JP2015070856A - ペントース糖の発酵 - Google Patents

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Abstract

【課題】アルコール発酵ができ、炭素源としてキシロースを利用できる酵母を提供する。
【解決手段】嫌気性菌から得られる真核生物性キシロース異性化酵素をコードする核酸配列で形質転換した宿主細胞であり、発現したときにキシロース異性化酵素をコードする配列は、キシロースをキシルロースに変換する能力を宿主細胞に付与し、それは宿主細胞によりさらに代謝される。従って、宿主細胞は、炭素源としてのキシロースに対して増殖することができる。宿主細胞は酵母または糸状菌のような真核性微生物であることが望ましい。さらにエタノールのような発酵産物の生産プロセスに関し、そのプロセスにおいて、該宿主細胞は増殖及び発酵産物の生産のためにキシロースを利用できる。
【選択図】なし

Description

本発明は、真核生物性キシロース異性化酵素をコードする核酸配列で形質転換した宿主細胞に関するものである。このキシロース異性化酵素は、宿主細胞で発現し、キシロースをキシルロースに変換する能力を付与する。この宿主細胞は、ペントース含有培地の発酵によるエタノール及びその他の発酵産物の製造プロセスに使用される。さらに本発明は、真核生物性キシロース異性化酵素をコードする核酸配列に関するものである。
この数十年間における古典的化石燃料（石油燃料）の大量消費は、高レベルの汚染の原因となっている。さらに、世界中の石油埋蔵量は無限でないことが認識され、このような認識は、環境問題への関心の高まりと相俟って、ＣＯ２排出の６０−９０％減少を実現できるエタノールのような代替燃料の可能性を研究する新しい動きを生んだ。バイオマス由来のエタノールは、多数の種々の資源から得られるヘキソース糖の発酵により生産することができるが、にも拘らず工業的規模の生産または燃料アルコールに向けられる原料は、ショ糖及びトウモロコシデンプンである。これらの原料の欠点は高価なことである。
燃料アルコールの生産拡大には、低コストの供給原料の使用を可能にすることが求められる。現在、植物バイオマスからは唯一リグノセルロース原料がかなり大量に使用可能であり、エタノール生産用の農産物を代替している。リグノセルロース原料の主な発酵可能な糖はグルコース及びキシロースであり、それぞれリグノセルロース中に約４０％及び２５％含有される。しかし、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなアルコール発酵ができる酵母のほとんどは、炭素源としてキシロースを使用できない。さらに、高収量及び高生産性でキシロースをエタノールに発酵できる微生物は知られていない。リグノセルロース加水分解産物からエタノールを商業的に生産することを可能にするには、これらの性質を持つ微生物が求められるであろう。従って本発明の一つの目的は、アルコール発酵ができ、炭素源としてキシロースを利用できる酵母を提供することである。
Ｄ−キシロースは、腸内細菌、一部の酵母及び真菌のような種々の微生物によって代謝される。大部分のキシロース利用細菌において、キシロースはキシロース（グルコース）異性化酵素（ＸＩ）により直接Ｄ−キシルロースに異性化される。しかし、糸状菌及び酵母は、この一ステップの異性化を行うことができず、まずキシロース還元酵素（ＸＲ）の作用によりキシロースをキシリトールに還元し、次いでキシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）によりキシリトールをキシルロースに変換する。最初のステップは補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とし、第二ステップはＮＡＤ＋を必要とする。生成したキシルロースは、その後、キシルロースキナーゼ（ＸＫ）によりリン酸化された後にペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に入る。厳密なＮＡＤＰＨ依存性のキシロース還元酵素（ＸＲ）を持つ微生物では、キシロースからエタノールへの嫌気性発酵は不可能である。キシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）は厳密にＮＡＤ＋に依存しているので、酸化還元不均衡（すなわち、ＮＡＤ＋欠乏）を生じるからである。嫌気性条件においてこの酸化還元不均衡を解決するために、微生物はグリセロール及びキシリトールのような副産物を生産する。同様に、キシロースに対するβ−ラクタムの嫌気的な生産も、グルコースに対するβ−ラクタム生産に比較すると生じにくい。これらの低収量の原因は、グルコースを利用する場合に比較して、この経路においてはＮＡＤＰＨの形の還元体を比較的高度に必要とすることにあるように思われる（W.M.van Gulik et al.,Biotechnol Bioeng.Vol.68,No.6,June 20,2000）。
Ｚａｌｄｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．（2001,Appl.Microbiol.Biotechnol.56;17-34）に総説されているように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び類似の酵母にキシロース代謝を導入する多くの試みが行われてきた。一つの方法は、少なくとも、キシロース（アルドース）還元酵素及びキシリトール脱水素酵素、すなわちＰｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓのＸＹＬ１及びＸＹＬ２、をコードする遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに発現させることに関する（ＵＳ５，８６６，３８２；ＷＯ９５／１３３６２；及びＷＯ９７／４２３０７）。この方法は、キシロースに対してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖を可能にしたが、主にＸＲ及びＸＤＨの間の酸化還元不均衡の結果として、一般的にエタノール生産性及び／または収量が低く、キシリトールの生産が多いという欠点がある。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ若しくは関連酵母または糸状菌にＸＩを発現させることにより、酸化還元不均衡及びその結果としてのキシリトール生産と分泌を回避することができるであろう。数種の細菌のキシロース異性化酵素遺伝子がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに挿入されたが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて中等温度好性原核生物のＸＩを発現させても、活性のあるＸＩを生じなかった（Amore and Hollenverg, 1989, Nucleic Acids Res. 17:7515 ; Amore etal., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol.30:351-357; Chan et al., 1986,Biotechnol. Lett 8:231-234;Chan et al., 1989,Appl.Microbiol.Biotechnol.31:524-528; Ho et al., 1983, Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 42 : 2167 ;Hollenberg, 1987, EBC Symposium on Brewer's Yeast, Helsinki(Finland), 24-25 Nov1986 ; Sarthy et al., 1987, Appl. Envion. Microbiol. 53:1996-2000 ; Ueng etal., 1985, Biotechnol. Lett. 7: 153-158）。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに発現させた好熱性細菌の二種のＸＩは８５℃において１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇの比活性を示した（Bao et al.,1999,Weishengwu-Xuebao 39:49-54;Walfridson etal.,1996,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190）。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの生理的温度（２０−３５℃）では、この活性のわずか数％しか維持できず、キシロースから有効にアルコールを発酵するには不十分であった。従って、生理的条件下において十分なＸＩ活性を提供して、炭素源としてキシロースを利用することを可能とするように、酵母で発現することができるＸＩをコードする核酸に対する要求は依然として存在する。
ＵＳ５，８６６，３８２ ＷＯ９５／１３３６２ ＷＯ９７／４２３０７
W.M.van Gulik et al.,BiotechnolBioeng. Vol.68, No.6, June 20,2000 Ｚａｌｄｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．, 2001, Appl.Microbiol.Biotechnol.56;17-34） more and Hollenverg, 1989, NucleicAcids Res. 17:7515 Amore et al., 1989, Appl.Microbiol. Biotechnol.30:351-357 Chan et al., 1986, Biotechnol. Lett8:231-234 Chan et al., 1989,Appl.Microbiol.Biotechnol.31:524-528 Ho et al., 1983, Fed. Proc. Fed.Am. Soc. Exp. Biol. 42 : 2167 Hollenberg, 1987, EBC Symposium onBrewer's Yeast, Helsinki(Finland), 24-25 Nov 1986 Sarthy et al., 1987, Appl. Envion.Microbiol. 53:1996-2000 Ueng et al., 1985, Biotechnol.Lett. 7: 153-158 Bao et al.,1999,Weishengwu-Xuebao39:49-54;Walfridson et al.,1996,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190
［発明の説明］
（定義）
キシロース異性化酵素
本明細書において、酵素「キシロース異性化酵素」（ＥＣ５．３．１．５）は、Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへのの直接の異性化、及びその逆の直接の異性化を触媒する酵素として定義される。この酵素はまた、Ｄ−キシロースケト異性化酵素としても知られている。一部のキシロース異性化酵素は、Ｄ−グルコース及びＤ−フルクトースの間の変換を触媒することもできるので、時にはグルコース異性化酵素とも呼ばれる。キシロース異性化酵素は補因子としてマグネシウムを必要とする。本発明のキシロース異性化酵素はさらに後述するアミノ酸配列によって定義される。同様に、キシロース異性化酵素はこの酵素をコードするヌクレオチド配列並びに後述されるキシロース異性化酵素をコードする対照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。
本明細書において、キシロース異性化酵素活性の単位（Ｕ）は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０），１０ｍＭキシロース及び１０ｍＭＭｇＣｌ２を含む反応混合物中、３７℃で、１分間に１ｎｍｏｌのキシルロースを生産する酵素の量として定義される。生成したキシルロースは、Ｄｉｓｃｈｅａｎｄ Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ（1951,J.Biol.Chem.192:583-587）の方法または実施例に記述したＨＰＬＣにより測定した。
配列の同一性及び類似性
本明細書において配列同一性（sequence identity）とは、配列比較により決定される、二以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク）配列または二以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の関係として定義される。この分野で、「同一性」は、場合によって、アミノ酸配列又は核酸配列の配列間の一致により決定される、アミノ酸または核酸配列間の配列関連性（sequence relatedness）の程度も意味している。二つのアミノ酸配列の「類似性（similarity）」は、あるポリペプチドの他のポリペプチドに対する、アミノ酸配列及び保存的置換アミノ酸を比較して決定される。「同一性」及び「類似性」は、限定はしないが以下に記述されている方法を含む既知方法により容易に計算することができる（Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford UniversityPress, New York, 1988; Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data,Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, g., Academic Press,1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., MStockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J.Applied Math., 48: 1073(1988）。
同一性を決める望ましい方法は、試験する配列間に最大の一致が得られるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、一般に使用可能なコンピュータプログラムとして作成される。二つの配列間の同一性及び類似性を決定するための望ましいコンピュータプログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BestFit, BLASTP, BLASTN,及びFASTA(Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990）が含まれる。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩ及びその他のサイトから誰でも入手できる（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894;Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990）。よく知られたＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性決定に使用することができる。
ポリペプチド配列比較のための望ましいパラメーターには以下のアルゴリズムが含まれる：Needlemanand Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453 (1970);Comparison matrix:BLOSSUM62 fromHentikoff and Hentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919(1992);GapPenalty:12;及びGap Length Penalty:4。これらのパラメーターを使用する有用なプログラムはＭａｄｉｓｏｎ，ＷＩにあるＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐの「Ｏｇａｐ」プログラムとして一般に入手することができる。既述のパラメーターはアミノ酸比較（エンドギャップに対するペナルティーなし）のためのデホルトパラメーターである。
核酸比較のための望ましいパラメーターは以下のアルゴリズムを含む：アルゴリズム：Needlemannand Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970);Comparison matrix：一致＝＋１０、不一致＝０；Gap Penalty:50;Gap Length Penalty:3。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧａｐプログラムとして入手できる。上記に示したものは核酸比較のためのデホルトパラメーターである。任意に、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れることもでき、このことは、当業者には明らかである。保存的アミノ酸置換とは類似の側鎖を持つ残基の互換性のことである。例えば、脂肪族側鎖をもつアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；ヒドロキシ脂肪族側鎖を持つアミノ酸の群はセリン及びトレオニン；アミノ基を含む側鎖を持つアミノ酸の群はアスパラギン及びグルタミン；芳香族側鎖を持つアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；塩基性側鎖を持つアミノ酸の群はリシン、アルギニン、及びヒスチジン；硫黄を含む側鎖を持つアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。望ましい保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書において開示したアミノ酸配列の置換変異体は、開示配列中の少なくとも一つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。望ましくはアミノ酸の変換は保存的である。天然に存在するアミノ酸の望ましい保存置換は以下のようなものである：アラニンからセリンへ；アルギニンからリシンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸へ；システインからセリンまたはアラニンへ；グルタミンからアスパラギンへ；グルタミン酸からアスパラギン酸へ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；イソロイシンからロイシンまたはバリンへ；ロイシンからイソロイシンまたはバリンへ；リシンからアルギニン；グルタミンまたはグルタミン酸；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからメチオニン、ロイシンまたはチロシンへ；セリンからトレオニンへ；トレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ；及びバリンからイソロイシンまたはロイシン。
核酸配列のハイブリッド形成
本発明のキシロース異性化酵素またはキシルロースキナーゼをコードする核酸配列は、中等度のまたは望ましくは厳密なハイブリッド形成条件下に、ＳＥＱＩＤ ＮＯ．２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のヌクレオチド配列それぞれとハイブリッド形成する能力によって規定することもできる。厳密なハイブリッド形成条件とは、少なくとも約２５、望ましくは約５０ヌクレオチド、７５または１００及び最も望ましくは約２００またはそれ以上のヌクレオチドの核酸配列を、約６５℃の温度において、１Ｍの塩、望ましくは６ｘＳＳＣまたは同等のイオン強度を持つその他の溶液中でハイブリッド形成させることができ、そして０．１Ｍの塩、またはそれ以下、望ましくは０．２ｘＳＳＣまたは同等のイオン強度を持つその他の溶液中で６５℃において洗浄する条件とここでは定義する。望ましくは、ハイブリッド形成は終夜、すなわち少なくとも１０時間行い、望ましくは、洗浄は洗浄液を少なくとも２回交換して少なくとも１時間行う。この条件により、通常約９０％またはそれ以上の配列同一性を持つ配列との特異的ハイブリッド形成が可能であろう。
中等度の条件とは、少なくとも５０ヌクレオチド、望ましくは約２００またはそれ以上のヌクレオチドの配列を、約１Ｍ塩を含む溶液、望ましくは６ｘＳＳＣまたは同等のイオン強度のその他の溶液の中で約４５℃の温度においてハイブリッド形成させ、そして約１Ｍ塩を含む溶液、望ましくは６ｘＳＳＣまたは相当するイオン強度のその他の溶液の中で室温において洗浄する条件とここでは定義する。望ましくは、ハイブリッド形成は終夜、すなわち少なくとも１０時間行い、望ましくは、洗浄は洗浄液を少なくとも２回交換して少なくとも１時間行う。この条件により、通常約５０％までの配列同一性を持つ配列との特異的ハイブリッド形成が可能であろう。当業者は、５０％及び９０％の間の同一性をもつ配列を特異的に同定するためにこれらのハイブリッド形成条件を変更できるであろう。
作動的連結
本明細書で使用される「作動的に連結した」とは、機能的に関連するポリヌクレオチド配列の連結のことである。他の核酸配列との機能的な関連を持って配置されている場合に、核酸は「作動的に連結している」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響するならば、コード配列と作動的に連結している。作動的に連結したとは、典型的には、連結したＤＮＡ配列同士が隣接しており、二個のタンパクコード領域を結合する必要がある場合には、連続し、読み枠内にあることを意味する。
プロモーター
本明細書で使用される「プロモーター」とは、転写の方向の点で遺伝子の転写開始部位の上流に存在する１またはそれ以上の遺伝子の転写を調節する機能を持つ核酸フラグメントであって、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始部位、及び限定はしないが、転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク結合部位を含むその他のＤＮＡ配列、並びにプロモーターの転写の量を直接的若しくは間接的に調節することが当業者には既知のその他のヌクレオチドの配列によって構造的に同定される。「構成的」プロモーターはほとんどの環境及び発生条件において活性であるプロモーターである。「誘導的」プロモーターは環境及び発生が調節されたときに活性となるプロモーターである。
炭素源として２５ｍＭガラクトース及び１００ｍＭキシロースを含む培地で増殖した形質転換Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの増殖曲線。形質転換体ｐＹｅｓは挿入のない酵母発現ベクターを含む。形質転換体１４．３，１６．２．１及び１６．２．２はＰｉｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．Ｅ２キシロース異性化酵素コード配列を含むｐＹＥＳベクターで形質転換されている。
［発明の詳細な説明］
本発明の最初の態様は、キシロースからキシルロースへ異性化する能力を持つ形質転換宿主細胞に関するものである。キシロースからキシルロースへ異性化する能力は、キシロース異性化酵素をコードする核酸配列を含む核酸構築物で宿主細胞を形質転換することにより付与される。キシロースからキシルロースへ異性化する形質転換宿主細胞の能力は、キシロースからキシルロースへの直接の異性化である。これは、それぞれキシロース還元酵素およびキシリトール脱水素酵素に触媒されてキシリトール中間体を経由してキシロースからキシルロースへ変換する２ステップ反応に対して、キシロース異性化酵素により触媒される１ステップ反応によりキシロースがキシルロースへ異性化したことを意味すると理解される。
核酸配列は、形質転換宿主細胞中で活性形態で発現するキシロース異性化酵素をコードすることが望ましい。従って、宿主細胞中で核酸配列が発現することにより、２５℃でタンパクｍｇ当り少なくとも１０Ｕのキシロース異性化酵素比活性、望ましくは２５℃で少なくとも２０，２５，３０，５０，１００，２００または３００Ｕ／ｍｇ、の比活性を持つキシロース異性化酵素が生産される。本明細書において、形質転換宿主細胞中で発現したキシロース異性化酵素の比活性は、宿主細胞の細胞分解物、例えば、酵母細胞分解物のタンパクｍｇ当りのキシロース異性化酵素活性の量と定義される。キシロース異性化酵素活性の測定、タンパク量、及び細胞分解物の調製については実施例１に記述されている。また、比活性は、実施例４に示すように測定することもできる。従って、宿主細胞中にヌクレオチド配列を発現させることにより、３０℃で少なくとも５０Ｕ／ｍｇタンパクのキシロース異性化酵素活性、望ましくは３０℃で少なくとも１００，２００，５００または７５０Ｕ／ｍｇの比活性を持つキシロース異性化酵素が生成される。
望ましくは、宿主細胞中にヌクレオチド配列を発現することにより、キシロースに対するＫｍが５０，４０，３０または２５未満のキシロース異性化酵素が得られ、より望ましくは、キシロースに対するＫｍが約２０ｍＭまたはそれ未満である。
キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列と少なくとも４０，４５，４９，５０，５３，５５，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２のヌクレオチド配列と少なくとも４０，５０，５５，５６，５７，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列；
（ｃ）その相補鎖が、（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｄ）遺伝子コードの縮重による、（ｃ）の核酸分子の配列と異なる配列からなるヌクレオチド配列：
からなる群から選択することができる。
ヌクレオチド配列は、真核生物性キシロース異性化酵素、すなわち真核生物中に天然に存在するキシロース異性化酵素と同じアミノ酸配列を持つキシロース異性化酵素をコードしていることが望ましい。中等温度好性原核性キシロース異性化酵素に比べ、真核生物性キシロース異性化酵素の発現は、酵母のような真核性宿主細胞においてキシロース異性化酵素が活性形態で発現する可能性を高める。ヌクレオチド配列が植物キシロース異性化酵素（例えば、Ｈｏｒｄｅｕｍｖｕｌｇａｒｅ由来）または菌（fungal）キシロース異性化酵素（例えば、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｓ由来）をコードするのがより望ましい。但し、真核生物性宿主細胞、特に酵母において酵素的に活性形態で発現する可能性をさらに増加させるためには、ヌクレオチド配列が嫌気性菌のキシロース異性化酵素をコードすることが最も望ましい。Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ，Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ，Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ，またはＲｕｍｉｎｏｍｙｃｅｓ科に属する嫌気性菌のキシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列が最も望ましい。
キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列で形質転換するための宿主細胞は、細胞の中へ能動的にまたは受動的にキシロースを輸送できる宿主であることが望ましい。宿主細胞は、活性な解糖経路、ペントースリン酸経路を含有していることが望ましく、キシロースから異性化されたキシルロースがピルビン酸に代謝されるようにキシルロースキナーゼを含有していることが望ましい。さらに宿主はピルビン酸を目的とする発酵産物、例えばエタノール、エチレンまたは乳酸に変換するための酵素を含有することが望ましい。望ましい宿主細胞は、天然においてアルコール発酵、望ましくは嫌気性アルコール発酵ができる宿主細胞である。さらに宿主細胞はエタノール及び乳酸、酢酸、ギ酸のような有機酸、及びフルフラール及びヒドロキシメチルフルフラールのような糖分解産物に対して高度な耐性を持っていることが望ましい。宿主細胞のこれらの特性または活性は天然に宿主細胞中に存在することもあるが、遺伝子操作により導入または修飾することができる。適する宿主細胞は細菌または真菌のような微生物であるが、宿主として最も適当なのは酵母または糸状菌である。
本明細書において酵母は、真核性微生物として定義され、主として単細胞の形で増殖するＥｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の全種（Alexopoulos,C.J.,1962,In:Introductory Mycology,John Wiley &Sons,Inc.,New York）を含む。酵母は単細胞葉状体の発芽によっても、また生物体の分裂によっても増殖することができる。宿主細胞として望ましい酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ，Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ，及びＹａｒｒｏｗｉａ種に属する。酵母は、嫌気性発酵、より望ましくは嫌気性アルコール発酵ができるものが望ましい。
本明細書において糸状菌は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の全ての糸状形態を含む真核性微生物として定義される。これらの菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合多糖からなる栄養菌糸体によって特徴付けられる。本発明の糸状菌は、形態的、生理的、及び遺伝的に、酵母とは区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸の延長によるものであり、ほとんどの糸状菌の炭素異化は、絶対的好気性による。宿主細胞として望ましい糸状菌はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ，Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ，及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種に属するものである。
数年にわたって、農産糖からバイオ−エタノールを生産するために、種々の生物体の導入が提案されてきた。しかしながら、実用的な主なバイオ−エタノール生産プロセスの全てにおいて、エタノール生産体としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の酵母を使用し続けてきた。これは工業的プロセスに対するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種の多くの魅力的な特徴、すなわち、高濃度の酸、エタノール及び浸透圧に対する耐性、嫌気的増殖能力、及び当然ではあるが高いアルコール発酵能力に基づくものである。宿主細胞として望ましい酵母の種は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ，Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ，Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ，Ｓ．ｕｖａｒｕｍ，Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ，Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ，Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓを含む。
宿主細胞は後に定義する核酸構築物で形質転換され、核酸構築物の一つのコピーを含むものでもよいが、複数のコピーを含むものが望ましい。この核酸構築物はエピソームとして維持され、ＡＲＳ配列のような自律的複製のための配列を含む。適するエピソーム性核酸構築物は、例えば、酵母２μまたはｐＫＤ１（Fleer et al.,1991, Biotechnology 9: 968-975）プラスミドに基づくことができる。しかし、核酸構築物は、宿主細胞のゲノム中に１以上のコピーが組み込まれていることが望ましい。宿主細胞ゲノムへの組み込みは、変則的な組換えによりランダムに生じることもありうるが、菌分子遺伝学の分野でよく知られている相同組換えにより核酸構築物を宿主細胞ゲノムへ組み込むことが望ましい（例えば、ＷＯ９０／１４４２３，ＥＰ−Ａ−０４８１ ００８，ＥＰ−Ａ−０ ６３５ ５７４及びＵＳ６，２６５，１８６参照）。
本発明による望ましい形質転換宿主細胞において、核酸構築物は、宿主細胞に、炭素源として、望ましくは唯一の炭素源としてのキシロースに対して、望ましくは嫌気的条件下で増殖する能力を付与する。それにより形質転換宿主は、好ましくはキシリトールを本質的に生産せず、例えば、当該宿主によって生産されるキシリトールは、検出限界以下、またはモルベースで消費した炭素の５，２，１％未満である。その形質転換宿主細胞は、唯一の炭素源としてのキシロースに対して少なくとも０．０１，０．０２，０．０５，０．１または０．２ｈ−１の速度で増殖する能力を有する。このように本発明の形質転換宿主細胞は、既に定義した比活性レベルでキシロース異性化酵素を発現する。
宿主細胞は、（ａ）宿主細胞中へのキシロース輸送の増加；（ｂ）キシルロースキナーゼ活性の増加；（ｃ）ペントースリン酸経路の流量の増加；（ｄ）カタボライト抑制に対する感受性の減少；（ｅ）エタノール、浸透圧または有機酸に対する耐性の増加；及び（ｆ）副生物生産の減少、からなる群から選択された特徴の一つまたはそれ以上を生じる遺伝子修飾をさらに含むことができる。副生物は目的とする発酵産物以外の炭素含有分子を意味すると理解され、例えば、キシリトール、グリセロール及び／または酢酸が含まれる。そのような遺伝子修飾は、古典的突然変異誘起及びスクリーニング及び／または目的変異体の選別により導入することができる。その他に、遺伝子修飾は、外来性遺伝子の過剰発現及び／または異種遺伝子の発現及び／または内在性遺伝子の不活化を含むことができる。これらの遺伝子は、ヘキソースまたはペントーストランスポーター；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（XKSI Deng and Ho, 1990, Appl. Biochem. Biotechnol. 24-25: 193-199）またはＰｉｒｏｍｙｃｅｓ（ｘｙｌＢ，すなわちＳＥＱＩＤ ＮＯ．４）のキシルロースキナーゼのようなキシルロースキナーゼ；トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ１）またはトランスケトラーゼ（ＴＫＬ１）のようなペントースリン酸経路の酵素（例えば、Ｍｅｉｎａｎｄｅｒｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｕｐｐｌ，２：４５参照）、解糖酵素、アルコール脱水素酵素のようなアルコール代謝酵素、をコードする遺伝子から選択されることが望ましい。不活化される望ましい内在性遺伝子としては、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＨＸＫ２遺伝子（Diderich et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67:1587-1593参照）のようなヘキソースキナーゼ；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＩＧ１またはＭＩＧ２遺伝子；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＥ３遺伝子（Traff et al.,2001,Appl.Environm.Microbiol.67:5668-5674）のような（非特異的）アルドース還元酵素遺伝子；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセロール−リン酸脱水素酵素１及び／または２遺伝子のようなグリセロール代謝に関係する酵素の遺伝子；またはその他の宿主の種の遺伝子の（ハイブリッド形成）相同体、が含まれる。宿主細胞のキシロース代謝に関するその他の望ましい修飾についてはＺａｌｄｉｖａｒｅｔ ａｌ．（２００１、前出）に総説されている。
その他の態様において、本発明は、エタノール以外の発酵産物を生産するための形質転換宿主細胞に関係している。その非エタノール発酵産物は原則として酵母または糸状菌のような真核性微生物によって生産することができる大量のまたは精製した化学品である。そのような発酵産物としては、例えば、乳酸、酢酸、コハク酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質及びセファロスポリンがある。
本発明の核酸構築物による宿主細胞の形質転換及び宿主細胞、望ましくは酵母の前記のようなその他の遺伝子修飾は当業者によく知られている方法により行われる。その方法は例えば標準的教科書から知ることができる、例えば、Sambrook and Russel(2001)“Molecular Cloning: A LaboratoryManual(3rd edition)”,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,または F. Ausubel et al, eds.,“Currentprotocols in molecular biology”,Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)。菌宿主細胞の形質転換及び遺伝子修飾の方法は、例えば、ＥＰ−Ａ−０６３５ ５７４，ＷＯ９８／４６７７２，ＷＯ９９／６０１０２及びＷＯ００／３７６７１から知ることができる。
その他の態様において、本発明は、前記で定義したキシロース異性化酵素をコードし、前記の宿主細胞の形質転換に使用されるヌクレオチド配列からなる核酸構築物に関する。核酸構築物において、キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列は、後述するように宿主細胞中でヌクレオチド配列の転写を調節し開始するためのプロモーターに作動的に連結していることが望ましい。このプロモーターは、宿主細胞にキシロースをキシルロースに異性化する能力を付与するために、宿主細胞中でキシロース異性化酵素を十分に発現できることが望ましい。プロモーターは、前記のような宿主細胞中で、特異的キシロース異性化酵素を生じさせるものが望ましい。本発明の核酸構築物中において有用なプロモーターは、構成的及び誘導的な天然プロモーター並びに人工的プロモーターである。さらに本発明に使用するための望ましいプロモーターは、カタボライト（グルコース）抑制に感受性がなくそして／または誘導のためのキシロースを必要としないものが望ましいであろう。このような特徴を持つプロモーターは、広く入手可能であり、同業者には知られている。そのようなプロモーターの適当な例は、例えば、酵母のリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＫ）、トリオースリン酸異性化酵素（ＴＰＩ）、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ，ＴＤＨ３またはＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリンセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターのような解糖遺伝子の酵母プロモーターである。そのようなプロモーターに関する詳細は（ＷＯ９３／０３１５９）に見ることができる。その他の有用なプロモーターは、リボソームタンパクコード遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコール脱水素酵素プロモーター（ＡＤＨ１，ＡＤＨ４，など）、及びエノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）である。その他の、構成的及び誘導的プロモーター及びエンハンサーまたは上流活性化配列は当業者に知られているであろう。本発明の核酸構築物に使用されるプロモーターは、必要に応じて、修飾して、その調節特徴を変更することができる。キシロース異性化酵素を発現させるために核酸構築物に使用されるプロモーターは、キシロース異性化酵素を発現させる宿主細胞と同種であることが望ましい。
核酸構築物において、キシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列の３’−末端は、転写ターミネーター配列に作動的に連結していることが望ましい。このターミネーター配列は、選択した宿主細胞、例えば選択した酵母種において作動し得ることが望ましい。いずれの場合にも、ターミネーターの選択は重要ではなく、ターミネーターは酵母ではない真核生物の遺伝子の場合にしばしば作動するが、酵母遺伝子由来のものを用いることができる。転写終結配列はさらにポリアデニル化シグナルを含むことが望ましい。
任意に、核酸構築物中に選択マーカーを入れることができる。本明細書で使用する用語「マーカー」とは、マーカーを含有する宿主細胞を、選別、またはスクリーニングすることができる特徴または表現型をコードする遺伝子のことである。マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子とすることができ、それによって形質転換されていない細胞の中から形質転換された細胞を選別するために適当な抗生物質を使用することができる。適当な抗生物質耐性マーカーの例としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼＩＩ（カナマイシン、ネオマイシン及びＧ４１８耐性）が含まれる。抗生物質耐性マーカーは、倍数体宿主細胞の形質転換には最も便利であるが、しかし栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３，ＴＲＰ１，ＬＥＵ２）またはＳ．ｐｏｍｂｅＴＰＩ遺伝子（Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｐ Ｒ，１９８５，Ｇｅｎｅ４０：１２５−１３０に記載）のような非抗生物質耐性マーカーが使用されることが望ましい。望ましい態様において、核酸構築物により形質転換された宿主細胞はマーカー遺伝子を含まない。マーカー遺伝子を含まない組換え微生物宿主細胞を作る方法はＥＰ−Ａ−０６３５ ５７４に開示されており、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子または酵母ＵＲＡ３及びＬＹＳ２遺伝子のような二方向性マーカーの使用に基づいている。そのほかには、形質転換細胞をスクリーニングできるように、緑色蛍光タンパク、ｌａｃＺ，ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−グルクロニダーゼのようなスクリーニングに役立つマーカーを本発明の核酸構築物の中に組み込むことができる。
さらに任意に本発明の核酸構築物中に存在することができる配列としては、これらに限定はしないが、一つまたはそれ以上のリーダー配列、エンハンサー、組み込み因子、並びに／或いはレポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロメア及び／またはマトリックス接着（ＭＡＲ）配列がある。本発明の核酸構築物はさらに、ＡＲＳ配列のような自己複製のための配列を含むことができる。適するエピソーム核酸構築物は、例えば、酵母２μまたはｐＫＤ１（Fleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975）プラスミドを基にすることができる。その他に核酸構築物は、望ましくは相同組換えによる、組み込みのための配列を含むことができる。従ってその配列は、宿主細胞のゲノム中の組み込みの標的部位に対して相同的な配列である。本発明の核酸構築物は、本来既知方法により提供することができ、その方法には核酸／核酸配列を制限及び連結するような技術を含み、その参考文献は例えば、Sambrook and Russel (2001) “Molecular Cloning: A LaboratoryManual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HarborLaboratory Press, またはF. Ausubel et al., eds.,”Currentprotocols in molecular biology”,Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)のような標準的教科書に示されている。
そのほかの態様において、本発明はキシロース異性化酵素をコードするヌクレオチドを含む核酸分子に関する。この核酸分子は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列と少なくとも５０，５３，５４，５５，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２のヌクレオチド配列と少なくとも５０，５６，５７，５８，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｃ）その相補鎖が、（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズする核酸分子；及び
（ｄ）遺伝子コードの縮重により（ｃ）の核酸分子配列と異なる配列からなる核酸分子；
からなる群から選択されることが望ましい。
また、（ａ）の核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列と少なくとも６７，６８，６９，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることができる。（ｃ）の核酸分子は望ましくは前記に定義した中等度の条件、より望ましくは厳密な条件の下にハイブリッド形成する。核酸分子は真核生物由来であることが望ましく、菌のような真核微生物由来であることがより望ましく、前記の嫌気性菌のような嫌気性菌由来であることが最も望ましい。
本発明の更に他の態様は、キシルロースキナーゼ、望ましくはＤ−キシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関するものである。本明細書において、Ｄ−キシルロースキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１７；Ｄ−キシルロキナーゼとも呼ばれる）は、Ｄ−キシルロースのキシルロース−５−リン酸への変換を触媒する酵素である。この核酸分子は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸配列と少なくとも４５，４７，４８，４９，５０，５５，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のヌクレオチド配列と少なくとも３０，３７，３８，３９，４０，５０，６０，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる核酸分子；
（ｃ）その相補鎖が、（ａ）または（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズする核酸分子；及び
（ｄ）遺伝子コードの縮重による、（ｃ）の核酸分子配列と異なる配列からなる核酸分子：
からなる群から選択されることが望ましい。
また、（ａ）の核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸配列と少なくとも６４，６５，６６，７０，８０，９０，９５，９７，９８，または９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることができる。（ｃ）の核酸分子は望ましくは前記で定義した中等度の条件、より望ましくは厳密な条件の下にハイブリッド形成する。核酸分子は、真核生物由来であることが望ましく、菌のような真核微生物由来であることがより望ましく、前記の嫌気性菌のような嫌気性菌由来であることが最も望ましい。
そのほかの態様において、本発明は、本発明の形質転換宿主細胞がキシロースのようなキシロース資源を含む炭素源の発酵のために使用される、発酵プロセスに関するものである。発酵培地中の炭素源は、キシロース資源に加えてグルコース資源も含むことができる。キシロースまたはグルコースの資源としては、キシロースまたはグルコースそのものでもよく、例えば、リグノセルロース、キシラン、セルロース、デンプンなどのようなキシロースまたはグルコース単位からなる炭水化物のオリゴマーまたはポリマーでもよい。そのような炭水化物からキシロースまたはグルコース単位を遊離させるために（キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなどのような）、適当な炭水化物分解酵素を、発酵培地に加えてもよく、形質転換宿主細胞に生産させてもよい。後者の場合には、形質転換宿主細胞に遺伝子操作を施し、その炭水化物分解酵素を生産させ、分泌させることができる。望ましいプロセスにおいて、形質転換宿主細胞は、キシロース及びグルコースを共に、望ましくは同時に発酵し、その場合にはグルコース抑制に非感受性の形質転換宿主細胞を使用してジオキシ増殖を阻害することが望ましい。炭素源としてのキシロース（及びグルコース）に加えて、発酵培地はさらに形質転換宿主細胞の増殖に必要な適当な成分を含むであろう。酵母などの微生物を増殖するための発酵培地の組成は、当業者にはよく知られている。
発酵プロセスは、エタノール、乳酸、酢酸、コハク酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ペニシリンＧ若しくはペニシリンＶ及びそれらの発酵誘導体のようなβ−ラクタム並びにセファロスポリンなどの発酵産物を生産するためのプロセスである。発酵プロセスは、好気的または嫌気的な発酵プロセスとすることができる。本明細書において嫌気的発酵プロセスとは、発酵プロセスが無酸素の状態でまたは実質的に酸素が消費されないで（例えば、５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満）で行われ、有機分子が、電子供与体及び電子受容体のいずれとしても働く発酵プロセスと定義される。酸素が存在しないところでは、糖分解及びバイオマス形成において生成したＮＡＤＨは、酸化的リン酸化により酸化することはできない。この問題を解決するために多くの微生物は電子及び水素受容体としてピルビン酸またはその誘導体の一つを利用することによって、ＮＡＤ＋を再生する。従って、望ましい嫌気的発酵プロセスにおいて、ピルビン酸は、電子（及び水素）受容体として使用され、エタノール、乳酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、酢酸またはコハク酸のような発酵産物へと還元される。
発酵プロセスは、形質転換宿主細胞にとって最適の温度で行うことが望ましい。従って、ほとんどの酵母または菌の宿主細胞に対して、発酵プロセスは３８℃未満の温度で実施される。酵母または糸状菌の宿主細胞に対して、発酵プロセスは３５，３３，３０または２８℃未満、且つ２０，２２，または２５℃を超える温度で実施されることが望ましい。
望ましいプロセスは、（ａ）前記に定義した形質転換宿主細胞と共にキシロース資源を含む培地を発酵することによって、宿主細胞にキシロースをエタノールに発酵させ；任意に、（ｂ）エタノールを回収するステップを含むエタノールの生産プロセスである。発酵培地は、グルコース資源を含むことができ、それもエタノールに発酵される。このプロセスにおいて、エタノールの容積生産性は、少なくとも０．５，１．０，１．５，２．０，２．５，３．０，５．０または１０．０ｇエタノール／リットル／時間であることが望ましい。このプロセスにおけるキシロース及び／またはグルコースに対するエタノール収率は、少なくとも５０，６０，７０，９０，９５または９８％であることが望ましい。本明細書においてエタノール収率は、理論的収量（グルコース及びキシロースについて０．５１ｇエタノール／ｇグルコースまたはキシロース）のパーセンテージとして定義する。
その他の態様において、本発明は、乳酸、酢酸、コハク酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物の生産プロセスに関する。このプロセスは、（ａ）前記に定義した形質転換宿主細胞と共にキシロース資源を含む培地を発酵することにより、宿主細胞に、キシロールを発酵産物に発酵させ、任意に、（ｂ）発酵産物を回収する、ステップを含むことが望ましい。望ましいプロセスにおいて、培地はグルコース資源も含む。
［実施例１］Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓキシラナーゼ異性化酵素及びキシルロースキナーゼｃＤＮＡのクローニング
（生物及び増殖条件）
インド象の糞から単離した嫌気性菌Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２（ＡＴＣＣ７６７６２）を、Ｎ２／ＣＯ２（８０％／２０％）中、３９℃で、種々の炭素源を添加したＭ２培地で嫌気的に増殖した（２４）。使用した炭素源は、アビセル（微結晶セルロース、タイプＰＨ１０５、Ｓｅｒｖａ，ドイツ）、フルクトースまたはキシロース（全て０．５％、ｗ／ｖ）であった。増殖が止まった後（水素の発生により判断した）、細胞を遠心分離（１５，０００ｘｇ，４℃，１５分間）またはナイロンガーゼ（３０μｍ孔径）による濾過により回収した。
（無細胞抽出物の調製）
菌細胞を脱イオン水で洗い、培地成分を除去した。細胞を液体窒素中で凍結し、次いで、乳鉢中で、硝子ビーズ（０．１０−０．１１ｍｍ径）ですりつぶして、無細胞抽出物を調製した。Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．０）を粉末に加え（１：１，ｗ／ｖ）そして１５分間解凍した後、懸濁液を遠心分離した（１８，０００ｘｇ，４℃，１５分間）。透明な上清を細胞内酵素の原料として使用した。
（酵素検定）
キシロース異性化酵素活性は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０），１０ｍＭキシロース，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び適当量の無細胞抽出物を含む反応混合物中３７℃で検定した。生成したキシルロースの量は、システイン−カルバゾール法（９）により測定した。キシルロースキナーゼ及びキシロース還元酵素活性はＷｉｔｔｅｖｅｅｎｅｔ ａｌ．（２８）による記述にしたがって検定した。活性の１単位は、検定条件の下に、毎分１ ｎｍｏｌのキシルロースを生産する酵素量と定義される。生成したキシルロースは、Ｄｉｓｃｈｅａｎｄ Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ（Dische and Borenfreund, 1951, J. Biol. Chem.192: 583-587）の方法によるか、または８０℃のＢｉｏｒａｄ ＨＰＸ−８７Ｎカラムを使用し、溶出液として０．０１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を使用して０．６ｍｌ／ｍｉｎで溶出するＨＰＬＣにより測定した。キシロース及びキシルロースは、内部温度６０℃で屈折計により測定した。
比活性は、タンパク１ｍｇ当りの単位として示す。タンパクは、ウシγ−グロブリンを標準としてＢｉｏ−Ｒａｄタンパク試薬（Bio-Rad Laboratories,Richmond,CA,米国）で測定した。
（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２ｃＤＮＡライブラリーのランダム配列）
既に記述されている（２）ベクターラムダＺＡＰＩＩ中に構築したｃＤＮＡライブラリーを使用した。このライブラリーの一部をＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（Stratagene,La Jolla,CA,米国）による大量切除（massexcission）によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−クローンに変換した。無作為に取り出したクローンをＭ１３逆プライマーを使用して配列解析し、５’部分の配列を得た。不完全ｃＤＮＡを使用してプローブを合成し、ライブラリーを再スクリーニングするために使用した。全長配列を得るためにｐＵＣ１８にサブクローニングを生成さた。配列分析は、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅターミネーターサイクルシークエンス即時反応ＤＮＡシークエンスキット（Perkin-Elmer Applied Biosystems）を使用してＡＢＩプリズム３１０自動化シークエンサーで実施した。
（結果）
嫌気性菌Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２のｃＤＮＡライブラリーから無作為に選択したクローンを配列解析し、その結果キシロース異性化酵素及びＤ−キシルロキナーゼ遺伝子にそれぞれ高い相同性を示す二つのクローン（ｐＨ９７及びｐＡＫ４４）を得た。これらのクローンを詳細に解析した。
クローンｐＨ９７は完全なＯＲＦを含有していなかったので、クローンｐＨ９７の配列データに基づいて設計したプローブを使用してｃＤＮＡライブラリーを再度スクリーニングした。この結果１６６９ｂｐの挿入配列を有するクローンｐＲ３を得た。キシロース異性化酵素に高い類似性のある４３７アミノ酸のタンパクをコードするＯＲＦを同定することができた。５’非翻訳領域はわずか４ｂｐを含むのみであったが、推定開始メチオニン残基は、既知キシロース異性化酵素配列の整列によく一致した。３’非翻訳領域は３５１ｂｐの長さであり、嫌気性菌で典型的である、高いＡＴ含有率を有していた。ＯＲＦは、基質との相互作用（触媒トリアド（catalytic triad）Ｈｉｓ１０２，Ａｓｐ１０５，Ａｓｐ３４０及びＬｙｓ２３５）及びマグネシウムとの結合（Ｇｌｕ２３２）に重要であることが示されているアミノ酸を含有していた（１４，２６）。さらに、キシロース異性化酵素のために開発した（２０）２個の符号パターン（残基１８５−１９４、及び２３０−２３７）が存在した。このＰｉｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．Ｅ２キシロース異性化酵素（ＸｙｌＡ）はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａの酵素（５２％同一性、６８％類似性）及びＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（４９％同一性、６７％類似性）と高い相同性を示す。ｃＤＮＡ配列から推定されるポリペプチドは４９，３９５Ｄａの分子量に相当し、５．２の計算値ｐＩを有す。
二番目のクローンｐＡＫ４４は、２０４１ｂｐの挿入を有し、５３，１５８Ｄａの分子量及び５．０のｐＩを持つ４９４アミノ酸のタンパクをコードする完全ＯＲＦを含有した。最初のメチオニンに先行して１１１ｂｐの５’非翻訳領域が存在したが、３’非翻訳領域は４４５ ｂｐからなっていた。両領域はＡＴが多い。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ調査によりキシルロキナーゼとの高い類似性が明らかにされた。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｅｆｉａｅｔ ａｌ．（２２）により定義された２個のリン酸共通領域が部分整列に示されるように位置６−２３及び２５４−２７０に認められた。さらにＰｒｏｓｉｔｅデーターベースに記述されているこの糖キナーゼファミリーの記号が同定された（１３１−１４５及び３５１−３７２）。Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．Ｅ２キシルロキナーゼ（ＸｙｌＢ）はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａのＸｙｌＢと高い相同性を示した（４６％同一性、６４％類似性）。
［実施例２］酵母発現ベクターの構築
Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２のキシロース異性化酵素のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の発現
Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２のｃＤＮＡをｐｆｕポリメラーゼ（Stratgene）を使用するＰＣＲ反応に使用した。プライマーはキシロース異性化酵素の５’及び３’末端の配列を使用して設計し、ＳｆｉＩ及びＸｂａＩ制限部位を含めた。ＰＣＲ産物をｐＰＩＣＺαベクター（Invitrogen,Carlsbad,CA,米国）中にクローニングした。キシロース異性化酵素を取り出すために、ｐＰＩＣＺαベクターをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化した。消化産物をｐＹｅｓ２ベクター（Invitrogen）に連結した。キシロース異性化酵素を含むｐＹｅｓ２プラスミドをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（株ＢＪ１９９１，ＢｅｔｈＪｏｈｎｓ，ＵｖＡから供与）に導入した。この株の遺伝型は：ｍａｔα，ｌｅｕ２，ｔｒｐ１，ｕｒａ３−２５１，ｐｒｂ１−１１２２及びｐｅｐ４−３、である。形質転換細胞をＳＣプレート（０．６７％ＹＮＢ培地＋０．０５％ Ｌ−Ｌｅｕ＋０．０５％ Ｌ−Ｔｒｐ＋２％グルコース＋２％アガロース）に接種した。
形質転換Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞をグルコース培地で２５℃で７２時間増殖した（グルコースの代わりにラフィノースを使用することができる）。細胞を回収し、グルコースの代わりにガラクトースを加えたＳＣ培地中に再懸濁した。８時間の誘導後、細胞を回収し、硝子ビーズ（０．１０−０．１１ｍｍ径）及び「破壊緩衝液」（５０ｍＭリン酸緩衝液＋５％グリセロール＋プロテアーゼ阻害剤）を使用して分解した。分解の後混合物を遠心分離（１８，０００ｘｇ，４℃，１５分間）した。透明上清を使用して前記方法（実施例１）によりキシロース異性化酵素活性を測定した。１０Ｕ／ｍｇタンパクの活性が３７℃において測定された。
［実施例３］キシロース上での形質転換酵母株の増殖
（培地組成）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を下記組成のＳＣ−培地上で増殖した：０．６７％（ｗ／ｖ）酵母窒素塩基；０．０１％（ｗ／ｖ）Ｌ−トリプトファン；０．０１％（ｗ／ｖ）Ｌ−ロイシン及びグルコース、ガラクトースまたはキシロースまたはこれら基質の組合せのいずれか（下記参照）。寒天培地用に培地に２％（ｗ／ｖ）細菌用寒天を加えた。
（増殖実験）
挿入のないｐＹｅｓ２で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＪ１９９１（遺伝型：ｍａｔα，ｌｅｕ２，ｔｒｐ１，ｕｒａ３−２５１，ｐｒｂ１−１１２２，ｐｅｐ４−３）及びＰｉｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．Ｅ２キシロース異性化酵素遺伝子を持つｐＹｅｓ２を含む形質転換細胞（１６．２．１；１６．２．２及び１４．３）を、炭素源として１０ｍＭグルコースを含むＳＣ−寒天プレート上で増殖した。コロニーが見えるようになったとき、一つのコロニーを使用して、炭素源として１００ｍＭキシロース及び２５ｍＭガラクトースを含むＳＶＣ液体培地に接種した。ＬＫＢＵｌｔｒｏｓｐｅｃ Ｋ分光光度計を使用して６００ｎｍの光学密度の増加を測定することにより増殖を監視した。
（結果）
増殖実験の結果を図１にまとめた。挿入のないｐＹｅｓ２で形質転換したＢＪ１９９１株の培養は８０時間までＯＤ６００の増加を示した。この後徐々に減少が観察された。これは増殖の末期にしばしば観察される酵母細胞の凝集によるものである。３種の形質転換細胞は、８０時間後も増殖を止めず、少なくとも１５０時間までさらに増加を示した。
［実施例４］Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＰｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２キシロース異性化酵素を構成的に発現するための新規で改良された酵母発現ベクターの構築
キシロース異性化酵素をコードするＰｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｅ２遺伝子を含むｐＰＩＣＺαベクターを、ＶｅｎｔＲ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）によるＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーはキシロース異性化酵素をコードする遺伝子の５’及び３’配列を使用して設計し、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ部位を含めた。さらに、プライマーはｐＰＩＣＺα構築中に認められるＸｂａＩ部位を除去し、その代わりに終結コドン（ＴＡＡ）を入れて設計した。最終産物は、ｐＰＩＣＺα構築に認められる追加のアミノ酸（ｈｉｓ及びｃ−Ｍｙｃタグ）のない、元のオープンリードフレームを復元するように設計した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで切り出した。最終産物をｐＹＥＳ２（Invitrogen）由来のベクター中にクローニングした。このベクター中において、キシロース異性化酵素の構成的発現を確実にし、それにより培地にガラクトースを加える必要をなくするために、ｐＹＥＳ２中にあるＧＡＬ１プロモーターをＴＰＩ１プロモーターに置換した。ＴＰＩ１プロモーターはプラスミドｐＹＸ０１２（R&D systems）の修飾型からクローニングした。このプロモーターをＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り出した。
このＴＰＩ１プロモーター及びキシロース異性化酵素をコードする遺伝子のＰＣＲ産物を共に、ＳｐｅＩ及びＸｂａＩで切り出したｐＹＥＳ２に連結した。このプラスミドを使用してＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ（Ｐｅｔｅｒ Ｋｏｔｔｅｒ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔより供与）を形質転換した。この株の遺伝型は：ＭａｔＡ ｕｒａ３−５２である。形質転換細胞は、炭素源として２％グルコースを加えたミネラル培地プレート上で選別した（Verduyn et al.:Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts;a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholicfermentation.(1992) Yeast 8(7): 501-17)。形質転換していない細胞は、このプレート上では増殖できない。
形質転換細胞を、炭素限定恒成分培養において、グルコース／キシロース混合物に対して増殖した。この条件下で増殖した形質転換細胞は、Ｄｅｒｓｔｅｒｓ−Ｈｉｌｄｅｒｓｓｏｎｅｔ ａｌ．（Kinetic characterization of D-xylose isomerases byenzymatic assays using D-sorbitol dehydrogenase. Enz. Microb. Techol. 9 (1987)145-148）により開発された特異的酵素検定により、高いキシロース異性化活性（３０℃において８００単位／ｍｇ）を示す。形質転換Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の無細胞抽出物中のキシロース異性化酵素のインビトロ活性は、２価カチオン（Ｍｇ２＋またはＣｏ２＋）に依存し、キシロースに対して約２０ｍＭの比較的低いＫｍ値が認められた。

Claims (18)

  1. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列と少なくとも７０％配列同一性（sequenceidentity）を有するアミノ酸配列（配列同一性は、Needleman andWunsch,J.Mol.Biol.48:443-453 (1970)に記載のアルゴリズムを使用し、Hentikoffand Hentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919(1992)に記載のBLOSSUM62 Comparison matrixを使用し、GapPenalty:12及びGap Length Penalty:4で同定した）を含むキシロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換した真菌宿主細胞であって、
    該形質転換で、該核酸構築物により、キシロースを炭素源として利用する能力を付与された、真菌宿主細胞。
  2. 前記アミノ酸配列は、
    （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列の１８５−１９４の位置のアミノ酸配列、
    （ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列の２３０−２３７の位置のアミノ酸配列、
    （ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列の１０２の位置のヒスチジン、１０５の位置のアスパラギン酸、３４０の位置のアスパラギン酸、及び２３５の位置のリジン、並びに
    （ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列の２３３の位置のグルタミン
    を含む、請求項１に記載の真菌宿主細胞。
  3. 前記宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ，Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ，及びＹａｒｒｏｗｉａ属の何れか一つに属する酵母である、請求項１又は２に記載の形質転換宿主細胞。
  4. 前記酵母が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ，Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ，Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ，Ｓ．ｕｖａｒｕｍ，Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ，Ｋ．ｌａｃｔｉｓ，Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ，及びＫ．ｆｒａｇｉｌｉｓ種の何れか一つに属する、請求項３に記載の形質転換宿主細胞。
  5. 前記宿主細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ，Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ，及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の何れか一つに属する糸状菌である、請求項１又は２に記載の形質転換宿主細胞。
  6. キシロースをキシルロースに異性化する能力を宿主細胞に付与するために、キシロース異性化酵素をコードする前記ヌクレオチド配列を、前記宿主細胞中で該キシロース異性化酵素を充分に発現させるプロモーターに作動的に連結している、請求項１から５の何れか１項に記載の形質転換宿主細胞。
  7. 前記宿主細胞中で、該プロモーターがカタボライト抑制に非感受性である、請求項６に記載の形質転換宿主細胞。
  8. 前記宿主細胞が
    （ａ）該宿主細胞中へのキシロース輸送の増加；
    （ｂ）キシルロースキナーゼ活性の増加；
    （ｃ）ペントースリン酸経路の流量の増加；
    （ｄ）カタボライト抑制に対する感受性の減少；
    （ｅ）エタノール、浸透圧または有機酸に対する耐性の増加；及び
    （ｆ）副産物生産の減少、
    からなる群から選択された特徴を生じる遺伝子修飾を含む、請求項１から７の何れか１項に記載の形質転換宿主細胞。
  9. 前記遺伝子修飾が、内在性遺伝子の過剰発現、異種遺伝子の発現、またはそれらの組合せからなり、それらによって、該遺伝子が；ヘキソースまたはペントーストランスポーター、キシルロースキナーゼ；ペントースリン酸経路系酵素、解糖系酵素、及びエタノール代謝酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
  10. 前記遺伝子修飾が内在性遺伝子の不活化からなり、それによって、該遺伝子がヘキソースキナーゼ遺伝子、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＭＩＧ１及びＭＩＧ２遺伝子、並びにそれらの遺伝子の塩基配列に対する相補配列を有するポリヌクレオチドとストリジェントな条件でハイブリダイズし、ヘキソキナーゼ、ＭＩＧ１又はＭＩＧ２活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ホモログからなる群から選択される、請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
  11. 前記宿主細胞が、該宿主細胞に、乳酸、酢酸、コハク酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質及びセファロスポリンを生産する能力を付与する一つまたはそれ以上の酵素を発現している、請求項１から１０の何れか１項に記載の形質転換宿主細胞。
  12. 前記宿主細胞が、アルコール脱水素酵素活性を減少させる遺伝子修飾を含む、請求項１１に記載の形質転換宿主細胞。
  13. （ａ）請求項１から１０の何れか一項に記載の形質転換真菌宿主細胞であって、アルコール発酵能力を有する細胞と共にキシロース資源を含有する培地を発酵することによって、該宿主細胞によってキシロースをエタノールに発酵させ、任意に
    （ｂ）エタノールを回収する、
    ステップを含む、エタノールの生産プロセス。
  14. 前記培地がグルコース資源も含む、請求項１３に記載のプロセス。
  15. エタノールの容積生産性が、少なくとも０．５ｇ／リットル／時間である、請求項１３又は１４に記載のプロセス。
  16. エタノール収率が少なくとも５０％である、請求項１３から１５の何れか１項に記載のプロセス。
  17. （ａ）請求項１１又は１２に記載の形質転換真菌宿主細胞と共にキシロース資源を含む培地を発酵することによって、該真菌宿主細胞によりキシロースを発酵産物に発酵させ、任意に
    （ｂ）発酵産物を回収する、
    ステップを含む、乳酸、酢酸、コハク酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物を生産するプロセス。
  18. 該培地がグルコース資源も含む、請求項１７に記載のプロセス。
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PT (1) PT1468093E (ja)
SI (1) SI1468093T2 (ja)
WO (1) WO2003062430A1 (ja)

Families Citing this family (289)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2319757T5 (es) * 2002-01-23 2018-05-22 Dsm Ip Assets B.V. Fermentación de azúcares de pentosa
US20050233030A1 (en) 2004-03-10 2005-10-20 Broin And Associates, Inc. Methods and systems for producing ethanol using raw starch and fractionation
MXPA05009553A (es) 2003-03-10 2006-03-17 Broin And Associates Inc Metodo para producir etanol utilizando almidon como materia prima.
DK2301949T3 (en) 2003-05-02 2015-07-20 Cargill Inc Genetically modified yeast species and fermentation methods using genetically modified yeast
WO2005113785A2 (en) * 2004-05-13 2005-12-01 Novozymes North America, Inc. A process of producing a fermentation product
CN101914462B (zh) 2004-07-16 2013-04-24 Dsm知识产权资产有限公司 发酵木糖的真核细胞的代谢工程
US7708214B2 (en) 2005-08-24 2010-05-04 Xyleco, Inc. Fibrous materials and composites
US20150328347A1 (en) 2005-03-24 2015-11-19 Xyleco, Inc. Fibrous materials and composites
US8097448B2 (en) 2005-06-02 2012-01-17 Cargill Inc. Genetically modified yeast of the species Issatchenkia orientalis and closely relates species, and fermentation processes using same
PT103331A (pt) * 2005-08-05 2007-02-28 Fundacao Da Faculdade De Cienc Expressão dum transportador activo de xilose em saccharomyces cerevisiae modificada geneticamente
US7919289B2 (en) 2005-10-10 2011-04-05 Poet Research, Inc. Methods and systems for producing ethanol using raw starch and selecting plant material
US7357527B2 (en) * 2006-03-03 2008-04-15 Thomas A Meyers Solar sign light
JP5507045B2 (ja) 2006-12-15 2014-05-28 石原産業株式会社 アントラニルアミド系化合物の製造方法
DE102006060381B4 (de) * 2006-12-20 2010-04-08 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Neuer spezifischer Arabinose-Transporter aus der Hefe Pichia stipitis und dessen Verwendungen
MY154965A (en) * 2007-06-01 2015-08-28 Solazyme Inc Production of oil in microorganisms
CA2693365A1 (en) * 2007-07-19 2009-01-22 Royal Nedalco B.V. Novel arabinose-fermenting eukaryotic cells
EP2062967A1 (en) 2007-11-21 2009-05-27 Technical University of Denmark Genetically engineered aspergillus
EP2128262A1 (en) * 2008-05-28 2009-12-02 Università Degli Studi Di Milano - Bicocca Improved yeast strains for organic acid production
DE102008031350B4 (de) * 2008-07-02 2011-02-10 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Prokaryotische Xylose-Isomerase zur Konstruktion Xylose-vergärender Hefen
GB0812318D0 (en) 2008-07-04 2008-08-13 Terranol As Microorganism
US8440449B2 (en) 2008-09-30 2013-05-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Transformed Saccharomyces cerevisiae engineered for xylose utilization
MX2011005630A (es) 2008-11-28 2011-09-28 Solazyme Inc Producción de aceites específicos en microorganismos heterótroficos recombinantes.
CA2745760A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
GB0822937D0 (en) * 2008-12-16 2009-01-21 Terranol As Microorganism
DK2379712T3 (en) 2008-12-19 2017-05-08 Novozymes Inc Methods for Increasing Hydrolysis of Cellulosic Material in the Presence of Cellobiose Dehydrogenase
WO2010080407A2 (en) 2008-12-19 2010-07-15 Novozymes, Inc. Methods for increasing hydrolysis of cellulosic material
CN102325893A (zh) 2008-12-19 2012-01-18 诺维信股份有限公司 在过氧化物酶存在下增加纤维素材料酶法水解的方法
JP5821132B2 (ja) 2008-12-24 2015-11-24 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． キシロース異性化酵素遺伝子及びペントース糖の発酵におけるそれらの使用
US8604277B2 (en) 2009-01-28 2013-12-10 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2010088463A2 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Novozymes, Inc. Polypeptides having expansin activity and polynucleotides encoding same
US8450094B1 (en) 2009-03-03 2013-05-28 Poet Research, Inc. System for management of yeast to facilitate the production of ethanol
EP2403954B1 (en) * 2009-03-03 2015-04-22 POET Research, Inc. Method for fermentation of biomass for the production of ethanol
US9068206B1 (en) 2009-03-03 2015-06-30 Poet Research, Inc. System for treatment of biomass to facilitate the production of ethanol
JP5608999B2 (ja) * 2009-04-08 2014-10-22 株式会社豊田中央研究所 キシロースを利用して有用物質を生産する方法
AU2010253848C1 (en) 2009-05-29 2015-02-19 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
ES2534078T3 (es) 2009-06-02 2015-04-17 Novozymes Inc. Polipéptidos con actividad de celobiohidrolasa y polinucleótidos que codifican los mismos
CA2767169A1 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CA2767361A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 Verdezyne, Inc. Engineered microorganisms with enhanced fermentation activity
WO2011035027A2 (en) 2009-09-17 2011-03-24 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN102712916B (zh) 2009-09-18 2015-11-25 诺维信股份有限公司 具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN102648276A (zh) 2009-09-29 2012-08-22 诺维信股份有限公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
WO2011050037A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
US20120260371A1 (en) 2009-10-29 2012-10-11 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellobiohydrolase Activity and Polynucleotides Encoding Same
DK2496694T3 (en) 2009-11-06 2017-06-06 Novozymes Inc COMPOSITIONS FOR SACCHARIFYING CELLULOS MATERIAL
EP2496693B1 (en) 2009-11-06 2017-10-25 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
CN102639697B (zh) 2009-11-06 2015-03-25 诺维信股份有限公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
WO2011059314A1 (en) * 2009-11-12 2011-05-19 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Pentose transporters and uses thereof
CN102791858B (zh) 2009-12-22 2014-11-26 株式会社丰田中央研究所 木糖异构酶及其利用
CN102906270B (zh) 2009-12-28 2016-06-22 Dsmip资产公司 在木糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途
CN102947440B (zh) * 2009-12-30 2015-04-08 埃欧金能源公司 呈现增强的木质纤维素水解产物发酵的改良酵母菌株
US8759049B2 (en) 2010-02-25 2014-06-24 Iogen Energy Corporation Method for the production of a fermentation product from a sugar hydrolysate
MX341905B (es) 2010-04-21 2016-09-06 Dsm Ip Assets B V * Celula apropiada para la fermentacion de una composicion de azucares mixtos.
WO2011149353A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 C5 Yeast Company B.V. Yeast strains engineered to produce ethanol from acetic acid and glycerol
MX339639B (es) 2010-05-28 2016-06-02 Solazyme Inc * Aceites especificos producidos a partir de microorganismos heterotrofos recombinantes.
CA2798937A1 (en) * 2010-05-28 2011-12-01 Codexis, Inc. Pentose fermentation by a recombinant microorganism
CN103124783A (zh) 2010-06-03 2013-05-29 马斯科马公司 表达用于使用淀粉和纤维素进行联合生物加工的糖分解酶的酵母
ES2543909T3 (es) 2010-06-17 2015-08-25 Poet Research, Inc. Método para producir etanol a partir de biomasa
DK2588604T3 (en) 2010-06-30 2016-09-26 Novozymes Inc Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding them
BR112013000287B1 (pt) 2010-07-07 2021-07-13 Novozymes North America, Inc Processo para produzir um produto de fermentação a partir de material contendo lignocelulose, e, uso de polipeptídeos gh61
US9057086B2 (en) 2010-08-12 2015-06-16 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a bicycle compound and uses thereof
WO2012024046A2 (en) * 2010-08-20 2012-02-23 Codexis, Inc. Pentose fermentation by a recombinant microorganism
CN103080306B (zh) 2010-08-20 2015-02-18 科德克希思公司 糖苷水解酶61家族蛋白在纤维素加工中的用途
WO2012030811A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US20130212746A1 (en) 2010-08-30 2013-08-15 Novoyzmes A/S Polypeptides Having Hemicellulolytic Activity And Polynucleotides Encoding Same
US9267126B2 (en) 2010-08-30 2016-02-23 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
EP2611914A1 (en) 2010-08-30 2013-07-10 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2012030849A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP2611901B1 (en) 2010-08-30 2016-05-11 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
US8709770B2 (en) 2010-08-31 2014-04-29 Iogen Energy Corporation Process for improving the hydrolysis of cellulose in high consistency systems using one or more unmixed and mixed hydrolysis reactors
CN102399804A (zh) * 2010-09-15 2012-04-04 中国农业科学院作物科学研究所 木糖异构酶基因的功能及其应用
ES2599613T3 (es) 2010-09-30 2017-02-02 Novozymes, Inc. Variantes de polipéptidos que tienen actividad de mejora celulolítica y polinucleótidos que codifican los mismos
CN103282489B (zh) 2010-09-30 2016-12-14 诺维信股份有限公司 具有纤维素分解增强活性的多肽变体及其编码多核苷酸
MX2013002586A (es) 2010-10-01 2013-03-21 Novozymes Inc Variantes de beta-glucosidasa y polinucleotidos que codifican las mismas.
KR20130100169A (ko) * 2010-10-13 2013-09-09 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 펜토스 및 글루코스 발효 효모 세포
BR112013009817B1 (pt) 2010-10-26 2020-02-04 Novozymes As métodos de degradar ou converter refugo de cana de açúcar, de produzir um produto de fermentação, e, de fermentar refugo de cana de açúcar
BR112013010008B1 (pt) 2010-11-02 2020-09-08 Novozymes, Inc. Métodos para degradar e para fermentar um material celulósico, e para produzir um produto de fermentação
SG10201509035WA (en) 2010-11-03 2015-12-30 Solazyme Inc Microbial Oils With Lowered Pour Points, Dielectric Fluids Produced Therefrom, And Related Methods
US9212354B2 (en) 2010-11-04 2015-12-15 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activitiy and polynucleotides encoding same
WO2012063344A1 (ja) * 2010-11-11 2012-05-18 トヨタ自動車株式会社 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
US9139823B2 (en) 2010-11-12 2015-09-22 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2012068509A1 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Novozymes, Inc. Chimeric polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
DK2663645T3 (da) 2010-11-18 2015-03-23 Dsm Ip Assets Bv Gærstammer, der er modificeret til produktion af ethanol fra glycerol
EP2649188A1 (en) 2010-12-06 2013-10-16 Novozymes North America, Inc. Methods of hydrolyzing oligomers in hemicellulosic liquor
US20140024826A1 (en) 2011-01-21 2014-01-23 Neelakantam V. Narendranath Systems and methods for improving fermentation
MX2013007720A (es) 2011-01-26 2013-08-09 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican para los mismos.
WO2012103288A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
MX337942B (es) 2011-01-26 2016-03-29 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de endoglucanasa y polinucleotidos que codifican los mismos.
US9506048B2 (en) 2011-01-26 2016-11-29 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2012103293A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
DK2670853T3 (en) 2011-01-31 2017-08-28 Novozymes North America Inc Process for enzymatic refining of pretreated cellulosic material for sugars
MX344012B (es) 2011-02-02 2016-12-02 Terravia Holdings Inc Aceites adaptados producidos a partir de microorganismos oleaginosos recombinantes.
CN102643845A (zh) * 2011-02-21 2012-08-22 中国农业科学院作物科学研究所 大麦木糖异构酶基因的功能及其应用
CN102174549B (zh) * 2011-02-22 2012-10-10 山东大学 一种编码木糖异构酶的核酸分子及其编码的木糖异构酶
EP2678352B1 (en) 2011-02-23 2017-12-06 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN103608461B (zh) 2011-03-09 2016-08-03 诺维信公司 增加多肽的纤维素分解增强活性的方法
US9409958B2 (en) 2011-03-10 2016-08-09 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2012125027A1 (en) 2011-03-14 2012-09-20 Dsm Ip Assets B.V. Yeast strains that ferment uronic acids
DK2689011T3 (en) 2011-03-25 2018-01-22 Novozymes As PROCEDURE FOR DEGRADATION OR CONVERSION OF CELLULOSE-SUBSTANCING MATERIAL
JP5813977B2 (ja) 2011-03-30 2015-11-17 トヨタ自動車株式会社 Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法
WO2012135719A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Novozymes, Inc. Cellulose binding domain variants and polynucleotides encoding same
WO2012135659A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Novozymes A/S Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
US9926547B2 (en) 2011-04-28 2018-03-27 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
BR112013027463A2 (pt) 2011-04-29 2017-09-26 Novozymes Inc métodos para degradar ou converter, e para fermentar um material celulóliso, para produzir um produto de fermentação, e para limpar ou lavar uma superfície dura ou roupa suja, e, composição de detergente
CN103608450A (zh) * 2011-05-06 2014-02-26 索拉兹米公司 基因工程改造的代谢木糖的微生物
WO2012159009A1 (en) 2011-05-19 2012-11-22 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation of cellulosic material with chitin binding proteins
US20140141471A1 (en) 2011-05-19 2014-05-22 Novozymes, Inc. Methods for Enhancing the Degradation of Cellulosic Material with Chitin Binding Proteins
BR112013032945B1 (pt) * 2011-06-21 2021-06-22 Katholieke Universiteit Leuven K.U. Leuven R&D Uso de um alelo de apj1 inativado e método de triagem de levedura resistente ao etanol
EP2546336A1 (en) 2011-07-11 2013-01-16 DSM IP Assets B.V. Yeast strains that consume uronic acids and produce fermentation products such as ethanol
US20140147895A1 (en) 2011-07-22 2014-05-29 Novozymes A/S Processes for Pretreating Cellulosic Material and Improving Hydrolysis Thereof
BR112014002405A2 (pt) 2011-08-04 2017-04-04 Novozymes As polopeptídeo e polinucleotídeo isolados, composição, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, métodos para produzir um polipeptídeo e uma proteína, e, processos para degradar um material celulóssico, para produzir um produto de fermentação, e para fermentar um material celulósico
BR112014002401B1 (pt) 2011-08-04 2021-08-03 Novozymes A/S Célula hospedeira transgênica de fungo filamentoso, métodos para produzir um polipeptídeo e uma proteína, e, construto de ácido nucleico ou um vetor de expressão
EP2748317B1 (en) 2011-08-22 2017-04-19 Codexis, Inc. Gh61 glycoside hydrolase protein variants and cofactors that enhance gh61 activity
CN103890165A (zh) 2011-08-24 2014-06-25 诺维信股份有限公司 纤维素分解酶组合物及其用途
EP2748314B1 (en) 2011-08-24 2016-12-28 Novozymes, Inc. Aspergillus fumigatus cellulolytic enzyme compositions and uses thereof
CN103930555A (zh) 2011-09-13 2014-07-16 诺维信北美公司 水解和发酵纤维素材料的方法
WO2013043910A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CA2849885A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Novozymes A/S Cellulolytic enzyme compositions and uses thereof
CN103930438A (zh) 2011-09-30 2014-07-16 诺维信股份有限公司 具有β-葡糖苷酶活性的嵌合多肽和对其进行编码的多核苷酸
EP2773656B1 (en) 2011-10-31 2019-06-19 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
BR112014011902A2 (pt) 2011-11-18 2017-05-16 Novozymes As polipeptídeo e polinucleotídeo isolados, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo, e para produzir um mutante de uma célula parental, processos para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico ou material contendo xilano, para produzir um produto de fermentação, e para fermentar um material celulósico ou material contendo xilano, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de células
EP2802651B1 (en) 2011-11-21 2017-03-08 Novozymes, Inc. Gh61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same
DK2782998T3 (en) 2011-11-22 2018-04-16 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH BETA-XYLOSIDASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
EP2785732B1 (en) 2011-12-01 2017-04-12 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
EP3272862A1 (en) 2011-12-16 2018-01-24 Novozymes, Inc. Polypeptides having laccase activity and polynucleotides encoding same
EP2794870A4 (en) 2011-12-19 2015-06-17 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH XYLANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES THAT CODE
CA2878019A1 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
EP2794899A1 (en) 2011-12-21 2014-10-29 Novozymes, Inc. Methods for determining the degradation of a biomass material
US20150031868A1 (en) 2012-01-23 2015-01-29 Dsm Ip Assets B.V. Diterpene production
EP2626423A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-14 Clariant Produkte (Deutschland) GmbH Pentose-fermenting microorganism
EP2831255A2 (en) 2012-03-26 2015-02-04 Novozymes North America, Inc. Methods of preconditioning cellulosic material
US9856498B2 (en) 2012-03-30 2018-01-02 Novozymes A/S Processes of producing fermentation products
EP3550025A1 (en) 2012-04-18 2019-10-09 Corbion Biotech, Inc. Tailored oils
US9719114B2 (en) 2012-04-18 2017-08-01 Terravia Holdings, Inc. Tailored oils
NL2008682C2 (en) 2012-04-23 2013-10-31 Stichting Energie Wet biomass treatment.
CN104245929A (zh) 2012-04-23 2014-12-24 诺维信公司 具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸
US9394556B2 (en) 2012-04-23 2016-07-19 Novozymes A/S Polypeptides having glucuronyl esterase activity and polynucleotides encoding same
CN113234695A (zh) 2012-04-27 2021-08-10 诺维信股份有限公司 Gh61多肽变体以及编码其的多核苷酸
US9982249B2 (en) 2012-07-24 2018-05-29 Bp Corporation North America Inc. Xylose isomerases and their uses
CN104797708A (zh) 2012-08-29 2015-07-22 拉勒曼德匈牙利流动性管理有限责任公司 酵母中用于木质纤维素衍生的寡聚物cbp的酶的表达
US8748152B1 (en) 2012-09-14 2014-06-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Prevotella ruminicola xylose isomerase and co-expression with xylulokinase in yeast for xylose fermentation
BR112015005884A2 (pt) 2012-09-19 2017-08-08 Novozymes Inc E Novozymes As processos para degradação de um material celulósico, para produção de um produto da fermentação, e de fermentação de um material celulósico, composição, e, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células
EP2903412B1 (en) 2012-10-08 2019-09-11 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
KR20150070151A (ko) 2012-10-16 2015-06-24 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 5탄당 전환이 개선된 세포
US20150275194A1 (en) 2012-10-24 2015-10-01 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
CN104769099A (zh) 2012-11-07 2015-07-08 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 pH控制的酵母繁殖
WO2014093835A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2014099798A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancinc activity and polynucleotides encoding same
US20140178954A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 E I Du Pont De Nemours And Company Expression of xylose isomerase activity in yeast
EP2956465A1 (en) 2013-02-15 2015-12-23 Stichting Energieonderzoek Centrum Nederland Process for the treatment of lignocellulosic biomass
NL2011164C2 (en) 2013-07-15 2015-01-21 Stichting Energie Improved process for the organosolv treatment of lignocellulosic biomass.
WO2014130812A1 (en) 2013-02-21 2014-08-28 Novozymes A/S Methods of saccharifying and fermenting a cellulosic material
CN105164254B (zh) 2013-03-08 2019-06-28 诺维信公司 纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸
NZ743055A (en) 2013-03-08 2020-03-27 Xyleco Inc Equipment protecting enclosures
US9187743B2 (en) 2013-03-11 2015-11-17 E I Du Pont De Nemours And Company Bacterial xylose isomerases active in yeast cells
US8669076B1 (en) 2013-03-11 2014-03-11 E I Du Pont De Nemours And Company Cow rumen xylose isomerases active in yeast cells
US9340767B2 (en) 2013-03-13 2016-05-17 Poet Research, Inc. Propagating an organism and related methods and compositions
US9034631B2 (en) 2013-03-14 2015-05-19 Poet Research, Inc. Systems and methods for yeast propagation
JP6027559B2 (ja) 2013-03-28 2016-11-16 株式会社豊田中央研究所 キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質及びその利用
EP2986707A2 (en) 2013-04-15 2016-02-24 VIB vzw Yeast alleles involved in maximal alcohol accumulation capacity and tolerance to high alcohol levels
CN105283546A (zh) 2013-05-10 2016-01-27 诺维信公司 具有木聚糖酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
US10689681B2 (en) 2013-05-31 2020-06-23 Dsm Ip Assets B.V. Microorganisms for diterpene production
JP5845210B2 (ja) 2013-06-13 2016-01-20 トヨタ自動車株式会社 組換え酵母、及びそれを用いたエタノールの製造方法
AU2014292150B2 (en) 2013-07-15 2019-04-04 Dsm Ip Assets B.V. Diterpene production
DK3022300T3 (en) 2013-07-17 2018-10-22 Novozymes As : Pullulan chimeras and polynucleotides encoding them
EP3536697A1 (en) 2013-07-31 2019-09-11 DSM IP Assets B.V. Recovery of steviol glycosides
CA2919157A1 (en) 2013-09-04 2015-03-12 Novozymes A/S Processes for increasing enzymatic hydrolysis of cellulosic material
AU2014331605A1 (en) 2013-10-04 2016-05-12 Corbion Biotech, Inc. Tailored oils
JP6210487B2 (ja) * 2013-10-11 2017-10-11 国立大学法人山口大学 キシロース資化能を有するエタノール生産酵母を生産する方法
CN105658804A (zh) 2013-11-01 2016-06-08 诺维信公司 糖化和发酵纤维素材料的方法
EP3074513A1 (en) 2013-11-26 2016-10-05 Novozymes A/S Enzyme compositions and uses thereof
KR20150065213A (ko) 2013-12-04 2015-06-15 삼성전자주식회사 감소된 에탄올 생산능을 갖는 효모 세포 및 이의 용도
EP3511418B1 (en) 2014-01-07 2020-07-15 Novozymes A/S Corollospora maritima mannanase and its use
DK3097192T3 (en) 2014-01-22 2018-11-19 Novozymes As PULLULANASE VARIATIONS AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
WO2015160887A1 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Shell Oil Company Processes for producing fermentation products
WO2015160257A1 (en) 2014-04-18 2015-10-22 Moralco B.V. Use of acetaldehyde in the fermentative production of ethanol
WO2015166645A1 (ja) 2014-04-28 2015-11-05 国立大学法人山口大学 キシロース資化能及びエタノール生産能を有する酵母
MY182924A (en) 2014-06-06 2021-02-05 Novozymes As Enzyme compositions and uses thereof
BR112016029855B1 (pt) 2014-06-24 2023-01-17 Poet Research, Inc. Método para inocular leveduras para fermentação e sistema de fermentação para inocular leveduras entre dois ou mais reatores de fermentação
BR112017000414A2 (pt) 2014-07-10 2017-11-07 Terravia Holdings Inc genes cetoacil-acp sintase e utilizações dos mesmos
US10619173B2 (en) 2014-07-22 2020-04-14 Iogen Corporation Process for using biogenic carbon dioxide derived from non-fossil organic material
WO2016011555A1 (en) 2014-07-22 2016-01-28 Iogen Corporation Process for producing fuel using two fermentations
US10793887B2 (en) 2014-08-21 2020-10-06 Novozymes A/S Process for saccharifying cellulosic material under oxygen addition
US11390898B2 (en) 2014-09-05 2022-07-19 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
DK3198001T3 (da) 2014-09-23 2021-11-08 Novozymes As Fremgangsmåde til fremstilling af ethanol og fermentering af organismer
ES2743515T3 (es) 2014-10-23 2020-02-19 Novozymes As Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican las mismas
BR102014027233A2 (pt) * 2014-10-30 2016-05-24 Biocelere Agroindustrial Ltda cassete de expressão, micro-organismo geneticamente modificado para expressão de xilose isomerase, processo para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e biocombustível e/ou bioquímicos produzidos
JP6303984B2 (ja) 2014-10-31 2018-04-04 トヨタ自動車株式会社 連続培養によるエタノールの製造方法及び連続培養装置
WO2016087327A1 (en) 2014-12-01 2016-06-09 Novozymes A/S Polypeptides having pullulanase activity comprising the x25, x45 and cbm41 domains
US11434509B2 (en) 2014-12-08 2022-09-06 Iogen Corporation Process for using biogenic carbon dioxide derived from non-fossil organic material
EP4001419A1 (en) 2015-01-28 2022-05-25 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2016120298A1 (en) 2015-01-28 2016-08-04 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US10287610B2 (en) 2015-01-28 2019-05-14 Dsm Ip Assets B.V. Integrated process for coproducing alcohol and organic acid from lignocellulosic material
NL1041192B1 (en) 2015-02-16 2017-01-05 Stichting Energieonderzoek Centrum Nederland Separation of lignin from organosolv liquors.
WO2016138167A2 (en) 2015-02-24 2016-09-01 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
US20180051306A1 (en) 2015-03-12 2018-02-22 Novozymes A/S Enzymatic Hydrolysis with Hemicellulolytic Enzymes
WO2016145363A1 (en) 2015-03-12 2016-09-15 Novozymes A/S Multi-stage enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass employing an oxidoreductase with an aa9 polypeptide
BR112017019332A2 (pt) 2015-03-12 2018-07-24 Beta Renewables Spa processos para melhorar um rendimento de glicose ou xilose de sacarificação de um material lignocelulósico e para produzir um produto de fermentação a partir de um material lignocelulósico
US10421667B2 (en) 2015-03-16 2019-09-24 Iogen Corporation Process for treating lignocellulosic feedstock comprising wet oxidation
CA2979931A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Dsm Ip Assets B.V. Udp-glycosyltransferases
WO2016145531A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Iogen Corporation Sulfur dioxide and/or sulfurous acid pretreatment with sulfur dioxide recovery
WO2016145527A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Iogen Corporation Process comprising acid pretreatment and enzymatic hydrolysis
WO2016151046A1 (en) 2015-03-23 2016-09-29 Dsm Ip Assets B.V. Udp-glycosyltransferases from solanum lycopersicum
BR112017021066B1 (pt) 2015-04-03 2022-02-08 Dsm Ip Assets B.V. Glicosídeos de esteviol, método para a produção de um glicosídeo de esteviol, composição, usos relacionados, gênero alimentício, alimento para animais e bebida
WO2016169892A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2016169893A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Whole fermentation broth
CA2980649A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Geranylgeranyl pyrophosphate synthase
CN116676293A (zh) 2015-05-27 2023-09-01 国投生物科技投资有限公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
WO2016201184A1 (en) * 2015-06-11 2016-12-15 Ebio, Llc Efficient production of biofuels from cells carrying a metabolic-bypass gene cassette
CA2981342A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 Novozymes A/S Polypeptides having trehalase activity and the use thereof in process of producing fermentation products
WO2016207144A1 (en) 2015-06-22 2016-12-29 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP4043579A1 (en) 2015-07-10 2022-08-17 DSM IP Assets B.V. Method for preparing a steviol glycoside compostion
JP6977231B2 (ja) 2015-07-13 2021-12-08 マラ リニューアブルズ コーポレーション Ｃ５有機炭素の微生物による代謝の増強
US20180216089A1 (en) 2015-07-24 2018-08-02 Novozymes, Inc. Polypeptides Having Beta-Xylosidase Activity And Polynucleotides Encoding Same
CN108138153A (zh) 2015-07-24 2018-06-08 诺维信股份有限公司 具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
EP3332004A1 (en) 2015-08-05 2018-06-13 Cargill, Incorporated Xylose isomerase-modified yeast strains and methods for bioproduct production
WO2017025649A1 (en) 2015-08-13 2017-02-16 Dsm Ip Assets B.V. Steviol glycoside transport
CN108350044B (zh) 2015-09-22 2022-05-24 诺维信公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
WO2017049394A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Iogen Corporation Wet oxidation of biomass
CA2999638A1 (en) 2015-10-05 2017-04-13 Dsm Ip Assets B.V. Kaurenoic acid hydroxylases
WO2017070219A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Novozymes A/S Lytic polysaccharide monooxygenase (lpmo) variants and polynucleotides encoding same
CA3002682C (en) 2015-11-25 2022-06-21 Iogen Energy Corporation System and method for cooling pretreated biomass
US10662455B2 (en) 2015-12-18 2020-05-26 Iogen Corporation Sulfur dioxide and/or sulfurous acid pretreatment
BR112018016366A2 (pt) 2016-02-10 2018-12-18 Iogen Corp processos para hidrolisar biomassa lignocelulósica e para pré-tratamento de biomassa lignocelulósica.
CN109415712A (zh) 2016-03-02 2019-03-01 诺维信公司 纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸
DK3433358T3 (da) 2016-03-24 2022-09-26 Novozymes As Cellobiohydrolasevarianter og polynukleotider, der koder for dem
US20190112590A1 (en) 2016-04-08 2019-04-18 Ei Du Pont De Nemours And Company Arabinose isomerases for yeast
WO2017205535A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
EP3469090A1 (en) 2016-06-09 2019-04-17 DSM IP Assets B.V. Seed train for large scale enzyme production
JP6447583B2 (ja) 2016-06-24 2019-01-09 トヨタ自動車株式会社 組換え酵母、及びそれを用いたエタノールの製造方法
WO2018015303A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 Novozymes A/S Serine protease variants and polynucleotides encoding same
CN109642225A (zh) 2016-07-21 2019-04-16 诺维信公司 丝氨酸蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
US10913938B2 (en) 2016-07-29 2021-02-09 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and uses thereof
WO2018026868A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
EP3497110A1 (en) 2016-08-09 2019-06-19 DSM IP Assets B.V. Crystallization of steviol glycosides
EP3497109A1 (en) 2016-08-09 2019-06-19 DSM IP Assets B.V. Crystallization of steviol glycosides
WO2018073107A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Dsm Ip Assets B.V. Eukaryotic cell comprising xylose isomerase
CA3040585A1 (en) 2016-10-27 2018-05-03 Dsm Ip Assets B.V. Geranylgeranyl pyrophosphate synthases
WO2018085370A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Novozymes A/S Processes for reducing production of primeverose during enzymatic saccharification of lignocellulosic material
WO2018083301A2 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Inbicon A/S Method for preparing fermentable sugars from lignocellulosic biomass
US20190276809A1 (en) 2016-11-24 2019-09-12 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
BR112019010355B1 (pt) 2016-11-24 2024-03-05 Dsm Ip Assets B.V. Composição de enzimas
US20210292723A1 (en) 2016-11-29 2021-09-23 Novozymes A/S Alpha-Amylase Variants and Polynucleotides Encoding Same
CN110168095A (zh) 2016-12-06 2019-08-23 诺维信公司 用于使用工程化酵母菌株从含有木糖的纤维素基质生产乙醇的改善方法
CA3045722A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Dsm Ip Assets B.V. Kaurenoic acid hydroxylases
BR112019012949A2 (pt) 2016-12-21 2019-11-26 Globalyeast N V isomerases de xilose que conferem capacidade de fermentação eficiente de xilose em levedura
WO2018114995A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Dsm Ip Assets B.V. Fermentation process for producing steviol glycosides
WO2018185071A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US11091753B2 (en) 2017-05-31 2021-08-17 Novozymes A/S Xylose fermenting yeast strains and processes thereof for ethanol production
WO2018222990A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Novozymes A/S Improved yeast for ethanol production
EP4155400A1 (en) 2017-06-27 2023-03-29 DSM IP Assets B.V. Udp-glycosyltransferases
US11584783B2 (en) 2017-06-28 2023-02-21 Novozymes A/S Processes for producing a fermentation product
US11220679B2 (en) 2017-08-08 2022-01-11 Novozymes A/S Polypeptides having trehalase activity
EP3676386A1 (en) 2017-08-30 2020-07-08 Novozymes A/S Combined use of an endo-protease of the m35 family and an exo-protease of the s53 family in the fermentation of starch
US11319559B2 (en) 2017-10-09 2022-05-03 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CA3078156A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2019086370A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2019090413A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Iogen Corporation Low temperature sulfur dioxide pretreatment
WO2019090414A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Iogen Corporation Low temperature pretreatment with sulfur dioxide
BR112020007140A2 (pt) 2017-11-14 2020-09-29 Dsm Ip Assets B.V. polipeptídeos com especificidade de transporte de arabinose melhorada
BR112020009540A2 (pt) 2017-11-16 2020-11-03 Poet Research, Inc. métodos para propagar micro-organismos para fermentação e métodos e sistemas relacionados
WO2019118869A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 Poet Research, Inc. Method for propagating microorganisms on a medium comprising stillage
CA3089135A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 Novozymes A/S Microorganisms with improved nitrogen utilization for ethanol production
US11198847B2 (en) 2018-02-01 2021-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Yeast cell capable of simultaneously fermenting hexose and pentose sugars
WO2019185737A1 (en) 2018-03-27 2019-10-03 Basf Se Xylose metabolizing yeast
WO2019185680A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
WO2019185681A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
WO2019191828A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Iogen Corporation Pretreatment with lignosulfonic acid
WO2019211230A1 (en) 2018-04-30 2019-11-07 Dsm Ip Assets B.V. Steviol glycoside transport
WO2019219804A1 (en) 2018-05-17 2019-11-21 Dsm Ip Assets B.V. Process for producing a polypeptide
CA3099202A1 (en) 2018-05-30 2019-12-05 Dsm Ip Assets B.V. Process for producing sugars from carbohydrate materials
CA3107110A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Novozymes A/S Enzyme-expressing yeast for ethanol production
WO2020058253A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058249A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058248A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
JP7078900B2 (ja) 2018-10-05 2022-06-01 トヨタ自動車株式会社 形質転換酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法
WO2020076697A1 (en) 2018-10-08 2020-04-16 Novozymes A/S Enzyme-expressing yeast for ethanol production
EP3894551A1 (en) 2018-12-12 2021-10-20 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP3938525A1 (en) 2019-03-12 2022-01-19 DSM IP Assets B.V. Process for producing a fermentation broth
EP4004029A1 (en) 2019-07-26 2022-06-01 Novozymes A/S Microorganisms with improved nitrogen transport for ethanol production
MX2021015818A (es) 2019-08-06 2022-02-03 Novozymes As Proteinas de fusion para mejorar la expresion de enzimas.
EP4028536A1 (en) 2019-09-10 2022-07-20 DSM IP Assets B.V. Enzyme composition
BR112022011271A2 (pt) 2019-12-10 2022-09-06 Novozymes As Célula hospedeira recombinante, composição, métodos para produzir um derivado de uma célula e um produto de fermentação, e, uso de uma célula hospedeira recombinante
WO2022049250A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Novozymes A/S Improved fermenting organism for ethanol production
EP4232568A1 (en) 2020-10-22 2023-08-30 DSM IP Assets B.V. Microorganisms for diterpene production
WO2022214458A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
WO2022214459A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
BR112023020370A2 (pt) 2021-04-06 2023-11-21 Dsm Ip Assets Bv Composição de enzimas
AU2022253636A1 (en) 2021-04-08 2023-06-01 Versalis S.P.A. Process for the preparation of a sugar product and a fermentation product
BR112023025624A2 (pt) 2021-06-07 2024-02-27 Novozymes As Célula de levedura recombinante, célula hospedeira recombinante, composição, cocultura, métodos de produção de um derivado de uma célula hospedeira recombinante e de produção de um produto de fermentação, e, uso de uma célula hospedeira recombinante

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5643758A (en) * 1987-03-10 1997-07-01 New England Biolabs, Inc. Production and purification of a protein fused to a binding protein
US5190877A (en) * 1987-09-03 1993-03-02 Gist-Brocades N.V. Saccharomyces strains for maltose fermentation
DE69432543T2 (de) 1993-07-23 2003-12-24 Dsm Nv Selektionmarker-genfreie rekombinante Stämme: Verfahren zur ihrer Herstellung und die Verwendung dieser Stämme
GB9502413D0 (en) * 1995-02-08 1995-03-29 Primalco Ltd Xylose isomerase
US5935837A (en) * 1997-07-28 1999-08-10 Novo Nordisk A/S DNA constructs and methods of producing xylose isomerase
SE9901298D0 (sv) 1999-04-09 1999-04-09 Forskarpatent I Syd Ab Xylose isomerase with improved kinetic properties
ES2319757T5 (es) * 2002-01-23 2018-05-22 Dsm Ip Assets B.V. Fermentación de azúcares de pentosa
DK2301949T3 (en) 2003-05-02 2015-07-20 Cargill Inc Genetically modified yeast species and fermentation methods using genetically modified yeast
CN101914462B (zh) 2004-07-16 2013-04-24 Dsm知识产权资产有限公司 发酵木糖的真核细胞的代谢工程
CN101965401B (zh) 2008-03-07 2014-06-04 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 发酵戊糖的细胞
JP5821132B2 (ja) 2008-12-24 2015-11-24 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． キシロース異性化酵素遺伝子及びペントース糖の発酵におけるそれらの使用
CN102174549B (zh) 2011-02-22 2012-10-10 山东大学 一种编码木糖异构酶的核酸分子及其编码的木糖异构酶
CN103131720A (zh) 2011-11-23 2013-06-05 中国农业科学院作物科学研究所 一种真菌木糖异构酶基因及其应用

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