树脂。将悬浮液在室温下保持过夜并且排干溶剂。用DMF(3x 30mL)和DCM(3x30mL)洗涤树脂。
用DCM(30mL，含3％三异丙基硅烷)中的1％ TFA处理树脂，并且在5min后，排干溶剂。再重复三次该过程并且将合并的滤液真空浓缩。将残余物用二乙醚(50mL)研磨，并且将悬浮液过滤并干燥以给出粗产物。将粗产物用反相色谱法纯化并且用水中的0-20％的MeCN溶液洗脱。将级分合并并且冻干以给出呈白色固体的产物。
下表1列出了生物信息学分析中优先考虑的分子的未经修饰的有义和反义序列。表1还显示了人MARC1转录物(SEQ ID NO:1)中每个序列家族的siRNA分子靶向的核苷酸范围。双链体编号D-1000至D-1003设计用于靶向Marc1小鼠转录物，且不会与人MARC1转录物发生交叉反应。表2提供了具有化学修饰的有义和反义链的序列。根据体外基于细胞的测定和体内小鼠研究的活性(分别如实例3和4所述)，选择靶向人类MARC1转录物特定区域的序列进行结构-活性关系(SAR)研究。根据以下符号列出了核苷酸序列：a、u、g、和c＝相应的2'-O-甲基核糖核苷酸；Af、Uf、Gf、和Cf＝相应的2'-脱氧-2'-氟(“2'-氟”)核糖核苷酸；和invAb＝反向无碱基脱氧核苷酸(即当在链的3'端时，经由其3'位置处的取代基连接至相邻核苷酸(3'-3'间键)或者当在链的5'端时，经由其5'位置处的取代基连接至相邻核苷酸(5'-5'核苷酸间键)的无碱基脱氧核苷酸)。在序列中“s”的插入指示两个相邻的核苷酸经由硫代磷酸二酯基(例如硫代磷酸酯核苷酸间键)而连接。除非另有指示，否则所有其他的核苷酸都是经由3'-5'磷酸二酯基而连接。[GalNAc3]表示式VII所示的GalNAc部分，当“s”跟随[GalNAc3]符号时，该部分通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键共价附接至有义链的5'端的5'末端核苷酸。当invAb核苷酸是有义链的5'端的5′末端核苷酸时，它通过5'-5'键连接至相邻核苷酸，且该GalNAc部分共价附接至invAb核苷酸的3'碳。另外，GalNAc部分共价附接至有义链的5'末端核苷酸的5'碳。
表1.未经修饰的mARC1 siRNA序列
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表2.经修饰的mARC1 siRNA序列
Figure BDA0004113300310001052
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Figure BDA0004113300310001231
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Figure BDA0004113300310001241
实例3.在基于细胞的测定中mARC1 siRNA分子的体外评估
使用RNA FISH(荧光原位杂交)测定，筛选具有不同序列的mARC1 siRNA分子(实例2中所述的生物信息学分析优先处理这些分子)，以确定其在降低人mARC1 mRNA中的功效。将Hep3B细胞(从ATCC购买)在补充10％胎牛血清(FBS，西格玛公司(Sigma))和1％青霉素-链霉素(P-S，康宁公司(Corning))的伊格尔氏最低必需培养基(EMEM)(ATCC 30-2003)中培养。使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(赛默飞世尔科技公司)通过反向转染将siRNA转染到细胞中。将mARC1 siRNA分子以10点剂量反应形式进行测试，3倍稀释，最终浓度范围为500nM至25pM(运行1)、25nM至1pM(运行2)、或100nM至5pM(运行3)。通过Bravo自动液体处理平台(安捷伦公司)将1μL测试siRNA分子或磷酸盐缓冲盐水(PBS)媒介物和4μL不含补充剂的基础EMEM添加到PDL包衣的CellCarrier-384超测定板(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))中。然后，用Multidrop Combi试剂分配器(赛默飞世尔科技公司)，将在无补充剂的基础EMEM中预稀释(在5μL EMEM中0.035μL的RNAiMAX)的5μL的Lipofectamine RNAiMAX(赛默飞世尔科技公司)分配入测定板中。在室温(RT)下孵育siRNA/RNAiMAX混合物20分钟后，使用Multidrop Combi试剂分配器，将补充有10％ FBS和1％ P-S的EMEM中的30μL Hep3B细胞(每孔2000个细胞)添加至转染复合物中。将测定板在室温下孵育20分钟，然后置于培养箱中。将细胞在37℃和5％ CO2下孵育72小时。RNA FISH测定在siRNA转染后72小时在内部组装的自动FISH测定平台上使用制造商的测定试剂和方案(来自赛默飞世尔科技公司的
Figure BDA0004113300310001251
ViewRNA HC筛选测定)进行。简言之，将细胞在4％甲醛(赛默飞世尔科技公司)中在室温下固定15分钟，在室温下用洗涤剂透化3分钟，且然后在室温下用蛋白酶溶液处理10分钟。将靶特异性探针(赛默飞世尔科技公司)或媒介物(不含靶探针的靶探针稀释剂，作为阴性对照)孵育3小时，而前置放大器、放大器和标记探针分别孵育1小时。所有杂交步骤均在40℃下在Cytomat 2C-LIN自动培养箱(赛默飞世尔科技公司)中进行。在杂交反应后，将细胞用Hoechst和CellMask Blue(赛默飞世尔科技公司)染色30分钟，且然后在OperaPhenix高含量筛选系统(珀金埃尔默公司)上成像。使用Columbus图像数据存储和分析系统(珀金埃尔默公司)分析影像以获得每个细胞的平均斑点计数。使用高(有靶探针的PBS)和低(没有靶探针的PBS)对照孔对每个细胞的平均斑点计数进行归一化。绘制相对于总siRNA浓度的归一化值，且将数据拟合到Genedata Screener数据分析软件(基因数据公司(Genedata))中的四参数S形模型以获得IC50和最大活性值。如果数据不能与模型拟合，则不计算IC50值，并且仅报告最大活性值。
mARC1 siRNA分子最初是在500nM至25pM范围的十种不同浓度下在第一次运行中筛选的。在第一次运行中表现出显著活性的siRNA分子在第二次和第三次运行中以十种不同浓度在较窄的浓度范围内进行筛选(运行2:25nM至1pM；运行3:100nM至5pM)。所有三次运行的测定结果显示于下表3中。
表3.在Hep3B细胞中人mARC1 mRNA的体外抑制
Figure BDA0004113300310001261
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Figure BDA0004113300310001271
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Figure BDA0004113300310001331
在RNA FISH测定中评估的最初257种mARC1 siRNA分子中，74种分子表现出平均80％或更大的人mARC1 mRNA敲除，且在测定运行2和3中IC50值至少在一位数纳摩尔范围内。特别是，在测定运行2和3中的一个或两个中，32种分子(双链体编号D-1092；D-1093；D-1139；D-1061；D-1138；D-1095；D-1191；D-1180；D-1090；D-1062；D-1177；D-1083；D-1245；D-1067；D-1143；D-1170；D-1044；D-1096；D-1113；D-1086；D-1256；D-1189；D-1091；D-1174；D-1185；D-1066；D-1171；D-1140；D-1130；D-1068；D-1243；D-1074)将人mARC1 mRNA降低了至少85％。
在第二系列实验中，在RNA FISH测定中，在100nM至5pM范围的十个不同浓度范围下评估另外的mARC1 siRNA分子，且如上所述计算IC50和最大活性值。该第二系列实验的测定结果显示于下表4中。针对分子子集重复测定。对于此类分子，显示了两个运行的IC50和最大活性值。
表4.在Hep3B细胞中通过选择mARC1 siRNA分子进行的人mARC1 mRNA的体外抑制
Figure BDA0004113300310001341
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Figure BDA0004113300310001351
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Figure BDA0004113300310001491
在另外406种靶向人mARC1转录物的不同区域的mARC1 siRNA分子中，128种分子使Hep3B细胞中的人mARC1 mRNA减少了85％或更大。四十六种分子(双链体编号D-1061；D-1093；D-1220；D-1276；D-1284；D-1298；D-1310；D-1311；D-1338；D-1363；D-1367；D-1375；D-1381；D-1382；D-1383；D-1386；D-1387；D-1388；D-1389；D-1390；D-1396；D-1400；D-1401；D-1402；D-1405；D-1407；D-1416；D-1420；D-1421；D-1441；D-1451；D-1487；D-1489；D-1491；D-1503；D-1504；D-1515；D-1549；D-1576；D-1581；D-1595；D-1596；D-1606；D-1626；D-1633；和D-1662)使人mARC1 mRNA减少至少90％，其中大多数分子的IC50值低于1nM。
实例4.siRNA分子在AAV人mARC1小鼠模型中的体内功效
为了评估mARC1 siRNA分子的体内效力，通过实例2中所述的方法将每种siRNA分子中的有义链与式VII所示的三价GalNAc部分缀合，并将mARC1 siRNA分子施用至表达人MARC1基因的小鼠。10-12周龄的C57BL/6小鼠(杰克逊实验室)喂食标准饲料(Harlan，2020×Teklad global无大豆蛋白膨化啮齿动物饲料)。小鼠腹腔内(i.p.)注射编码人MARC1基因(AAV-hmARC1)的腺相关病毒(AAV)，剂量为每只动物1×1011个基因组拷贝(GC)。注射AAV-hmARC1后一周，小鼠接受单次皮下(s.c.)注射缓冲液或mARC1 siRNA分子，剂量为缓冲液中0.5mg/kg、1mg/kg或3mg/kg体重(每组n＝3)。将动物禁食并在siRNA施用后四周收获，以用于进一步分析。将来自收获的动物的肝脏总RNA用于qPCR分析，且通过临床分析仪(AU400化学分析仪，奥林巴斯公司)测量血清参数。相对于表达人mARC1mRNA并仅接受缓冲液注射的对照动物(即仅AAV-hmARC1动物)中的人mARC1 mRNA肝脏水平，计算每只动物肝脏中人mARC1mRNA的百分比变化。
对实例3所述体外活性测定中表现最好的mARC1 siRNA分子在该模型中的体内功效进行了评估。在SAR研究中进一步评估了表现出显著体内敲除活性的mARC1 siRNA分子，以通过改变化学修饰模式进一步改善体内效力和耐久性。使用不同mARC1 siRNA分子在AAV-hmARC1小鼠模型中进行的18项单独研究的结果如下表5-22所示。数据表示为每个治疗组(n＝3只动物/组)在研究第5周(siRNA注射后4周)与对照组相比的平均变化百分比。如果mARC1 siRNA分子与另一个mARC1 siRNA分子具有相同的触发物家族名称，则两个分子具有相同的核心序列(即靶向mARC1转录物的相同区域)，但化学修饰模式不同。
表5.在AAV-hmARC1小鼠中人mARC1 mRNA的体内抑制-研究1
Figure BDA0004113300310001511
表6.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究2
Figure BDA0004113300310001512
Figure BDA0004113300310001521
表7.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究3
Figure BDA0004113300310001522
表8.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究4
Figure BDA0004113300310001523
Figure BDA0004113300310001531
/>
表9.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究5
Figure BDA0004113300310001532
表10.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究6
Figure BDA0004113300310001541
表11.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究7
Figure BDA0004113300310001542
Figure BDA0004113300310001551
表12.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究8
Figure BDA0004113300310001552
表13.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究9
Figure BDA0004113300310001561
/>
*平均值包括一个异常值；如果移除异常值，则平均变化％为-79.41％(D-2170)和-70.68％(D-2193)。
表14.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究10
Figure BDA0004113300310001562
Figure BDA0004113300310001571
表15.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究11
Figure BDA0004113300310001572
表16.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究12
Figure BDA0004113300310001581
表17.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究13
Figure BDA0004113300310001582
/>
Figure BDA0004113300310001591
表18.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究14
Figure BDA0004113300310001592
表19.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究15
Figure BDA0004113300310001601
表20.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究16
Figure BDA0004113300310001602
/>
Figure BDA0004113300310001611
表21.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究17
Figure BDA0004113300310001612
表22.在AAV-hmARC1小鼠中的人mARC1 mRNA的体内抑制-研究18
Figure BDA0004113300310001621
在早期体内研究中表现出显著的沉默活性(双链体编号D-2042和D-2081)的两种mARC1 siRNA分子在后期的体内研究中用作基准化合物。在单次皮下注射1mg/kg剂量后四周，七十种mARC1 siRNA分子在AAV-hmARC1小鼠中产生75％或更大的人mARC1 mRNA降低。一些被测试的mARC1 siRNA分子(包括D-2081、D-2241、D-2255和D-2258)特别有效，这可以通过在四周时在单次皮下注射0.5mg/kg的情况下人mARC1 mRNA降低85％或更大所证明的。此外，与靶向转录物的其他区域的mARC1 siRNA分子相比，观察到靶向人mARC1转录物的某些区域的mARC1 siRNA分子在体内产生更大的人mARC1 mRNA降低。例如，含具有与人mARC1转录物(SEQ ID NO:1)的核苷酸1205至1250之间、核苷酸1345至1375之间或核苷酸2039至2078之间的区域互补的序列的反义链的mARC1 siRNA分子在单次皮下注射1mg/kg后四周表现出显著的敲除活性(表23)。表23总结了来自上述研究的具有相同化学修饰模式且在指定核苷酸范围内靶向人转录物的siRNA分子的人mARC1 mRNA肝脏水平的平均变化百分比。靶向核苷酸1211至1236之间的人转录物的mARC1 siRNA分子尤其有效，因为单次皮下施用1mg/kg剂量的此类siRNA分子在给药后至少四周内将人mARC1 mRNA水平降低大于80％。
表23.靶向特定转录区的mARC1 siRNA分子的体内功效总结
Figure BDA0004113300310001631
/>
Figure BDA0004113300310001641
1研究3、6和8中1mg/kg剂量组的平均值(分别见表7、10和12)
2研究3和6中1mg/kg剂量组的平均值(分别见表7和10)
3研究2和5中1mg/kg剂量组的平均值(分别见表6和9)
4研究1、4、5、6、7、9、10、12和13中1mg/kg剂量组的平均值(分别见表5、8、9、10、11、13、14、16和17)
5研究1和13中1mg/kg剂量组的平均值(分别见表5和17)
实例5.mARC1 siRNA在小鼠模型中治疗NASH的功效
为了确定抑制mARC1表达是否可以治疗脂肪肝病，向进行0.2％胆固醇饮食(TD190883饮食)的小鼠施用靶向小鼠Marc1基因的siRNA分子或对照siRNA分子。TD190883饮食含有0.2％胆固醇、20％果糖、12％蔗糖和22％氢化植物油(HVO)。已显示类似的饮食诱导在几周内进行该饮食的小鼠中的NAFLD和NASH特征(参见，例如，Zhong等人,Digestion[消化],第101卷:522-535,2020和Kroh等人,Gastroenterol Res Pract.第2020卷:7347068,2020,doi:10.1155/2020/7347068)。
6周龄雄性c57BL/6小鼠(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))喂食标准饲料(Harlan，2020×Teklad global无大豆蛋白膨化啮齿动物饲料)或0.2％胆固醇饮食(TD190883，Envigo)。通过皮下注射，进行0.2％胆固醇饮食的小鼠以3mg/kg体重接受单独缓冲液(磷酸盐缓冲盐水)、在0.2ml缓冲液中的mARC1靶向siRNA(双链体编号D-1000)或对照siRNA(双链体编号D-1002)，每两周一次，持续24周。合成siRNA分子且将其与三价GalNAc部分(式VII所示结构)缀合，如实例2中所述。每种siRNA分子的结构提供在表1和2中。动物禁食且在第24周收获以供进一步分析。将来自收获的动物的肝脏总RNA用于qPCR分析，并通过临床分析仪(AU400化学分析仪，奥林巴斯公司(Olympus))测量血清参数。首先将每个肝脏样品中的mRNA水平相对于18S核糖体RNA水平归一化，且然后与饲料对照组中的表达水平进行比较。在饲料对照组中，数据表示为相对过表达倍数。肝组织均质化并用异丙醇提取以测量总胆固醇和总甘油三酯(赛默飞世尔公司，Infinity胆固醇和Infinity甘油三酯)。所有动物饲养条件和研究方案均由安进机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。小鼠被安置在指定的无病原体、AAALAC、Intl认证的在通风微型隔离器中的设施中。在12:12的黑暗:光周期下，对程序和安置室进行正向加压和调节。所有动物都通过自动浇水系统随意接受反渗透纯化水。
在喂食0.2％胆固醇饮食的小鼠中，mARC1和mARC2两者的肝脏表达均降低。在用mARC1靶向siRNA治疗的动物中，mARC1表达(而不是mARC2表达)进一步降低(图5A和5B)。如所期望的，在研究过程中，进行0.2％胆固醇饮食的小鼠的血清肝酶(AST和ALT)、胆固醇、LDL-胆固醇(LDL-C)和HDL-胆固醇(HDL-C)水平增加(图6A-6E)。用mARC1靶向siRNA治疗降低饮食诱导的血清胆固醇、LDL-C和HDL-C增加(图6C-6E)。mARC1 siRNA治疗也显示出降低饮食诱导的血清肝酶水平的趋势(图6A-6B)。进行0.2％胆固醇饮食的动物在24周后体重和肝脏重量增加(图7A和7B)。在24周时，进行0.2％胆固醇饮食的动物的肝脏中的甘油三酯和胆固醇水平也增加(图7C和7D)。mARC1 siRNA治疗并未显著降低饮食诱导的体重、肝脏重量、肝脏甘油三酯水平或肝脏胆固醇水平的增加(图7A-7D)。
总之，该研究结果显示，在NASH小鼠模型中，用mARC1靶向siRNA分子抑制mARC1肝脏表达降低血清胆固醇、LDL-C、HDL-C和肝酶，表明mARC1 siRNA分子可能是治疗该疾病和其他脂肪肝障碍的一种新的治疗方法。
实例6.错配对mARC1 siRNA分子效力的影响
为了评估碱基对错配对mARC1 siRNA分子效力的影响，合成最有效的siRNA分子子集的类似物，使其在反义链5'端的6或8位具有不同的核苷酸，从而当反义链与其mARC1mRNA转录物靶区域杂交时，在该位置产生碱基对错配。然而，在每种类似物中，该有义链的序列被设计为与反义链的序列完全互补，因此在siRNA双链体中，有义链和反义链之间不会产生错配。每种错配类似物(双链体编号D-2514至D-2561)和亲本siRNA分子(双链体编号D-2052、D-2072、D-2076、D-2077、D-2079、D-2081、D-2105、D-2108、D-2111、D-2113、D-2115、D-2118、D-2142、D-2136、D-2189、D-2196、D-2238、D-2241、D-2254、D-2258、D-2301、D-2462、D-2465和D-2510)的未经修饰的和经修饰的序列分别在表1和2中提供。使用上述实例3中所述的体外RNA FISH测定，在Hep3B细胞中评估错配类似物和亲本siRNA分子在降低人mARC1mRNA水平方面的功效。如实例3所述，对100nM至5pM范围的十个不同浓度的每种siRNA分子进行测试，且根据剂量反应曲线计算IC50和最大活性值。这些测定的结果显示于下表24中。
表24.mARC1 siRNA错配类似物在Hep3B细胞中的体外功效
Figure BDA0004113300310001671
/>
Figure BDA0004113300310001681
/>
Figure BDA0004113300310001691
对于大多数分子，与其中反义链与靶mARC1 mRNA序列完全互补的亲本分子相比，位于反义链种子区内的位置6和8处的错配没有显著影响siRNA分子的最大敲除活性或效力。这些结果有些令人惊讶，因为反义链的种子区(即5′端的核苷酸2到8)被认为对上靶功效很重要。
实例7.mARC1 siRNA分子在非人灵长类动物中的体内疗效
在食蟹猴中评估了三种不同mARC1 siRNA分子(双链体编号D-2241、D-2081或D-2258)的疗效和药代动力学曲线。三种不同的mARC1 siRNA分子中每种都有与食蟹猴(Macaca fascicularis)MARC1基因发生交叉反应的反义链序列。雌性初次治疗食蟹猴，年龄22至48个月，原产毛里求斯，源自查尔斯河实验室公司研究模型服务公司(休斯顿，德克萨斯州)。向动物(每个治疗组n＝3)单次皮下(s.c.)注射3mg/kg GalNAc缀合mARC1 siRNA分子至肩胛骨和中背区域，该分子为双链体编号D-2241、D-2081或D-2258，在1X磷酸盐缓冲盐水中配制。在给药后的以下时间点收集全血制备血清：0.083、0.25、1、2、4、24、28、96、168、264、336、456、528、576、720、864和1056小时。在治疗前(第-13天或第-7天)和给药后第14天和第30天，在麻醉下收集外科手术肝活检(每个左肝叶和右肝叶约100mg组织)。在尸检时收集给药后第44天的肝脏样品。
血清和肝脏药代动力学
为了确定每种GalNAc缀合mARC1 siRNA分子的血清和肝脏药代动力学曲线，使用类似于Thayer等人,Sci.Rep.[科学研究],第10卷(1):10425,2020中所述的基于板的寡核苷酸电化学发光(POE)免疫测定，针对每种mARC1 siRNA分子(反义和有义链)分析在用皮下单次3mg/kg剂量的mARC1 siRNA分子治疗后不同时间点收集的血清和肝脏样品。寡核苷酸捕获(生物素)和检测(地高辛)探针由凯杰公司(Qiagen)(德国希尔登)定制合成，其序列是下表25列出的。将肝脏样品在含有50mM Tris HCl、100nM NaCl、0.1％ Triton X100和罗氏蛋白酶抑制剂混合物(11836170001)的裂解缓冲液中均质化至最终浓度为200mg/mL。对于生物分析，将GalNAc-mARC1siRNA标准品掺入血清或肝匀浆中，浓度范围为0.13至2500ng/mL。然后将标准品和生物样品在96孔PCR板中1:10稀释至最终体积50μL。在杂交缓冲液中制备寡核苷酸捕获和检测探针，该缓冲液由60mM Na2PO4(pH 7.0，二元酸)、1M NaCl、5mM EDTA和0.02％ Tween20组成。将探针合并并以10nM的最终浓度添加到PCR板中，使总样品体积达到100μL/孔。在以下条件下，使用热循环仪进行杂交：90℃持续5分钟，40℃持续30分钟，最终保持在12℃。杂交后，将45μL样品转移到中尺度诊断公司(Meso Scale Diagnostics，LLC)MSD Gold96孔链霉素SECTOR板(L15SA)中，并在室温下伴随振荡孵育30分钟。用SerCare Life Sciences 1X KPL免疫测定洗涤液(5150-0011)洗涤板。洗涤后，将板用50μL的在赛默飞世尔科技公司SuperBlock T20 TBS封闭缓冲液(37536)中稀释的0.5μg/mL钌标记的抗地高辛抗体孵育1小时。进行最终洗涤，然后添加中尺度诊断公司1X MSD读取缓冲液T(R92TC；150μL)并在中尺度诊断公司Meso Sector S 600仪器上读取。在Watson LIMS生物分析软件7.5版(赛默飞世尔科技公司)中，使用4参数逻辑模型和1/Y2的加权因子，从标准曲线内插mARC1 siRNA分子的血清和肝脏浓度。通过除以200mg/mL，将肝脏浓度的单位从ng/mL转换为ng/mg。使用Phoenix WinNonlin软件版本8.3.2.116(法赛特公司(Pharsight))中的非房室分析，测定给药后0.083至24小时的血清药代动力学参数。
表25.POE免疫测定捕获和检测探针
双链体编号 链 序列(5′→3′)1 SEQ ID NO:
D-2241 反义 /5Biosg/ACCTGGAATA 3659
D-2241 反义 TTAGATGCCT/3Dig_N/ 3660
D-2241 有义 /5Biosg/AAGGCATCTA 3661
D-2241 有义 ATATTCCAGG/3Dig_N/ 3662
D-2081 反义 /5Biosg/ATGTCCTGGAA 3663
D-2081 反义 TATTAGATGCT/3Dig_N/ 3664
D-2081 有义 /5Biosg/GCATCTAATA 3665
D-2081 有义 TTCCAGGACA/3Dig_N/ 3666
D-2258 反义 /5Biosg/CCTGGAATAT 3667
D-2258 反义 TAGATGCCTT/3Dig_N/ 3668
D-2258 有义 /5Biosg/AGGCATCTAA 3669
D-2258 有义 TATTCCAGGA/3Dig_N/ 3670
1加下划线的碱基＝锁核酸修饰；/5Biosg/＝通过六碳接头进行的生物素缀合；/3Dig_N/＝通过N-羟基琥珀酰亚胺酯进行的地高辛缀合。
图8A-8F显示了针对三种不同mARC1 siRNA分子中每种的反义和有义链浓度的血清浓度-时间曲线。如表26所总结的，在给药后2.0至4.0小时，针对D-2241、D-2258和D-2081，在血清中观察到的平均最大反义链浓度(Cmax)分别为511、496和321ng/mL。从剂量施用开始到给药后24小时(AUC0-24小时)，针对D-2258、D-2241和D-2081的血清反义链的平均浓度时间曲线下面积分别为6399、5040和4137h*ng/mL。双链体编号D-2258的有义链与反义链的血清浓度比率指示双链体的潜在不稳定性，可能在注射部位或体循环中发生链分离。表27报告了给药后第14、30和44天反义和有义链的siRNA肝脏浓度。第14天，双链体编号D-2081的肝脏反义链浓度最高，其次是D-2241，然后是D-2258。与血清药代动力学曲线一致，双链体编号D-2258的有义和反义链的肝脏浓度比率指示链分离。
表26.在食蟹猴中单次皮下3mg/kg剂量的mARC1 siRNA分子的情况下的反义链血清药代动力学参数
Figure BDA0004113300310001721
1Tmax＝给药后观察到最大观察浓度的时间；Cmax＝给药后测量的最大观察浓度；AUC0-24小时＝从剂量施用开始到给药后24小时，使用线性梯形法得出的浓度-时间曲线下面积。N＝每个治疗组3只动物。
表27.在食蟹猴中单次皮下3mg/kg剂量的mARC1 siRNA分子的情况下的反义和有义链肝脏浓度
Figure BDA0004113300310001722
Figure BDA0004113300310001731
SD＝标准差
肝脏mARC1 mRNA沉默
评估了三种GalNAc缀合mARC1 siRNA分子(双链体编号D-2241、D-2081和D-2258)敲低在皮下3mg/kg剂量后食蟹猴的肝脏中的mARC1 mRNA水平的功效。使用赛默飞世尔科技公司MagMAX-96总RNA分离试剂盒(AM1830)从快速冷冻的肝脏中纯化RNA，用赛默飞世尔科技公司NanoDrop 2000分光光度计(ND-2000)测定样品完整性(260/280比率)和RNA浓度。使用赛默飞世尔科技公司的TaqManTMRNA-to-CT 1-Step试剂盒(4392938)进行一步逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。通过将50ng RNA模板与2X TaqMan RT-PCR混合物、40X TaqMan RT酶混合物、20X mARC1引物-探针(IDT，正向引物5'-TTCAGGATGCGATGTCTATGC-3'(SEQ ID NO:3671)，反向引物5'-TGCCCAAAGAGTGGTGATTT-3'(SEQ ID NO:3672)，探针5'-/56-FAM/AGCCGCTGG(SEQ ID NO:3673)/ZEN/AAACACTGAAGAGTT(SEQ ID NO:3674)/3IABkFQ/-3')和20X甘油醛-3-磷酸脱氢酶引物-探针(GAPDH；赛默飞世尔科技公司，Mf04392546_g1VIC-MGB)混合，将反应组装到96孔PCR板中。在以下条件下，使用赛默飞世尔科技公司QuantStudio 7Flex实时PCR系统(4485701)进行RT-PCR：48℃持续30分钟，90℃持续10分钟，随后是40个90℃持续15秒，60℃持续1分钟的循环。将每个样品的mRNA表达通过获取目的基因浓度(mARC1)与管家基因浓度(GAPDH)的比率进行归一化。然后，针对每个治疗组的每个动物重复，相对于治疗前(第-13天或第-7天)时间点计算siRNA给药后(第14天、第30天和第44天)mARC1 mRNA表达的百分比(％)，表示为治疗前剩余％。mARC1 mRNA转录物的沉默百分比(％)最终通过从100％减去治疗前剩余％值来计算。下表28总结了治疗前剩余mRNA％和沉默％值。双链体编号D-2241是测试的最有效的GalNAc缀合mARC1siRNA分子，在单次皮下注射后的第14、30和44天，将食蟹猴mARC1肝脏mRNA减少到治疗前剩余<20％(>80％沉默)。
表28.用单次皮下3mg/kg剂量的GalNAc缀合mARC siRNA分子进行的食蟹猴肝脏mARC1 mRNA沉默
Figure BDA0004113300310001741
ND＝未检测到；SC＝皮下；SD＝标准差；其中mARC1 mRNA表达低于测定检测限的样品表示为“ND”(未检测到)，且设置为零。
肝脏mARC1蛋白质沉默
还评估了三种GalNAc缀合mARC1 siRNA分子(双链体编号D-2241、D-2081和D-2258)敲低在皮下3mg/kg剂量后食蟹猴的肝脏中的mARC1蛋白质水平的功效。在含有赛默飞世尔科技公司蛋白酶抑制剂片剂(A32963)的Boston Bioproduct NP-40裂解缓冲液(BP-119)中，以200mg/mL将快速冷冻的肝组织均质化。然后将匀浆在4℃下以10000x g旋转沉降10分钟，并将上清液转移到2mL 96深孔板中。将上清液用甲醇中的1％三氟乙酸处理，同时在室温下孵育15分钟，并在1400rpm下振荡。将沉淀的蛋白质在4000rpm下沉淀15分钟，从中吸取上清液，且用甲醇洗涤颗粒两次。所得蛋白质在含有10mM三(2-羧乙基)膦(赛默飞世尔科技公司，77720)和8M尿素的溶液中在37℃下还原并变性30分钟。然后将碘乙酰胺(20mM；赛默飞世尔科技公司，A39271)添加到20mM碳酸氢铵缓冲液中的样品中，且在室温下孵育30分钟。在37℃下过夜进行胰蛋白酶消化，添加30μg胰蛋白酶(赛默飞世尔科技公司，A90058)和10pmol稳定同位素标记(SIL)肽(赛默飞世尔科技公司定制肽；SPLFGQYFVLENPGTIK(SEQID NO:3675))。用20％甲酸终止消化反应，且制备样品进行固相萃取(SPE)脱盐(沃特斯公司(Waters Corporation)，186008052)。在装载样品之前，用甲醇调节SPE板，并用1％乙腈洗涤一次。将样品添加到经调节的SPE板中，并使用70％乙腈洗脱分析物。将洗脱液在pH 10的10mM甲酸铵中重新悬浮，且注入安捷伦公司1260Infinity生物惰性分析级级分收集器(G5664A)中。将分馏样品(第11级分)重新悬浮在0.1％甲酸溶液中，以便在与OrbitrapLumos质谱仪(MS)联用的赛默飞世尔科技公司Ultimate3000超高效液相色谱(LC)系统上进行分析。该LC法如下进行：以3％乙腈/水8μL/分钟，以及3.0％至36％乙腈/水分析梯度经1.0至12.1分钟350nL/分钟捕获，柱温为45℃。在Orbitrap Fusion Lumos仪器上进行了平行反应监测实验，该仪器分别在m/z＝955.5066和m/z＝959.5137时监测轻和重标记肽SPLFGQYFVLENPGTIK(SEQ ID NO:3675)和SPLFGQYFVLENPGTIK(SEQ ID NO:3675)。然后将数据导入Skyline 21.1软件(Pino LK等人The Skyline ecosystem:Informatics forquantitative mass spectrometry proteomics[Skyline生态系统:定量质谱蛋白质组学信息学].Mass Spectrom Rev.[质谱研究]2020年5月；39(3):229-244.doi:10.1002/mas.21540.Epub 2017年7月9日)，其中将每个样品的SPLFGQYFVLENPGTIK(SEQ ID NO:3675)肽峰面积相对于掺入型SIL肽SPLFGQYFVLENPGTIK(SEQ ID NO:3675)的峰面积归一化。使用相同的起始组织匀浆进行GAPDH管家蛋白的测量，且用冰冷丙酮沉淀，随后在1250rpm下混合10分钟，且在3220x g下离心15分钟。吸取上清液，且将蛋白质颗粒用甲醇洗涤，溶解在含有10μg胰蛋白酶的50mM碳酸氢铵缓冲液中，并在37℃下以1000rpm混合过夜进行消化。用20％甲酸终止消化反应，且注入LC-MS/MS分析，监测588.61和743.35m/z下的GAPDH肽：LISWYDNEFGYSNR(SEQ ID NO:3676)。使用SCIEX分析软件整合GAPDH肽峰面积。将每个样品的蛋白质表达通过获取相对于SIL肽测定的目的蛋白质浓度(mARC1)与管家蛋白浓度(GAPDH)的比率进行归一化。然后，针对每个治疗组的每个动物重复，相对于治疗前(第-13天或第-7天)时间点计算siRNA给药后(第14天、第30天和第44天)mARC1蛋白质表达的百分比(％)，表示为治疗前剩余％。mARC1蛋白质表达的沉默百分比(％)最终通过从100％减去治疗前剩余％值来计算。表29总结了治疗前剩余蛋白％和沉默％值。双链体编号D-2081在给药后第14天显示食蟹猴mARC1肝蛋白表达的最大降低，单次皮下注射后89％±0.71％沉默。在给药后第30天，双链体编号D-2081和D-2241分别将蛋白表达降低至治疗前剩余<20％，82％±7.8％和87％±11％沉默，在给药后第44天保持或增加。
表29.用单次皮下3mg/kg剂量的GalNAc缀合mARC siRNA分子进行的食蟹猴肝脏mARC1蛋白质沉默
Figure BDA0004113300310001761
Figure BDA0004113300310001771
N/A＝不适用；ND＝未检测到；SC＝皮下；SD＝标准差；其中mARC1蛋白质表达低于测定检测限的样品表示为“ND”(未检测到)，且设置为零。
本文讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其全文并入本文。应理解，披露的发明不限于所描述的特定方法、方案和材料，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不意图限制所附权利要求的范围。
本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效物。这类等效物旨在由以下权利要求所涵盖。

Claims (97)

1.一种包含有义链和反义链的RNAi构建体，其中该反义链包含具有与mARC1 mRNA序列基本上互补的序列的区域，且其中所述区域包含来自表1或表2中列出的反义序列的至少15个连续核苷酸。
2.如权利要求1所述的RNAi构建体，其中该有义链包含与该反义链的序列充分地互补以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的序列。
3.如权利要求2所述的RNAi构建体，其中该双链体区的长度为约17至约24个碱基对。
4.如权利要求2所述的RNAi构建体，其中该双链体区的长度为约19至约21个碱基对。
5.如权利要求1至4中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链的长度各自独立地为约19至约30个核苷酸。
6.如权利要求5所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链的长度各自独立地为约19至约23个核苷酸。
7.如权利要求1至6中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体包含一个或两个平端。
8.如权利要求1至6中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体包含具有1至4个未配对核苷酸的一个或两个核苷酸突出端。
9.如权利要求8所述的RNAi构建体，其中该核苷酸突出端具有2个未配对的核苷酸。
10.如权利要求8或9所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体在该有义链的3′端、该反义链的3′端、或者该有义链和该反义链两者的3′端包含核苷酸突出端。
11.如权利要求1至10中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体包含至少一个经修饰的核苷酸。
12.如权利要求11所述的RNAi构建体，其中该经修饰的核苷酸是2′-修饰的核苷酸。
13.如权利要求11所述的RNAi构建体，其中该经修饰的核苷酸是2′-氟修饰的核苷酸、2′-O-甲基修饰的核苷酸、2′-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2′-O-烷基修饰的核苷酸、2′-O-烯丙基修饰的核苷酸、二环核酸(BNA)、脱氧核糖核苷酸、或其组合。
14.如权利要求11所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。
15.如权利要求14所述的RNAi构建体，其中该经修饰的核苷酸是2′-O-甲基修饰的核苷酸、2′-氟修饰的核苷酸、或其组合。
16.如权利要求1至15中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链在其3′端、其5′端、或其3′和5′端两者处包含作为末端核苷酸的无碱基核苷酸。
17.如权利要求16所述的RNAi构建体，其中该无碱基核苷酸通过3′-3′核苷酸间键或5′-5′核苷酸间键附接至相邻核苷酸。
18.如权利要求1至17中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链、该反义链或该有义链和反义链两者包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
19.如权利要求18所述的RNAi构建体，其中该反义链在3'端和5'端两者的末端核苷酸之间包含两个连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。
20.如权利要求18或19所述的RNAi构建体，其中该有义链在3′端的末端核苷酸之间包含单个硫代磷酸酯核苷酸间键。
21.如权利要求18或19所述的RNAi构建体，其中该有义链在3′端的末端核苷酸之间包含两个连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。
22.如权利要求1至21中任一项所述的RNAi构建体，其中该反义链包含选自表1或表2中列出的反义序列的序列或由其组成。
23.如权利要求1至22中任一项所述的RNAi构建体，其中该反义链包含选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO:715；SEQ ID NO:732；SEQ ID NO:733；SEQ ID NO:738；SEQ ID NO:754；SEQ ID NO:761；SEQ ID NO:763；SEQ ID NO:764；SEQ ID NO:766；SEQ ID NO:809；SEQID NO:810；SEQ ID NO:814；SEQ ID NO:841；SEQ ID NO:848；SEQ ID NO:851；SEQ ID NO:862；SEQ ID NO:916；SEQ ID NO:1057；SEQ ID NO:1078；SEQ ID NO:2919；SEQ ID NO:2926；SEQ ID NO:2946；SEQ ID NO:2949；SEQ ID NO:2953；和SEQ ID NO:2956。
24.如权利要求1至23中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链包含选自表1或表2中列出的有义序列的序列或由其组成。
25.如权利要求24所述的RNAi构建体，其中该有义链包含选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:92；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:140；SEQ ID NO:141；SEQ IDNO:145；SEQ ID NO:172；SEQ ID NO:179；SEQ ID NO:182；SEQ ID NO:193；SEQ ID NO:247；SEQ ID NO:388；SEQ ID NO:390；SEQ ID NO:391；SEQ ID NO:409；SEQ ID NO:2808；和SEQID NO:2820。
26.如权利要求1至25中任一项所述的RNAi构建体，其中：
(i)该有义链包含SEQ ID NO:46的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:715的序列或由其组成；
(ii)该有义链包含SEQ ID NO:63的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:732的序列或由其组成；
(iii)该有义链包含SEQ ID NO:64的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:733的序列或由其组成；
(iv)该有义链包含SEQ ID NO:69的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:738的序列或由其组成；
(v)该有义链包含SEQ ID NO:85的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:754的序列或由其组成；
(vi)该有义链包含SEQ ID NO:92的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:761的序列或由其组成；
(vii)该有义链包含SEQ ID NO:94的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:763的序列或由其组成；
(viii)该有义链包含SEQ ID NO:95的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:764的序列或由其组成；
(ix)该有义链包含SEQ ID NO:97的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:766的序列或由其组成；
(x)该有义链包含SEQ ID NO:140的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:809的序列或由其组成；
(xi)该有义链包含SEQ ID NO:141的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:810的序列或由其组成；
(xii)该有义链包含SEQ ID NO:145的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:814的序列或由其组成；
(xiii)该有义链包含SEQ ID NO:172的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:841的序列或由其组成；
(xiv)该有义链包含SEQ ID NO:179的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:848的序列或由其组成；
(xv)该有义链包含SEQ ID NO:182的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:851的序列或由其组成；
(xvi)该有义链包含SEQ ID NO:193的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:862的序列或由其组成；或
(xvii)该有义链包含SEQ ID NO:247的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:916的序列或由其组成。
27.如权利要求1至25中任一项所述的RNAi构建体，其中：
(i)该有义链包含SEQ ID NO:409的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:1078的序列或由其组成；
(ii)该有义链包含SEQ ID NO:388的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:1057的序列或由其组成；
(iii)该有义链包含SEQ ID NO:2808的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:2926的序列或由其组成；
(iv)该有义链包含SEQ ID NO:2820的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:2946的序列或由其组成；
(v)该有义链包含SEQ ID NO:391的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:2949的序列或由其组成；
(vi)该有义链包含SEQ ID NO:390的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:2956的序列或由其组成；
(vii)该有义链包含SEQ ID NO:179的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:2919的序列或由其组成；
(viii)该有义链包含SEQ ID NO:388的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:2953的序列或由其组成；或
(ix)该有义链包含SEQ ID NO:388的序列或由其组成，且该反义链包含SEQ ID NO:1057的序列或由其组成。
28.如权利要求27所述的RNAi构建体，其中：
(i)该有义链包含根据SEQ ID NO:3078的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3337的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；
(ii)该有义链包含根据SEQ ID NO:3080的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3339的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；
(iii)该有义链包含根据SEQ ID NO:3163的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3441的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；
(iv)该有义链包含根据SEQ ID NO:3183的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3469的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；
(v)该有义链包含根据SEQ ID NO:3076的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3472的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；
(vi)该有义链包含根据SEQ ID NO:3077的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3484的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；
(vii)该有义链包含根据SEQ ID NO:2051的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3545的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；
(viii)该有义链包含根据SEQ ID NO:3080的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3481的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；
(ix)该有义链包含根据SEQ ID NO:3188的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3339的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；
(x)该有义链包含根据SEQ ID NO:3080的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3476的经修饰的核苷酸的序列或由其组成；或
(xi)该有义链包含根据SEQ ID NO:3223的经修饰的核苷酸的序列或由其组成，且该反义链包含根据SEQ ID NO:3517的经修饰的核苷酸的序列或由其组成。
29.如权利要求1至28中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是表1-24中列出的双链体化合物中的任一种。
30.如权利要求29所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是D-2078、D-2079、D-2081、D-2182、D-2196、D-2238、D-2241、D-2243、D-2246、D-2255、D-2258、D-2301、D-2316、D-2317、D-2329、D-2332、D-2341、D-2344、D-2356、D-2357、D-2399或D-2510。
31.如权利要求30所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是D-2079、D-2081、D-2196、D-2238、D-2241、D-2255、D-2258、D-2317、D-2332、D-2357或D-2399。
32.一种用于抑制细胞中人MARC1基因的表达的RNAi构建体，所述RNAi构建体包含杂交以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的有义链和反义链，且其中该反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1205至1250中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。
33.如权利要求32所述的RNAi构建体，其中该反义链的该区域包含与SEQ ID NO:1的核苷酸1209至1239中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列。
34.如权利要求32或33所述的RNAi构建体，其中该反义链的该区域包含CAUCUAAUAUUCCAG序列(SEQ ID NO:3656)。
35.如权利要求32所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是D-2063、D-2066、D-2076、D-2077、D-2078、D-2080、D-2081、D-2108、D-2113、D-2142、D-2240、D-2241、D-2243、D-2245、D-2246、D-2248、D-2250、D-2251、D-2253、D-2255、D-2256、D-2258、D-2259、D-2261、D-2264、D-2265、D-2268、D-2269、D-2270、D-2271、D-2301、D-2309、D-2311、D-2312、D-2314、D-2316、D-2317、D-2319、D-2321、D-2322、D-2324、D-2326、D-2327、D-2329、D-2331、D-2332、D-2334、D-2336、D-2337、D-2339、D-2341、D-2342、D-2344、D-2346、D-2347、D-2349、D-2351、D-2352、D-2354、D-2356、D-2357、D-2376、D-2380、D-2393、D-2395、D-2396、D-2431、D-2436、D-2437、D-2440、D-2441、D-2444、D-2445、D-2447、D-2453、D-2518、D-2519、D-2520、D-2521、D-2522、D-2523、D-2524、D-2525、D-2526、D-2527、D-2528、D-2529、D-2530、D-2531、D-2532、D-2533、D-2534或D-2535。
36.如权利要求35所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是D-2063、D-2066、D-2076、D-2077、D-2078、D-2080、D-2081、D-2108、D-2113、D-2142或D-2301。
37.一种用于抑制细胞中人MARC1基因的表达的RNAi构建体，所述RNAi构建体包含杂交以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的有义链和反义链，且其中该反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸1345至1375中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。
38.如权利要求37所述的RNAi构建体，其中该反义链的该区域包含UGGGACAUUGAAGCA序列(SEQ ID NO:3657)。
39.如权利要求37所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是D-2042、D-2043、D-2047、D-2052、D-2158、D-2162、D-2169、D-2182、D-2183、D-2184、D-2185、D-2186、D-2187、D-2189、D-2211、D-2213、D-2304、D-2305、D-2306、D-2307、D-2308、D-2384、D-2384、D-2385、D-2386、D-2387、D-2388、D-2389、D-2390、D-2391、D-2392、D-2399、D-2400、D-2401、D-2402、D-2403、D-2488、D-2494、D-2500、D-2506、D-2512、D-2538、D-2539、D-2540或D-2541。
40.如权利要求39所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是D-2042、D-2043、D-2047、D-2052、D-2304、D-2305、D-2306、D-2307或D-2308。
41.一种用于抑制细胞中人MARC1基因的表达的RNAi构建体，所述RNAi构建体包含杂交以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的有义链和反义链，且其中该反义链包含具有与SEQ ID NO:1的核苷酸2039至2078中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列的区域。
42.如权利要求41所述的RNAi构建体，其中该反义链的该区域包含与SEQ ID NO:1的核苷酸2048至2074中的至少15个连续核苷酸的序列基本上互补的序列。
43.如权利要求41或42所述的RNAi构建体，其中该反义链的该区域包含AUCAGAUCUUAGAGU序列(SEQ ID NO:3658)。
44.如权利要求41所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是D-2045、D-2065、D-2079、D-2082、D-2105、D-2106、D-2137、D-2143、D-2166、D-2173、D-2193、D-2242、D-2247、D-2252、D-2257、D-2260、D-2262、D-2266、D-2272、D-2273、D-2302、D-2303、D-2310、D-2313、D-2315、D-2318、D-2320、D-2323、D-2325、D-2328、D-2330、D-2333、D-2335、D-2338、D-2340、D-2343、D-2345、D-2348、D-2350、D-2353、D-2355、D-2358、D-2394、D-2397、D-2454、D-2455、D-2456、D-2457、D-2458、D-2459、D-2460、D-2463、D-2465、D-2465、D-2468、D-2470、D-2472、D-2473、D-2477、D-2487、D-2493、D-2499、D-2505、D-2511、D-2552、D-2553、D-2554、D-2555、D-2556或D-2557。
45.如权利要求44所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体是D-2045、D-2065、D-2079、D-2082、D-2105、D-2106、D-2137、D-2143、D-2302或D-2303。
46.如权利要求32至45中任一项所述的RNAi构建体，其中该双链体区的长度为约19至约21个碱基对。
47.如权利要求32至46中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链的长度各自独立地为约19至约30个核苷酸。
48.如权利要求47所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链的长度各自独立地为约19至约23个核苷酸。
49.如权利要求32至48中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体包含一个或两个平端。
50.如权利要求32至48中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体包含具有1至4个未配对核苷酸的一个或两个核苷酸突出端。
51.如权利要求50所述的RNAi构建体，其中该核苷酸突出端具有2个未配对的核苷酸。
52.如权利要求50或51所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体在该有义链的3′端、该反义链的3′端、或者该有义链和该反义链两者的3′端包含核苷酸突出端。
53.如权利要求32至52中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体包含至少一个经修饰的核苷酸。
54.如权利要求53所述的RNAi构建体，其中该经修饰的核苷酸是2′-修饰的核苷酸。
55.如权利要求54所述的RNAi构建体，其中该经修饰的核苷酸是2′-氟修饰的核苷酸、2′-O-甲基修饰的核苷酸、2′-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2′-O-烷基修饰的核苷酸、2′-O-烯丙基修饰的核苷酸、BNA、脱氧核糖核苷酸、或其组合。
56.如权利要求53所述的RNAi构建体，其中该有义链和该反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。
57.如权利要求56所述的RNAi构建体，其中该经修饰的核苷酸是2′-O-甲基修饰的核苷酸、2′-氟修饰的核苷酸、或其组合。
58.如权利要求32至57中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链在其3′端、其5′端、或其3′和5′端两者处包含作为末端核苷酸的无碱基核苷酸。
59.如权利要求58所述的RNAi构建体，其中该无碱基核苷酸通过3′-3′核苷酸间键或5′-5′核苷酸间键附接至相邻核苷酸。
60.如权利要求32至59中任一项所述的RNAi构建体，其中该有义链、该反义链或该有义链和反义链两者包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
61.如权利要求60所述的RNAi构建体，其中该反义链在3'端和5'端两者的末端核苷酸之间包含两个连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。
62.如权利要求60或61所述的RNAi构建体，其中该有义链在3′端的末端核苷酸之间包含单个硫代磷酸酯核苷酸间键。
63.如权利要求60或61所述的RNAi构建体，其中该有义链在3′端的末端核苷酸之间包含两个连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。
64.如权利要求1至63中任一项所述的RNAi构建体，其中该RNAi构建体进一步包含配体。
65.如权利要求64所述的RNAi构建体，其中该配体包含胆固醇部分、维生素、类固醇、胆汁酸、叶酸部分、脂肪酸、碳水化合物、糖苷、抗体或其抗原结合片段。
66.如权利要求64所述的RNAi构建体，其中该配体包含半乳糖、半乳糖胺、或N-乙酰基-半乳糖胺。
67.如权利要求66所述的RNAi构建体，其中该配体包含多价半乳糖部分或多价N-乙酰基-半乳糖胺部分。
68.如权利要求67所述的RNAi构建体，其中该多价半乳糖部分或多价N-乙酰基-半乳糖胺部分是三价或四价的。
69.如权利要求64至68中任一项所述的RNAi构建体，其中该配体任选地通过接头共价附接至该有义链。
70.如权利要求69所述的RNAi构建体，其中将该配体共价附接至该有义链的5′端。
71.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1至70中任一项所述的RNAi构建体，和药学上可接受的载体或赋形剂。
72.一种用于降低有需要的患者中的mARC1蛋白质表达的方法，该方法包括向该患者施用如权利要求1至70中任一项所述的RNAi构建体或如权利要求71所述的药物组合物。
73.如权利要求72所述的方法，其中与未接受该RNAi构建体或药物组合物的患者中的mARC1表达水平相比，在施用该RNAi构建体或药物组合物之后该患者中肝细胞中的mARC1表达水平降低。
74.如权利要求72所述的方法，其中该患者被诊断出心血管疾病、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎或肝硬化，或有患心血管疾病、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎或肝硬化的风险。
75.一种用于降低有需要的患者中的血清胆固醇的方法，该方法包括向该患者施用如权利要求1至70中任一项所述的RNAi构建体或如权利要求71所述的药物组合物。
76.如权利要求75所述的方法，其中该血清胆固醇是非HDL胆固醇或LDL胆固醇。
77.一种用于在有需要的患者中治疗、预防脂肪肝病或减少发展脂肪肝病的风险的方法，该方法包括向该患者施用如权利要求1至70中任一项所述的RNAi构建体或如权利要求71所述的药物组合物。
78.如权利要求77所述的方法，其中该脂肪肝病是非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎。
79.如权利要求77或78所述的方法，其中，该患者被诊断出2型糖尿病、代谢障碍或肥胖。
80.如权利要求77或78所述的方法，其中，该患者具有升高的非HDL胆固醇或甘油三酯水平。
81.一种用于在有需要的患者中治疗、预防或降低肝纤维化的方法，该方法包括向该患者施用如权利要求1至70中任一项所述的RNAi构建体或如权利要求71所述的药物组合物。
82.如权利要求81所述的方法，其中向该患者施用该RNAi构建体或药物组合物预防或延迟肝硬化。
83.如权利要求81或82所述的方法，其中，该患者被诊断出非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎。
84.如权利要求72至83中任一项所述的方法，其中该RNAi构建体或药物组合物经由肠胃外施用途径施用至该患者。
85.如权利要求84所述的方法，其中该肠胃外施用途径是静脉内或皮下。
86.如权利要求1至70中任一项所述的RNAi构建体，用于在有需要的患者中降低血清胆固醇的方法中使用。
87.如权利要求86所述的RNAi构建体，其中该血清胆固醇是非HDL胆固醇或LDL胆固醇。
88.如权利要求1至70中任一项所述的RNAi构建体，用于在有需要的患者中治疗、预防脂肪肝病、或减少发展脂肪肝病的风险的方法中使用。
89.如权利要求88所述的RNAi构建体，其中该脂肪肝病是非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎。
90.如权利要求1至70中任一项所述的RNAi构建体，用于在有需要的患者中治疗、预防或减少肝纤维化的方法中使用。
91.如权利要求90所述的RNAi构建体，其中该患者被诊断出非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎。
92.如权利要求1至70中任一项所述的RNAi构建体在制备用于在有需要的患者中降低血清胆固醇的药物中的用途。
93.如权利要求92所述的用途，其中该血清胆固醇是非HDL胆固醇或LDL胆固醇。
94.如权利要求1至70中任一项所述的RNAi构建体在制备用于在有需要的患者中治疗、预防脂肪肝病、或减少发展脂肪肝病的风险的药物中的用途。
95.如权利要求94所述的用途，其中该脂肪肝病是非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎。
96.如权利要求1至70中任一项所述的RNAi构建体在制备用于在有需要的患者中治疗、预防或降低肝纤维化的药物中的用途。
97.如权利要求96所述的用途，其中该患者被诊断出非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎。
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