KR20200102018A - 님트리 잎 추출물 및 이를 이용하여 제조된 피커링 에멀젼 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 열수, 에탄올 또는 아세톤을 이용하여 추출되어 님트리(Azadirachta indica) 잎의 유효성분을 포함하는 님트리 잎 추출물 및 이를 포함하는 피커링 에멀젼 조성물에 관한 것으로서, 님트리 잎 추출물에 포함된 유효성분에 의한 여드름 개선, 미백 및 주름개선 효능 등 약리활성 효과를 이용하여 식품, 화장품, 의약 등 다양한 산업에서 활용 가능한 새로운 용도를 제공하고, 님트리 잎 추출물을 포함하는 피커링 에멀젼의 안정화를 위한 최적의 조성 및 조건을 제공한다.

Description

님트리 잎 추출물 및 이를 이용하여 제조된 피커링 에멀젼 조성물{Azadirachta indica leaf extract and pickering emulsion composition using the same}
본 발명은 님트리(Azadirachta indica) 잎 추출물 및 이를 포함하여 제조된 피커링 에멀젼 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 님트리 잎으로부터 유효성분을 추출한 님트리 잎 추출물 및 이를 포함하여 식품, 화장품 및 의약품 등에 사용 가능한 피커링 에멀젼 조성물에 관한 것이다.
여기서는, 본 개시에 관한 배경기술이 제공되며, 이들이 반드시 공지기술을 의미하는 것은 아니다.
최근 현대 사회에서는 삶의 질이 향상되면서 평균 수명이 늘어나고 여유로워짐에 따라 보다 건강하게 살아가고자 하는 욕구가 증가하면서 질병을 치료하거나 사전에 예방할 수 있는 물질을 탐색하려는 다양한 연구가 진행되고 있다. 그 중에서도 천연물을 이용하여 유효성분을 탐색하고 다양한 생리활성 연구를 통하여 그 성분의 생물학적 기능을 규명하고 물질의 약효를 화학적으로 검증하고자 하는 연구에 집중되고 있다.
인간의 노화 요인에는 여러 가지 요인이 작용하지만, 인체 내의 다양한 질병과 함께 노화를 촉진하는 원인 중의 하나인 활성산소가 생성되면서 산화작용을 일으켜 DNA, 세포막 그리고 피부의 주요 구성물질인 단백질, 다당류, 지질과 반응해 세포에 손상을 주고 피부 노화를 발생시키는데 이러한 활성 산소를 제거하기 위한 기능성 식품과 화장품 분야의 연구가 활발히 진행되고 있다.
이러한 활성산소를 억제하는 성분으로 부틸레이티드하이드록시아니솔(Butylated Hydroxy Anisol; BHA), 부틸레이티드하이드록시톨루엔(Butylated Hydroxy Toluene; BHT) 등 페놀계 합성 항산화제와 야채나 또는 식물의 잎과 같은 식물성 원료 속에 들어있는 천연 항산화제인 페놀 화합물(phenolic compound), 아스코르브산(ascorbic acid), 플라보노이드(flavonoid), 토코페롤(tocopherol) 등이 있다.
또한 자외선(Ultraviolet; UV)은 멜라닌(melanin) 생성을 촉진시키는 것으로 알려져 있는데, 과도한 멜라닌의 합성과 축적은 기미, 주근깨와 같이 시각적으로 좋지 않은 질병을 낳게 되며, 멜라노솜(Melanosome)에는 정상적인 멜라닌을 합성하는데 필요한 효소들을 함유하고 있는데 이들 중 가장 대표적인 것으로 티로시나제 관련 유전자 1(tyrosinase related protein-1; TRP-1), 티로시나아제(tyrosinase), 티로시나제 관련 유전자 2(tyrosinase related protein-2; TRP-2) 등이 있다.
과도한 활성 산소종(reactive oxyzen species, ROS)에 의해 일어나는 산화적 스트레스는 외부요인으로 세포손상을 일으키며 노화 및 내부 요인으로는 산화적 스트레스로부터 유발된 염증(inflammation)에 의해 병적 손상을 유발한다. 염증반응은 외부자극으로부터 대응하기 위해서 생체 내에서 일어나는 정상적인 방어기작으로, 염증반응이 일어나면 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS), 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α; TNF-α), 산화질소(Nitric oxide; NO), 인터류킨-1β(interleukin-1β; IL-1β)와 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2; COX-2)에 의해 생성된다. 산화적 스트레스로 인해 일어나는 노화 및 염증성 질병에 대응하기 위한 연구가 계속해서 이루어지고 있다.
피부는 나이가 들면서 피부의 두께가 점점 얇아지고, 주름이 증가하며, 피부로부터 탄력이 감소하게 된다. 이는 몸속에서 신진대사를 조절하는 호르몬의 분비가 줄어들고, 피부의 세포활성이 저하되어 피부 구성 단백질의 생합성이 줄어듦으로써 나타나는 현상이다. 또한 주름이 깊어지는 것과 두꺼운 피부로 인한 광노화 피부는 자외선을 통해 증가되는 자유라디칼(free radical) 및 유해 활성 산소종에 의한다. 이런 노화들이 진행될수록 피부를 구성하는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 히알루론산(hyaluronic acid)과 같은 구조 단백질을 생성하는 능력이 줄어들고 type I collagenase(Matrix metalloproteinase; MMP)의 생합성이 늘어나면서 피부 구조 단백질을 더 많이 분해하게 한다. 또한 이처럼 누적되는 산화적 스트레스는 피부에서 노화를 더 많이 촉진하게 된다. 자외선을 통해 증가되는 단백질 효소들 중에서 기질을 분해하는 기질금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase; MMPs)는 피부의 광노화 발생과정에서 중요한 역할을 한다. 피부 진피 내 기질단백질(extracellular matrix)은 피부의 구조 및 탄력기능을 유지하는 역할을 하는데, 그 중 80% 이상이 제 1형 교원질(type I procollagen)로 이루어져 있다. 자외선에 노출된 피부에서는 MMPs 의 발현이 증가하며, 증가한 MMPs가 피부를 구성하고 있는 교원질을 분해하여 기질 단백질의 결핍을 초래하게 됨으로써 피부의 노화가 일어나게 된다.
한편, 님트리(Azadirachta indica)는 'Neem' 또는 'Nim tree' 라고 불리며 멀구슬 나무과와 비슷한 종이다. 인도와 네팔, 파키스탄, 방글라데시, 스리랑카, 몰디브와 같은 열대 및 아열대 지역에서 서식하고 높이가 15-20m 로 급성장 하는 특징을 가지고 있다. 인도 대륙에서 해충 방지제, 치과위생, 사막화방지 및 전통의학으로 사용되고 있다.
1. 한국등록특허 제10-1412111호 (2014.06.19.) 2. 일본공개특허 제2010-512381호 (2010.04.22)
1. National Research Council, (1992) Neem: A Tree For Solving Global Problems. The National Academies Press, Washington (DC). 2. Van der Nat, J.M., Van der Sluis, W.G., Silva, K.T.D., Labadie, R.P., (1991) Ethnopharmacognostical survey of Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae). Journal of Ethnopharmacology 35, 1~24.
본 발명은 님트리 잎으로부터 유효성분을 추출한 님트리 잎 추출물을 제공하며, 님트리 잎 추출물을 포함하는 피커링 에멀젼을 제공하여, 님트리 잎 추출물에 포함된 유효성분에 의한 약리활성 효과를 이용하여 식품, 화장품, 의약 등 다양한 산업에서 활용 가능한 새로운 용도를 제공하고, 님트리 잎 추출물을 포함하는 피커링 에멀젼의 안정화를 위한 최적의 조성 및 조건을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명의 목적들은 상기에 언급된 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 열수, 에탄올 또는 아세톤을 이용하여 추출되어 님트리(Azadirachta indica) 잎의 유효성분을 포함하여 여드름 개선, 미백 및 주름개선 효능을 갖는 님트리 잎 추출물 및 이의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 님트리 잎 추출물을 포함하여 여드름 개선, 미백 및 주름개선 효능을 갖는 피커링 에멀젼 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 님트리 잎 추출물의 용매에 따른 항산화 효과, 항균효과, 항염 효과(여드름 개선), 미백 효과(피부 색소 침착 완화), 주름 개선 효과 등을 검증하고 이 결과를 통하여 요구되는 용도에의 활용 가치를 상승시킬 수 있다.
또한 본 발명은 님트리 잎으로부터 추출한 유효성분을 포함하는 조성물을 제공하여 식품, 화장품, 의약품 등에 사용될 수 있으며, 특히 화장품으로 사용될 경우 유효성분 및 기타 첨가성분이 보다 안정한 형태로 함유될 수 있는 피커링 에멀젼 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 님트리 추출방법을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 님트리 잎 추출물의 DPPH radical 소거능 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 님트리 잎 추출물의 ABTS cation radical 소거능 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 님트리 잎 추출물의 SOD 유사활성 효과 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 님트리 잎 추출물의 Superoxide anion radical 소거능 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1(열수 추출)에 따른 님트리 잎 추출물의 생육 저해환(Clear zone) 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 2(에탄올 추출)에 따른 님트리 잎 추출물의 생육 저해환(Clear zone) 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 3(아세톤 추출)에 따른 님트리 잎 추출물의 생육 저해환(Clear zone) 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 님트리 잎 추출물의 tyrosinase 저해활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 님트리 잎 추출물의 elastase 저해 활성 효과 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 님트리 잎 추출물의 Macrophage cell 세포 생존율 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 님트리 잎 추출물의 NO 저해활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실시예 1(열수 추출)에 따른 님트리 잎 추출물의 iNOS, COX-2 발현 저해 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실시예 2(에탄올 추출)에 따른 님트리 잎 추출물의 iNOS, COX-2 발현 저해 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 실시예 3(아세톤 추출)에 따른 님트리 잎 추출물의 iNOS, COX-2 발현 저해 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 실시예 2(에탄올 추출)에 따른 님트리 잎 추출물의 iNOS mRNA 발현 억제률 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 실시예 2(에탄올 추출)에 따른 님트리 잎 추출물의 Melanoma cell(B16F10) 세포독성 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 실시예 2(에탄올 추출)에 따른 님트리 잎 추출물의 TRP-1, TRP-2 및 Tyrosinase 발현 억제 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 실시예 2(에탄올 추출)에 따른 님트리 잎 추출물의 TRP-1 mRNA 발현 억제 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 실시예 2(에탄올 추출)에 따른 님트리 잎 추출물의 Human keratinocyte cell 세포 생존율 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 실시예 2(에탄올 추출)에 따른 님트리 잎 추출물의 MMP-1과 Filaggrin 단백질 발현 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 피커링 에멀젼 제조방법을 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 피커링 에멀젼의 보습제(Glycerin) 함량에 따른 제형 변화를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 피커링 에멀젼의 보습제(1,3-BG) 함량에 따른 제형 변화를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 피커링 에멀젼의 보습제(Propandiol) 함량에 따른 제형 변화를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 피커링 에멀젼의 복합 보습제 함량에 따른 TEWL 수분증발 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 피커링 에멀젼의 pH에 따른 제형변화를 나타낸 것이다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 피커링 에멀젼의 L-ascorbic acid 원료 pH 함량에 따른 제형 변화를 나타낸 것이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 따른 피커링 에멀젼의 L-ascorbic acid 함량에 따른 제형 변화를 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 피커링 에멀젼의 온도와 시간에 따른 pH 측정 결과를 나타낸 것이다.
이하에 본 발명을 상세하게 설명하기에 앞서, 본 명세서에 사용된 용어는 특정의 실시예를 기술하기 위한 것일 뿐 첨부하는 특허청구의 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아님을 이해하여야 한다. 본 명세서에 사용되는 모든 기술용어 및 과학용어는 다른 언급이 없는 한은 기술적으로 통상의 기술을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서 및 청구범위의 전반에 걸쳐, 다른 언급이 없는 한 포함(comprise, comprises, comprising)이라는 용어는 언급된 물건, 단계 또는 일군의 물건, 및 단계를 포함하는 것을 의미하고, 임의의 어떤 다른 물건, 단계 또는 일군의 물건 또는 일군의 단계를 배제하는 의미로 사용된 것은 아니다.
한편, 본 발명의 여러 가지 실시예들은 명확한 반대의 지적이 없는 한 그 외의 어떤 다른 실시예들과 결합될 수 있다. 특히 바람직하거나 유리하다고 지시하는 어떤 특징도 바람직하거나 유리하다고 지시한 그 외의 어떤 특징 및 특징들과 결합될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 조성물은 님트리 잎 추출물을 포함하여, 추출된 식물의 유효성분을 포함함으로써, 여드름 억제 및 피부색소 침착 완화를 위한 기능성 화장품, 식품, 의약품 등에 사용될 수 있다. 본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명에서는 님트리 잎으로부터 유효성분을 추출하고, 님트리 잎 추출물을 포함하는 피커링 에멀젼 조성물을 제공한다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예 및 이에 따른 효과를 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 님트리 잎 추출물은 열수, 에탄올 또는 아세톤을 이용하여 추출된 님트리 유효성분을 포함한다. 추출된 님트리 유효성분은 항산화 효과, 항균효과, 항염 효과(여드름 개선), 미백 효과(피부 색소 침착 완화), 주름 개선 효과를 제공한다. 이 때 추출에 이용된 용매에 따라 가장 우수한 효과를 갖는 기능을 제공하여 요구되는 기능에 최적화된 피커링 에멀젼 조성물을 제공할 수 있으며, 안정성 및 내수성이 우수한 피커링 에멀전 조성물을 제공한다.
상기 님트리 잎 추출물은 님트리 잎을 용매인 열수, 에탄올 또는 아세톤에 침지시킨 후 추출하여 얻는다. 추출방법은 그 용매에 따라 상이하게 이루어질 수 있다.
상기 님트리 잎을 열수를 이용하여 추출하는 경우, 건조된 님트리 잎의 중량 8 내지 12배의 열수에 침지시킨 후 90 내지 110℃에서 3 내지 5 시간 동안 추출한다. 이 때 상기와 같은 추출단계를 적어도 2회 이상, 바람직하게는 3회 이상 반복하여 추출물을 얻는 것이 좋다.
상기 님트리 잎을 에탄올 또는 아세톤을 이용하여 추출하는 경우, 60 내지 80% 에탄올 또는 아세톤 용액을 용매로 이용하며, 건조된 님트리 잎의 중량 8 내지 12배의 에탄올 또는 아세톤 용액에 침지시킨 후 상온에서 20 내지 30 시간 동안 추출한다. 이 때 상기와 같은 추출단계를 적어도 2회 이상, 바람직하게는 3회 이상 반복하여 추출물을 얻는 것이 좋다.
님트리 잎 추출물은 50 mg/g 이상의 높은 폴리페놀 함량을 가지고, DPPH radical 소거능, ABTS+ radical 소거능, SOD 유사활성능, Superoxide anion radical 소거능을 나타내 항산화 효과를 가진다.
특히, 열수 추출된 님트리 잎 추출물은 1,000 μg/mL 농도에서 DPPH radical 소거능이 40% 이상이고, ABTS+ radical 소거능이 70% 이상으로 가장 우수하다. 에탄올 추출된 님트리 잎 추출물은 1,000 μg/mL 농도에서 SOD 유사활성능이 20% 이상이고, Superoxide anion radical 소거능이 95% 이상으로 가장 우수하다. 아세톤 추출된 님트리 잎 추출물은 70 mg/g 이상의 가장 높은 폴리페놀 함량을 가진다.
님트리 잎 추출물은 Staphylococcus aureus 균 및 Propionibacterium acnes 균에 대해서 생육 저해를 나타내 항균 효과를 가진다. 더욱 구체적으로 생육 저해환 측정 실험에서 에탄올 또는 아세톤 추출된 님트리 잎 추출물이 Staphylococcus aureus균에서 2 mg/disc 에서부터 1.0±0cm 이상의 clear zone이 나타났고, 모든 님트리 잎 추출물이 Propionibacterium acnes 균에 대해서 5 mg/disc 에서부터 1.1±0cm 이상의 clear zone이 나타난다.
님트리 잎 추출물은 Tyrosinase 저해활성을 나타내 피부 색소 침착 완화, 즉 미백 효과를 가진다. 특히, 에탄올 또는 아세톤 추출된 님트리 잎 추출물이 1,000 μg/mL 농도에서 Tyrosinase 저해활성율이 45% 이상으로 우수하며, 에탄올 추출된 님트리 잎 추출물의 Tyrosinase 저해활성이 가장 우수하다.
나아가 Tyrosinase 저해활성이 가장 우수한 에탄올 추출된 님트리 잎 추출물은 Melanoma cell인 B16F10에서 85% 이상의 생존율을 보이며, 10 μg/mL 농도에서 85% 이상으로 높은 TRP-1 mRNA 발현 억제능을 가진다.
님트리 잎 추출물은 Elastase 저해활성을 나타내 주름 개선 효과를 가진다. 특히, 에탄올 또는 아세톤 추출된 님트리 잎 추출물이 1,000 μg/mL 농도에서 Elastase 저해활성율이 20% 이상으로 우수하며, 에탄올 추출된 님트리 잎 추출물의 Elastase 저해활성이 가장 우수하다.
나아가 Elastase 저해활성이 가장 우수한 에탄올 추출된 님트리 잎 추출물은 Human keratinocyte cell에서 90% 이상의 생존율을 보이며, 10 μg/mL 농도에서 MMP-1 발현 억제능을 가진다.
님트리 잎 추출물은 Macrophage cell인 RAW 264.7에서 90% 이상의 생존율을 보이며 NO 저해활성을 나타내었고, iNOS 및 COX-2 단백질 발현 저해 활성을 나타내 항염 효과를 가진다.
특히 에탄올 또는 아세톤 추출 님트리 잎 추출물은 100 μg/mL 농도에서 NO 저해활성율이 65% 이상으로 우수하며, 에탄올 추출된 님트리 잎 추출물의 NO 저해활성이 가장 우수하다. 또한 에탄올 추출 님트리 잎 추출물은 iNOS 단백질 발현 저해 활성을 가지며, 아세톤 추출 님트리 잎 추출물은 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 저해 활성을 가진다. 더욱 구체적으로 에탄올 추출 님트리 잎 추출물의 100 μg/mL 농도에서 iNOS mRNA 발현 억제율이 97% 이상으로 가장 우수하다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른 님트리 잎 추출물을 포함하는 피커링 에멀젼 조성물은 님트리 잎 추출물, 첨가상, 수상 및 기타 첨가제를 포함한다.
상기 님트리 잎 추출물은 상기 얻어진 추출물을 포함한다. 즉 열수, 에탄올 또는 아세톤을 이용하여 님트리 잎의 유효성분을 포함하는 추출물을 포함한다. 열수 추출된 님트리 잎 추출물, 에탄올 추출된 님트리 잎 추출물, 아세톤 추출된 님트리 잎 추출물 중 피커링 에멀젼 조성물이 사용되는 용도에 따라 해당 용도에 있어서 가장 우수한 효능을 갖는 추출물을 선택하여 포함시킬 수 있다.
상기 님트리 잎 추출물은 피커링 에멀젼 조성물 전체 중량부에 대하여 0.5 내지 5 중량% 포함되고, 바람직하게는 0.5 내지 3 중량% 포함되는 것이 좋다.
상기 첨가상은 탄산칼슘, 실리카, 점토, 라포나이트, 흑연, 라텍스, 자분(magnetic particle) 및 탄소나노튜브(CNT)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함하며, 바람직하게는 실리카를 사용하는 것이 좋다.
상기 첨가상은 피커링 에멀젼 조성물 전체 중량부에 대하여 1 내지 10 중량% 포함되고, 바람직하게는 3 내지 8 중량% 포함되는 것이 좋다.
상기 수상은 물 및 보습제를 포함하며, 상기 보습제는 글리세린(Glycerin), 1,3-부틸렌 글리콜(1,3-Butylene Glycol), 소르비톨(Sorbitol), 에틸렌글리콜(Ethylene glycol) 및 프로판디올(Propandiol) 로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함한다. 바람직하게는 글리세린(Glycerin), 1,3-부틸렌 글리콜(1,3-Butylene Glycol) 및 프로판디올(Propandiol) 3종을 혼합하여 사용하는 것이 좋다.
상기 수상은 피커링 에멀젼 조성물 전체 중량부에 대하여 75 내지 95 중량% 포함되고, 바람직하게는 80 내지 85 중량% 포함되는 것이 좋다.
상기 물은 수상 전체 중량부에 대하여 50 내지 80 중량% 포함되고, 바람직하게는 60 내지 70 중량% 포함되는 것이 좋다. 또한 상기 보습제는 수상 전체 중량부에 대하여 20 내지 50 중량% 포함되고, 바람직하게는 40 내지 30 중량% 포함되는 것이 좋다.
더욱 구체적으로 보습제로서 글리세린(Glycerin)을 사용하는 경우 수상 전체 중량부에 대하여 10 내지 70 중량% 로 포함하며, 보습제로서 1,3-부틸렌 글리콜(1,3-Butylene Glycol)을 사용하는 경우 수상 전체 중량부에 대하여 10 내지 30 중량% 로 포함하고, 보습제로서 프로판디올(Propandiol)을 사용하는 경우 수상 전체 중량부에 대하여 10 내지 40 중량% 로 포함한다. 가장 바람직하게는 보습제로서 글리세린(Glycerin), 1,3-부틸렌 글리콜(1,3-Butylene Glycol) 및 프로판디올(Propandiol)을 혼합하여 사용하고, 이 때 상기 3종을 3.5~4.5:2.5~3.5:0.5~1.5 비율로 혼합하여 수상 전체 중량부에 대하여 30 내지 40 중량% 포함하는 것이 좋다.
상기 첨가제는 항산화제방부제 및 pH 조절제 중 어느 하나 이상을 포함하며, 상기 항산화제는 예를 들면 L-ascorbic acid, α-tocopherol, polyphenol, carnosic acid), lipoic acid, 2-aminoethanesulfonic acid, aromatic carboxylic acid 및 이들의 조합물을 포함하고, 상기 방부제는 예를 들면 1,2-hexanediol, glyceryl caprylate, methylparaben, salicylic acid, isopropylparaben, phenoxyethanol 및 이들의 조합물을 포함하며, 상기 pH 조절제는 예를 들면 Citric acid 또는 L-arginine을 포함한다.
상기 첨가제는 피커링 에멀젼 조성물 전체 중량부에 대하여 2.2 내지 12 중량% 포함된다. 더욱 구체적으로 상기 항산화제는 피커링 에멀젼 조성물 전체 중량부에 대하여 2 내지 10 중량% 포함된다. 상기 방부제는 피커링 에멀젼 조성물 전체 중량부에 대하여 0.1 내지 1.0 중량% 포함되고, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량% 포함되는 것이 좋다.
상기 pH 조절제는 피커링 에멀젼 조성물의 pH를 2 내지 4 범위로 조절하도록 포함되며, 더욱 구체적으로는 피커링 에멀젼 조성물 전체 중량부에 대하여 0.1 내지 1.0 중량% 포함되고, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량% 포함되는 것이 좋다.
상기 피커링 에멀젼 조성물은 상기 성분들을 상기 함량으로 혼합하고 10,000rpm 내지 20,000rpm 으로 30초 내지 5분간 분쇄 처리한 후 300 내지 800rpm 으로 1 내지 5분간 혼합 처리하여 얻는다.
상기 님트리 잎 추출물을 포함하는 피커링 에멀젼 조성물을 화장품으로 사용하는 경우 스킨 및 바디 케어 화장품으로서 에센스, 앰플, 비누, 토닉 및 바디 에센스, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 분말 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 상기 님트리 잎 추출물을 포함하는 피커링 에멀젼 조성물은 전체 화장품에 대하여 0.05 내지 100 wt%로 포함되고, 앰플 제형의 경우 상기 님트리 잎 추출물을 포함하는 피커링 에멀젼 100%로 이루어진 것일 수 있다.
피커링 에멀젼 조성물은 님트리 잎 추출물 이외에 피부 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체로서는 알콜, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 방부제, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료, 희석제 등이 예시될 수 있다.
상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 방부제, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료, 희석제 등으로 사용될 수 있는 구체적인 화합물 또는 조성물은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 화합물 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
여기서 몇 가지를 예시하여 보면, 알콜로서는 고급 알콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 다가 알콜 등을 들 수 있고, 오일로서는 아보가드유, 팜유, 우지, 호호바유 등을 들 수 있고, 방부제로서는 에틸파라벤, 부틸파라벤 등을 들 수 있으며, 보습제로서는 히알론산, 황산콘드로이친(chondroitin sulfate), 피롤리돈카복실산염 등을 들 수 있으며, 희석제로서는 에탄올, 이소프로판올 등을 들 수 있다.
더욱 구체적으로 화장품의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
또한 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
또한 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산에스테르가 있다.
또한 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또한 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한 본 발명의 일실시예에 따른 님트리 잎 추출물을 포함하는 비누의 경우, 비누 기재에 님트리 잎 추출물을 포함하여 제조될 수 있으며, 첨가제로서 피부 보습제, 유화제, 경수 연화제 등을 포함하여 제조될 수 있다.
상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속이온 봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
<실시예 1 내지 3 - 님트리 잎 추출물의 제조>
본 발명의 실시예에서 사용한 님트리(Azadirachta indica) 잎은 TNHH SBJ Viet Nam Co. 에서 구입하였다.
실시예 1에 따른 열수 추출물(AIW)은 건조된 시료 중량의 10배의 초순수를 용매로 사용하여 100 ℃ 에서 4 h 동안 추출하는 것을 3회 반복한 후 추출액을 여과지(No. 20 filter paper, Hyundai micro Co., Ltd., Korea)로 여과, 농축, 동결건조 하여 분말화 하여 얻었다.
실시예 2에 따른 70% 에탄올 추출물(AIE) 및 실시예 3에 따른 70% 아세톤 추출물(AIA)은 각각 건조된 시료 중량의 10배의 용매로 상온에서 24 h 침지하여 추출하는 것을 3회 반복하여 추출액을 얻었고, 열수 추출물과 동일한 방법으로 나머지 추출물을 분말화 하여 얻었다(도 1).
열수 추출물의 수율은 16.55%, 70% 에탄올 추출물의 수율은 29.32%, 70% 아세톤 추출물의 수율은 26.38% 이었다. 각 추출물들은 4 ℃ 냉장실에 보관하고 이하 실험예의 시료로 사용하였다.
<실험예 1 - 항산화 효과 측정>
(1) 측정 시약
항산화 효과 측정 실험에 사용된 시약은 다음과 같다.
2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt, Potassium peroxodisulfate, Butylated hydroxy anisole, L-ascorbic acid, Tannic acid, Epigallocatechin gallate, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Pyrogallol, 2,6-dihydroxypurine, Nitro blue tetrazolium, Xanthine oxidase 등은 Sigma aldrich Co., Ltd.(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. Folin-ciocalteu phenol reagent는 Junsei chemical Co., Ltd.(Japan)의 제품을 사용하였다. Ethanol, 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol, Hydrogen chloride, Potassium phosphate monobasic, Potassium phosphate dibasic 등은 Duksan pure chemicals Co., Ltd.(Korea)의 제품을 사용하였다.
(2) 총 폴리페놀 화합물 함량 측정
총 페놀 화합물 함량 측정은 Folin-Denis 방법으로 측정하였으며, 각 시료를 10 mg/mL 로 증류수에 녹인 후 5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL 농도로 희석하여 준비한다. 0.2 mL Folin ciocalteu reagent를 첨가하여 잘 혼합한 후 3분간 실온에 방치하였다. 3분 후 0.7M Na2CO3 포화용액 0.5 mL를 가하여 섞은 후 각 추출물 0.5 mL씩 농도별로 넣은 후 1시간 반응시킨 뒤, 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tannic acid 를 사용한 표준곡선을 이용하여 양을 환산 후 총 폴리페놀 함량을 측정하였다.
페놀성 분획물은 천연물 속에 많이 함유되어 있으며 자유 라디칼을 소거하는 것이 이들의 주요 역할이라는 연구가 많이 보고되어 있으며, 또한 이러한 플라보노이드나 페놀산 및 안토시아닌 등의 페놀성 분획물이 DPPH 라디칼 소거활성과 같은 항산화 활성에 매우 중요한 인자로 작용한다. 본 실험에서는 기본 물질로 Tannic acid를 이용해 표준곡선을 사용하여 님트리 추출물의 폴리페놀 함량을 측정하였고 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Solvent type extract Polyphenol contents (mg/g)1)
실시예 1(Water) 52.94 ± 0.962)
실시예 2(70% Ethanol) 51.37 ± 0.602)
실시예 3(70% Acetone) 73.45 ± 0.272)
1) TAE standards for tannic acid equivalents.2) All Value are expressed as Mean ± SD of triplicate determinations.
3) Different superscripts within the column are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
상기 표 1에 나타난 것과 같이 님트리 열수 추출물(AIW)은 52.94 mg/g, Ethanol 70% 추출물(AIE)은 51.37 mg/g, Acetone 70% 추출물(AIA)은 73.45 mg/g 으로 나타났으며 각 용매추출물 중 AIA 가 가장 높은 폴리페놀 함량을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다. 약용식물 추출물의 폴리페놀 함량 분석(Shin JH, Jang JR, Kang MJ, Shin JH (2018) Physiological Activity of Five Kinds of Medicinal Plant Extracts with Various Solvents and Their Composites. Journal of life science, 28, 3, 320-330.)에서 나온 갈화(6.46 mg/g), 갈근(5.50 mg/g) 및 감국(2.48 mg/g) 등과 비교했을 때 AIW, AIE, AIA의 폴리페놀 함량이 높은 것을 확인하였다.
(3) DPPH radical 소거 효과 측정
DPPH radical 소거능의 효과 측정은 Blois의 방법으로 측정하였다. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)를 0.45 mM 농도가 되도록 99% ethanol로 녹여 준비하고 각각의 추출물은 5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL 농도로 희석하여 준비한다. 양성 대조군으로는 Butylated hydroxy anisole(BHA)을 사용하였다. 이 후 96 well plate에 각 추출물 120 μL와 DPPH 60 μL 를 첨가하고 실온에서 차광하여 15 min 동안 반응시키고 517 nm 에서 ELISA reader를 사용하여 소거활성을 측정하였다.
Figure pat00001
1,1 - diphenyl -2- picrylhydrazyl(DPPH)는 전자공여능 측정에 사용되며 물질 스스로가 매우 안정한 free radical을 가지고 517 nm에서 다른 파장과 구별되는 광흡수를 나타내 보라색을 띄는 분획물이다. DPPH는 유기용매인 알코올 등에 안정하며 항산화 기전과정에서 proton - radical scavenger에 의해 탈색되기 때문에 항산화 활성을 눈으로 쉽게 파악 할 수 있는 장점이 있다. DPPH radical 소거능을 측정하여 님트리 잎 추출물의 항산화 효능을 측정하였으며 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 것과 같이 AIW, AIE, AIA 모두에서 농도 의존적인 항산화 효과가 나타났으며 전체적으로 AIW가 동일 농도에서 더욱 좋은 활성을 가진 것으로 나타났다. 1,000 μg/mL 농도에서 AIW가 41.41%의 효과를 나타내었고 AIE, AIA는 각각 34.09%, 30.61%의 효과를 나타내어 AIW가 나머지 추출물보다 높은 효과를 가진 것으로 나타났다.
(4) ABTS+ radical 소거 효과 측정
ABTS+ cation decolorization assay 방법에 따라 ABTS radical을 이용한 항산화력을 측정하였다. 7mM 2,2-azino-bis 와 2.4mM potassium persulfate를 같은 비율로 섞고 차광하여 12~24시간동안 방치하여 반응을 시킨 후 실험을 진행하였다. 각각의 추출물은 5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL 농도로 희석하여 준비하였고 양성 대조군으로는 Butylated hydroxy anisole(BHA)를 사용하였다. 이후 96well plate에 ABTS+ 용액 100μL 와 각 추출물 100μL을 가하여 25℃에서 7분간 반응시킨 뒤 파장 734 nm에서 흡광도를 측정하고 저해율(%)로 나타내었다.
Figure pat00002
ABTS radical 소거능은 ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)가 potassium persulfate와 반응하여 ABTS+ radical이 생성되어 특유의 색인 청록색을 나타내는데, 시료를 첨가하게 되면 연한 녹색으로 변하며 hydrogen donating antioxidant 와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있는 특징을 갖는다. 항산화 물질과 반응함에 따라 흡광도의 변화가 생기므로 DPPH 소거능 실험법과 함께 많은 연구에서 이용되고 있다. ABTS cation radical 소거능을 측정하여 님트리 잎 추출물의 항산화 효능을 측정한 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타나는 것과 같이 최고 농도인 1,000 μg/mL에서 AIW 는 73.55% AIE 및 AIA 는 69.60%, 62.24%의 저해율을 나타내었다. 동일 농도에서 AIW 가 가장 높은 ABTS+ cation radical scavenging activity를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
(5) Superoxide dismutase 유사활성 효과 측정
Marklund의 방법에 따라 Superoxide dismutase(SOD) 유사활성을 측정하였다. 각각의 시료는 5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL 농도로 희석하여 준비하였고 양성 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다. 96 well plate에 각 시료용액 20 μL에 50 mM Tris-HCl buffer (pH8.5) 130 μL, 증류수에 녹인 7.2 mM pyrogallol 20 μL를 넣고 20 min 동안 실온에서 차광하여 반응시킨 후 420 nm 에서 흡광도를 측정하여 pyrogallol의 양을 측정하였다.
Figure pat00003
Superoxide dismutase(SOD)는 생체에서 유해한 superoxide anion radical (·O2)과 반응하여 과산화수소(H2O2)를 생성하는 효소로, 산소를 사용하는 모든 생물에 존재하며 생체에서 활성산소에 대한 장애의 방어 작용을 하는 대표적인 활성산소 저해제이다. 또한 산소분자가 환원되어 생기는 superoxide anion radical (·O2 - ·2O2 + 2e-→ 2 ·O2 -)을 제거하는 방어 메커니즘에 관여하는 효소(2O2 - + 2H+→ H2O2 + O2 -)로, 독성이 매우 강한 hydroxy radical이 생성되는 것을 예방하는 작용을 하여 항염증 소재나 피부 노화방지를 위한 미용적인 소재로 화장품 등과 같은 첨가제로 사용이 되고 있다. 님트리 잎 추출물의 SOD 유사활성 효과를 측정하여 님트리 잎 추출물의 항산화 효과를 측정한 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 것과 같이 AIW, AIE, AIA에서 최고농도인 1,000 μg/mL 농도에서 각각의 추출물의 효과는 12.82%, 24.13%, 7.38%로 나타났으며, AIE>AIW>AIA 순서로 효과가 나타난 것을 확인 하였다.
(6) Superoxide anion radical 소거 효과 측정
Nitroblue tetrazolium(NBT) 환원방법에 따라 Superoxide anion radical 소거능을 측정하였다. 각각의 시료를 5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL 농도로 희석하여 각 시료 0.1 mL와 0.1 M Potassium phosphate buffer (pH 7.5) 0.4mL에 NBT (0.24mM)와 Xanthine (0.4mM)을 녹인 substrate 2mL을 첨가하고 Xanthine oxidase (0.2 U/mL) 2mL를 첨가하여 20분 동안 37℃에서 반응 시킨 후 1 N HCL 1mL을 첨가하여 흡광도 560 nm에서 측정하였다. 양성 대조군으로는 Epigallocatechin gallate (EGCG)를 사용하였다.
Figure pat00004
Superoxide anion radical(NBT)은 호기성 세포의 효소 또는 비효소적 단계에서 매우 강한 독성이 생성되는 radical로서 노화와 관련하여 산화반응의 개시단계에 관여한다. 또한 과산화수소, 하이드록시 라디칼, 일중항산소 등과 같은 활성산소종의 생성에 관여하여 지질. DNA, 단백질 등에 산화적 손상을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이러한 과정중 항산화 물질이 superoxide anion radical과 반응하여 소거되면 보랏빛으로 발색되는 현상이 줄어들게 되고 이 흡광도의 변화를 이용하여 항산화 효과를 측정하는 방법이다. Superoxide anion radical 소거능을 측정하여 님트리 잎 추출물의 항산화 효과를 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 것과 같이 최고 농도인 1,000 μg/mL에서 AIW, AIE, AIA 순으로 81.37%, 96.04%, 52.30%로 나타났다. 동일 농도에서 AIE가 가장 높은 효능을 나타내었으며 AIW, AIA 순으로 superoxide anion radical 소거능을 나타냈다.
<실험예 2 - 항균 효과 측정>
(1) 균주 및 배지
항균 효과 측정에 사용된 균주 및 배지는 다음과 같다.
균주로는 Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas auruginosa, Enterobacter cloace, Propionibacterium acnes, Candida albicans 등이 사용되었다. 배지로는 Nutrient broht(NB), Tryptic soy broth(TSB), Gifu anaerobic medum(GAM), Nutrint agar(NA), Tryptic soy agar(TSA) 등이 사용되었다.
(2) 균 배양
항균력 측정 실험을 위해서 사용한 균주는 Escherichia coli KCTC 2441, Staphylococcus aureus KCTC 1916, Enterobacter cloacae subsp cloacae KCTC 2361, Staphylococcus epidermis KCTC 1917, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1750 를 사용하였고, 여드름 유발균으로 Propionibacterium acnes KCTC 3065를 사용하였다. 곰팡이 균으로 Candida albicans KCTC 7965를 계대 배양히여 실험에 사용하였다. 전처리 배양 및 본 실험의 배양을 위한 액체 배지로 Escherichia coli, Staphylococcus epidermis, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterobacter cloacae subsp cloacae 의 액체배지로는 Nutrient broth(NB)를 Difco Lab. (Sparks, U.S.A)에서 구입하였으며, Staphylococcus aureus의 액체배지로 Tryptic soy broth (TSB)를 Difco Lab. (Sparks, U.S.A)에서 구입하여 사용하였으며, Propionibacterium acnes의 액체배지로 Gifu anaerobic medum(GAM, Nissui Co. Japan)에서 구입하여 사용하였으며, Candida albicans균의 액체배지로 Yeast Mold broth(YMB, Sparks, U.S.A)에서 구입하여 사용하였다. 고체 배지는 Nutrient ager(NA), Tryptic soy Agar(TSA), Yeast Mold agar(YMA)는 Difco Lab. (Sparks, U.S.A)에서 구입하였고, Gifu anaerobic medium(GAM)은 Nissui Co. Japan에서 구입하여 사용하였으며 실험에 있어서 본 배지에 Agar Powder를 첨가하여 실험에 사용하였다.
(3) 생육 저해환 (Clear Zone) 측정
Paper disc를 이용하여 생육 저해력을 측정하였다. 즉, 액체 배지 15mL에 평판 배지에서 배양된 각 균주를 1 백금이 취해서 18∼24시간 배양하여 활성화시킨 뒤 다음 액체 배지 15 mL에 균액을 0.1 mL 접종하여 4∼8 시간 본 배양한 다음 평판배지 1개당 균수가 약 1×106cell이 되게 접종하여 멸균된 면봉을 사용하여 균일하게 도말하였다. 멸균된 Filter papae disk (8mm, Tokyo, Japan)를 고체 평판배지에 올려놓고 시료를 농도별로 0.05 mL/disk가 되도록 흡수시켜 세균은 37℃ 인큐베이터에, 진균은 25℃인큐베이터에 12∼48 시간 배양하여 disc 주위의 Clear zone (mm)의 직경을 측정하여 저해활성을 확인하였다.
한천 내 확산법(Paper disc agar diffusion assay)을 통한 님트리 잎 추출물의 항균 효과를 알아보았으며 그 결과를 생육 저해환(Clear zone)으로서 측정하여 도 6 내지 8 및 하기 표 2에 나타냈다.
Micro organism Size of clear zone(mm) 1)
mg/disc AIW AIE AIA
Enterobacter cloace 1 -2) - -
2 - - -
5 - - -
10 - - -
Staphylococcus aureus 1 - - -
2 - 10±0 10±0
5 - 13±0.12 12±0
10 - 16±0.05 17±0.15
Staphlococcus epidermis 1 - - -
2 - - -
5 - - -
10 - - -
Pseudomonas auruginosa 1 - - -
2 - - -
5 - - -
10 - - -
Escherichia coli 1 - - -
2 - - -
5 - - -
10 10±0 - -
Propionibacterium acnes 1 - - -
2 - - -
5 11±0 13±0.05 13±0
10 14±0 15±0 15±0
Candidia albicans 1 - - -
2 - - -
5 - - -
10 - - -
1) Dismeter (Disc 8mm),
2) No inhibitory zone was formed. Values are mean ± standard deviations of triplicate determination.
도 6 내지 8 및 표 2에 나타난 것과 같이 님트리 잎 추출물은 Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas auruginosa, Enterobacter cloace, Candida albicans균에 대하여 항균 효과를 가지지 못한 것으로 나타났으며 Staphylococcus aureus균에서 2 mg/disc 에서부터 AIE 및 AIA가 1.0±0cm 이상의 clear zone이 나타났고, Propionibacterium acnes 균에 대해서는 AIW, AIE, AIA에서 5 mg/disc 에서부터 1.1±0cm 이상의 clear zone이 나타난 것을 확인 할 수 있었다.
<실험예 3 - 미백 효과 측정>
(1) 측정 시약
미백 효과 측정에 사용된 시약은 다음과 같다.
3,4-dihydroxy-L-phenylalanine, Tyrosinase from mushroom 등은 Sigma aldrich Co., Ltd.(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. Sodium phosphate monobasic dihydrate, Sodium phosphate dibasic anhydrous 등은 Duksan pure chemicals Co., Ltd.(Korea)의 제품을 사용하였다. 미백 효과 측정에 사용된 MITF, Tyrosinase, TRP-1, TRP-2 2차 antibodies는 Santa Cruz (Biotech, CA, USA)에서 구입하였다.
(2) Mushroom 유래의 Tyrosinase 저해활성 측정
Tyrosinase 저해활성을 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 각각의 시료는 5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL 농도로 희석하여 준비하였고 양성 대조군으로 L-ascorbic acid를 사용하였다. 67mM sodium phosphate buffer(pH 6.8) 80 μL에 10 mM L-DOPA를 녹인 substrate 40 μL와 시료 40 μL를 섞은 혼합액에 mushroom tyrosinase [125 unit/mL] 40 μL를 첨가하여 10분간 37℃에서 반응 시킨 후 흡광도를 492 nm에서 측정하였다.
Figure pat00005
melanocyte는 표피 기저층의 색소세포 내의 melanosome에서 생합성 되는데 여기서 melanin은 피부의 색조를 결정하는 중요한 인자로 작용한다. 아미노산의 일종인 tyrosine은 멜라닌을 합성하는 물질이다. Tyrosine은 melanoma cell 내에서의 tyrosinase에 의해 L-3,4-dihudroxyl phenylslsnine(DOPA)과 DOPA quinone으로 산화된다. 그 후 다시 DOPA quinone이 5,6-dihydroxyindole, DOPA chrome, indole-5,6-quinone이 되고, indole-5,6-quinone 중합에 의해 melanin을 생성하는 것으로 알려져 있다. 이렇게 피부 속에서의 melanin의 중합체 생합성을 저해할 수 있는 tyrosinase의 저해활성을 측정하기 위해서 mushroom 유래의 tyrosinase 저해활성을 측정하였고 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타나는 것과 같이 최고 농도인 1,000 μg/mL 농도에서 AIW는 32.77%, AIE는 47.21%, AIA는 45.36%로 나타났으며 같은 농도에서 AIE가 가장 높은 활성을 나타내었다. 양성 대조군으로 사용된 L-ascorbic acid 보다는 낮은 효과가 나타났지만 님트리 잎 추출물은 천연물로서 상당한 효과가 확인되어 미백 작용에 도음울 줄 수 있을 것으로 판단된다.
<실험예 4 - 주름 개선 효과 측정>
(1) 측정 시약
주름개선 효과 측정 실험에 사용된 시약은 다음과 같다.
N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide, Elastase from porcine pancreas 등은 Sigma aldrich Co., Ltd.(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol, Hydrogen chloride 등은 Duksan pure chemicals Co., Ltd.(Korea)의 제품을 사용하였다. MMP-1, Filaggrin 2차 antibodies는 Santa Cruz (Biotech, CA, USA)에서 구입하였다.
(2) Elastase 저해 효과 측정
Elastase inhibition activity은 Cannell 등의 방법을 참고하여 실험을 진행하였다. N - succinyl -(L-Ala)3 - p -nitroanailide를 사용하여 36℃에서 25분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성되는 양을 405 nm에서 ELISA로 측정하였다. 그 후, 각각의 시료는 5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL 농도로 희석하여 각 시료액을 40 μL 으로 취하고 50 nm 농도의 tris- HCl Buffer (pH8.6)에 녹인 Porcine pancreas elastase[0.5 unit/mL]용액 40 μL를 가한 후 기질로 50mM 농도의 tris buffer(pH 8.6)에 녹인 N - succinyl -(L-Ala)3 - p -nitroanailide을 첨가하여 20분간 반응 시킨 후 결과를 측정하였다. 양성 대조군으로는 Epigallocatechin gallate (EGCG)를 사용하였다.
Figure pat00006
Elastin은 진피 내에서 피부 탄력을 유지하는데 매우 중요한 단백질이며 피부의 결합조직에 존재하여 조직의 신축성과 유연성에 관여하고 있다. elastase는 이러한 elastin을 분해하는 효소이며 주름과 피부처짐 등의 피부노화를 발생시키는 원인 중 하나이다. 따라서 elastase 저해제는 피부 주름개선을 통한 노화를 방지하는 작용을 하게 되는데 님트리 잎 추출물의 elastase 저해 활성 효과를 측정한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 것과 같이 최고 농도인 1,000 μg/mL에서 AIW, AIE, AIA 순으로 17.56%, 24.24%, 21.92%로 AIE가 가장 높은 활성을 나타내었다.
<실험예 5 - 항염증 효과 측정>
(1) 세포주 및 시약
세포의 생존율 측정에 사용된 세포주 Murine macrophage cell(RAW 264.7), Mouse melanoma cell(B16F10)은 American type culture collection(Manassas, VA, USA)의 제품을 사용하였다. Human Keratinocyte cell(HacaT)은 한국한방진흥원에서 분양받은 세포를 사용하였다. Dulbecco's modified eagle medium(DMEM), Fetal bovine serum(FBS) 등은 LONZA Co.에서 제품을 구입하여 사용하였다. 0.25 % trypsin-EDTA, 0.4 % trypan blue stain은 gibco BRL Co.(Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)시약은 sigma chemical Co. Ltd.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
(2) 세포 독성 측정
1) 세포 배양
본 실험에 이용한 RAW 264.7 macrophage cell, B16F10 melanoma cell, HacaT keratynocyte cell은 1% penicillin/streptomycin(100 unit/mL)과 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.
2) MTT assay 에 의한 세포 생존률 측정
Carmichael의 방법에 따라 세포 생존률을 측정하였다. 96 well plate에 세포주 RAW 264.7, B16F10, HaccaT cell 을 1 x 104 cells/well가 되도록 분주하고 incubator에서 37℃, 5% CO2 조건으로 24h 동안 배양시킨다. AIW, AIE, AIA를 각각 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 μg/mL 농도별로 희석 후 200 μL/well에 취하고 24h 동안 처리하였다. 그 뒤에 2.5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액을 20 μL/well로 첨가하여 3~4 h 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 100 μL/well으로 첨가하여 실온에서 10 min 간 반응 시킨 후 540 nm에서 흡광도를 통해 결과를 도출하였다.
Figure pat00007
Azadirachta indica에 의한 macrophage cell의 세포 생존율을 MTT assay를 통해 확인하였으며 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 것과 같이 농도별로 측정한 결과 농도 5, 10, 50, 100 μg/mL에서 AIW, AIE, AIA 모두 90% 이상의 생존율을 보였고 Western blot, Real-time PCR은 10, 50, 100 μg/mL 3개의 구간으로 설정하여 실험을 진행하였다.
3) Nitric oxide 생성 저해 효과 측정
Nitric oxide(NO) 측정은 세포의 상등액의 Nitric oxide(NO)의 양을 Nitrite and nitrate로 측정하였다. 96 well plate에 세포주 RAW 264.7을 4 × 104 cells/well이 되도록 분주하고 incubator에서 37℃, 5% CO2 조건으로 24h 동안 배양시킨다. 그 뒤에 배양액을 혈청 무첨가 DMEM 배지로 교환하고 Lipopolysaccharide (LPS)를 처치하여 염증 반응을 유도한다. 따라서 LPS 1 ppm/well 이 되도록 처리하고 각각의 시료용액을 농도별로 처리한 후 incubator에서 37 ℃, 5% CO2 조건으로 24 h 동안 배양시킨다. 그 뒤에 새로운 96 well plate에 세포 배양액을 100 μL 옮기고 griess reagent를 100 μL 첨가 하여 상온에서 5 min 동안 반응시킨 뒤에 540 nm 에서 흡광도를 측정하여 결과를 계산하였다.
Figure pat00008
Azadirachta indica에 의한 Macrophage cell인 RAW 264.7에서 Chitosan-Gluconate의 Nitric oxide의 억제 정도를 측정하기 위해 용매별, 농도별로 샘플을 처리하여 NO 양을 측정한 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 것과 같이 최고농도인 100 μg/mL에서 AIW, AIE, AIA 순으로 35.7%, 68.86%, 66.45% 의 저해효과를 보였다. 같은 농도일 때 AIE가 가장 많은 NO 저해활성을 나타내었다.
(3) Western blot을 통한 단백질 발현 측정
iNOS와 COX-2, Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MMP-1, Fillagrin 단백질 발현을 확인하기 위하여 6 well plate에 세포주 RAW 264.7, HacaT cell을 3 × 105 cells/well, B16F10 이 2 × 105 cells/well이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 h 동안 배양시킨다. 그 뒤에 배양액을 혈청 무첨가 DMEM 배지로 교환한 후 세포의 염증, 미백처리, 주름개선 반응을 유도하기 위하여 RAW 264.7은 lipopolysaccharide(LPS), B16F10 은 Alpha-Melanocyte-stimulating hormone(α-MSH)를 1 ppm/well 이 되도록 처리하고 각 시료용액을 농도별로 처리하고 incubator에서 37℃, 5% CO2 조건으로 24 h 동안 배양시킨다. HacaT cell은 무처리군을 제외한 모든 실험군은 PBS로 1회 세척한 후 PBS를 넣어 UV-B (300 mJ/cm2)를 조사하였다. 조사 후 시료용액을 농도별로 처리하고 24h~48h 동안 배양시킨다. 그 뒤에 배지를 제거 후 PBS로 1회 세척 하고 phosphatase 와 protease inhibitor를 각각 0.1% 함유시킨 RIPA 버퍼를 60 μL/well로 처리하여 세포를 용해시키고 원심분리기를 이용하여 4℃, 12,000 rpm에서 15 min 동안 원심분리 시키고 얻은 상층액을 새 튜브에 옮긴다. membrane은 Digital reciprocating shaker 기기를 이용하여 5% skim milk 2 h, Primary antibody 2 h, 1X TBST solution 10 min (Repeat 3 times), Secondary antibody 1 h, 1X TBST solution 10 min (Repeat 3 times) 순의 blocking 과정을 거친 다음 HRP substrate 발색시약으로 2 min 동안 반응시킨 후 western imaging system (CAS-400SM, Davinch-K Co., Ltd., Korea) 기기를 이용하여 밴드를 확인하고 정량 및 결과를 산출하였다.
Azadirachta indica가 iNOS, COX-2 에 미치는 영향을 보기 위해 LPS로 유도된 mouse macrophages cell (RAW 264.7)에 AIW, AIE, AIA 는 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리한 후 24hr 뒤에 회수하여 western blot을 통해 발현을 확인하였다. 대조군으로는 Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate(PDTC)를 사용하였다. House keeping gene으로는 β-actin을 사용하였다. 그 결과를 도 13 내지 15에 나타내었다.
도 13 내지 15에 나타난 것과 같이 AIE는 iNOS, AIA는 iNOS, COX-2 단백질의 발현 저해가 나타난 것을 확인 할 수 있었다.
(4) mRNA 분리 및 Real-time PCR 분석
6 well plate에 세포주 RAW 264.7, B16F10 및 HacaT cell을 3 × 105 cells/well이 되도록 분주하고 incubator에서 37℃, 5% CO2 조건으로 24 h 동안 배양시킨다. 그 뒤에 배양액을 혈청 무첨가 DMEM 배지로 교환한 후 세포의 염증 및 미백처리, 주름개선반응을 유도하기 위하여 RAW 264.7은 lipopolysaccharide(LPS), B16F10 은 Alpha-Melanocyte-stimulating hormone(α-MSH)를 1 ppm/well 이 되도록 처리하고 각 시료용액을 농도별로 처리한 뒤 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 h 동안 배양시킨다. HacaT cell은 무처리군을 제외한 모든 실험군은 PBS로 1회 세척한 후 PBS를 넣어 UV-B (300 mJ/cm2)를 조사하였다. 조사 후 시료용액을 농도별로 처리하고 24h~48h 동안 배양시킨다. 그 뒤에 배지를 제거 후 PBS로 1회 세척하고 그 뒤에 TRI-Solution을 1ml/well 이 되도록 첨가하여 세포를 완전히 용해시키고 새 튜브에 옮겨 상온에서 5 min 동안 배양한다. 그 후에 chloroform을 튜브 당 200 ml 첨가하여 강하게 vortex 시키고 다시 5 min 동안 배양시킨다. 그 뒤에 4℃에서 12000 rpm 으로 20 min 동안 원심분리 시키고 투명한 상층액 500 μL를 새 튜브에 옮긴다. 상층액에 Isopropyl alcohol 500 μL를 첨가하고 수회 inverting 시킨 다음 5 min 동안 배양시키고 4℃에서 12000 rpm 으로 20 min 동안 원심분리시켜 상등액을 제거한다. 바닥에 남은 펠렛은 75% ethanol 1 mL 로 세척 후에 완전히 건조시키고 50 μL의 DEPC water를 이용하여 용해시킨다. 그 뒤에 흡광도를 이용한 RNA 정량을 거치고 TProfessional basic thermocycler 기기를 이용하여 cDNA 합성하였다. 이후 power SYBR green PCR master mix 시약과 각각의 primer, cDNA를 사용하여 step one real-time pcr system 기기로 95℃ 10 sec, 60℃ 15 sec, 72℃ 20 sec 동안 반응하는 온도순환조건을 40회 반복실시하고 analysis program을 사용하여 정량 분석을 하였다. 실험에 사용한 sequence는 하기 표 3 에 나타내었다.
Gene Primer Sequencs(5’→3’)
iNOS Sense ACA TCG ACC CGT CCA CAG TAT
Antisense CAG AGG GGT AGG CTT GTC TC
TRP-1 Sense CCC CTA GCC TAT ATC TCC CTT TT　
Antisense TAC CAT CGT GGG GAT AAT GGC
GAPDH Sense TGA CCA CAG TCC ATG CCA TC
Antisense GAC GGA CAC ATT GGG GGT AG
Real-time PCR은 기존의 PCR보다 빠르게 측정이 가능하고 오염률이 적어 널리 이용된다. 앞선 Western blot 실험과 항산화 실험의 결과를 토대로 AIE가 가장 효능이 좋은 것을 확인하여 본 실험에서는 AIE를 선택하여 실험을 진행하였다. AIE를 Real-time PCR을 사용하여 iNOS의 mRNA 발현 억제률을 나타낸 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 것과 같이 AIE의 iNOS 발현 억제 효과는 최고농도인 100 μg/mL에서 97.49%의 억제 효과를 확인 할 수 있었다.
<실험예 6 - 에탄올 추출 님트리 잎 추출물의 미백 효능 측정>
(1) Melanoma cell(B16F10)의 세포독성 확인
Azadirachta indica 에 의한 Melanoma cell의 세포 생존율을 MTT assay를 통해 확인한 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 것과 같이 AIE 농도 2.5, 5, 10, 25 μg/mL에서 모두 85% 이상의 생존율을 보였고, Western blot은 상위 3개 구간으로 설정하여 실험을 진행 하였다.
(2) Western blot을 통한 TRP-1, TRP-2 및 Tyrosinase 발현 억제 확인
Melanin 생합성에 관여하는 Alpha-Melanocyte-stimulating hormone(α-MSH)는 cAMP 경로를 활성화 시키는 melanocortin-1 receptor (MC1R)가 관련되어 melanin 합성을 조절하는데, 세포에서 cAMP가 계속 늘어날 때 PKA(cAMP-dependent protein kinase or protein kinase A)가 CREB(cAMP Response Element Binding Protein)을 인산화 시켜서 Tyrosinase 유전자 발현을 유도시키는 MITF 발현을 증가시켜 준다. 님트리 추출물이 melanin의 생성에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위해 멜라닌 형성에 영향을 미치는 인자들 (TRP-1, TRP-2, Tyrosinase)를 Western blot 실험을 통해 확인하였으며 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타난 것과 같이 멜라닌 형성 억제 관련 실험 결과 AIE는 α-MSH에 의해 유도된 최고농도 10 μg/mL에서 TRP-1은 36.35%의 저해율을 보였으며 나머지 인자인 TRP-2와 Tyrosinase는 억제하지 못하는 것으로 판단된다.
(3) Real-time PCR을 통한 TRP-1 발현 억제 확인
AIE를 Real-time PCR을 사용하여 TRP-1의 mRNA 발현 억제률을 나타내었으며 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타난 것과 같이 AIE의 TRP-1 발현 억제 효과는 최고농도인 10 μg/mL에서 87.43%로 대조군인 Albutin 농도 100 μg/mL에서 14.86%보다 높은 억제 효과를 확인 할 수 있었다.
<실험예 7 - 에탄올 추출 님트리 잎 추출물의 주름개선 효능 측정>
(1) Human keratinocyte cell(HacaT)의 세포독성 확인
Azadirachta indica 에 의한 Human keratinocyte cell의 세포 생존율을 MTT assay를 통해 확인한 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20에 나타난 것과 같이 AIE 농도 1, 2.5, 5, 10, 25 μg/mL에서 농도 10 μg/mL까지 90%이상의 생존율을 보였고, Western blot은 2.5, 5, 10 μg/mL 3개 구간으로 설정하여 실험을 진행 하였다.
(2) Western blot을 통한 MMP-1, Filaggrin 단백질 발현 확인
MMPs는 피부의 섬유아세포, 각질형성세포를 비롯하여 많은 세포들로부터 분비되며, 현제까지 약 20여종의 종류가 있다고 알려져 있다. MMP-1은 Collagenase 1 로 알려져 있으며, 콜라겐 type-I과 3을 기질로 한다. Profilaggrin 이라고 불리는 전구체는 각질층 각질형성세포의 주요 특징인 케라티노 히알린 과립으로 알려진 세포이며 이것은 체내에 축적된다. 본 실험에서는 MMP-1과 Filaggrin 단백질 발현 확인을 하여 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타난 것과 같이 AIE는 최고농도인 10 μg/mL에서 MMP-1은 9.93%의 억제율을 보였으며, Filaggrin에서는 32.52%의 보습효과를 가진 것을 확인 할 수 있었다.
<실험예 8 - 피커링 에멀전 제조 및 안정성 측정>
(1) 피커링 에멀전 제조 원료
피커링 에멀전(Pickering emulsion) 제형의 첨가상은 코팅처리가 되지 않은 Silica (Silica silylate, CABOT)를 사용하였다. 수상은 보습제로 Glycerin (Vegetable Glycerin, LG H&H), 1,3-BG (1,3-Butylene Glycol, Cosnet), Propandiol (1,3-Propanediol, USA)을 사용하였다. 항산화제로 Vitamin C (L-ascorbic acid, DAEJUNG)을 사용하였다. 방부제로 Hexanediol (1,2-Hexanediol, K1 Solution), Ethylhexylglycerin (Ethylhexylglycerin, K1 Solution)을 사용하였다.
(2) 피커링 에멀젼 제조
기중수형 에멀젼(W/A emulsion) 의 제조는 하기 표 4에 따라 수상을 계량 후 파우더 형태인 Silica Silylate를 분쇄기에 넣고 15,500 rpm 으로 1분간 분쇄한 다음, 비커에 옮겨담고 Agi mixer로 500 rpm 3분간 처리하여 파우더에센스 형태의 피커링 에멀젼을 제조하였다(도 22).
Material Name Contents(wt%)
Water phase Water 53.4
Moisturizers
(Glycerin(4)/1,3-BG(3)/Propandiol(1))		 30.0
L-ascorbic acid 10.0
Additive
phase		 Silica silylate 5.00
Azadirachta indica(AIE, 10% solution) 1.00
1,2-hexanediol 0.30
L-arginine 0.30
Total 100
본 실시예는 보습제와 pH 조절, L-ascorbic acid의 함량에 따라 피커링 에멀젼이 가장 잘 형성된 함량을 선택하여 제조하였다. 피커링 에멀젼은 Silica 성분이 수상에 둘러싸여 공기를 막아주고 안정성을 더욱 높여준다. 따라서 피커링 에멀젼의 복합보습제와 L-ascorbic acid의 함량으로 산화 안정성에 중요한 역할을 한다고 알 수 있다. 이하의 실험예에서는 각각의 원료의 배합에 따른 액정 형정을 확인해 보았다.
(3) 보습제(Glycerin) 함량에 따른 제형 변화
보습제로 사용된 Glycerin의 함량에 따른 파우더 형성을 확인해 보았다. 하기 표 5와 같이 Glycerin 함량을 10% 씩 70%까지 증가시켜가며 사용한 제형 변화 결과를 도 23에 나타내었으며, 도 23에 나타난 것과 같이 파우더 형성을 하기에 70% 까지 Glycerin을 첨가하여도 제형이 양호한 것을 확인할 수 있었다.
Phase Material Name Contents(wt%)
A B C D E F G H
Water phase Water to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100
Glycerin 0 10 20 30 40 50 60 70
1,3-BG
Propandiol
Additive phase Silica Silylate 5 5 5 5 5 5 5 5
Total 100 100 100 100 100 100 100 100
(4) 보습제(1,3-Butylene Glycol) 함량에 따른 제형 변화
보습제로 사용된 1,3-Butylene glycol (1,3-BG)의 함량에 따른 파우더 형성을 확인해 보았다. 표 6과 같이 1,3-BG 함량을 10% 씩 40%까지 증가시켜가며 사용한 제형 변화 결과를 도 24에 나타내었으며, 도 24에 나타난 것과 같이 파우더 형성을 하기에 30% 까지 1,3-BG를 첨가하여도 제형이 양호한 것을 확인할 수 있었다.
Phase Material Name Contents(wt%)
A B C D
Water phase Water to 100 to 100 to 100 to 100
Glycerin
1,3-BG 10 20 30 40
Propandiol
Additive phase Silica Silylate 5 5 5 5
Total 100 100 100 100
(5) 보습제(Propandiol) 함량에 따른 제형 변화
보습제로 사용된 Propandiol의 함량에 따른 파우더 형성을 확인해 보았다. 표 7과 같이 Propandiol 함량을 10% 씩 50%까지 증가시켜가며 사용한 제형 변화 결과를 도 25에 나타내었으며, 도 25에 나타난 것과 같이 파우더 형성을 하기에 40% 까지 Propandiol를 첨가하여도 제형이 양호한 것을 확인할 수 있었다.
Phase Material Name Contents(wt%)
A B C D E
Water phase Water to 100 to 100 to 100 to 100 to 100
Glycerin
1,3-BG
Propandiol 10 20 30 40 50
Additive phase Silica Silylate 5 5 5 5 5
Total 100 100 100 100 100
(6) 복합 보습제 함량에 따른 TEWL 수분증발 측정 결과
보습제로 사용된 Glycerin, 1,3-Butylene glycol, Propandiol의 함량을 표 8과 같이 섞은 후 A, B, C, D 로 파우더 형성을 확인해 보았다. 도 26에 나타난 것과 같이 TEWL 수분증발 측정계를 이용하여 경피 수분 손실량의 차이를 보았을 때 대조군으로 사용된 물보다 4h 뒤의 수분 손실량을 봤을 때 A, B, C, D 순으로 15.93 , 4.06, 18.86, 12.6 g/m2/h 로 낮은 손실량을 나타내었고, 복합 보습제 C가 가장 보습력이 좋은 것을 확인하여 이후 실험에서 복합보습제 C를 사용하여 진행하였다.
Phase Material Name Contents(wt%)
A B C D
Water phase Water to 100 to 100 to 100 to 100
Moisturizers (Glycerin:1,3-BG: Propandiol) 30
(1:2:1)		 30
(1:5:1)		 30
(4:3:1)		 30
(1:7:1)
Additive phase Silica Silylate 5 5 5 5
Total 100 100 100 100
(7) pH에 따른 제형 변화
Citric acid 와 L-argigine을 이용하여 표 9에 나타낸 것과 같이 수상의 pH를 3∼10까지 맞추어 pH에 따라 Silica의 Pickering emulsion 제형이 형성되는지 확인하여 도 27에 나타내었다. 그 결과 도 27에 나타난 것과 같이 pH 3∼9까지 emulsion이 형성되었고 pH10 에서는 벽면에 제형이 묻어나는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 pH 범위를 3∼9로 정하여 다음 실험을 진행하였다.
Phase Material Name Contents(wt%)
pH3 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10
Water phase Water to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100
Additive phase Silica Silylate 5 5 5 5 5 5 5 5
Total 100 100 100 100 100 100 100 100
(8) L-ascorbic acid 원료의 pH 함량에 따른 제형 변화
L-ascorbic acid를 1% 로 계량하여 수상의 pH 를 각각 측정하여 표 10과 같이 A는 pH 측정값이 2.98 이고, B는 L-argigine을 이용하여 pH 값을 조절하여 6.5로 맞춘 다음 45℃ 챔버에 일주일 방치 후 측정한 결과를 도 28에 나타내었다. 도 28에 나타난 것과 같이 B는 안정성이 깨진 것을 확인 하였고 A는 첫 번째 날과 비교했을 때 비슷한 결과를 나타낸 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 다음 실험에서 L-ascorbic acid를 넣은 후 pH를 2∼4 로 맞추어 실험을 진행 하였다.
Phase Material Name Contents(wt%)
A B
Water phase Water to 100 to 100
Moisturizers (Glycerin(4), 1,3-BG(3), Propandiol(1)) 30 30
L-ascorbic acid 1 1
Additive phase Silica Silylate 5 5
Total 100 100
pH 2.95 6.5
(9) L-ascorbic acid 함량에 따른 제형 변화
L-ascorbic acid (비타민 C)의 함량에 따른 제형의 변화를 확인 해보기 위해 실험을 진행하였다. 표 11에 나타낸 것과 같이 L-ascorbic acid 함량을 2.00%, 5.00%, 10.00%, 15.00%로 증가시켜가며 사용한 결과 도 29에 나타난 것과 같이 파우더 형성을 하기에 10%까지 첨가하더라도 제형이 안정적인 것을 확인할 수 있다.
Phase Material Name Contents(wt%)
A B C D
Water phase Water to 100 to 100 to 100 to 100
Moisturizers(Glycerin, 1,3-BG, Propandiol) 30 30 30 30
1,2-Hexandiol 0.3 0.3 0.3 0.3
L-argigine 0.3 0.3 0.3 0.3
L-ascorbic acid 2 5 10 15
Additive phase Silica Silylate 5 5 5 5
Total 100 100 100 100
(10) 온도와 시간에 따른 pH 측정
피부에서 pH는 피부의 피지막을 측정하여 나타나는데 대체적으로 약산성 범위를 가지고 있다. 그러나 이러한 범위를 벗어나게 되면 피부에 미생물 증식이 활발해지고 자극, 감염, 가려움 등을 유발할 수 있다. 따라서 화장품의 pH는 이러한 범위 내에서 제조하고 또한 유지되어야 할 필요가 있다. 표 4에 나타낸 조성으로 제조된 피커링 에멀젼 조성물의 pH 변화를 측정하기 위해 60일 동안 25℃와 암실의 조건을 유지시키며 확인하였으며 그 결과를 도 30 및 표 12에 나타내었다.
Pickering emulsion pH
0 Day 3.6
3 Day 3.5
7 Day 3.5
14 Day 3.4
21 Day 3.7
28 Day 3.7
1 Month 3.8
(11) 온도와 시간에 따른 상변이 측정
표 4에 나타낸 조성으로 제조된 피커링 에멀젼 조성물의 상변이, 변질 및 분리 등 안정성을 측정하기 위해 60일 동안 0℃, 25℃, 45℃ 의 조건을 유지시키면서 확인하였으며 그 결과를 표 13에 나타내었다. 측정한 결과 45℃에서는 L-ascorbic acid의 안정성이 깨지면서 노란색 파우더로 변하여 안정하지 못한 것을 확인하였으며 나머지 온도인 0℃, 25℃에서는 흰색파우더 형태를 유지한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 온도가 높으면 제형에 안정성이 깨질 수 있다는 것을 확인 하였다.
Pickering emulsion 0℃ 25℃ 45℃
0 Day ○ ○ ○
3 Day ○ ○ ○
7 Day ○ ○ ×
14 Day ○ ○ ×
21 Day ○ ○ ×
28 Day ○ ○ ×
1 Month ○ ○ ×
전술한 각 실시예에서 예시된 특징, 구조, 효과 등은 실시예들이 속하는 분야의 통상의 지식을 가지는 자에 의하여 다른 실시예들에 대해서도 조합 또는 변형되어 실시 가능하다. 따라서 이러한 조합과 변형에 관계된 내용들은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (21)

  1. 열수, 에탄올 또는 아세톤을 이용하여 추출되어 님트리(Azadirachta indica) 잎의 유효성분을 포함하여 여드름 개선, 미백 및 주름개선 효능을 갖는 님트리 잎 추출물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 열수를 이용하여 추출된 님트리 잎 추출물은 DPPH radical 소거능 및 ABTS+ radical 소거능을 갖는 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 에탄올을 이용하여 추출된 님트리 잎 추출물은 SOD 유사활성능 및 Superoxide anion radical 소거능을 갖는 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 아세톤을 이용하여 추출된 님트리 잎 추출물은 70 mg/g 이상의 폴리페놀 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 님트리 잎 추출물은 Propionibacterium acnes 균에 대한 생육 저해능을 갖는 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 에탄올 또는 아세톤을 이용하여 추출된 님트리 잎 추출물은 Staphylococcus aureus 균 및 Propionibacterium acnes 균에 대한 생육 저해능을 갖는 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 님트리 잎 추출물은 Tyrosinase 저해활성을 갖는 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 에탄올 또는 아세톤을 이용하여 추출된 님트리 잎 추출물은 1,000 μg/mL 농도에서 Tyrosinase 저해활성율이 45% 이상인 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 님트리 잎 추출물은 Elastase 저해활성을 갖는 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 에탄올 또는 아세톤을 이용하여 추출된 님트리 잎 추출물은 1,000 μg/mL 농도에서 Elastase 저해활성율이 20% 이상인 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 님트리 잎 추출물은 Macrophage cell에서 90% 이상의 생존율을 보이며 NO 저해활성을 나타내고, iNOS 및 COX-2 단백질 발현 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 에탄올 또는 아세톤을 이용하여 추출된 님트리 잎 추출물은 100 μg/mL 농도에서 NO 저해활성율이 65% 이상인 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물.
  13. 건조된 님트리(Azadirachta indica) 잎의 중량 8 내지 12배의 열수에 침지시킨 후 90 내지 110℃에서 3 내지 5 시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물 제조방법.
  14. 60 내지 80% 에탄올 또는 아세톤 용액을 용매로 이용하며, 건조된 님트리 잎의 중량 8 내지 12배의 에탄올 또는 아세톤 용액에 침지시킨 후 상온에서 20 내지 30 시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 님트리 잎 추출물 제조방법.
  15. 열수, 에탄올 또는 아세톤을 이용하여 추출되어 님트리(Azadirachta indica) 잎의 유효성분을 포함하는 님트리 잎 추출물을 포함하여 여드름 개선, 미백 및 주름개선 효능을 갖는 피커링 에멀젼 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 피커링 에멀전 조성물은 님트리 잎 추출물, 첨가상, 수상 및 첨가제를 포함하고,
    상기 님트리 잎 추출물은 열수 추출된 님트리 잎 추출물, 에탄올 추출된 님트리 잎 추출물 또는 아세톤 추출된 님트리 잎 추출물을 포함하며,
    상기 첨가상은 탄산칼슘, 실리카, 점토, 라포나이트, 흑연, 라텍스, 자분(magnetic particle) 및 탄소나노튜브(CNT)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함하고,
    상기 수상은 물 및 보습제를 포함하며,
    상기 첨가제는 항산화제, 보습제 및 pH 조절제로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 피커링 에멀젼 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 님트리 잎 추출물은 피커링 에멀젼 조성물 전체 중량부에 대하여 0.5 내지 5 중량% 포함되고,
    상기 첨가상은 피커링 에멀젼 조성물 전체 중량부에 대하여 1 내지 10 중량% 포함되며,
    상기 수상은 75 내지 95 중량% 포함되고,
    상기 첨가제는 2.2 내지 12 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 피커링 에멀젼 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 수상 전체 중량부에 대하여 상기 물은 50 내지 80 중량% 포함되고, 상기 보습제는 20 내지 50 중량% 포함되며,
    상기 보습제는 글리세린(Glycerin), 1,3-부틸렌 글리콜(1,3-Butylene Glycol), 소르비톨(Sorbitol), 에틸렌글리콜(Ethylene glycol) 및 프로판디올(Propandiol) 로 구성되는 군에서 선택되는 어느 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 피커링 에멀젼 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 보습제는 글리세린(Glycerin), 1,3-부틸렌 글리콜(1,3-Butylene Glycol) 및 프로판디올(Propandiol)을 3.5~4.5:2.5~3.5:0.5~1.5 비율로 혼합하여 수상 전체 중량부에 대하여 30 내지 40 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 피커링 에멀젼 조성물.
  20. 제15항에 있어서,
    상기 피커링 에멀젼 조성물의 pH는 2 내지 4인 것을 특징으로 하는 피커링 에멀젼 조성물.
  21. 열수 추출된 님트리 잎 추출물, 에탄올 추출된 님트리 잎 추출물 또는 아세톤 추출된 님트리 잎 추출물을 포함하는 님트리 잎 추출물, 첨가상, 수상 및 첨가제를 포함하는 조성물을 10,000rpm 내지 20,000rpm 으로 30초 내지 5분간 분쇄 처리한 후 300 내지 800rpm 으로 1 내지 5분간 혼합 처리하는 것을 특징으로 하는 피커링 에멀젼 조성물 제조방법.
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