JP2015111123A - 血液凝固分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】装置の複雑化を招くことなく検体ごとの散乱光の強度に応じて適切な検出角度を選択することで血液凝固分析におけるダイナミックレンジ確保と高感度化を両立する血液凝固分析装置を提供する。【解決手段】試料と試薬を混合し反応させる反応容器101と、反応容器101に光を照射する光源102と、反応容器101周辺に光源102の光軸に対し異なる角度で配置され試料と試薬の混合液から発せられる散乱光を検出する複数の検出器103a、103bと、検出器103a、103bから得られる複数の経時的な光強度変化データを取り込み記憶する記憶部107と、記憶部107に保管された各々の光強度変化データから光強度変化量に基づき血液凝固時間の算出に用いる光強度変化データを選択する判断部106と、判断部106により選択された光強度変化データから血液凝固時間を算出する演算部108を備える。【選択図】図１

Description

本発明は、血漿と血液凝固試薬を混合してフィブリンを析出させ、光学的手段を用いて血液凝固時間を測定する血液凝固分析装置に関する。

血液は血管内部では流動性を保持して流れているが、一旦出血すると、血漿や血小板中に存在する凝固因子が連鎖的に活性化され、血漿中のフィブリノーゲンがフィブリンに変換され析出することで止血に至る。

このような、血液凝固能には組織内出血を止血する内因性のものと、外傷等による出血を止血する外因性のものが存在する。血液凝固能に関する測定項目としては、外因系血液凝固反応検査のプロトロンビン時間（ＰＴ）、内因系血液凝固反応検査の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）と、フィブリノーゲン量（Ｆｂｇ）等が存在する。これらの項目は、いずれも凝固を開始させる試薬を添加することにより析出するフィブリンを、光学的、物理的、電気的手法で検出することによっている。

光学的手段を用いる方法としては、反応液に光を照射し、反応液中に析出してくるフィブリンを散乱光や透過光の経時的な強度変化をとらえることで、フィブリンが析出し始める時間を算出する方法が知られている。

光学的手法を用いた場合、試料中の干渉物質（ヘモグロビン、ビリルビン、乳び）の影響が無視できず、これらの影響をいかに排除するか努力がなされていた。
たとえば特許文献１記載の技術によると、複数の波長の光を照射し、被測定検体に応じ干渉物質の影響の少ない波長のデータを選択して凝固時間の算出に用いる技術が開示されている。

また、特許文献２記載の、単一レーザ光源の光軸に対して異なる角度の複数の光散乱強度を測定する技術がある。

特開２００７−２６３９１２号公報 特開昭５８−１７２５３７号公報

特許文献１記載の技術では、複数の波長の光を準備するために機構が複雑にならざるを得ず、シンプルで信頼性が高く、かつ製造コストを抑えた装置を作り上げることは困難である。

また、特許文献２記載の技術は、それぞれの検出器は血液凝固分析やラテックス試薬等による抗原抗体反応分析に最適化されたもので、１台の装置で血液凝固分析と抗原抗体反応の測定を実現することに主眼が置かれており、それ以上の効果については言及されていない。

さらに、血液凝固分析におけるダイナミックレンジ確保と高感度化を両立する技術として、測定初期の光量により、アンプ倍率を切り替えるという手段も考えられる。しかしながら、光検出を用いた凝固時間測定では、乳び等の影響により初期の散乱光量が大きかったとしても、凝固能が小さい検体や大きい検体があり得ることや、異常検体などは2段反応のような凝固曲線を描く例もあるため、切り替えの判断を測定初期に行なうことは、事実上不可能である。

また、複数の倍率で同時にデータを取得し、反応終了後に分析に使用する光強度変化データを選択するという方法も考えられるが、アンプ倍率の変更のみでは測定感度までをコントロールすることはできないため、本願のように感度の異なる２角度の光強度変化データを同時に取得する技術とは全く異なる。

以上の課題を鑑みて本発明の目的は、装置の複雑化を招くことなく、検体ごとの散乱光の強度に応じて、適切な検出角度を選択することで、血液凝固分析におけるダイナミックレンジ確保と高感度化を両立する血液凝固分析装置を提供することにある。

前記目的を達成するための本発明の構成は以下のとおりである。

試料と試薬を混合し反応させるための反応容器と、前記反応容器に光を照射するための光源と、前記反応容器周辺に前記光源の光軸に対し異なる角度で配置され試料と試薬の混合液から発せられる散乱光を検出する複数の検出器と、前記検出器から得られる複数の経時的な光強度変化信号を取り込み記憶する記憶部と、前記記憶部に保管された各々の光強度変化データから光強度変化量に基づき血液凝固時間の算出に用いる光強度変化データを選択する判断部と、前記判断部により選択された光強度変化データから血液凝固時間を算出する演算部を備えた血液凝固分析装置。

本発明によれば、検体ごとの血液凝固能の違いや、干渉物質の影響を緩和して信号検出のダイナミックレンジを確保でき、また、信号量が小さい検体に対してもより大きな信号量にて高感度で再現性の良い分析が実現可能な血液凝固分析装置を提供できる。

本発明における、血液凝固分析装置の概略を示す図。 本発明の一実施例における、血液凝固分析のフローチャートを示す図。 本発明の一実施例において、標準レベルの凝固能を有する検体のプロトロンビン時間測定の光強度変動実データを示す図。 本発明の一実施例における、標準レベルの凝固能を有する検体を１６倍に希釈したサンプルのプロトロンビン時間測定の光強度変動実データを示す図。 本発明の一実施例における、もう１つの実施形態を示す図。 本発明の一実施例における、光強度変動データの概略を示す図。

以下、図面を用いて本発明の実施の形態について説明する。

図１に本発明を実施する血液凝固分析装置の概略を示す。図示していない試料分注機構により試料が光学的に透明な反応容器１０１に分注され、その後に図示していない試薬分注機構により当該反応容器１０１に試薬が分注される。

単一波長光源１０２（ＬＥＤ、レーザ等）から反応容器１０１内の試料と試薬の混合液に光が照射され、当該混合液からの散乱光を予め優先順位がつけられた複数の検出器１０３ａ〜１０３ｂ（フォトダイオード、フォトトランジスタ等）により受光される。本実施例において、検出器１０３ａ〜１０３ｂは単一波長光源１０２の光軸を含む水平平面上に配置することとし、光軸と一致する方向を０°とする。

つまり、光軸に対して４５°とは、４５°方向の前方散乱光が検出できることを意味する。検出器１０３ａ〜１０３ｂにより受光された光は光電流に変換され、増幅部１０４により増幅され、Ａ／Ｄ変換部１０５によりアナログ信号からデジタル信号に変換されて、判断部１０６を経由して経時的な光強度変動データとして記憶部１０７に保存される。

保存された検出器１０３ａ〜１０３ｂからの光強度変動データは、後述する判断手順に従い、判断部１０６により検出器１０３ａ〜１０３ｂからのいずれの光強度変動データを血液凝固時間の算出に使用するかが判断されて、選択された光強度変動データが演算部１０８に送信される。演算部１０８は当該光強度変動データから血液凝固時間を算出し、制御部１０９に結果が送信され、制御部１０９は出力部１１０に結果を出力する。

血液凝固時間の算出方法としては、光強度変動データがある一定量になる時点までの時間をもって凝固時間とする方法、光強度変動データを微分し経時的に変化する光強度変動データの微分値が最大となる時点の時間をもって血液凝固時間とする方法、光強度変動データの微分値が最大となる時点の１／Ｎに相当する時点までの時間をもって凝固時間とする方法等が知られているが、いずれも光強度変化を捉えて凝固時間を算出しており、光強度の絶対量が直接凝固時間に影響するものではない。

したがって、本実施例においても、配置角度が異なることにより光の強度の絶対値が異なっていたとしても、適切に光強度変動データが得られていれば、血液凝固時間は実用上同一のものとして扱うことができる。

図２に本実施例における血液凝固分析のフローチャートを示す。本実施例においては、２方向の検出器１０３ａと１０３ｂについて説明することとし、優先順位の高い第１検出器を光軸に対して９０°方向の検出器１０３ａ、優先順位の低い第２検出器を光軸に対して４５°方向の検出器１０３ｂを設定する。このとき、優先順位の高い第１検出器の信号は優先順位の低い第２検出器の信号に比べ、(1)信号が安定している（ノイズが少ない）、(2)信号ベースレベルが低い（試薬ブランク信号レベルが低い）という判断基準で設定する。

試料と試薬が分注された反応容器１０１に単一波長の光源１０２から光が照射され、試料と試薬の混合液から発せられる散乱光は、前記第１検出器１０３ａおよび第２検出器１０３ｂにより受光され、光電流に変換され、増幅部１０４に送られる。光電流は、増幅部１０４により増幅され、Ａ／Ｄ変換部１０５によりデジタル信号に変換され、散乱光強度変動データとして判断部１０６を介して記憶部１０７に保存される。このとき、判断部１０６は、第１検出器１０３ａおよび第２検出器１０３ｂからの信号が、設定された信号強度上限値Ｓｍａｘ以下であることを確認しながら、記憶部１０７に送信する。フィブリン析出開始を検出後に反応が飽和し、予め設定された一定時間（例えば１０秒間）いずれかの検出器からの信号が予め設定された信号変化率ΔＳｆｉｎ以下なったときに血液凝固反
応が終了したとして、散乱光測定を終了する。このとき、測定終了までに第１検出器１０３ａおよび第２検出器１０３ｂからの信号が、ともに信号強度上限値Ｓｍａｘを予め設定された一定時間（例えば３秒間）連続で超えたことを判断部１０６が検出した場合、即時、測定を終了し、制御部１０９に希釈再検依頼のフラグを送信する。

少なくとも一方の検出器の信号が信号強度上限値Ｓｍａｘ以下の場合は、測定終了もしくは予め設定した最長測定時間Ｔｌｉｍ（例えば３００秒）まで、測定を継続する。測定が終了したら、判断部１０６は第１検出器１０３ａからの信号の信号ベースレベルからの信号変化量が予め設定された最低信号強度変化量ΔＳｍｉｎ以上かチェックする。最低信号強度変化量ΔＳｍｉｎ以上であった場合、その散乱光強度変動データを演算部１０８に送信し、血液凝固時間を算出する。また、第１検出器１０３ａからの信号が最低信号強度変化量ΔＳｍｉｎ以下であった場合に、第２検出器の信号のチェックに移行する。第２検出器１０３ｂの信号の信号ベースレベルからの信号変化量が最低信号強度変化量ΔＳｍｉｎ以上であった場合、その散乱光強度変動データを演算部１０８に送信し、血液凝固時間を算出する。また、第２検出器１０３ｂからの信号が、最低信号強度変化量ΔＳｍｉｎ以下であった場合に、判断部１０６は制御部１０９に測定不能のフラグを送信する。上記、血液凝固時間、希釈再検依頼フラグ、測定不能フラグは制御部１０９から出力部１１０に送信され、出力される。

図３は、実際に取得した標準レベルの凝固能を有する検体のプロトロンビン時間測定の光強度変動データである。第２検出器１０３ｂの信号は信号強度上限値Ｓｍａｘを超えているが、第１検出器１０３ａの信号は、乳び等の干渉物質よる信号ベースレベルの上昇に対して余裕があることがわかる。第１検出器１０３ａの信号を測定に使うことで信号検出のダイナミックレンジを確保できる。

また、図４は標準レベルの凝固能を有する検体を１６倍に希釈したサンプルのプロトロンビン時間測定の光強度変動データである。第１検出器１０３ａの信号強度変化量は小さく血液凝固時間の算出が困難であるが、第２検出器１０３ｂの信号強度は第１検出器１０３ａの２倍程度あり、血液凝固時間の算出が容易であることがわかる。

また、本実施例において、優先順位の高い第１検出器の光路が試薬の吐出で発生した気泡等により阻害されたり、または電気的ノイズ等の影響で信号が正常に得られず、血液凝固時間の算出が困難で、かつ第２検出器からの信号がそれらの影響を受けていない場合に、第２検出器からの信号を用いて血液凝固時間の算出を行なっても良い。

図５に本発明の別の実施形態を示す。予め優先順位がつけられた複数の単一波長光源５０２ａ〜５０２ｂが反応容器１０１周辺部に配置され、それぞれの単一波長光源は必要十分に短い点滅間隔（例えば、１００ｍｓ）にて交互に点滅し、これらの点滅光源に対しある角度をもって設置された単一の検出器５０３があり、試料と試薬の混合液に光が照射され、当該混合液からの散乱光を受光する。本実施例において、単一波長光源５０２ａ〜５０２ｂを光軸を含む水平平面上に配置することとし、検出器５０３と反応容器１０１の中心を結ぶ方向を０°とする。つまり、４５°方向の単一波長光源５０２ｂによる散乱光により、４５°方向の前方散乱光が検出できることを意味する。交互に点滅する単一波長光源５０２ａ〜５０２ｂよる散乱光は、単一の検出器５０３により一括して受光され、受光された光は光電流に変換され、増幅器１０４により増幅され、Ａ／Ｄ変換部１０５によりアナログ信号からデジタル信号に変換されて、判断部１０６を経由して経時的な光強度変動データとして記憶部１０７に保存される。

図６に本実施例における光強度変動データの概略図を示す。保存された光強度変動データは、判断部１０６により光源ごとの信号に分割され、前記の実施例と同様の判断手順に従い、判断部１０６によりいずれの光源による光強度変動データを血液凝固時間の算出に使用するかが判断されて、選択された光強度変動データが演算部１０８に送信される。演算部は当該光強度変動データから血液凝固時間を算出し、制御部１０９に結果が送信され、制御部１０９は出力部１１０に結果を出力する。

また、図１、図５に示す実施例では、単一波長光源は３２０ｎｍ〜１０００ｎｍの波長から適宜の波長を選択して単一波長の光源を使用することが可能である。但し、ビリルビンやヘモグロビン等の干渉物質による影響を避けるためには、６００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長を選択すればよい。検出する粒子の大きさと粒子数密度が同等の場合、光源波長が短い方が散乱しやすいことが知られており、５０２ａを長波長光源、５０２ｂを短波長光源とすることで、信号検出のダイナミックレンジ拡大と検出感度向上をさらに進めることができる。

また、５０２ａを短波長光源、５０２ｂを長波長光源とすることで、それぞれの弱点を補うような構成にすることも考えられる。

また、図５に示す実施例の光源を一つとし、光量を高速で切り替え制御することで第１光源、第２光源とすることが可能である。

また、図１、図５に示す実施例では、検出器および光源は水平方向配置であるが、縦方向配置にすることも可能である。

なお、上記実施例は血液凝固分析装置に関するものであるが、ラテックス凝集法や免疫比濁法などの抗原抗体反応分析にも応用可能である。

１０１…反応容器
１０２…単一波長光源
１０３ａ〜１０３ｂ…検出器
１０４…増幅部
１０５…Ａ／Ｄ変換部
１０６…判断部
１０７…記憶部
１０８…演算部
１０９…制御部
１１０…出力部
５０２ａ〜５０２ｂ…単一波長光源
５０３…検出器

Claims (8)

1. 試料と試薬を混合し反応させるための反応容器（１０１）と、前記反応容器（１０１）に光を照射するための互いに異なる角度で配置される複数の単一波長の点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）と、前記反応容器（１０１）周辺に配置され試料と試薬の混合液から発せられる散乱光を検出する単一の検出器（５０３）と、前記検出器（５０３）から得られる経時的な光強度変化データを取り込み記憶する記憶部（１０７）と、前記記憶部（１０７）に保管された光強度変化データから血液凝固時間を算出する演算部（１０８）を備えた血液凝固分析装置において、
   前記複数の点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）が互いに発光タイミングが重ならないように点滅することを特徴とする血液凝固分析装置。
2. 請求項１記載の血液凝固分析装置において、
   前記記憶部（１０７）に保管された光強度変化データから前記点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）ごとのデータを分離し、光強度変化量に基づき血液凝固時間の算出に用いる光強度変化データを選択する判断部（１０６）を備えることを特徴とする血液凝固分析装置。
3. 請求項２記載の血液凝固分析装置において、
   前記点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）に予め優先順位が設定されており、優先順位の高い点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）の光強度変化データの変化量が予め設定された閾値以下の場合、次の優先順位の点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）の光強度データを血液凝固時間の算出に用いることを特徴とする血液凝固分析装置。
4. 請求項３記載の血液凝固分析装置において、
   前記優先順位の高い点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）の波長が、前記次の優先順位の点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）の波長より長波長であることを特徴とする血液凝固分析装置。
5. 請求項３記載の血液凝固分析装置において、
   前記優先順位の高い点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）の波長が、前記次の優先順位の点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）の波長より短波長であることを特徴とする血液凝固分析装置。
6. 請求項３記載の血液凝固分析装置において、
   前記点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）で優先順位の高い点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）の光強度変化データがノイズ等の影響で血液凝固時間の算出が困難な場合に、次の優先順位の検出器からのデータを血液凝固時間の算出に用いることを特徴とする血液凝固分析装置。
7. 請求項４記載の血液凝固分析装置において、
   前記点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）で優先順位の高い点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）の光強度変化データがノイズ等の影響で血液凝固時間の算出が困難な場合に、次の優先順位の検出器からのデータを血液凝固時間の算出に用いることを特徴とする血液凝固分析装置。
8. 請求項５記載の血液凝固分析装置において、
   前記点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）で優先順位の高い点滅光源（５０２ａ、５０２ｂ）の光強度変化データがノイズ等の影響で血液凝固時間の算出が困難な場合に、次の優先順位の検出器からのデータを血液凝固時間の算出に用いることを特徴とする血液凝固分析装置。

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