JP2021516669A - インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物に関する。具体的に、インドセンダン葉抽出物を有効成分として含むことにより、抗菌効能、抗炎症効能及び抗公害効能を有し、特に、前記抗公害効能は、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効能であることを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物、これを含む化粧品組成物、及びインドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物を開示する。

Description

本発明は、インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物、これを含む化粧品組成物、及びインドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物に関する。

微細粒子状物質は、直径１０μｍ以下の非常に微細な粒子状物質であって、皮膚にも多くの影響を及ぼすが、皮膚にくっ付いて油分と絡み付くと老廃物が溜まり、毛穴の中に浸透してヒ素、カドミウム、鉛などの重金属が入るとニキビや発疹などの肌トラブルの原因になるおそれがある。微細粒子状物質は、特にニキビなどの肌トラブル疾患を持っている患者には一層致命的である。最近、ニキビ疾患が急増しており、過去の１０代中心から２０代までへと疾患の年齢層が拡大しているが、食習慣の欧米化、現代人のストレス増加だけでなく、前述した微細粒子状物質などの環境汚染が最も大きな原因として知られている。

現在、微細粒子状物質などによる肌トラブルの改善にはニキビ用化粧品が主に使用されているが、これらのニキビ用化粧品は、殺菌剤を主成分とした製品がほとんどであって、副作用への懸念により市場の拡散には限界がある。また、微細粒子状物質による肌トラブルを解決する方法としては、外出後に洗顔をよく行う方法や、微細粒子状物質の接触を防ぐための皮膚保護化粧品を塗る方法などがある。従来開発された微細粒子状物質関連化粧品としては、微細な泡を用いてメイク残余物だけでなく、微細粒子状物質や各種汚染物質まできれいに洗い出す方式のクレンジング製品がほとんどである。しかし、皮膚に接触した微細粒子状物質は、洗顔によって一部除去が可能であるが、毛穴などの経路を介して皮膚の中に浸透した微細粒子状物質を除去することは非常に難しい。よって、微細粒子状物質が皮膚に接触または浸透することを防止して皮膚を保護することがさらに重要である。

また、人間の老化には様々な要因が作用するが、人体内の様々な病気と共に老化を促進する原因の一つである活性酸素が生成されながら、酸化作用を起こしてＤＮＡ、細胞膜、及び皮膚の主要構成物質であるタンパク質、多糖類、脂質と反応して細胞に損傷を与えるうえ、肌の老化を引き起こすが、このような活性酸素を除去するための機能性食品及び化粧品分野の研究が盛んに行われている。

また、紫外線（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ；ＵＶ）は、メラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）の生成を促進させることが知られているが、過剰なメラニンの合成及び蓄積は、シミ、ソバカスのように視覚的に良くない病気を生む。メラノソーム（Ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ）には、正常なメラニンの合成に必要な酵素を含有しているが、これらの酵素の中で最も代表的なものとしては、チロシナーゼ関連遺伝子１（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１；ＴＲＰ−１）、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、チロシナーゼ関連遺伝子２（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−２；ＴＲＰ−２）などがある。

過剰な活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｚｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）により起こる酸化的ストレスは、外部要因であって細胞損傷を起こし、酸化的ストレスから誘発された炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）は、老化及び内部要因であって病的損傷を誘発する。炎症反応は、外部の刺激に対応するために生体内で起こる正常な防御機作であって、炎症反応が起こると、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ｉＮＯＳ）、腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α；ＴＮＦ−α）、一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ；ＮＯ）、インターロイキン−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β；ＩＬ−１β）及びシクロオキシゲナーゼ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２；ＣＯＸ−２）によって生成される。酸化的ストレスにより起こる老化及び炎症性疾患に対応するための研究が続けられている。

肌は、加齢に伴って厚みが益々薄くなり、シワが増加し、皮膚から弾力が減少する。これは、体の中から新陳代謝を調節するホルモンの分泌が減少し、肌の細胞活性が低下して皮膚構成タンパク質の生合成が減ることにより現れる現象である。また、シワが深まることと厚い肌に起因する光老化皮膚は、紫外線により増加するフリーラジカル（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ）及び有害な活性酸素種による。これらの老化が進むほど、皮膚を構成するコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、エラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）などの構造タンパク質を生成する能力が減少し、I型コラゲナーゼ（ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）（マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ））の生合成が増えることにより、皮膚構造タンパク質をより多く分解するようにする。また、このように累積される酸化的ストレスは、皮膚の老化をもっと促進する。紫外線により増加するタンパク質酵素の中でも、マトリックスを分解するマトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰｓ）は、皮膚の光老化発生過程で重要な役割を果たす。皮膚真皮内の細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）は、皮膚の構造及び弾力機能を維持する役割を果たすが、その中の８０％以上がI型プロコラーゲン（ｔｙｐｅ Ｉ ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ）からなっている。紫外線に晒された皮膚では、ＭＭＰｓの発現が増加し、増加したＭＭＰｓが、皮膚を構成している膠原質を分解して基質タンパク質の欠乏を招くことにより、肌の老化が起こる。

一方、インドセンダンは、センダン科の常緑高木であって、学名がＡｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａであり、英語では「Ｎｅｅｍ」または「Ｎｉｍ ｔｒｅｅ」と呼ばれる。インド、ネパール、パキスタン、バングラデシュ、スリランカ、モルディブなどの熱帯及び亜熱帯地域に生息し、１５〜２０ｍの高さに急成長する特徴を持っており、インド亜大陸で害虫防止剤、歯科衛生、砂漠化防止及び伝統医学に使われている。

本発明者は、活性酸素、紫外線、微細粒子状物質などの内外部要因による老化に効果的な抽出物に関する研究の末に、インドセンダン葉抽出物が活性酸素による肌の老化及びシワや、紫外線によるメラニン生成促進、微細粒子状物質などによる皮膚老化及び皮膚疾患などに効能を有することを見出し、本発明を完成した。

そこで、本発明は、インドセンダン葉抽出物を有効成分として含む化粧料組成物、及びこれを含む化粧品組成物を提供することを技術的課題とする。

また、本発明は、前記インドセンダン葉抽出物の薬理活性効果を利用して食品、化粧品、医薬などの様々な産業で活用可能なピッカリングエマルジョンを提供することを技術的課題とする。

ところが、本発明で解決しようとする技術的課題は上述した課題に制限されず、上述していな別の技術的課題は以降の記載から当業者に明確に理解できるだろう。

上記の技術的課題を解決するために、本発明は、インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）葉抽出物を有効成分として含むことにより抗菌効能、抗炎症効能及び抗公害効能を有することを特徴とし、前記抗公害効能は、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効能であることを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物を提供する。

本発明において、前記抗公害効能は、ヒアルロン酸の分解を防止して皮膚吸着を防止する機能を含み、前記抗菌効能は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌及びＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ菌に対する生育阻害機能であることを特徴とする。

また、本発明において、前記化粧料組成物は、抗酸化効能、美白効能及びシワ改善効能をさらに含むことを特徴とする。

また、本発明において、前記インドセンダン葉抽出物は、熱水抽出されたインドセンダン葉抽出物、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物、またはアセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物であることを特徴とする。

また、本発明は、前記インドセンダン葉抽出物を有効成分として含む化粧料組成物を含む化粧品組成物を提供する。このとき、好ましくは、前記化粧品組成物は、エッセンス、アンプル、石鹸、トニック及びボディエッセンス、エマルジョン、ローション、クリーム（水中油滴型、油中水滴型または多重相）、溶液、懸濁液（無水または水系）、無水生成物（オイルまたはグリコール系）、ジェルまたは粉末の形態であることを特徴とする。

また、上記の他の技術的課題を解決するために、本発明は、インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）葉抽出物を有効成分として含み、粉末相、水相及び添加剤をさらに含み、抗菌効能、抗炎症効能及び抗公害効能を有することを特徴とし、前記抗公害効能は、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効能であることを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物を提供する。

本発明において、前記ピッカリングエマルジョン組成物は、熱水、エタノールまたはアセトンを用いて抽出されたインドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）葉抽出物、粉末相、水相及び添加剤を含む組成物を１０，０００ｒｐｍ〜２０，０００ｒｐｍで３０秒〜５分間粉砕処理した後、３００〜８００ｒｐｍで１〜５分間混合処理して製造されることを特徴とする。

また、本発明において、前記抗公害効能は、ヒアルロン酸の分解を防止して皮膚吸着を防止する機能を含み、前記抗菌効能は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌及びＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ菌に対する生育阻害機能であることを特徴とする。

また、本発明において、前記ピッカリングエマルジョン組成物は、抗酸化効能、美白効能及びシワ改善効能をさらに含むことを特徴とする。

本発明のインドセンダン葉抽出物を有効成分として含む化粧料組成物は、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効果を示して抗公害（ａｎｔｉ−ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ）効能を示す。したがって、汚染物質、微細粒子状物質、重金属などの吸着による皮膚疾患や皮膚炎症、抗菌などにおける有意な効果を有し、皮膚細胞を改善し、皮膚保湿及び皮膚バリアを維持することができるようにする。したがって、本発明の化粧料組成物は、インドセンダン葉抽出物を有効成分として含むことにより、抗菌、抗炎、抗公害（ａｎｔｉ−ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ）効能だけでなく、抗酸化、美白、シワ改善効果を有する化粧料組成物を提供することができるという効果がある。

また、本発明は、インドセンダン葉抽出物の溶媒による抗酸化効果、抗菌効果、抗炎効果（ニキビ改善）、美白効果（皮膚色素沈着の緩和）、シワ改善効果などを検証し、この結果により要求される用途への活用価値を上昇させることができる。

また、本発明は、インドセンダンの葉から抽出した有効成分を含む組成物を提供して食品、化粧品、医薬品などに使用することができ、特に化粧品に使用される場合、有効成分及びその他の添加成分がより安定な形態で含有できるピッカリングエマルジョン組成物を提供することができる。これにより、有効成分であるインドセンダン葉抽出物の経皮吸収を促進しながら使用感を向上させることができる。

本発明の一実施例に係るインドセンダン抽出方法を示すもので、以下の図面において、ＡＩＷはインドセンダン葉熱水抽出物、ＡＩＥはインドセンダン葉エタノール抽出物、ＡＩＡはインドセンダン葉アセトン抽出物を意味する。 本発明の実験例１によるインドセンダン葉抽出物の抗酸化効果を測定して示すもので、図２ａはＤＰＰＨラジカル消去能測定結果、図２ｂはＡＢＴＳカチオンラジカル消去能測定結果、図２ｃはＳＯＤ類似活性効果測定結果、図２ｄはスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）消去能測定結果を示すものである。 図３ａは本発明の実験例３によるインドセンダン葉抽出物のチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）阻害活性測定結果を示すものであり、図３ｂは本発明の実験例４によるインドセンダン葉抽出物のエラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）阻害活性効果測定結果を示すものである。 本発明の実験例５によるインドセンダン葉抽出物の細胞毒性及び抗炎症効果を測定した結果を示すもので、図４ａはマクロファージ細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｅｌｌ）のの細胞生存率測定結果、図４ｂはＮＯ阻害活性測定結果を示すものである。 本発明の実験例５によるインドセンダン葉抽出物の抗炎症効果をウエスタンブロットによって確認した結果を示すものであり、図５ａはＡＩＷ、図５ｂはＡＩＥ、図５ｃはＡＩＡのｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２発現阻害測定結果を示すものである。 本発明の実験例５によるＡＩＥに対する測定結果を示すもので、図６ａはｉＮＯＳ ｍＲＮＡ発現抑制率測定結果、図６ｂはメラノーマ細胞（Ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ）（Ｂ１６Ｆ１０）の細胞毒性確認結果、図６ｃはＴＲＰ−１（Ａ）、ＴＲＰ−２（Ｂ）及びチロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）（Ｃ）発現抑制確認結果、図６ｄはＴＲＰ−１ｍ ＲＮＡ発現抑制結果を示すものである。 本発明の実験例７によるＡＩＥのシワ改善効能を測定した結果を示すもので、図７ａはヒトケラチノサイト細胞（Ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ）の細胞生存率確認結果、図７ｂはＭＭＰ−１とフィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）タンパク質発現確認結果を示すものである。 本発明の実験例８による細胞毒性確認結果を示すもので、図８ａは角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）での細胞生存率、図８ｂは線維芽細胞（ＣＣＤ−９８６ｓｋ ｃｅｌｌ）での細胞生存率を示すものである。 本発明の実験例８による抗公害実験結果を示すもので、図９ａは角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）でのＢｅｎｚｏ［α］ｐｙｒｅｎｅ（ＢＰ）処理時のインドセンダン葉抽出物による細胞生存率、図９ｂはＢｅｎｚｏ［α］ｐｙｒｅｎｅ（ＢＰ）処理時のインドセンダン葉抽出物による線維芽細胞（ＣＣＤ−９８６ｓｋ ｃｅｌｌ）での細胞生存率、図９ｃは微細粒子状物質処理時のインドセンダン葉抽出物による線維芽細胞（ＣＣＤ−９８６ｓｋ ｃｅｌｌ）での細胞生存率を確認した結果を示すものである。 本発明の実験例９によるピッカリングエマルジョンの製造方法を示すものである。 本発明の実験例９によるピッカリングエマルジョンの保湿剤の含有量による剤形変化を示すものであって、図１１ａはグリセリン（Ｇｌｙｃｅｒｉｎ）の含有量による剤形変化、図１１ｂは１，３−ＢＧの含有量による剤形変化、図１１ｃはプロパンジオール（Ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ）の含有量による剤形変化を示すものである。 本発明の実験例９によるピッカリングエマルジョンの複合保湿剤の含有量によるＴＥＷＬ水分蒸発測定結果を示すものである。 本発明の実験例９のｐＨによる剤形変化を示すもので、図１３ａはピッカリングエマルジョンのｐＨによる剤形変化、図１３ｂはＬ−アスコルビン酸原料のｐＨの含有量による剤形変化、図１３ｃはＬ−アスコルビン酸の含有量による剤形変化を示すものである。

以下、本発明を詳細に説明するに先立ち、本明細書に使用された用語は、特定の実施例を記述するためのものに過ぎず、添付する特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。本明細書に使用されるすべての技術用語及び科学用語は、他の記載がない限り、技術的に通常の技術を有する者に一般的に理解されるのと同様の意味を持つ。

本明細書及び請求の範囲全般にわたり、他の記載がない限り、包含（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という用語は、記載されたもの、ステップ、または一群のものまたはステップを含むことを意味し、任意の他のもの、ステップ、または一群のものまたは一群のステップを排除する意味で使用されたものではない。

一方、本発明の様々な実施例は、明確な反対の指摘がない限り、その他のある実施例とも組み合わせられ得る。特に好ましい或いは有利であると指示するいずれの特徴も、好ましい或いは有利であると指示したその他のある特徴とも組み合わせられ得る。

本発明の一実施例に係る組成物は、インドセンダン葉抽出物を含み、抽出された植物の有効成分を含むことにより、微細粒子状物質、重金属などから皮膚を保護する化粧品、ニキビの抑制及び皮膚色素沈着の緩和のための機能性化粧品、食品、医薬品などに使用できる。本明細書において、前記「有効成分」とは、単独で目的の活性を示すか、或いはそれ自体は活性のない担体と共に活性を示すことができる成分を意味する。

本発明は、一態様として、インドセンダン葉抽出物を有効成分として含む化粧料組成物を提供する。

前記本発明に含まれるインドセンダン葉抽出物は、溶媒抽出法によって抽出でき、溶媒抽出法に使用される溶媒は、例えば、水、炭素数１〜４の無水または含水低級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノール）、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、アセトン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン及びこれらの混合物よりなる群から選択される溶媒が使用できる。

好ましくは、熱水、エタノールまたはアセトンを用いて抽出され、インドセンダンの有効成分を含有することができる。この場合、前記インドセンダン葉抽出物は、インドセンダンの葉を溶媒である熱水、エタノールまたはアセトンに浸漬させた後、抽出して得る。抽出方法はその溶媒によって異なる。具体的に、前記インドセンダンの葉を熱水を用いて抽出する場合には、乾燥したインドセンダン葉の重量の８〜１２倍の熱水に浸漬させた後、９０〜１１０℃で３〜５時間抽出する。このとき、上述した抽出ステップを少なくとも２回、好ましくは少なくとも３回繰り返して抽出物を得るのが良い。また、前記インドセンダンの葉をエタノールまたはアセトンを用いて抽出する場合には、６０〜８０％のエタノールまたはアセトン溶液を溶媒として用い、乾燥したインドセンダン葉の重量の８〜１２倍のエタノールまたはアセトン溶液に浸漬させた後、常温で２０〜３０時間抽出する。このとき、上述した抽出ステップを少なくとも２回、好ましくは少なくとも３回繰り返して抽出物を得るのが良い。

また、前記インドセンダンの有効成分が抽出されたインドセンダン葉抽出物は、抗菌効果、抗炎効果（ニキビ改善）及び抗公害（ａｎｔｉ−ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ）効果を提供する。

まず、抗菌効果に関連して、インドセンダン葉抽出物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌及びＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ菌に対して生育阻害を示して抗菌効果を有する。さらに具体的には、生育阻害環測定実験でエタノールまたはアセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌で２ｍｇ／ｄｉｓｃから１．０±０ｃｍ以上のｃｌｅａｒ ｚｏｎｅが現れ、すべてのインドセンダン葉抽出物がＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ菌に対して５ｍｇ／ｄｉｓｃから１．１±０ｃｍ以上のｃｌｅａｒ ｚｏｎｅが現れる。

また、抗炎症効果に関連して、インドセンダン葉抽出物は、マクロファージ細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｅｌｌ）であるＲＡＷ２６４．７で９０％以上の生存率を示し、ＮＯ阻害活性を示し、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２タンパク質発現阻害活性を示して抗炎症効果を有する。

特にエタノールまたはアセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物は、１００μｇ／ｍＬの濃度でＮＯ阻害活性率が６５％以上と優れており、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物のＮＯ阻害活性が最も優れている。また、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物はｉＮＯＳタンパク質発現阻害活性を有し、アセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物はｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２タンパク質発現阻害活性を有する。さらに具体的には、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物の１００μｇ／ｍＬの濃度でｉＮＯＳ ｍＲＮＡ発現抑制率が９７％以上と最も優れている。

また、抗公害効果に関連して、インドセンダン葉抽出物は、ヒト皮膚細胞であるＨａＣａＴ ｃｅｌｌとＣＣＤ−９８６ｓｋ ｃｅｌｌにおいてＢｅｎｚｏ［α］ｐｙｒｅｎｅ（ＢＰ）で刺激された細胞がインドセンダン抽出物によって改善され、抗公害効能を有する。このようなベンゾピレンは、化石燃料などの不完全燃焼過程で生成される多環芳香族炭化水素の一種であって、煤煙だけでなく、空気中に含まれる汚染物質である。特に、ＨａＣａＴ ｃｅｌｌでは、Ｂｅｎｚｏ［α］ｐｙｒｅｎｅのみを処理した細胞と比較して２５μｍ／ｍＬで９２％以上の改善効果を示し、ＣＣＤ−９８６ｓｋ ｃｅｌｌでは、２５μｇ／ｍＬで８１％以上の改善効果を示す。

また、インドセンダン葉抽出物は、ＣＣＤ−９８６ｓｋ ｃｅｌｌにおいて微細粒子状物質で刺激された細胞がインドセンダン抽出物によって改善され、皮膚細胞を保護する抗公害効能を有する。具体的には、ＣＣＤ−９８６ｓｋ ｃｅｌｌで微細粒子状物質のみ処理した細胞と比較して１００μｇ／ｍＬで８５％以上の改善効果を示す。

また、インドセンダン葉抽出物は、皮膚バリアを形成するヒアルロン酸を保護する効果を持つ。本発明の一実施例によれば、皮膚バリアを形成し、皮膚保湿に関与するヒアルロン酸に鉄分１０ｐｐｍ、１％インドセンダン抽出物及び０．２％ＥＤＴＡ−２Ｎａを反応させた後、ヒアルロン酸の粘度を測定した結果、ＥＤＴＡ−２Ｎａよりもインドセンダン抽出物が鉄と結合する効果がより良いため、粘度がさらに高いことを確認した。これは、インドセンダン葉抽出物によってヒアルロン酸の分解を防止することができ、重金属などを吸着するＥＤＴＡ−２Ｎａよりもその効果がさらに優れていることを意味する。

したがって、インドセンダン葉抽出物は、化粧品組成物に含まれ、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効果を示して抗公害（ａｎｔｉ−ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ）効能を示す。したがって、汚染物質、微細粒子状物質、重金属などの吸着による皮膚疾患や皮膚炎症、抗菌などにおいて有意な効果を有し、皮膚細胞を改善し、皮膚保湿及び皮膚バリアを維持することができるようにする。

また、前記インドセンダンの有効成分が抽出されたインドセンダン葉抽出物は、上述した抗菌効果、抗炎効果（ニキビ改善）、抗公害（ａｎｔｉ−ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ）効果だけでなく、抗酸化効果、美白効果、シワ改善効果を提供する。

抗酸化効果に関連して、インドセンダン葉抽出物は、５０ｍｇ／ｇ以上の高いポリフェノール含有量を有し、ＤＰＰＨラジカル消去能、ＡＢＴＳ^＋ラジカル消去能、ＳＯＤ様活性能、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）消去能を示して抗酸化効果を有する。

特に、熱水抽出されたインドセンダン葉抽出物は、１，０００μｇ／ｍＬの濃度でＤＰＰＨラジカル消去能が４０％以上であり、ＡＢＴＳ^＋ラジカル消去能が７０％以上と最も優れている。エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物は、１，０００μｇ／ｍＬの濃度でＳＯＤ様活性能が２０％以上であり、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）消去能が９５％以上と最も優れている。アセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物は、７０ｍｇ／ｇ以上の最も高いポリフェノール含有量を有する。

また、美白効果に関連して、インドセンダン葉抽出物は、チロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）阻害活性を示して皮膚色素沈着の緩和、すなわち美白効果を有する。特に、エタノールまたはアセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物のチロシナーゼ阻害活性率が１，０００μｇ／ｍＬの濃度で４５％以上と優れており、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物のチロシナーゼ阻害活性が最も優れている。

さらにチロシナーゼ阻害活性が最も優れた、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物は、メラノーマ細胞（Ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ）であるＢ１６Ｆ１０で８５％以上の生存率を示し、１０μｇ／ｍＬの濃度で８５％以上と高いＴＲＰ−１ ｍＲＮＡ発現抑制能を有する。

また、シワ改善効果に関連して、インドセンダン葉抽出物は、エラスターゼ（Ｅｌａｓｔａｓｅ）阻害活性を示してシワ改善効果を有する。特に、エタノールまたはアセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物のエラスターゼ阻害活性率が１，０００μｇ／ｍＬの濃度で２０％以上と優れており、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物のエラスターゼ阻害活性が最も優れている。

さらにエラスターゼ阻害活性に最も優れた、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物は、ヒトケラチノサイト細胞（Ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ）で９０％以上の生存率を示し、１０μｇ／ｍＬの濃度でＭＭＰ−１発現抑制能を有する。

上述したように、インドセンダン葉抽出物を有効成分として含むことにより、抗菌・抗炎・抗公害（ａｎｔｉ−ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ）効能と抗酸化・美白・シワ改善効能を有する本発明の化粧料組成物を含む化粧品を提供することができる。このようにインドセンダン葉抽出物を含む化粧品は、スキン及びボディケア化粧品であって、エッセンス、アンプル、石鹸、トニック泳ぎボディエッセンス、エマルジョン、ローション、クリーム（水中油滴型、油中水滴型、多重相）、溶液、懸濁液（無水及び水系）、無水生成物（オイル及びグリコール系）、ジェル、粉末などの様々な剤形に製造できる。

このとき、前記化粧品組成物は、インドセンダン葉抽出物以外に、皮膚化粧品製剤において収容可能な担体を含むことができる。前記担体としては、アルコール、オイル、界面活性剤、脂肪酸、シリコーンオイル、防腐剤、湿潤剤、保湿剤、粘性変形剤、乳剤、安定剤、紫外線遮断剤、発色剤、香料、希釈剤などが例示できる。

前記アルコール、オイル、界面活性剤、脂肪酸、シリコーンオイル、防腐剤、湿潤剤、保湿剤、粘性変形剤、乳剤、安定剤、紫外線遮断剤、発色剤、香料、希釈剤などとして使用できる具体的な化合物または組成物は、当業分野で既に公知になっているので、当業者であれば、適切な該当化合物または組成物を選択して使用することができる。

ここで幾つかを例示してみると、アルコールとしては、高級アルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポリエチレングリコールなどの水溶性多価アルコールなどを挙げることができ、オイルとしては、アボカド油、パーム油、牛脂、ホホバ油などを挙げることができ、防腐剤としては、エチルパラベン、ブチルパラベンなどを挙げることができ、保湿剤としては、ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）、ピロリドンカルボン酸塩などを挙げることができ、希釈剤としては、エタノール、イソプロパノールなどを挙げることができる。

より具体的に、化粧品の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物線維、植物線維、ワックス、パラフィン、デンプン、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが使用できる。

また、剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが使用でき、特にスプレーである場合には、さらにクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルなどの推進体を含むことができる。

また、剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶媒和剤または油濁化剤が使用され、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。

また、剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールなどの液状希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラカントなどが使用できる。

また、剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコール硫酸塩、脂肪族アルコールエーテル硫酸塩、スルホンコハク酸モノエステル、イセチオン酸塩、イミダゾニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテル硫酸塩、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グルリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、リノリン誘導体またはエトキシ化グリセロール脂肪酸エステルなどが使用できる。

また、本発明の一実施例に係るインドセンダン葉抽出物を含む石鹸の場合、石鹸基材にインドセンダン葉抽出物を含めて製造でき、添加剤として皮膚保湿剤、乳化剤、硬水軟化剤などを含めて製造できる。

前記石鹸基材としては、ヤシ油、パーム油、大豆油、ヒマシ油、オリーブ油、パーム核油などの植物油脂、または牛脂、豚脂、羊脂、魚油などの動物油脂などが使用でき、前記皮膚保湿剤としては、グリセリン、エリトリトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ペンチレングリコール、ヘキシルグリコール、ミリスチン酸イソプロピル、シリコーン誘導体、アロエベラ、ソルビトールなどが使用でき、前記乳化剤としては、天然オイル、ワックス、脂肪アルコール、炭化水素類、天然植物抽出物などが使用でき、前記硬水軟化剤としては、ＥＤＴＡテトラナトリウムなどが使用できる。

本発明の石鹸組成物は、また、添加剤として抗菌剤、分散剤、泡抑制剤、溶媒、水垢防止剤、腐食防止剤、香料、色素、金属イオン封鎖剤、酸化防止剤、防腐剤などをさらに含むことができる。

また、本発明は、別の態様として、インドセンダン葉抽出物を含むことにより、抗菌・抗炎・抗公害（ａｎｔｉ−ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ）効能と抗酸化・美白・シワ改善効能を有するピッカリングエマルジョン組成物を提供する。このようなピッカリングエマルジョン組成物は、固体粒子で安定化されたエマルジョンを意味するもので、インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）葉抽出物を有効成分として含み、粉末相、水相及び添加剤をさらに含むことにより、有効成分であるインドセンダン葉抽出物の経皮吸収を促進しながら使用感を向上させることができる。

このとき、前記インドセンダン葉抽出物は、先立って述べたように、熱水抽出されたインドセンダン葉抽出物、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物、アセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物であり得る。これらの中で、ピッカリングエマルジョン組成物が使用される用途に応じて、当該用途において最も優れた効能を有する抽出物を選択して含めさせることができる。

前記インドセンダン葉抽出物は、ピッカリングエマルジョン組成物の全体重量に対して０．５〜５重量％、好ましくは０．５〜３重量％含まれるのが良い。

前記粉末相は、炭酸カルシウム、シリカ、粘土、ラポナイト、黒鉛、ラテックス、磁粉（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ）及びカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）よりなる群から選択される少なくとも１種を含み、好ましくはシリカを使用することが良い。

前記粉末相は、ピッカリングエマルジョン組成物の全体重量に対して１〜１０重量％、好ましくは３〜８重量％含まれるのが良い。

前記水相は、水及び保湿剤を含み、前記保湿剤は、グリセリン（Ｇｌｙｃｅｒｉｎ）、１，３−ブチレングリコール（１，３−Ｂｕｔｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）、ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、エチレングリコール（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）及びプロパンジオール（Ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ）よりなる群から選択される少なくとも１種を含む。好ましくは、グリセリン（Ｇｌｙｃｅｒｉｎ）、１，３−ブチレングリコール（１，３−Ｂｕｔｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）及びプロパンジオール（Ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ）の３種を混合して使用するのが良い。

前記水相は、ピッカリングエマルジョン組成物の全体重量に対して７５〜９５重量％、好ましくは８０〜８５重量％含まれるのが良い。

前記水は、水相の全体重量に対して５０〜８０重量％、好ましくは６０〜７０重量％含まれるのが良い。また、前記保湿剤は、水相の全体重量に対して２０〜５０重量％、好ましくは３０〜４０重量％含まれるのが良い。

さらに具体的には、保湿剤としてグリセリン（Ｇｌｙｃｅｒｉｎ）を使用する場合には、水相の全体重量に対して１０〜７０重量％で含み、保湿剤として１，３−ブチレングリコール（１，３−Ｂｕｔｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）を使用する場合には、水相の全体重量に対して１０〜３０重量％で含み、保湿剤としてプロパンジオール（Ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ）を使用する場合には、水相の全体重量に対して１０〜４０重量％で含む。最も好ましくは、保湿剤としてグリセリン（Ｇｌｙｃｅｒｉｎ）、１，３−ブチレングリコール（１，３−Ｂｕｔｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）及びプロパンジオール（Ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ）を混合して使用し、このとき、前記３種を１：０．８〜１．２：０．８〜１．２の比率で混合して水相の全体重量に対して３０〜４０重量％含むのが良い。

前記添加剤は、抗酸化剤、防腐剤及びｐＨ調整剤の少なくとも一つを含み、前記抗酸化剤は、例えば、Ｌ−アスコルビン酸（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、α−トコフェロール（α−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、ポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）、カルノシン酸（ｃａｒｎｏｓｉｃ ａｃｉｄ）、リポ酸（ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ）、２−アミノエタンスルホン酸（２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、芳香族カルボン酸（ａｒｏｍａｔｉｃ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）及びこれらの組み合わせを含み、前記防腐剤は、例えば、１，２−ヘキサンジオール（１，２−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ）、カプリル酸グリセリル（ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｃａｐｒｙｌａｔｅ）、メチルパラベン（ｍｅｔｈｙｌｐａｒａｂｅｎ）、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、イソプロピルパラベン（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐａｒａｂｅｎ）、フェノキシエタノール（ｐｈｅｎｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ）及びこれらの組み合わせを含み、前記ｐＨ調整剤は、例えばクエン酸（Ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）またはＬ−アルギニン（Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）を含む。

前記添加剤は、ピッカリングエマルジョン組成物の全体重量に対して２．２〜１２重量％含まれる。より具体的に、前記抗酸化剤は、ピッカリングエマルジョン組成物の全体重量に対して２〜１０重量％含まれる。前記防腐剤は、ピッカリングエマルジョン組成物の全体重量に対して０．１〜１．０重量％、好ましくは０．１〜０．５重量％含まれるのがよい。

前記ｐＨ調整剤は、ピッカリングエマルジョン組成物のｐＨを２〜４の範囲に調整するように含まれ、さらに具体的には、ピッカリングエマルション組成物の全体重量に対して０．１〜１．０重量％、好ましくは０．１〜０．５重量％含まれるのがよい。

前記ピッカリングエマルジョン組成物は、前記成分を前記含有量で混合し、１０，０００ｒｐｍ〜２０，０００ｒｐｍで３０秒〜５分間粉砕処理した後、３００〜８００ｒｐｍで１〜５分間混合処理して得られる。

前記インドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物を化粧品として使用する場合、スキン及びボディケア化粧品として、エッセンス、アンプル、石鹸、トニック及びボディエッセンス、エマルジョン、ローション、クリーム（水中油滴型、油中水滴型、多重相）、溶液、懸濁液（無水及び水系）、無水生成物（オイル及びグリコール系）、ジェル、粉末などの様々な剤形に製造でき、前記インドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物は、全体化粧品に対して０．０５〜１００重量％で含まれ、アンプル剤形の場合は、前記インドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン１００重量％からなるものであり得る。

また、前記ピッカリングエマルジョン組成物を含む化粧品製剤において収容可能な担体として、アルコール、オイル、界面活性剤、脂肪酸、シリコーン油、防腐剤、湿潤剤、保湿剤、粘性変形剤、乳剤、安定剤、紫外線遮断剤、発色剤、香料、希釈剤などをさらに含むことができるのは、上述したとおりである。

以下、本発明を実施例及び実験例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜実施例１〜３−インドセンダン葉抽出物の製造＞
本発明の実施例で使用したインドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）葉は、ＴＮＨＨ ＳＢＪ Ｖｉｅｔ Ｎａｍ Ｃｏ．から購入した。

実施例１による熱水抽出物（ＡＩＷ）は、乾燥した試料の重量の１０倍の超純水を溶媒として用いて１００℃で４時間抽出することを３回繰り返し行った後、抽出液をろ紙（Ｎｏ．２０ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ、Ｈｙｕｎｄａｉ ｍｉｃｒｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、韓国）で濾過、濃縮、凍結乾燥させた後、粉末化して得た。

実施例２による７０％エタノール抽出物（ＡＩＥ）及び実施例３による７０％アセトン抽出物（ＡＩＡ）は、それぞれ、乾燥した試料の重量の１０倍の溶媒に常温で２４時間浸漬して抽出することを３回繰り返し行って抽出液を得、熱水抽出物と同様の方法で残りの抽出物を粉末化して得た（図１）。

熱水抽出物の収率は１６．５５％、７０％エタノール抽出物の収率は２９．３２％、７０％アセトン抽出物の収率は２６．３８％であった。各抽出物は、４℃の冷蔵室に保管し、以下の実験例の試料として使用した。

＜実験例１−抗酸化効果の測定＞

（１）測定試薬
抗酸化効果測定実験に使用された試薬は、次のとおりである。
２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（２，２−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ）、過硫酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｅｒｏｘｏｄｉｓｕｌｆａｔｅ）、ブチルヒドロキシアニソール（Ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｉｓｏｌｅ（ＢＨＡ））、Ｌ−アスコルビン酸（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、タンニン酸（Ｔａｎｎｉｃ ａｃｉｄ）、没食子酸エピガロカテキン（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ（ＥＣＧＣ））、２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（２，２−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）、ピロガロール（Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）、２，６−ジヒドロキシプリン（２，６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｕｒｉｎｅ）、ニトロブルーテトラゾリウム（Ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）、キサンチンオキシダーゼ（Ｘａｎｔｈｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ）などは、Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）製の製品を使用した。フォリン−チオカルトフェノール試薬（Ｆｏｌｉｎ−ｃｉｏｃａｌｔｅｕ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ）は、純正化学（日本）製の製品を使用した。エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（２−Ａｍｉｎｏ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉｏｌ）、塩化水素（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、リン酸カリウム一塩基性（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｏｎｏｂａｓｉｃ）、リン酸カリウム二塩基性（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｂａｓｉｃ）などは、Ｄｕｋｓａｎ ｐｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（韓国）製の製品を使用した。

各実験において、試料は、１０ｍｇ／ｍＬで蒸留水に溶かした後、５、１０、５０、１００、５００、１０００μｇ／ｍＬの濃度に希釈して準備する。

（２）総ポリフェノール含有量の測定
総フェノール含有量の測定は、Ｆｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓの方法で行う。各試料を１０ｍｇ／ｍＬで蒸留水に溶かした後、５、１０、５０、１００、５００、１０００μｇ／ｍＬの濃度に希釈して準備する。０．２ｍＬのフォリン−チオカルト試薬（Ｆｏｌｉｎ ｃｉｏｃａｌｔｅｕ ｒｅａｇｅｎｔ）を添加してよく混合した後、３分間室温に放置した。３分後に０．７Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３飽和溶液０．５ｍＬを加えて混ぜた後、各抽出物０．５ｍＬずつ濃度別に入れて１時間反応させた後、７２５ｎｍで吸光度を測定した。タンニン酸（Ｔａｎｎｉｃ ａｃｉｄ）を用いた標準曲線を利用して量を換算した後、総ポリフェノール含有量を測定した。

フェノール性画分は、天然物中に多く含有されており、フリーラジカルを消去することがこれらの主要役割であるという研究が多く報告されている。また、このようなフラボノイドやフェノール酸、アントシアニンなどのフェノール性画分がＤＰＰＨラジカル消去活性などの抗酸化活性に非常に重要な因子として作用する。本実験では、基本物質としてタンニン酸を用いて標準曲線を使用してインドセンダン抽出物のポリフェノール含有量を測定した。その結果を下記表１に示した。

表１に示すように、インドセンダン熱水抽出物（ＡＩＷ）は５２．９４ｍｇ／ｇ、７０％エタノール抽出物（ＡＩＥ）は５１．３７ｍｇ／ｇ、７０％アセトン抽出物（ＡＩＡ）は７３．４５ｍｇ／ｇであって、各溶媒抽出物の中でもＡＩＡが最も高いポリフェノール含有量を持っていることを確認することができた。薬用植物抽出物のポリフェノール含有量の分析(Shin JH, Jang JR, Kang MJ, Shin JH (2018) Physiological Activity of Five Kinds of Medicinal Plant Extracts with Various Solvents and Their Composites. Journal of life science, 28, 3, 320-330.)から出た葛花（６．４６ｍｇ／ｇ）、葛根（５．５０ｍｇ／ｇ）及びハマカンギク（２．４８ｍｇ／ｇ）などと比較したとき、ＡＩＷ、ＡＩＥ、ＡＩＡのポリフェノール含有量が高いことを確認した。

（３）ＤＰＰＨラジカル消去効果の測定
ＤＰＰＨラジカル消去能の効果測定は、Ｂｌｏｉｓの方法で行った。２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を０．４５ｍＭの濃度となるように９９％エタノールに溶かして準備し、それぞれの抽出物は、５、１０、５０、１００、５００、１０００μｇ／ｍＬの濃度に希釈して準備する。陽性対照群としては、ブチルヒドロキシアニソール（Ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｉｓｏｌｅ（ＢＨＡ））を使用した。その後、９６ウェルプレートに各抽出物１２０μＬとＤＰＰＨ６０μＬを添加し、室温で遮光して１５分間反応させ、５１７ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーを用いて消去活性を測定した。

１，１−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）は、電子供与能の測定に使用され、物質自体が非常に安定なフリーラジカル（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ）を有し、５１７ｎｍで他の波長と区別される光吸収を示して紫色を帯びる画分である。ＤＰＰＨは、有機溶媒であるアルコールなどに安定し、抗酸化メカニズム過程でプロトン−ラジカル捕捉剤（ｐｒｏｔｏｎ−ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）によって脱色されるため、抗酸化活性を肉眼で容易に把握することができるという利点がある。ＤＰＰＨラジカル消去能を測定してインドセンダン葉抽出物の抗酸化効能を測定した。その結果は図２ａに示した。

図２ａから分かるように、ＡＩＷ、ＡＩＥ及びＡＩＡが濃度依存的な抗酸化効果を示し、全体的にＡＩＷが同じ濃度でより良い活性を持つ。さらに、１０００μｇ／ｍＬの濃度でＡＩＷが４１．４１％の効果を示し、ＡＩＥ、ＡＩＡはそれぞれ３４．０９％、３０．６１％の効果を示してＡＩＷが残りの抽出物よりも高い効果を持つ。

（４）ＡＢＴＳ^＋ラジカル（ｒａｄｉｃａｌ）消去効果の測定
ＡＢＴＳ^＋ ｃａｔｉｏｎ ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ方法によってＡＢＴＳラジカルを用いた抗酸化力を測定した。７ｍＭの２，２−アジノ−ビスと２．４ｍＭの過硫酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）を同じ割合で混ぜ、遮光して１２〜２４時間放置して反応させた後、実験を行った。それぞれの抽出物は、５、１０、５０、１００、５００、１０００μｇ／ｍＬの濃度に希釈して準備し、陽性対照群としては、ブチルヒドロキシアニソール（Ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｉｓｏｌｅ（ＢＨＡ））を使用した。その後、９６ウェルプレートにＡＢＴＳ^＋溶液１００μＬと各抽出物１００μＬを加えて２５℃で７分間反応させた後、波長７３４ｎｍで吸光度を測定し、阻害率（％）で示した。

ＡＢＴＳラジカル消去能は、ＡＢＴＳ（２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）が過硫酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）と反応してＡＢＴＳ^＋ラジカルが生成されることにより、特有の色である青緑色を表すが、試料を添加すると、淡緑色に変わり、水素供与抗酸化物質（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）と連鎖破壊型抗酸化物質（ｃｈａｉｎ ｂｒｅａｋｉｎｇ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）の両方ともを測定することができるという特徴を持つ。抗酸化物質と反応することにより、吸光度の変化が生じるので、ＤＰＰＨ消去能実験法と共に多くの研究で用いられている。ＡＢＴＳカチオンラジカル消去能を測定してインドセンダン葉抽出物の抗酸化効能を測定した結果は、図２ｂに示す。

図２ｂから分かるように、最高濃度である１０００μｇ／ｍＬにおけるＡＩＷは７３．５５％、ＡＩＥ及びＡＩＡは６９．６０％、６２．２４％の阻害率を示した。また、同じ濃度でＡＩＷが最も高いＡＢＴＳ^＋カチオンラジカル捕捉活性（ＡＢＴＳ^＋ ｃａｔｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示した。

（５）スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）様活性効果の測定
Ｍａｒｋｌｕｎｄの方法によってスーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ））様活性を測定した。それぞれの試料は、５、１０、５０、１００、５００、１０００μｇ／ｍＬの濃度に希釈して準備し、陽性対照群としては、Ｌ−アスコルビン酸（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）を使用した。９６ウェルプレートに、各試料溶液２０μＬ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．５）１３０μＬ、蒸留水に溶かした７．２ｍＭのピロガロール（ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）２０μＬを入れ、２０分室温で遮光して反応させた後、４２０ｎｍで吸光度を測定してピロガロールの量を測定した。

スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、生体で有害なスーパーオキシドアニオンラジカル（・Ｏ_２）と反応して過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を生成する酵素であって、酸素を使用するすべての生物に存在し、生体で活性酸素に対する障害の防御作用をする代表的な活性酸素阻害剤である。また、酸素分子が還元されて生じるスーパーオキシドアニオンラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）（・Ｏ_２ ⁻・２Ｏ_２＋２ｅ⁻→２・Ｏ_２ ⁻）を除去する防御メカニズムに関与する酵素（２Ｏ_２ ⁻＋２Ｈ^＋→Ｈ_２Ｏ_２＋Ｏ_２ ⁻）であり、毒性が非常に強いヒドロキシラジカル（ｈｙｄｒｏｘｙ ｒａｄｉｃａｌ）が生成されることを予防する作用をして抗炎症素材または皮膚老化防止のための美容的な素材であって、化粧品などの添加剤として使用されている。インドセンダン葉抽出物のＳＯＤ様活性効果を測定してインドセンダン葉抽出物の抗酸化効果を測定した結果は、図２ｃに示した。

図２ｃより、ＡＩＷ、ＡＩＥ、ＡＩＡで最高濃度１，０００μｇ／ｍＬにおけるそれぞれの抽出物の効果は１２．８２％、２４．１３％、７．３８％であり、ＡＩＥ＞ＡＩＷ＞ＡＩＡの順に効果を示すことを確認した。

（６）スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）消去効果の測定
ニトロブルーテトラゾリウム（Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ））還元方法によってスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）消去能を測定した。それぞれの試料を５、１０、５０、１００、５００、１０００μｇ／ｍＬの濃度に希釈して、各試料０．１ｍＬと０．１Ｍのリン酸カリウムバッファ（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．５）０．４ｍＬにＮＢＴ（０．２４ｍＭ）とキサンチン（Ｘａｎｔｈｉｎｅ）（０．４ｍＭ）を溶かした基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）２ｍＬを添加し、キサンチンオキシダーゼ（Ｘａｎｔｈｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ）（０．２Ｕ／ｍＬ）２ｍＬを添加して２０分間３７℃で反応させた後、１Ｎ ＨＣｌ１ｍＬを添加して吸光度５６０ｎｍで測定した。陽性対照群としては、没食子酸エピガロカテキン（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ））を使用した。

スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）は、好気性細胞の酵素または非酵素的段階で非常に強い毒性が生成されるラジカルであって、老化に関連して酸化反応の開始段階に関与する。また、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素などの活性酸素種の生成に関与して脂質、ＤＮＡ、タンパク質などに酸化的損傷を誘導することが知られている。このような過程中に抗酸化物質がスーパーオキシドアニオンラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）と反応して消去されると、紫色に発色する現象が減少し、この吸光度の変化を用いて抗酸化効果を測定する方法である。スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）消去能を測定してインドセンダン葉抽出物の抗酸化効果を測定した結果を図２ｄに示した。

図２ｄから分かるように、最高濃度１，０００μｇ／ｍＬでＡＩＷ、ＡＩＥ、ＡＩＡの順に８１．３７％、９６．０４％、５２．３０％であった。同じ濃度でＡＩＥが最も高い効能を示し、ＡＩＷ、ＡＩＡの順にスーパーオキシドアニオンラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）消去能を示した。

＜実験例２−抗菌効果の測定＞

（１）菌株及び培地
抗菌効果の測定に使用された菌株及び培地は、次のとおりである。
菌株としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓなどが使用された。培地としては、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ（ＮＢ）、Ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）、Ｇｉｆｕ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ）、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ（ＮＡ）、Ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ａｇａｒ（ＴＳＡ）などが使用された。

（２）菌培養
抗菌力測定実験のために使用した菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＣＴＣ ２４４１、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＫＣＴＣ １９１６、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ｓｕｂｓｐ ｃｌｏａｃａｅ ＫＣＴＣ ２３６１、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ＫＣＴＣ １９１７、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＫＣＴＣ １７５０を使用した。ニキビ誘発菌としては、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ＫＣＴＣ ３０６５を使用した。カビ菌としてＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＫＣＴＣ ７９６５を継代培養して実験に使用した。前処理培養及び本実験の培養のための液体培地の場合、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ｓｕｂｓｐ ｃｌｏａｃａｅの液体培地としてはＮｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ（ＮＢ）をＤｉｆｃｏ Ｌａｂ．（Ｓｐａｒｋｓ、ＵＳＡ）から購入して使用し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの液体培地としてはＴｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）をＤｉｆｃｏ Ｌａｂ．（Ｓｐａｒｋｓ、ＵＳＡ）から購入して使用し、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓの液体培地としてはＧｉｆｕ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ、Ｎｉｓｓｕｉ Ｃｏ．Ｊａｐａｎ）から購入して使用し、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ菌の液体培地としてはＹｅａｓｔ Ｍｏｌｄ ｂｒｏｔｈ（ＹＭＢ、Ｓｐａｒｋｓ、ＵＳＡ）から購入して使用した。固体培地としては、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇｅｒ（ＮＡ）、Ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ Ａｇａｒ（ＴＳＡ）、Ｙｅａｓｔ Ｍｏｌｄ ａｇａｒ（ＹＭＡ）をＤｉｆｃｏ Ｌａｂ．（Ｓｐａｒｋｓ、米国）から購入し、Ｇｉｆｕ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ）をＮｉｓｓｕｉ Ｃｏ．Ｊａｐａｎから購入して使用した。実験において、本培地に寒天末（Ａｇａｒ Ｐｏｗｄｅｒ）を添加して実験に使用した。

（３）生育阻害環（Ｃｌｅａｒ Ｚｏｎｅ）の測定
ペーパーディスク（Ｐａｐｅｒ ｄｉｓｃ）を用いて生育阻害力を測定した。すなわち、液体培地１５ｍＬに、平板培地で培養された各菌株を１白金耳採取し、１８〜２４時間培養して活性化させた後、液体培地１５ｍＬに菌液を０．１ｍＬ接種して４〜８時間本培養した後、平板培地１個あたりの菌数が約１×１０^６ｃｅｌｌとなるように接種し、滅菌された綿棒を用いて均一に塗抹した。滅菌されたフィルターペーパーディスク（Ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ｄｉｓｃ）（８ｍｍ、東京、日本）を固体平板培地にのせ、試料を濃度別に０．０５ｍＬ／ｄｉｓｃとなるように吸収させ、細菌は３７℃のインキュベーター、真菌は２５℃のインキュベーターに１２〜４８時間培養してディスク周囲のＣｌｅａｒ ｚｏｎｅ（ｍｍ）の直径を測定することにより、阻害活性を確認した。

ペーパーディスク寒天拡散法（Ｐａｐｅｒ ｄｉｓｃ ａｇａｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）によるインドセンダン葉抽出物の抗菌効果を調べ、その結果を生育阻害環（Ｃｌｅａｒ ｚｏｎｅ）として測定して下記表２に示した。

表２に示すように、インドセンダン葉抽出物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ菌に対して抗菌効果を持っていないことが分かった。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌に対してＡＩＥ及びＡＩＡで２ｍｇ／ｄｉｓｃから１．０±０ｃｍ以上のｃｌｅａｒ ｚｏｎｅが現れ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ菌に対してはＡＩＷ、ＡＩＥ、ＡＩＡで５ｍｇ／ｄｉｓｃから１．１±０ｃｍ以上のｃｌｅａｒ ｚｏｎｅが現れたことを確認することができた。

＜実験例３−美白効果の測定＞

（１）測定試薬

美白効果の測定に使用された試薬は、次のとおりである。
３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、キノコ由来チロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｕｓｈｒｏｏｍ）などは、Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）製の製品を使用した。Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｏｎｏｂａｓｉｃ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ、Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｂａｓｉｃ ａｎｈｙｄｒｏｕｓなどは、Ｄｕｋｓａｎ ｐｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（韓国）製の製品を使用した。美白効果の測定に使用されたＭＩＴＦ、チロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２の２次抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。

（２）キノコ（Ｍｕｓｈｒｏｏｍ）由来のチロシナーゼ阻害活性の測定
チロシナーゼ阻害活性をＹａｇｉ等の方法によって測定した。それぞれの試料は、５、１０、５０、１００、５００、１０００μｇ／ｍＬの濃度に希釈して準備し、陽性対照群としてＬ−アスコルビン酸を使用した。６７ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ６．８）８０μＬに１０ｍＭのＬ−ＤＯＰＡを溶かした基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）４０μＬと試料４０μＬとを混ぜた混合液に、キノコ由来チロシナーゼ（ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）［１２５ｕｎｉｔ／ｍＬ］４０μＬを添加して、１０分間３７℃で反応させた後、吸光度を４９２ｎｍで測定した。

メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）は、表皮基底層の色素細胞内のメラノソーム（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ）で生合成されるが、ここで、メラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）は、皮膚の色調を決定する重要な因子として作用する。アミノ酸の一種であるチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）は、メラニンを合成する物質である。チロシナーゼは、メラノーマ細胞（ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ）内でのチロシナーゼによってＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（ＤＯＰＡ））とＤＯＰＡキノン（ｑｕｉｎｏｎｅ）に酸化する。その後、再びＤＯＰＡキノンが５，６−ジヒドロキシインドール（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｉｎｄｏｌｅ）、ＤＯＰＡクローム（ｃｈｒｏｍｅ）、インドール−５，６−キノン（ｉｎｄｏｌｅ−５，６−ｑｕｉｎｏｎｅ）になり、インドール−５，６−キノン重合によってメラニンを生成することが知られている。このように皮膚中でのメラニンの重合体生合成を阻害することができるチロシナーゼの阻害活性を測定するために、キノコ（ｍｕｓｈｒｏｏｍ）由来のチロシナーゼ阻害活性を測定し、その結果を図３ａに示した。

図３ａに示すように、最高濃度１，０００μｇ／ｍＬでＡＩＷは３２．７７％、ＡＩＥは４７．２１％、ＡＩＡは４５．３６％であり、同じ濃度でＡＩＥが最も高い活性を示した（ただし、データは３つの個別実験の平均±ＳＤを表す）。陽性対照群として使用されたＬ−アスコルビン酸よりは低い効果が現れたが、インドセンダン葉抽出物は、天然物として相当な効果が確認され、美白作用に役立てることができると判断される。

＜実験例４−シワ改善効果の測定＞

（１）測定試薬
シワ改善効果の測定実験に使用された試薬は、次のとおりである。
Ｎ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリド（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ ）、ブタ膵臓由来のエラスターゼ（Ｅｌａｓｔａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ）などは、Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）製の製品を使用した。２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（２−Ａｍｉｎｏ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉｏｌ ）、塩化水素（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）などは、Ｄｕｋｓａｎ ｐｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（韓国）製の製品を使用した。ＭＭＰ−１、フィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）２次抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。

（２）エラスターゼ阻害効果の測定
エラスターゼ阻害活性（Ｅｌａｓｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、Ｃａｎｎｅｌｌなどの方法を参照して実験を行った。Ｎ−スクシニル−（Ｌ−Ａｌａ）_３−ｐ−ニトロアニリド（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−（Ｌ−Ａｌａ）_３−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）を用いて３６℃で２５分間基質から生成されるｐ−ニトロアニリド（ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）の生成量を４０５ｎｍでＥＬＩＳＡによって測定した。その後、それぞれの試料は、５、１０、５０、１００、５００、１０００μｇ／ｍＬの濃度に希釈して各試料液を４０μＬ採取し、５０ｎｍ濃度のｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．６）に溶かしたブタ膵臓エラスターゼ（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ ｅｌａｓｔａｓｅ）［０．５ｕｎｉｔ／ｍＬ］溶液４０μＬを加えた後、基質として、５０ｍＭ濃度のトリスバッファ（ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ８．６）に溶かしたＮ−スクシニル−（Ｌ−Ａｌａ）_３−ｐ−ニトロアニリドを添加して２０分間反応させた後、結果を測定した。陽性対照群としては、没食子酸エピガロカテキン（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ（ＥＣＧＣ））を使用した。

エラスチン（Ｅｌａｓｔｉｎ）は、真皮内で皮膚弾力を維持するのに非常に重要なタンパク質であり、皮膚の結合組織に存在して組織の伸縮性と柔軟性に関与している。エラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）は、このようなエラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）を分解する酵素であり、シワやたるみなどの皮膚老化を発生させる原因の一つである。したがって、エラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）阻害剤は、皮膚のシワ改善によって老化を防止する作用をするが、インドセンダン葉抽出物のエラスターゼ阻害活性効果を測定した結果を図３ｂに示した。

図３ｂから分かるように、最高濃度１０００μｇ／ｍＬにおけるＡＩＷ、ＡＩＥ、ＡＩＡの順に１７．５６％、２４．２４％、２１．９２％であって、ＡＩＥが最も高い活性を示した（ただし、データは３つの個別実験の平均±ＳＤを表す）。

＜実験例５−抗炎症効果の測定＞

（１）細胞株及び試薬
細胞生存率の測定に使用された細胞株Ｍｕｒｉｎｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｅｌｌ（ＲＡＷ２６４．７）、Ｍｏｕｓｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ（Ｂ１６Ｆ１０）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）製の製品を使用した。ヒトケラチノサイト細胞（Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ）（ＨａｃａＴ）は、韓国漢方振興院から分譲を受けた細胞を使用した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）などは、ＬＯＮＺＡ Ｃｏ．から製品を購入して使用した。０．２５％トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡ、０．４％トリパンブルー染色剤（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎ）は、ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｃｏ．（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入して使用し、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ））試薬は、ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。

（２）細胞毒性の測定

１）細胞培養
本実験に用いたＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞、ＨａｃａＴケラチノサイト細胞は、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）と１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターに適応させて継代培養した。

２）ＭＴＴアッセイによる細胞生存率の測定
Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌの方法によって細胞生存率を測定した。９６ウェルプレートに細胞株ＲＡＷ２６４．７、Ｂ１６Ｆ１０、ＨａｃｃａＴ ｃｅｌｌを１ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように分注し、インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２４時間培養する。ＡＩＷ、ＡＩＥ、ＡＩＡをそれぞれ５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００μｇ／ｍＬの濃度別に希釈した後、２００μＬ／ｗｅｌｌで採取し、２４時間処理した。その後、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で製造したＭＴＴ溶液を２０μＬ／ｗｅｌｌで添加して３〜４時間培養した後、培養液を除去し、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ））を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して室温で１０分間反応させた後、５４０ｎｍでの吸光度から結果を導出した。

インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）によるマクロファージ細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｅｌｌ）の細胞生存率をＭＴＴアッセイで確認し、その結果を図４ａに示した。

図４ａに示すように濃度別に測定した結果、濃度５、１０、５０、１００μｇ／ｍＬでＡＩＷ、ＡＩＥ、ＡＩＡの全ては９０％以上の生存率を示し、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）、リアルタイム（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲは１０、５０、１００μｇ／ｍＬの３つの区間に設定して実験を行った（ただし、ＣはＬＰＳ処理群を意味する。データは３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。

（３）一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）生成阻害効果の測定
一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ（ＮＯ））の測定は、細胞の上澄み液の一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ（ＮＯ））の量を亜硝酸塩（Ｎｉｔｒｉｔｅ）及び硝酸塩（ｎｉｔｒａｔｅ）で測定した。９６ウェルプレートに細胞株ＲＡＷ２６４．７を４ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように分注し、インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２４時間培養する。その後、培養液を血清無添加ＤＭＥＭ培地に交換し、リポ多糖類（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ））を処置して炎症反応を誘導する。したがって、ＬＰＳ １ｐｐｍ／ｗｅｌｌとなるように処理し、それぞれの試料溶液を濃度別に処理した後、インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２４時間培養する。その後、新しい９６ウェルプレートに細胞培養液を１００μＬ移し、グリース試薬（ｇｒｉｅｓｓ ｒｅａｇｅｎｔ）を１００μＬ添加して常温で５分間反応させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定して結果を計算した。

インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）によるマクロファージ細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｅｌｌ）であるＲＡＷ２６４．７でグルコン酸キトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）の一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）の抑制程度を測定するために、溶媒別、濃度別にサンプルを処理してＮＯ量を測定した結果を図４ｂに示した。

図４ｂに示すように、最高濃度１００μｇ／ｍＬでＡＩＷ、ＡＩＥ、ＡＩＡの順に３５．７％、６８．８６％、６６．４５％の阻害効果を示した。同じ濃度であるとき、ＡＩＥが最も多いＮＯ阻害活性を示した（ただし、ＮはＬＰＳ未処理群、ＣはＬＰＳ処理群を意味する。データは３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。

（４）ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）によるタンパク質発現の測定
ｉＮＯＳとＣＯＸ−２、チロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＭＰ−１、フィラグリン（Ｆｉｌｌａｇｒｉｎ）タンパク質発現を確認するために、６ウェルプレートに細胞株ＲＡＷ２６４．７、ＨａｃａＴ ｃｅｌｌを３ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、Ｂ１６Ｆ１０が２ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように分注し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２４時間培養する。その後、培養液を血清無添加ＤＭＥＭ培地に交換した後、細胞の炎症、美白処理、シワ改善反応を誘導するために、ＲＡＷ２６４．７はリポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ））、Ｂ１６Ｆ１０はα−メラノサイト−刺激ホルモン（Ａｌｐｈａ−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（α−ＭＳＨ））を１ｐｐｍ／ｗｅｌｌとなるように処理し、各試料溶液を濃度別に処理し、インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２４時間培養する。ＨａｃａＴ ｃｅｌｌは、無処理群を除いたすべての実験群をＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳを入れてＵＶ−Ｂ（３００ｍＪ／ｃｍ^２）を照射した。照射後、試料溶液を濃度別に処理し、２４時間〜４８時間培養する。その後、培地を除去した後、ＰＢＳで１回洗浄し、ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）とプロテアーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）をそれぞれ０．１％含有させたＲＩＰＡバッファを６０μＬ／ｗｅｌｌで処理して細胞を溶解させ、遠心分離器を用いて４℃、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離させ、得られた上澄み液を新しいチューブに移す。メンブレイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、デジタル往復シェーカー（Ｄｉｇｉｔａｌ ｒｅｃｉｐｒｏｃａｔｉｎｇ ｓｈａｋｅｒ）機器を用いて５％スキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）２時間、１次抗体（Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）２時間、１Ｘ ＴＢＳＴ溶液１０分（３回繰り返し）、２次抗体（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）１時間、１Ｘ ＴＢＳＴ溶液１０分（３回繰り返し）の順のブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）過程を経た後、ＨＲＰ基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）発色試薬で２分間反応させ、その後、ウエスタンイメージングシステム（ｗｅｓｔｅｒｎ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）（ＣＡＳ−４００ＳＭ、Ｄａｖｉｎｃｈ−Ｋ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、韓国）機器を用いてバンドを確認し、定量及び結果を算出した。

インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）がｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２に及ぼす影響を見るために、ＬＰＳにより誘導されたｍｏｕｓｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｃｅｌｌ（ＲＡＷ２６４．７）にＡＩＷ、ＡＩＥ、ＡＩＡは１０、５０、１００μｇ／ｍＬの濃度で処理した後、２４時間後に回収してウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を介して発現を確認した。対照群としては、ピロリジンカルボジチオ酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ（ＰＤＴＣ））を使用した。ハウスキーピング遺伝子（Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）としてはβ−ａｃｔｉｎを使用した。ＡＩＷ、ＡＩＥ、ＡＩＡに対するそれぞれの結果を図５ａ、図５ｂ及び図５ｃに示した。

図５ａ、図５ｂ及び図５ｃに示すように、ＡＩＥはｉＮＯＳ、ＡＩＡはｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２タンパク質の発現阻害が現れたことを確認することができた（ただし、ＮはＬＰＳ未処理群、ＣはＬＰＳ処理群を意味する。データは３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。

（５）ｍＲＮＡ分離及びリアルタイム（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲ分析
６ウェルプレートに細胞株ＲＡＷ２６４．７、Ｂ１６Ｆ１０及びＨａｃａＴ ｃｅｌｌを３ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように分注し、インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２４時間培養する。その後、培養液を血清無添加ＤＭＥＭ培地に交換した後、細胞の炎症及び美白処理、シワ改善反応を誘導するために、ＲＡＷ２６４．７はリポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ））、Ｂ１６Ｆ１０はα−メラノサイト−刺激ホルモン（Ａｌｐｈａ−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ（α−ＭＳＨ））を１ｐｐｍ／ｗｅｌｌとなるように処理し、各試料溶液を濃度別に処理した後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養する。ＨａｃａＴ ｃｅｌｌは、無処理群を除いたすべての実験群ではＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳを入れてＵＶ−Ｂ（３００ｍＪ／ｃｍ^２）を照射した。照射後、試料溶液を濃度別に処理し、２４〜４８時間培養する。その後、培地を除去した後、ＰＢＳで１回洗浄し、その後にＴＲＩ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１ｍｌ／ｗｅｌｌとなるように添加して細胞を完全に溶解させ、新しいチューブに移して常温で５分間培養する。次に、クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）をチューブあたり２００ｍｌ添加して強くボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）させ、再び５分間培養する。その後、４℃で１２０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、透明な上澄み液５００μＬを新しいチューブに移す。上澄み液にイソプロピルアルコール（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）５００μＬを添加し、数回反転（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ）させた後、５分間培養し、４℃で１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離させて上澄み液を除去する。底に残ったペレットは、７５％エタノール１ｍＬで洗浄した後、完全に乾燥させ、５０μＬのＤＥＰＣ水を用いて溶解させる。その後、吸光度を用いたＲＮＡ定量を経て、ＴＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｂａｓｉｃ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ機器を用いてｃＤＮＡ合成した。その後、ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ試薬とそれぞれのプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、ｃＤＮＡを用いてｓｔｅｐ ｏｎｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ機器で９５℃１０秒、６０℃１５秒、７２℃２０秒間反応する温度サイクル条件を４０回繰り返し行い、解析プログラム（ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて定量分析を行った。実験に使用した配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、下記表３に示す。

リアルタイムＰＣＲは、従来のＰＣＲよりも速く測定が可能であり、汚染率が少なくて広く用いられる。先立ってのウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）実験と抗酸化実験の結果に基づいてＡＩＥが最も良い効能を持つことを確認し、本実験ではＡＩＥを選択して実験を行った。ＡＩＥをリアルタイムＰＣＲを用いてｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現抑制率を示した結果を図６ａに示した。

図６ａに示すように、ＡＩＥのｉＮＯＳ発現抑制効果は、最高濃度１００μｇ／ｍＬで９７．４９％の抑制効果を確認することができた（ただし、ＮはＬＰＳ未処理群、ＣはＬＰＳ処理群を意味する。データは３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。ＬＰＳ処理対照群と比較して、＊ｐ＜０．０１は有意な差を示す）。

＜実験例６−インドセンダン葉抽出物の美白効能の測定＞

（１）メラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ１０）の細胞毒性の確認
インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）（７０％エタノール抽出）によるメラノーマ細胞（Ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ）の細胞生存率をＭＴＴアッセイを介して確認した結果を図６ｂに示した。

図６ｂに示すように、ＡＩＥ濃度２．５、５、１０、２５μｇ／ｍＬでいずれも８５％以上の生存率を示し、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）は、上位３つの区間に設定して実験を行った（ただし、Ｎはα−ＭＳＨ未処理群を意味する。データは、３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。

（２）ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）によるＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２及びチロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）発現抑制の確認
メラニン生合成に関与するα−メラノサイト−刺激ホルモン（Ａｌｐｈａ−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（α−ＭＳＨ））は、ｃＡＭＰ経路を活性化させるメラノコルチン−１受容体（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＭＣ１Ｒ））が関連してメラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）合成を調節するが、細胞でｃＡＭＰが増え続けるとき、ＰＫＡ（ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ）がＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をリン酸化させてチロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）遺伝子発現を誘導させるＭＩＴＦ発現を増加させる。インドセンダン抽出物がメラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）の生成にどの影響を与えるかを確認するために、メラニン形成に影響を及ぼす因子をウエスタンブロック（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）実験によって確認し、その結果を図６ｃに示した（ただし、Ａ：ＴＲＰ−１、Ｂ：ＴＲＰ−２、Ｃ：チロシナーゼメラノーマ細胞（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ Ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ））

図６ｃに示すように、メラニン形成阻害関連実験結果、ＡＩＥでは、α−ＭＳＨによって誘導された最高濃度１０μｇ／ｍＬにおける、ＴＲＰ−１は３６．３５％の阻害率を示し、残りの因子であるＴＲＰ−２とチロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）は抑制しないものと判断される（ただし、Ｎはα−ＭＳＨ未処理群、Ｃはα−ＭＳＨ処理群を意味する。データは、３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。

（３）リアルタイム（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲを用いたＴＲＰ−１発現抑制の確認
ＡＩＥのＴＲＰ−１ ｍＲＮＡ発現抑制率をリアルタイム（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲを用いて確認し、その結果を図６ｄに示した。

図６ｄに示すように、ＡＩＥが最高濃度１０μｇ／ｍＬで８７．４３％のＴＲＰ−１発現抑制効果を示し、対照群であるアルブチン（Ａｒｂｕｔｉｎ）濃度１００μｇ／ｍＬでは１４．８６％より高い抑制効果を確認することができた（ただし、Ｎはα−ＭＳＨ未処理群、Ｃはα−ＭＳＨ処理群を意味する。データは３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。

＜実験例７−インドセンダン葉抽出物のシワ改善効能の測定＞

（１）ヒトケラチノサイト細胞（Ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ）（ＨａｃａＴ）の細胞毒性の確認
インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）（７０％エタノール抽出）によるヒトケラチノサイト細胞の細胞生存率をＭＴＴアッセイを介して確認した結果を図７ａに示した。

図７ａに示すように、ＡＩＥ濃度１、２．５、５、１０、２５μｇ／ｍＬから濃度１０μｇ／ｍＬまで９０％以上の生存率を示し、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）は２．５、５、１０μｇ／ｍＬの３つの区間に設定して実験を行った（ただし、ＣはＤＭＥＭのみ処理された群を意味する。データは、３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。

（２）ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）によるＭＭＰ−１、フィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）タンパク質発現の確認
ＭＭＰｓは、皮膚の線維芽細胞、角質形成細胞を始めとして多くの細胞から分泌され、現在まで約２０種の種類があると知られている。ＭＭＰ−１は、コラゲナーゼ−１（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−１）として知られており、I型とIII型コラーゲンを基質とする。プロフィラグリン（Ｐｒｏｆｉｌａｇｇｒｉｎ）と呼ばれる前駆体は、角質層の角質形成細胞の主要特徴であるケラチノヒアリン顆粒として知られている細胞であり、これは体内に蓄積される。本実験では、ＭＭＰ−１とフィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）タンパク質の発現を確認し、その結果を図７ｂに示した。

図７ｂに示すように、ＡＩＥは、最高濃度１０μｇ／ｍＬにおけるＭＭＰ−１では９．９３％の抑制率を示し、フィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）では３２．５２％の保湿効果を持つことを確認することができた（ただし、ＮはＵＶ−Ｂ未処理群、Ｃは、ＵＶ−Ｂ処理群を意味する。データは３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。

＜実験例８＞インドセンダン葉抽出物の抗公害（ａｎｔｉ−ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ）効能の測定

（１）細胞毒性の確認
インドセンダン（７０％エタノール抽出）による角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）、線維芽細胞（ＣＣＤ−９８６ｓｋ ｃｅｌｌ）での細胞生存率をＭＴＴアッセイを介して確認した結果を、図８ａ及び図８ｂに示した。

図８ａに示すように、角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）は、ＡＩＥ濃度５、１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬで９０％以上の生存率を示した（ただし、Ｃは、ＵＶ−Ｂを処理していない群を意味する。データは３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。

図８ｂに示すように、線維芽細胞（ＣＣＤ−９８６ｓｋ ｃｅｌｌ）は、ＡＩＥ濃度５、１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬで９０％以上の生存率を示した（ただし、ＣはＤＭＥＭのみ処理された群を意味する。データは３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。

（２）皮膚細胞の保護による抗公害（ａｎｔｉ−ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ）効能の確認
角質形成細胞であるＨａＣａＴ ｃｅｌｌ、線維芽細胞であるＣＣＤ−９８６ｓｋ ｃｅｌｌそれぞれに対してインドセンダン７０％エタノール抽出物（ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ）の抗公害効果実験を行った。

１）まず、ＨａＣａＴ ｃｅｌｌを１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように分注し、インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２４時間培養する。その後、培養液を血清無添加ＤＭＥＭ培地に交換し、ベンゾ［α］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［α］ｐｙｒｅｎｅ（ＢＰ））を処理して刺激する。したがって、ベンゾ［α］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［α］ｐｙｒｅｎｅ（ＢＰ））１００ｐｐｍ／ｗｅｌｌとなるように処理し、それぞれの試料溶液を濃度別に処理した後、インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２４時間培養する。その後、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で製造したＭＴＴ溶液を２０μＬ／ｗｅｌｌで添加して３〜４時間培養した後、培養液を除去し、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ））を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して室温で１０分間反応させた後、５４０ｎｍでの吸光度を介して結果を導出した。

２）ＣＣＤ−９８６ｓｋ ｃｅｌｌに対しては、上記と同様にＢＰに対する抗公害実験と、ＢＰの代わりに微細粒子状物質１５０ｐｐｍ／ｗｅｌｌを処理して抗公害実験を行った。
その結果は、図９に示した。

図９ａに示すように、細胞にベンゾ［α］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［α］ｐｙｒｅｎｅ（ＢＰ））のみを処理した場合には、３０％程度の死滅を示し、ベンゾ［α］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［α］ｐｙｒｅｎｅ（ＢＰ））を処理した細胞にインドセンダン抽出物を５、１０、２５、５０、１００μ／ｍＬで処置した場合には、ベンゾ［α］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［α］ｐｙｒｅｎｅ）のみを処理した細胞と比較して２５μｍ／ｍＬ以上で９０％以上の改善効果を示した（ただし、Ｎはベンゾピレンを処理していない群、Ｃはベンゾピレンのみを処理した群を意味する。データは、３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。

図９ｂに示すように、ＣＣＤ−９８６ｓｋ細胞にベンゾ［α］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［α］ｐｙｒｅｎｅ）のみを処理した場合には、３１％程度の死滅を示し、ベンゾ［α］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［α］ｐｙｒｅｎｅ）を処理した細胞にインドセンダン抽出物を５、１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬで処理した場合には、ベンゾ［α］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［α］ｐｙｒｅｎｅ）のみを処理した細胞と比較して２５μｇ／ｍＬ以上で８０％以上の改善効果を示した（ただし、Ｎはベンゾピレンを処理していない群、Ｃはベンゾピレンのみを処理した群を意味する。データは３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。

図９ｃに示すように、ＣＣＤ−９８６ｓｋ細胞に微細粒子状物質のみを処理した場合には、２３％程度の死滅を示し、微細粒子状物質を処理した細胞にインドセンダン抽出物を５、１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬで処理した場合には、微細粒子状物質のみを処理した細胞と比較して１００μｇ／ｍＬで８５％以上の改善効果を示した（ただし、Ｎは、微細粒子状物質を処理していない群、Ｃは微細粒子状物質のみを処理した群を意味する。データは３つの個別実験の平均±ＳＤを示す。対照群と比較して有意である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。

（３）ヒアルロン酸分解防止による抗公害（ａｎｔｉ−ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ）効能の確認
インドセンダン７０％エタノール抽出物（ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ）が重金属から皮膚保湿に関与するヒアルロン酸を保護することができるかを確認するために、鉄分（３２５ｍｇ）、インドセンダン７０％エタノール抽出物０．５ｇ及びＥＤＴＡ−２Ｎａを反応させた。

ヒアルロン酸分解防止効果はヒアルロン酸の粘度測定によって確認し、その結果は表４に示した。ヒアルロン酸が重金属により分解されると、溶液の粘度が減少するので、粘度が低いほどヒアルロン酸が多く分解されたことを意味する。表４に示すように、一般的に重金属吸着時に使用される錯化合物形成物質であるＥＤＴＡ−２Ｎａと比較すると、インドセンダン抽出物を含有したときに鉄と結合する効果がより良くて粘度がさらに高いことを確認することができた。これにより、インドセンダン抽出物は、ヒアルロン酸分解防止効果がさらに向上することを確認することができる。

＜実験例９−ピッカリングエマルジョンの製造及び安定性の測定＞

（１）ピッカリングエマルジョンの製造原料
ピッカリングエマルジョン（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）剤形の粉末状は、コーティング処理されていないシリカ（シリル化シリカ（Ｓｉｌｉｃａ ｓｉｌｙｌａｔｅ）、ＣＡＢＯＴ）を使用した。水相は、保湿剤としてグリセリン（Ｇｌｙｃｅｒｉｎ）（植物由来のグリセリン（Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｇｌｙｃｅｒｉｎ）、ＬＧ Ｈ＆Ｈ）、１，３−ＢＧ（１，３−ブチレングリコール、Ｃｏｓｎｅｔ）、プロパンジオール（１，３−プロパンジオール、ＵＳＡ）を使用した。抗酸化剤としてビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸、ＤＡＥＪＵＮＧ製）を使用した。防腐剤としてヘキサンジオール（１，２−ヘキサンジオール、Ｋ１ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、エチルヘキシルグリセリン（エチルヘキシルグリセリン、Ｋ１ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用した。

（２）ピッカリングエマルジョンの製造
気中水型エマルジョン（Ｗ／Ａ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）の製造は、下記表５に基づいて水相を計量した後、粉末形態であるシリル化シリカ（Ｓｉｌｉｃａ Ｓｉｌｙｌａｔｅ）を粉砕機に入れて１５，５００ｒｐｍで１分間粉砕した後、ビーカーに移し、Ａｇｉミキサーで５００ｒｐｍにて３分間処理してパウダーエッセンス形態のピッカリングエマルジョンを製造した（図１０）。

本実験例では、保湿剤、ｐＨ調整及びＬ−アスコルビン酸の含有量に応じて、ピッカリングエマルジョンが最もよく形成された含有量を選択して製造した。ピッカリングエマルジョンは、シリカ（Ｓｉｌｉｃａ）成分が水相に取り囲まれて空気を防ぎ、安定性をより一層高める。したがって、ピッカリングエマルジョンの複合保湿剤とＬ−アスコルビン酸の含有量によって酸化安定性に重要な役割を果たすことが分かる。以下の実験例では、それぞれの原料の配合による液晶形成を確認してみた。

（３）保湿剤（グリセリン）の含有量による剤形変化
保湿剤として使用されたグリセリンの含有量によるパウダー形成を確認してみた。下記表６のようにグリセリンの含有量を１０％ずつ７０％まで増加させながら使用した剤形の変化結果を図１１（ａ）に示した。図１１ａに示すようにパウダー形成を行うので、７０％までグリセリン（Ｇｌｙｃｅｒｉｎ）を添加しても剤形が良好であることを確認することができた。

（４）保湿剤（１，３−ブチレングリコール）の含有量による剤形変化
保湿剤として使用された１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）の含有量によるパウダー形成を確認した。表７ように１，３−ＢＧの含有量を１０％ずつ４０％まで増加させながら使用した剤形の変化結果を図１１ｂに示した。図１１ｂに示すようにパウダー形成を行うので、３０％まで１，３−ＢＧを添加しても剤形が良好であることを確認することができた。

（５）保湿剤（プロパンジオール）の含有量による剤形変化
保湿剤として使用されたプロパンジオールの含有量によるパウダー形成を確認してみた。表８のようにプロパンジオール（Ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ）の含有量を１０％ずつ５０％まで増加させながら使用した剤形の変化結果を図１１ｃに示した。図１１ｃに示すようにパウダー形成を行うので、４０％までプロパンジオールを添加しても剤形が良好であることを確認することができた。

（６）複合保湿剤の含有量によるＴＥＷＬ水分蒸発測定の結果
保湿剤として使用されたグリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロパンジオールの含有量を表９に示すように混ぜた後、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄでパウダー形成を確認してみた。図１２に示すように、ＴＥＷＬ水分蒸発測定計を用いて経皮水分喪失量の差を見たとき、対照群として使用された水よりも４時間後の水分喪失量がＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの順に１５．９３、４．０６、１８．８６、１２．６ｇ／ｍ^２／ｈと低い喪失量を示し、複合保湿剤Ｃが最も良い保湿力を持つことを確認し、以後の実験で複合保湿剤Ｃを用いて行った。

（７）ｐＨによる剤形変化
クエン酸（Ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）とＬ−アルギニンを用いて、表１０に示すように水相のｐＨを３〜１０までに合わせてｐＨに応じてシリカのピッカリングエマルジョン（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）剤形が形成されるかを確認して図１３ａに示した。その結果、図１３ａに示すようにｐＨ３〜９までエマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）が形成され、ｐＨ１０では壁面に剤形が滲み出ることを確認することができた。よって、ｐＨの範囲を３〜９に定めて次の実験を行った。

（８）Ｌ−アスコルビン酸原料のｐＨ含有量による剤形変化
Ｌ−アスコルビン酸を１％に計量して水相のｐＨをそれぞれ測定し、表１１のように、ＡはｐＨ測定値が２．９８であり、ＢはＬ−アルギニンを用いてｐＨ値を調整して６．５に合わせ、４５℃のチャンバーに一週間放置した後に測定した結果を図１３ｂに示した。図１３ｂに示すように、Ｂは安定性が壊れたことを確認し、Ａは一番目の日と比較して類似の結果を示すことを確認することができた。したがって、次の実験でＬ−アスコルビン酸を入れた後、ｐＨを２〜４に合わせて実験を行った。

（９）Ｌ−アスコルビン酸の含有量による剤形変化
Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）の含有量による剤形変化を確認するために実験を行った。表１２に示すように、Ｌ−アスコルビン酸の含有量を２．００％、５．００％、１０．００％、１５．００％に増加させながら使用した結果、図１３ｃに示すようにパウダー形成を行うので、１０％まで添加しても剤形が安定的であることを確認することができる。

（１０）温度と時間によるｐＨの測定
皮膚におけるｐＨは皮膚の皮脂膜を測定して示すが、おおむね弱酸性の範囲を持っている。しかし、このような範囲から外れると、皮膚における微生物の増殖が活発になり、刺激、感染、かゆみなどを誘発することができる。よって、化粧品のｐＨは、このような範囲内で製造し且つ維持されるべき必要がある。表５に示す組成で製造されたピッカリングエマルジョン組成物のｐＨの変化を測定するために、６０日間２５℃と暗室の条件を維持させて確認した。その結果を下記表１３に示す。

（１１）温度と時間による相変移の測定
表５に示す組成で製造されたピッカリングエマルジョン組成物の相変移、変質及び分離などの安定性を測定するために、６０日間０℃、２５℃、４５℃の条件を維持させながら確認した。その結果を表１４に示す。測定した結果、４５℃ではＬ−アスコルビン酸の安定性が壊れながら、黄色パウダーに変わって不安定であることを確認したとともに、残りの温度である０℃、２５℃では白色パウダー形態を維持したことを確認することができた。よって、温度が高ければ剤形の安定性が壊れるおそれがあることを確認した。

前述した各実施例で例示された特徴、構造、効果などは、実施例の属する分野における通常の知識を有する者であれば、他の実施例に対しても組み合わせまたは変形させて実施可能である。よって、それらの組み合わせ及び変形に関する内容も本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (7)

1. インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）葉抽出物を有効成分として含むことにより抗菌効能、抗炎症効能及び抗公害効能を有することを特徴とし、
   前記抗公害効能は、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効能であることを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物。
2. 前記化粧料組成物は抗酸化効能、美白効能及びシワ改善効能をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のインドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物。
3. 前記インドセンダン葉抽出物は、熱水抽出されたインドセンダン葉抽出物、エタノール抽出されたインドセンダン葉抽出物、またはアセトン抽出されたインドセンダン葉抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載のインドセンダン葉抽出物を含む化粧料組成物。
4. 請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化粧料組成物を含むことを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含む化粧品組成物。
5. インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）葉抽出物を有効成分として含み、粉末相、水相及び添加剤をさらに含み、
   抗菌効能、抗炎症効能及び抗公害効能を有することを特徴とし、
   前記抗公害効能は、空気中の汚染物質、微細粒子状物質または重金属粒子の皮膚吸着を防止し、皮膚細胞を保護する効能であることを特徴とする、インドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物。
6. 前記ピッカリングエマルジョン組成物は、熱水、エタノールまたはアセトンを用いて抽出されたインドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）葉抽出物、粉末相、水相及び添加剤を含む組成物を１０，０００ｒｐｍ〜２０，０００ｒｐｍで３０秒〜５分間粉砕処理した後、３００〜８００ｒｐｍで１〜５分間混合処理して製造されることを特徴とする、請求項５に記載のインドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物。
7. 前記ピッカリングエマルジョン組成物は抗酸化効能、美白効能及びシワ改善効能をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載のインドセンダン葉抽出物を含むピッカリングエマルジョン組成物。

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