JP2015196656A

JP2015196656A - 一酸化窒素消去剤

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Publication number: JP2015196656A
Application number: JP2014074646A
Authority: JP
Inventors: 美穂森田; Yoshio Morita; 克彦土田; Katsuhiko Tsuchida; 咲子浅井; Sakiko Asai; 祐介牧; Yusuke Maki
Original assignee: Naris Cosmetics Co Ltd
Current assignee: Naris Cosmetics Co Ltd
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2015-11-09
Anticipated expiration: 2034-03-31
Also published as: JP6333026B2

Abstract

【課題】選択的にＮＯを消去する高い活性を有する物質の提供する。【解決手段】アキノワスレグサ抽出物を有効成分として含有する、一酸化窒素消去剤。本願一酸化窒素消去剤は、そのまま或いは、飲食品、医薬品、又は化粧品に添加して用いることもできる。【効果】ＮＯ産生亢進に起因する肌荒れなどの皮膚疾患および冠動脈硬化、狭心症、心不全、高血圧、動脈硬化、敗血症性ショック、肝硬変、腎不全、炎症性疾患などの疾患症状に対する予防薬・治療薬として有用な医薬品、食品、化粧品組成物としても有用である。【選択図】図２

Description

本発明は、ユリ科ワスレグサ属に属するアキノワスレグサの抽出物を含有する安全性の高い一酸化窒素（以下、「ＮＯ」と言う場合がある。）消去剤に関する。更に詳しくは、ＮＯ産生亢進に起因する皮膚疾患、冠動脈硬化、狭心症、心不全、高血圧、動脈硬化、敗血症性ショック、肝硬変、腎不全、炎症性疾患などの疾患症状に対する予防薬・治療薬として有用な医薬品、食品、化粧品組成物に関する。

活性酸素の一つであるＮＯは、大気汚染物質として問題となっている窒素酸化物（ＮＯｘ）の一種であり、大気中で酸化されてＮＯ２になる。ＮＯ２は、高濃度で呼吸器に影響を及ぼすほか、環境汚染の原因物質の一つだといわれている。また、空気中のＮＯは、酸化剤として働き、皮脂に含まれる不飽和脂肪酸等を攻撃して、肌荒れ等を引き起こす原因となる可能性も指摘されている（非特許文献１）。

ＮＯの発生原因は、主として石油等の化石燃料の燃焼によるものであり、工場、自動車、家庭等から排出されている。また、より身近な例としてタバコの煙中にも存在することが知られている（非特許文献２）。

一方、ＮＯは生体内にも存在することも知られている。生体内のＮＯは、Ｌ−アルギニン、ＮＡＤＰＨ、テトラヒドロビオプテリン、カルモジュリン等を基質としてＮＯ合成酵素（以下、ＮＯＳという）により作られ、極めて重要な生理活性分子として機能している。例えば、血管内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）の正体はＮＯであり、その他、神経系における情報伝達物質や免疫系での異物攻撃の役割を担っていることが知られている。

ＮＯは発見当初から主として血流保持作用の観点により常に細胞保護的に作用していると考えられてきたが、高濃度のＮＯは細胞障害性を有することや人体の病態に悪影響を与えることが報告されている。ＮＯの産生過剰状態としてエンドトキシンショック、動脈硬化症の存在が明らかにされてきた。そのほかにも心不全、心筋炎、敗欠症性ショック、肝硬変など多くの病態におけるＮＯの関与が報告されている（非特許文献３）。

過剰に産生された生体内ＮＯを低減する手段として、Ｎω−モノメチル−Ｌ−アルギニン、Ｎω−ジメチル−Ｌ−アルギニン、Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン等のＬ−アルギニン誘導体やアミノグアニジンやＳ−エチルイソチオウレア等のアルギニン類似化合物のようなＮＯＳを不活性化するＮＯＳ阻害剤やジエチレントリアミン５酢酸の鉄錯体、デスフェリオキサミンの鉄錯体、ヒドロキソコバラミン等のようなＮＯと速やかに反応するＮＯ消去剤等の使用が挙げられる（非特許文献４）。

しかしながら、上記のようなＮＯＳ阻害剤を投与した臨床的な試みにおいては、症状の改善にはつながるものの、ＮＯ合成の制御では生成するＮＯの定量的制御が難しく、血圧の上昇、臓器の血流低下・障害等の様々な副作用を引き起こすという問題が指摘されている。また、上記のような従来のＮＯ消去剤は選択的にＮＯを消去することに注力したものではなかった。

これまで活性酸素は生体内のエネルギー代謝や感染防御過程において発生する一連の反応性分子種（Ｏ_２ ⁻，Ｈ_２Ｏ_２等）であり、これまで酸素毒性の要因となる有害物質として取り扱われてきた（活性酸素毒性説）。

一方、生体内にはＮｏｘ（およびＤｕｏｘ）と呼ばれる酵素群があり、白血球の抗菌作用のみならず、血管系、上皮・内分泌系細胞やリンパ球など多彩な細胞において積極的に活性酸素を産生し、殺菌作用以外の生理機能を発揮していることが近年報告されており、活性酸素は生体内で細胞保護シグナルとして重要な情報伝達も司っている（非特許文献５）。

このように、活性酸素は細胞・組織において、大変重要なシグナル機能も担っていることがわかってきた。そのため、身体に悪影響を及ぼす危険性があるＮＯの産生過剰状態を、従来の抗酸化物質を用いて改善しようとすると、細胞保護シグナルのような生体にとって重要な働きを担っている活性酸素も消去することになってしまう。そのため、他の活性酸素を消去することなく選択的にＮＯを消去することは大変重要であり、ＮＯに着目した研究は大変意味がある。

大久保洋一ら：大気汚染学会誌，２５（３），２１２−２２０，１９９０Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｋ．ｅｔａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，２５３，９９−１０３，（１９９８）日本化学編：季刊化学総説ＮＯ−化学と生物、ｐ．１６１−１６８吉村哲彦著：「ＮＯ（一酸化窒素）宇宙から細胞まで」、ｐ１１３−１３４、共立出版（１９９８）ＨｉｄｅｋｉＳｕｍｉｍｏｔｏ、ＦＥＢＳＪｏｕｒｎａｌ、Ｖｏｌｕｍｅ２７５，Ｉｓｓｕｅ１３（２００８）

本発明は、選択的にＮＯを消去する高い活性を有する物質の提供を課題としている。

本願発明は活性酸素種のなかでも、とりわけ一酸化窒素を選択的に消去する成分を有効成分とするものである。
具体的には、アキノワスレグサ抽出物を有効成分として含有させて、一酸化窒素消去剤を用いることで上記課題を解決する。本願一酸化窒素消去剤は、そのまま或いは、飲食品、医薬品、又は化粧品に添加して用いることもできる。

本願発明の一酸化窒素消去剤は、ＮＯ産生亢進に起因する皮膚疾患および冠動脈硬化、狭心症、心不全、高血圧、動脈硬化、敗血症性ショック、肝硬変、腎不全、炎症性疾患などの疾患症状に対する予防薬・治療薬として有用な医薬品、食品、化粧品組成物としても有用である。

ラジカル捕捉能試験の結果ＮＯ消去能評価試験の結果

本発明に用いるアキノワスレグサは、ユリ科ワスレグサ属の多年草植物で、別名「萱草」、「金針」、「忘憂草」等と称される。使用する部位は特に限定されない。全草の他、花、葉、茎、根、蕾、種子等が使用できる。

アキノワスレグサ抽出物の調製方法は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて、低温下から加温下で抽出される。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることができる。就中、水、エチルアルコール、１，３−ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適である。

本発明に用いることのできる植物抽出物の抽出方法は特に限定されないが、例えば乾燥したものであれば質量比で１〜１０００倍量、特に１０〜１００倍量の溶媒を用い、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好ましい。また、６０〜１００℃で１時間、加熱抽出しても良い。

以上のような条件で得られる上記各抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、さらに必要により、濾過等の処理をして、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることができる。

本発明の一酸化窒素消去剤における植物抽出物の配合量は、有効量存在すれば良い。
一般的には一酸化窒素消去剤の組成物に対して蒸発乾燥分に換算して０．０００１〜１００質量％が好ましく、特に０．０１〜１０．０質量％の範囲が最適である。

本発明の一酸化窒素消去剤の剤型は特に限定されない。液状、ジェル状、粉末状、乳化状等各種の剤型で用いることができる。

本発明の一酸化窒素消去剤は、本発明の一酸化窒素消去剤を基剤に配合して製造することができる。本発明の一酸化窒素消去剤以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、たとえば、油脂、ロウ類、炭化水素油、エステル油、高級アルコール、シリコーン油、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、保湿剤、界面活性剤、水溶性高分子、増粘剤、粉体、各種有効成分、皮膚保護剤、老化防止剤、植物抽出物、防腐剤、消炎剤、ｐＨ調整剤、金属イオン封鎖剤、酸化防止剤などを配合することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。また、特記しない限り配合量は質量％で示す。

＜被験物質の調製＞
（１）被検物質の植物抽出物は、アキノワスレグサ（葉及び茎の混合物）、夏枯草（葉及び茎の混合物）、ウラジロガシ（葉）の乾燥物を用いて調製した。各植物原体１ｇに１０倍量の５０％エタノールを１０ｇ加えて６０℃、３時間加熱抽出した。抽出後、ろ過をし、植物原体を取り除いた後、固形蒸発残分が１％になるように蒸留水で希釈した。以上の操作によって、固形蒸発残分が１％になるように調製した植物抽出物を得た。
（２）アスコルビン酸、Ｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、ＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）はＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）で溶解させ、全て１０ｍＭの濃度に調製した。

ＤＰＰＨラジカル捕捉試験
既知の抗酸化物質と植物抽出物のラジカル捕捉能を確認するため、ＤＰＰＨラジカル捕捉試験を用いて、ラジカル捕捉能の評価を行なった。
（１）ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）８．５３ｇをｄＨ２Ｏ１００ｍＬで溶解し、４００ｍＭＭＥＳを調製した。
（２）ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）０．０６２８ｇをＥｔＯＨ１００ｍＬで溶解し、０．４ｍＭＤＰＰＨを調製した。
（３）ＤＰＰＨ：ＭＥＳ：ｄＨ２Ｏ＝４：１：３の割合で混合し、これをＤＰＰＨＷｏｒｋｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎとして調製した。
（４）９６穴マイクロプレートに上述の方法で調製した植物抽出物１０μＬを分注し、ＤＰＰＨＷｏｒｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎを１９０μＬ添加し、プレートミキサーで３０分振とうさせた。
（５）その後、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍの吸光度を測定した。測定後、下記のラジカル捕捉率の計算式を用いて算出した。結果は図１に示す。尚、植物抽出物は植物名のみ表記している。

ラジカル捕捉率の計算式
（１）１０ｍＭＴｒｏｌｏｘを調製し、それをＤＭＳＯで段階希釈し、標準試薬として用いた。
（２）上記の段階希釈したＴｒｏｌｏｘの吸光度Ａｂ５４０の値と濃度から検量線（Ｙ＝ａＸ＋ｂ、Y＝吸光度、X＝濃度）を作成した。
（３）その検量線Ｙ＝ａＸ＋ｂから、試料のＴｒｏｌｏｘ当量として濃度を算出した。
＜式１＞
Ｔｒｏｌｏｘ当量＝（測定試料Ａｂ５４０−ｂ）／ａ（ｍＭ）

既知の抗酸化物質であるアスコルビン酸、ＢＨＴでは、高いラジカル捕捉能が確認され、１０ｍＭのときそれぞれＴｒｏｌｏｘ当量が８．５ｍＭ、５．７ｍＭであった。ウラジロガシ抽出物、夏枯草抽出物も同様にアスコルビン酸、ＢＨＴと同等の高いラジカル捕捉能が確認されたが、一方でアキノワスレグサ抽出物は上記の既知の抗酸化物質と比べて非常に低いラジカル捕捉能しか確認されなかった。

ＮＯ消去能評価試験
既知の抗酸化物質と植物抽出物のＮＯ消去能を確認するため、ＮＯの酸化物であるＮＯ２−を測定することでＮＯ量を測定するＧｒｉｅｓｓ法を用いて、ＮＯ消去能の評価を行なった。Ｇｒｉｅｓｓ法による測定は、ＮＯ２／ＮＯ３ＡｓｓａｙＫｉｔ−ＣＩＩ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）（同仁化学製）を用いた。ＮＯ発生剤として、ＮＯＣ−７（１−ヒドロキシ−２−オキソ−３−（Ｎ−メチル-３―アミノプロピル）−３−メチル−１−トリアゼン）（同仁化学社製）を用い、使用直前に０．１Ｎ水酸化ナトリウムのアルカリ溶液で調製した。一酸化窒素供与体として開発されたＮＯＣ−７はアルカリ溶液中では安定だが、中性および酸性条件下では一酸化窒素を生成する不安定な化合物（２５℃、ｐＨ７．４条件下で半減期５分）である。

（１）９６穴マイクロプレートにＰＢＳを１０μＬ、上記緩衝液（ｐＨ＝７．６）を４０μＬ、［００２５］で調製した測定試料を１０μＬ添加した。
（２）その後、１００μＭに調製したＮＯＣ−７溶液４０μＬを添加して、室温で３０分反応させた。
（３）反応終了後、Ｋｉｔ中のＧｒｉｅｓｓ試薬Ａを５０μＬ添加して、続けてＧｒｉｅｓｓ試薬Ｂを５０μＬずつ添加して１０分放置して呈色反応を行った。
（４）マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍの吸光度を測定した。各測定試料における吸光度をＳ５４０、試料の代わりに緩衝液とＮＯＣ−７のみを混合したコントロールの吸光度をＣ５４０、ＮＯＣ−７を含まないブランクの吸光度をＢ５４０として以下の式でＮＯ消去率（％）を算出し、結果を図２に示す。

＜式２＞
ＮＯ消去率（％）＝｛１００×（１−（Ｓ５４０−Ｂ５４０）／（Ｃ５４０−Ｂ５４０）}

抗酸化物質で既知のＴｒｏｌｏｘはＮＯ抑制率４０％と高いＮＯ消去能が観測されたが、ラジカル捕捉能が高い結果を得たＢＨＴやアスコルビン酸の２種においてＮＯ消去能は観測されなかった。一方で、ラジカル捕捉能が観測されなかったアキノワスレグサ抽出物においては、ＮＯ抑制率４７％と高い結果を得た。
尚、実施例では、アキノワスレグサの葉及び茎の５０％エタノール抽出物のみを開示しているが、その他の部位、抽出溶媒においても同様の傾向が見られた。

以上の結果から、本発明のアキノワスレグサ抽出物が他の活性酸素種を除くことなく、ＮＯを選択的に消去することが明らかになった。このアキノワスレグサ抽出物は生体内に存在する過剰なＮＯを選択的に消去し、正常なＮＯ濃度にする作用およびＮＯが過剰に発生することが予測される場合にあらかじめ投与し生体内に過剰なＮＯが発生することを防止する作用を有している。従って、ＮＯ産生亢進に起因する肌荒れなどの皮膚疾患および冠動脈硬化、狭心症、心不全、高血圧、動脈硬化、敗血症性ショック、肝硬変、腎不全、炎症性疾患などの疾患症状に対する予防薬・治療薬として有用な医薬品、食品、化粧品等に利用することができる。

Claims

ユリ科ワスレグサ属に属するアキノワスレグサの抽出物を含有することを特徴とする一酸化窒素消去剤。