JP2014510749A

JP2014510749A - ソウハクヒから単離された化合物の用途

Info

Publication number: JP2014510749A
Application number: JP2014502451A
Authority: JP
Inventors: チャン、ファンボン; ヨン、ザビョン; イ、ヒョンヨン; チェ、ヒョンシック; イ、ヒョンボック
Original assignee: ドンファファームカンパニーリミテッド
Priority date: 2011-03-28
Filing date: 2012-03-26
Publication date: 2014-05-01
Also published as: AU2012237084A1; CA2830639A1; EP2691092A2; WO2012134126A2; US20140018552A1; CN103476408A; WO2012134126A3; KR20120111771A; EP2691092A4; ZA201307248B

Abstract

本発明は、ソウハクヒから単離された化合物を有効成分として含有する、糖尿合併症の誘発を抑制させることが可能な最終糖化産物生成抑制剤または健康機能食品を提供する。本発明は、ソウハクヒ(Morus Bark)から単離されたムルベロフランＧ(mulberrofuran G)、ムルベロフランＫ(mulberrofuran K)、クワノンＧ(kuwanon G)、クワノンＺ(kuwanon Z)、オキシレスベラトロール(oxyresveratrol)、２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン(2′ 4′, 5, 7- tetrahydroxyflavanone)、モルシグニンＬ(morusignin L)およびジヒドロモリン(dihydromorin)の中から選ばれる化合物が、糖尿合併症の原因物質である最終糖化産物の精製を抑制し、糖尿合併症、例えば糖尿病性ネフロパシー、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害の誘発を抑制させることが可能な最終糖化産物生成抑制剤およびこれを改善することが可能な健康機能食品として有用に利用できる。

Description

本発明は、ソウハクヒ（桑白皮； Morus Bark）から単離された化合物を有効成分として含有する、糖尿合併症の誘発を抑制できる最終糖化産物生成抑制剤または健康機能食品に関する。

全世界的に代表的な成人疾患の一つである糖尿病は、インスリンの非正常的な分泌または機能などにより高血糖状態が持続することを特徴とする。最近、韓国でも食生活などの西欧化および老齢人口の増加などにより糖尿有病率が急速に増加している。

糖尿による合併症は急性疾患と慢性疾患に大別される。急性疾患としては、糖尿病性ケトアシドーシス(diabetic ketoacidosis)、高血糖性高浸透圧症候群(hyperglycemic hyperosmolar syndrome)などがあり、慢性疾患としては、微小血管障害(microvascular disease)である糖尿病性ネフロパシー(diabetic nephropathy)、糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)及び糖尿病性神経障害(diabetic neuropathy)、大血管障害(macrovascular disease)である糖尿病性心筋症(diabetic cardiomyopathy)、脳血管疾患などがある。

前記糖尿合併症が誘発された疾患を治療および予防するための薬物としては、最終糖化産物生成抑制剤、アルドース還元酵素活性抑制剤、形質転換成長因子−β受容体活性抑制剤などがある。

最終糖化産物生成抑制剤は、高血糖状態(hyperglycemia)が持続してタンパク質の非酵的糖化反応(nonenzymatic glycation)を介して生成された最終糖化産物（Advanced glycation end products、ＡＧＥｓ）に起因した糖尿合併症の誘発を抑制させることにより、最終糖化産物の生成を抑制する。

長期間の高血糖状態が持続する場合、血管にあるブドウ糖を始めとする還元糖(reducing sugar)がタンパク質や脂質などと非酵素的に結合および再配列(rearrangement)などをしてタンパク質や脂質などの構造的、機能的変化を引き起こし、この過程で非可逆的な最終糖化産物が生成される。また、このような高血糖過程で形成された最終糖化産物は、コラーゲン(collagen)やフィブロネクチン(fibronectin)など寿命の長い細胞外基質タンパク質(extracellular matrix protein)との交差結合および細胞表面の最終糖化産物受容体（ＲＡＧＥ、Receptor for AGEs）との結合を介してシグナル伝達メカニズムによって糖尿合併症を誘発すると知られている(Schmidt, A. M., et. al., 2000, Trends Endocrinol. Metab. 11, 368-375)。

最終糖化産物によって誘発される糖尿合併症の種類をより詳細に考察する。最終糖化産物は、転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）依存的または非依存的方法でＳｍａｄ−２／３を活性化させて糖尿病性ネフロパシーを誘発させ(Li, J. H., et. al., 2004, FASEB J. 18, 176-178; Fukami K., et. al., 2004, Kidney Int. 66, 2137-2147; Chung, C. K., et. al., 2010, J. Am. Soc. Nephrol.. 21, 249-260)、最終糖化産物受容体（Receptor for advanced glycation end product、ＲＡＧＥ）との相互作用を介して糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を誘発させると報告されている(Barile G. R., et. al., 2005, Invest Ophthalmol Vis Sci. 46(8), 2916-2924; Toth C., et. al., 2008, Diabetes. 57(4), 1002-1017)。

最終糖化産物生成抑制剤を投与した動物実験において、糖尿病性ネフロパシー(Osicka T. M., et. al., 2000, Diabetes. 49(1), 87-93; Yang C. W., et. al., 1994, Proc Natl Acad Sci U S A. 91(20), 9436-9440)、糖尿病性網膜症(Hammes H. P., et. al., 1991, Proc Natl Acad Sci U S A. 88(24), 11555-11558)、糖尿病性神経障害(Duran-Jimenez B., et. al., 2009, Diabetes. 58(12), 2893-2903)などの誘発が有意的に抑制された。

代表的な最終糖化産物生成抑制剤としてはアミノグアニジン(aminoguanidine)とピリドキサミン(pyridoxamine)（製品名：ピリドリン）が挙げられるが、アミノグアニジンは臨床３床実験でビタミンＢの欠乏に関連した毒性により開発が中断され、ピリドキサミンは最近、臨床２床を済ませて３床準備中にある。未だ商品化された薬物はない実情である。

一方、ソウハクヒ(Morus Bark)は、桑の根の皮から作った薬材であって、鎮咳、利尿、血圧降下、鎮静、鎮痛、解熱、鎮痙、抗菌などの薬理作用が知られている（斗山百科Ｅｎｃｙｂｅｒ＆Ｅｎｃｙｂｅｒ．ｃｏｍ）。

ソウハクヒから多くの成分が単離され、これらに関する多くの研究が行われてきた。ソウハクヒから分離されたモラシンＯ(moracin O)、モラシンＰ(moracin P)およびムルベロフランＨ(mulberrofuran H)は、各種ガンおよび糖尿病性網膜症を誘発する低酸素誘導因子−１（Hypoxia Inducible Factor-1、ＨＩＦ−１）の活性を抑制する作用があることが知られ（韓国特許出願第２００７−７８８８８号）、モラシンＭ(moracin-M)は糖尿病性マウスから血糖降下作用が報告されている(Zang M., et. al., 2009, Fitoterapia 80(8) 475-477)。また、クワノンＬ(kuwanon-L)は、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ１（protein tyrosin phosphatase 1B1、ＰＴＰ１Ｂ１）抑制作用があり(Cui L., et. al., 2006, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16(5) 1426-1429)、モリン（３，７，２’，４’−ペンタヒドロキシフラボン）は低密度脂タンパク質（low density lipoprotein、ＬＤＬ）の糖化作用抑制効果およびＴＧＦ受容体IIの拮抗作用が報告されている(Gaffari M. A., et. al., 2007, Iran Biomed. J. 11(3) 185-191; Shimanuki T., et. al., 2007, Oncogene 26(23) 3311-3320)。

前記ソウハクヒから単離された物質の他にも、ムルベロフランＧ(mulberrofuran G)、ムルベロフランＫ(mulberrofuran K) 、クワノンＧ(kuwanon G)、クワノンＺ(kuwanon Z)、オキシレスベラトロール(oxyresveratrol)、２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン(2',4',5',7-tetrahydroxyflavanone)、モルシグニンＬ(morusignin L)およびジヒドロモリン(dihydromorin)などがソウハクヒ単離物質として公知になっている。

前記ソウハクヒから単離されたムルベロフランＧ、ムルベロフランＫ、クワノンＧの化合物は、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒタイプの付加物(Deles-Alder type adduct)であり、クワノンＺはシルベン(Silbene)誘導体であり、オキシレスベラトロールはクマリン誘導体であり、２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン、モルシグニンＬおよびジヒドロモリンはフラボノイド誘導体であって、下記のとおりその用途が知られている。

ムルベロフランＧは、下記[化１]の構造を示し、チロシナーゼ(tyrosinase)阻害作用(Zheng Z. P., et. al., 2010, Agric. Food Chem. 58(9) 5368-5373)および抗酸化作用(Dai S. J., et. al., 2004, Chem. Pharm. Bull (Tokyo) 52(10) 1190-1193)を有する。

ムルベロフランＫは、下記[化２]の構造を示し、抗酸化効果(Dai S. J., et. al., 2004, Chem. Pharm. Bull (Tokyo) 52(10) 1190-1193)を有することが知られている。

クワノンＧは、下記[化３]の構造を示し、抗菌作用(Park. K. M., et. al., 2003, J. Ethnopharmacol. 84(2-3) 181-185)およびボンベシン受容体(bombesin receptor)拮抗作用(Mihara S., et. al., 1995, Biochem Biophys Res Commun. 15;213(2):594-9)を有することが知られている。

クワノンＺは、下記[化４]の構造を示し、その作用については研究されたことがない。

オキシレスベラトロールは、下記[化５]の構造を示し、韓国特許出願第２００９−１１２２２２号にソウハクヒからの分離製造方法が開示されており、前記特許には美白作用について記載しており、抗酸化作用(Lorenz P., et. al., 2003, Nitric Oxide 9(2): 64)および抗炎作用(Jung K. O., et. al., 2003, J Pharm Pharmacol 55(12): 1695)などを有することが知られている。

２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン化合物は、下記[化６]の構造を示し、その作用については知られていない。

モルシグニンＬは、下記[化７]の構造を示し、１９９３年に構造が解明されたが(Yoshio H., et. al., 1993, Heterocycles 36(6) 1359-1366)、その作用については知られていない。

ジヒドロモリンは、下記[化８]の構造を示し、チロシナーゼ阻害作用(Kuniyoshi S., et. al., 1998, Plata Medica 64(5) 408-412)を有することが知られている。

本発明者は、ソウハクヒ抽出物から単離された化合物の作用をスクリーニングする途中で、前記[化１]〜[化８]の化合物が糖尿合併症を誘発する最終糖化産物の生成を抑制する作用を有することを見出して、前記[化１]〜[化８]の化合物を含有する糖尿合併症の誘発を抑制できる最終糖化産物生成抑制剤への開発可能性を確認し、本発明を完成した。

本発明は、ソウハクヒから単離された化合物を用いて糖尿合併症の誘発を抑制することが可能な最終糖化産物生成抑制剤を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記化合物が含有された食品を摂取することにより、糖尿患者の第２次症状である糖尿合併症の誘発環境を改善することが可能な用途を有する健康機能食品を提供することを目的とする。

本発明は、ソウハクヒから単離されたムルベロフランＧ(mulberrofuran G)、ムルベロフランＫ(mulberrofuran K)、クワノンＧ(kuwanon G)、クワノンＺ(kuwanon Z)、オキシレスベラトロール(oxyresveratrol)、２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン(2′, 4′, 5, 7- tetrahydroxyflavanone)、モルシグニンＬ(morusignin L)およびジヒドロモリン(dihydromorin)の中から選ばれる化合物を有効成分として含有する、糖尿合併症の誘発を抑制できる最終糖化産物生成抑制剤を提供する。

本発明は、ソウハクヒから単離されたムルベロフランＧ、ムルベロフランＫ、クワノンＧ、クワノンＺ、オキシレスベラトロール、２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン、モルシグニンＬおよびジヒドロモリンの中から選ばれる化合物を用いて糖尿合併症の誘発を抑制させる最終糖化産物生成抑制剤または健康機能食品として有用に利用できる。

特に、本発明は、糖尿合併症、例えば糖尿病性ネフロパシー、糖尿病性網膜症または糖尿病性神経障害疾患を予防および治療することができる。

本発明に係る[化１]〜[化８]の化合物についての最終糖化産物生成抑制を示す図である。

最終糖化産物（Advanced glycation end products、ＡＧＥｓ）は、糖尿合併症を誘発する原因物質である。最終糖化産物の種類としては、ペントシジン(pentosidine)やアルグピリミジン(argpyrimidine)などの蛍光性物質と、Ｎ−カルボキシメチルリシン（N-carboxymethyl lysine、ＣＭＬ）、Ｎ−カルボキシエチルリシン（N-carboxyethyl lysine、ＣＥＬ）などの非蛍光性物質がある。

したがって、蛍光分析法を用いた実験法(Monnier, V. M., et. al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 583-587)や、最終糖化産物に特異的な抗体を用いた実験法(Horie H., et. al., 1997, J. Clin. Invest. 100(12), 2995-3004)などがよく定立されており、これらの方法によって最終糖化産物の生成程度を確認することができる。

本発明は、ソウハクヒから単離されたムルベロフランＧ、ムルベロフランＫ、クワノンＧ、クワノンＺ、オキシレスベラトロール、２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン(2′, 4′, 5, 7- tetrahydroxyflavanone)、モルシグニンＬ(morusignin L)およびヒドロモリン(dihydromorin)の化合物に対して、蛍光分析用マイクロプレートリーダー(microplate reader)（励起(Excitation)：３６０ｎｍ、エミッション(Emission)：４６５ｎｍ）を用いて、培養液で生成された最終糖化産物の量を測定した抑制効能値（ＩＣ₅₀）、および最終糖化産物に特異的な抗体および最終糖化産物の種類のうちの代表的な非蛍光性物質ＣＭＬに特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析法(western blot analysis)で測定した最終糖化産物の量の抑制程度を確認することにより、糖尿合併症を引き起こす原因物質である最終糖化産物の生成抑制作用を示すことを確認した。

したがって、本発明のソウハクヒから単離された前記ムルベロフランＧ、ムルベロフランＫ、クワノンＧ、クワノンＺ、オキシレスベラトロール、２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン、モルシグニンＬおよびジヒドロモリンの化合物は、糖尿合併症の誘発を抑制させることが可能な最終糖化産物生成抑制剤の医薬的用途を有する。

特に、最終糖化産物によって糖尿病性ネフロパシーが誘発され(Li, J. H., et. al., 2004, FASEB J. 18, 176-178; Fukami K., et. al., 2004, Kidney Int. 66, 2137-2147; Chung, C. K., et. al., 2010, J. Am. Soc. Nephrol.. 21, 249-260)、最終糖化産物受容体（Receptor for advanced glycation end product、ＲＡＧＥ）との相互作用を介して糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害が誘発されるので(Barile G. R., et. al., 2005, Invest Ophthalmol Vis Sci. 46(8), 2916-2924; Toth C., et. al., 2008, Diabetes. 57(4), 1002-1017)、本発明に係る最終糖化産物生成抑制剤は、最終糖化産物生成抑制作用によって糖尿合併症、例えば糖尿病性ネフロパシー、糖尿病性網膜症または糖尿病性神経障害疾患を予防および治療することができる。

本発明に係る最終糖化産物生成抑制剤は、実際臨床投与の際に経口および非経口の様々な剤形で投与でき、最も好ましい投与経路は経口投与である。また、製剤化する場合には、一般に用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。

経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などを含むことができ、このような固形製剤は、一つ以上の賦形剤、例えば、微結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、コロイド性二酸化珪素、ケイ酸カルシウム、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて製造することができ、単純な賦形剤以外にもステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用できる。また、経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、一般に用いられる単純希釈剤である水、流動パラフィン以外にも様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。

非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール(Propylene glycol)、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性オイル、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾル(witepsol)、マクロゴール、ツイン(Tween)６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。

しかも、本発明に係る最終糖化産物生成抑制剤の投与量または服用量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度によってその範囲が異なり、成人を基準に、ムルベロフランＧ、ムルベロフランＫ、クワノンＧ、クワノンＺ、オキシレスベラトロール、２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン、モルシグニンＬおよびジヒドロモリンは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇを１回または数回に分けて服用することが好ましい。

本発明は、ソウハクヒから単離された物質である、ムルベロフランＧ、ムルベロフランＫ、クワノンＧ、クワノンＺ、オキシレスベラトロール、２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン、モルシグニンＬおよびジヒドロモリンの中から選ばれる物質を含み、食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含む健康機能食品に関する。

本発明は、前記化合物が含有された食品を摂取することにより、糖尿患者の第２次症状である糖尿合併症の誘発環境を改善することができる。具体的に、本発明は、最終糖化産物によって誘発された糖尿合併症として現れる疾患の症状を改善させることが可能な最終糖化産物生成抑制機能を有する健康機能食品を提供する。

本発明において、最終糖化産物生成抑制機能を有する健康機能食品は、ソウハクヒから単離されたムルベロフランＧ、ムルベロフランＫ、クワノンＧ、クワノンＺ、オキシレスベラトロール、２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン、モルシグニンＬおよびジヒドロモリンの中から選ばれる化合物を含有するものである。

本発明において、前記化合物に対して蛍光分析用マイクロプレートリーダー（励起(Excitation)：３６０ｎｍ、エミッション(Emission)：４６５ｎｍ）を用いて、培養液で生成された最終糖化産物の量を測定した抑制効能値（ＩＣ₅₀）、および最終糖化産物に特異的な抗体および最終糖化産物の種類のうちの代表的な非蛍光性物質ＣＭＬに特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析法(western blot analysis)で測定した最終糖化産物の量の抑制程度を確認することにより、糖尿合併症を引き起こす原因物質である最終糖化産物の生成抑制作用があることを明らかにした。

したがって、本発明は、最終糖化産物によって誘発された糖尿合併症、例えば糖尿病性フルロパシー、糖尿病性網膜症または糖尿病性神経障害疾患の症状を改善させることが可能な最終糖化産物生成抑制機能を有する健康機能食品として有用に利用できる。

本発明に係る最終糖化産物生成抑制機能を有する健康機能食品は、各種食品類、例えば、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあり、丸薬、粉末、顆粒、浸剤、錠剤、カプセルまたは飲料の形で使用することができる。

この際、食品または飲料中の前記生薬抽出物の量は、一般に、本発明の健康食品の場合、全体食品重量の０．００１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜１重量％で添加することができ、健康飲料組成物の場合、１００ｍＬを基準として０．００１〜１０ｇ、好ましくは０．０１〜１ｇの比率で添加することができる。

本発明の健康飲料組成物は、指示された比率で必須成分として、前記ソウハクヒから単離された物質を含有する以外は通常の飲料と同様に、様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。

上述した天然炭水化物の例としては、単糖類（例えば、ブドウ糖、果糖など）、二糖類（例えば、マルトース、スクロースなど）、多糖類（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなど）などの通常の糖、またはキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリシルヒジンなど））および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の比率は本発明の健康機能食品１００ｍＬ当たり一般に約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。

上記の他にも、本発明の健康機能食品は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および風味増強剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有することができる。その他にも、本発明の健康機能食品は、天然果物ジュースおよび果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は独立に、または組み合わせて使用することができる。このような添加剤の比率は、あまり重要でないが、本発明の健康機能食品１００重量部当たり０〜約２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。

以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。但し、これらの実施例は本発明を例示するためのもので、本発明の範囲を制限するものではない。

ソウハクヒからのムルベロフランＧの製造および分析
１−１：ソウハクヒのメタノール抽出物
乾燥したソウハクヒ（３ｋｇ）を１０Ｌのメタノールで４時間ずつ３回繰り返し還流抽出し、濾過した後、減圧濃縮して１５０ｇのメタノール抽出物を得た。

１−２：ソウハクヒ抽出物からの有機溶媒分画物の製造
前記１−１で製造したソウハクヒのメタノール抽出物（１５０ｇ）を６Ｌの水に懸濁し、ヘキサン（３Ｌ、３回）と酢酸エチル（３Ｌ、３回）に順次分配し、ヘキサン抽出物（５０ｇ）および酢酸エチル抽出物（５０ｇ）を得た。この酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲルカラム５００ｇ）処理し、ジクロロメタン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）−メタノール（７０％：３０％、５０％：５０％、３０％：７０％、１０％：９０％、０：１００％）から構成される段階濃度勾配溶媒システムを適用して２５個の小分画物（ＭＡＥ−０１〜２５）を得た。

１−３：有機溶媒分画物からの活性分画物および化合物の製造
前記１−２で製造した酢酸エチルの小分画ＭＡ．Ｅ−１６を逆相シリカゲル（ＲＰ−１８）カラムクロマトグラフィー（メタノール：水＝１：１→３：１、メタノール、段階濃度勾配システム）処理し、小分画物１５個の分画物（ＭＡ．Ｅ−１６０１〜１６１５）を得た。これから得た分画物ＭＡ．Ｅ−１６０７を逆相シリカゲルクロマトグラフィー（ＲＰ−１８、メタノール：水＝１：１（２０００ｍＬ→２：１（１０００ｍＬ）処理して１０個の小分画（１６０７０１〜１６０７１０）に分け、この中でもＭＡ．Ｅ−１６０７０９を分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ｓｕｎｆｉｒｅ（登録商標）Ｃ１８、５μｍ、１９×１５０ｍｍｉ．ｄ．、５０％アセトニトリル、２８５ｎｍ、５ｍＬ／ｍｉｎ）処理し、分離精製して前記[化１]のムルベロフランＧ（５０ｍｇ）を得た。

ムルベロフランＧ：無定形のオレンジ色粉末
1H-NMR(500 MHz, CD3OD) : 1.76(3H, s, H-7″), 1.99(1H, dd, J =5.2, 16.9 Hz, H-6″), 2.63(1H, dd, J =11.8, 16.9 Hz, H-6″), 2.92(1H, ddd, J =5.2, 11.8, 11.8Hz, H-5″), 3.29(2H, H-3″, H-4″), 6.11(1H, dd, J =2.6, 8.6 Hz, H-13″), 6.29(1H, d, J =2.6 Hz, H-11″), 6.32(1H, d, J =2.3 Hz, H-17″), 6.38(1H, brs, H-2″), 6.43(1H, dd, J =2.3, 8.6 Hz, H-19″), 6.78(1H, d, J =1.4 Hz, H-2′), 6.70(1H, dd, J =2.3, 8.6 Hz, H-5), 6.87(2H, H-7, H-6′), 6.89(1H, H-3), 7.06(1H, d, J =8.6 Hz, H-20″), 7.11(1H, d, J =8.6 Hz, H-14″), 7.30(1H, d, J =8.6 Hz, H-4)
13C-NMR(125 MHz, CD3OD) : 22.6(C-7″), 27.5(C-5″), 34.1(C-3″), 35.4(C-6″), 36.3(C-4″), 97.2(C-7), 100.8(C-3), 101.8(C-8″), 102.8(C-17″), 103.2(C-11″), 103.7(C-6′), 104.1(C-2′), 105.7(C-13″), 108.7(C-19″), 111.9(C-5), 112.6(C-4′), 116.0(C-9″), 116.9(C-15″), 120.7(C-4), 121.8(C-3a), 122.0(C-2″), 126.7(C-20″), 129.3(C-14″), 130.2(C-1′), 132.6(C-1″), 152.3(C-16″), 153.6(C-5′), 154.4(C-2), 155.5(C-6), 155.9(C-7a), 156.4(C-18″), 156.6(C-10″), 157.1(C-3′), 158.7(C-12″)
1H-NMR(500 MHz, Acetone-d6) : 3.34(1H, dd, J =5.5, 12.0 Hz, H-4″)
ESI-MS (negative mode) m/z[M-H]- : 561

ソウハクヒからのムルベロフランＫの製造および分析
実施例１の１−２で製造した酢酸エチルの小分画ＭＡ．Ｅ−１４を逆相シリカゲル（ＲＰ−１８）カラムクロマトグラフィー（メタノール：水＝１：１→３：１、メタノール、段階濃度勾配システム）処理し、小分画物２０個の分画物（ＭＡ．Ｅ−１４０１〜１４２０）を得た。これから得た分画物ＭＡ．Ｅ−１４１７〜１４１８を逆相シリカゲルクロマトグラフィー（ＲＰ−１８、メタノール：水＝１：１（２０００ｍＬ）→２：１（１０００ｍＬ）処理し、２つの小分画に分けて分離精製することにより、前記[化２]のムルベロフランＫ（２０ｍｇ）を得た。

ムルベロフランＫ：淡黄色の結晶性粉末
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) : 1.24(3H, s, H-24″), 1.29(3H, s, H-25″), 1.74(3H, s, H-1″), 1.92(1H, dd, J =11.4, 16.2 Hz, H-6″), 2.68(1H, brs, H-6″), 2.77(1H, m, H-5″), 3.18(1H, brs, H-3″), 3.23(1H, dd, J =11.5 Hz, H-4″), 5.67(1H, d, J =9.9 Hz, H-22″), 6.23(1H, brs, H-17″), 6.24(1H, d, J =8 Hz, H-13″), 6.31(1H, brd, J =4.4 Hz, H-2″), 6.41(1H, dd, J =2.4, 8.4 Hz, H-19″), 6.57(1H, d, J =9.9 Hz, H-21″), 6.74(1H, dd, J =2, 8.4 Hz, H-5), 6.83(1H, d, J =1.5 Hz, H-2′), 6.92(3H, 1H・3, H-6′, H-7, H-14″), 7.08(1H, d, J =8.4 Hz, H-20″), 7.11(1H, s, H-3), 7.40(1H, d, J =8.4 Hz, H-4), 9.32, 9.62, 9.79, 9.85(each brs, aromatic OH)
13C-NMR(100 MHz, DMSO-d6) : 23.6(C-7″), 26.6(C-24″), 27.1(C-5″), 27.3(C-25″), 33.5(C-3″), 35.4(C-6″), 36.3(C-4″), 75.5(C-23″), 97.4(C-7), 100.6(C-8″), 101.7(C-3), 102.6(C-17″), 103.2(C-6′), 104.2(C-2′), 107.0(C-13″), 109.0(C-19″), 109.8(C-11″), 111.7(C-4′), 112.5(C-5), 115.9(C-15″), 116.8(C-21″), 117.0(C-9″), 120.8(C-3a), 121.2(C-4), 121.4(C-2″), 127.1(C-20″), 127.8(C-14″), 128.6(C-22″), 129.6(C-1′), 132.9(C-1″), 151.2(C-12″), 151.8(C-18″), 153.3(C-2), 153.4(C-3′), 153.8(C-10″), 155.3(C-6), 155.8(C-7a), 156.7(C-16″), 157.1(C-5′)
ESI-MS(negative mode) m/z [M-H]- : 627

ソウハクヒからのクワノンＧの製造および分析
実施例１の１−２で製造した酢酸エチルの小分画ＭＡ．Ｅ−１７を逆相シリカゲル（ＲＰ−１８）カラムクロマトグラフィー（メタノール：水＝１：１→２：１、メタノール、段階濃度勾配システム）処理し、小分画物１２個の分画物（ＭＡ．Ｅ−１７０１〜１７１２）を得た。これから得た分画物ＭＡ．Ｅ−１７１０を分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ｓｕｎｆｉｒｅ（登録商標）Ｃ１８、５μｍ、１９×１５０ｍｍｉ．ｄ．、６０％アセトニトリル、２８５ｎｍ、５ｍＬ／ｍｉｎ）処理し、分離精製して前記[化３]のクワノンＧ（３０ｍｇ）を得た。

クワノンＧ：無定形の赤色粉末
1H-NMR(500 MHz, acetone-d6) : 7.34(1H, H-14″), 7.27(1H, H-6′), 6.76(1H, H-20″), 6.65(1H, H-3′), 6.55(1H, H-5′), 6.18(1H, H-17″), 6.06(1H, H-19″), 6.00(1H, H-6), 5.96(1H, H-11″), 5.93(1H, H-13″), 5.20(1H, H-2″), 5.16(1H, H-12), 4.62(1H, H-6″), 4.42(1H, H-1″), 3.70(1H, H-7″), 3.15(1H, H-11), 3.14(1H, H-11), 1.59(3H, H-14), 1.51(3H, H-4″), 1.47(3H, H-15), 1.28(2H, H-5″)
13C-NMR(125 MHz, acetone-d6) : 208.6(C-8″), 182.4(C-4), 165.1(C-12″), 164.1(C-10″), 161.5(C-4′), 161.3(C-2′), 160.5(C-7, 9), 156.6(C-5, 18″), 156.3(C-2, 16″), 133.7(C-3″), 132.8(C-14″), 132.0(C-13), 131.4(C-6′), 127.9(C-20″), 123.6(C-2″), 122.1(C-12, 15″), 120.5(C-3), 116.5(C-1′), 115.0(C-9″), 108.0(C-8), 107.4(C-5′), 107.0(C-13″), 106.7(C-19″), 104.8(C-10), 103.0(C-3′, 17″), 102.1(C-11″), 97.8(C-6), 47.3(C-7″), 40.4(C-6″), 37.7(C-1″), 29.4(C-5″), 24.9(C-14), 23.6(C-11), 22.2(C-4″), 16.8(C-15)
ESI-MS (positive mode) m/z [M+H]+ : 693

ソウハクヒからのクワノンＺの製造および分析
実施例１の１−２で製造した酢酸エチルの小分画ＭＡ．Ｅ−２３を逆相シリカゲル（ＲＰ−１８）カラムクロマトグラフィー（メタノール：水＝１：１）処理し、小分画物９個の分画物（ＭＡ．Ｅ−２３０１〜２３０９）を得た。これから得た分画物ＭＡ．Ｅ−２３０５を分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ｓｕｎｆｉｒｅ（登録商標）ｐｒｅｐＣ１８、５μｍ、１９×１５０ｍｍｉ．ｄ．、４５％アセトニトリル、２８５ｎｍ、１０ｍＬ／ｍｉｎ）処理し、分離精製して前記[化４]のクワノンＺ（５ｍｇ）を得た。

クワノンＺ：無定形のオレンジ色粉末
1H-NMR(500 MHz, CD3OD) : 1.68(3H, s, H-7″), 1.84(1H, m, H-6″), 2.71(1H, m, H-6″), 2.73(2H, H-3″, H-5″), 6.06(1H, s, H-17″), 6.17(1H, s, H-6′), 6.27(2H, H-3, H-5), 6.29(1H, d, J = 8.3 Hz, H-14″), 6.35(1H, s, H-11″), 6.47(1H, d, J =8.3 Hz, H-19), 6.52(1H, s, H-2′), 6.62(1H, d, J =8.3 Hz, H-13″), 6.75(1H, d, J =16.4 Hz, Hβ), 7.17(1H, d, J =16.4 Hz, Hα), 7.18(1H, s, H-4), 7.26(1H, d, J =8.3 Hz, H-6), 7.44(1H, d, J =8.3 Hz, H-20″)
13C-NMR(125 MHz, CD3OD) : 21.1(C-7″), 30.2(C-6″), 37.4(C-3″, C-5″), 74.8(C-1″), 92.1(C-4″), 97.4(C-17″), 98.9(C-2′), 102.2(C-3, C-11″), 106.3(C-6′), 106.8(C-14″), 107.1(C-5), 108.7(C-8″), 108.8(C-9″), 110.1(C-4′), 112.0(C-19″), 113.2(C-15″), 116.5(C-1), 123.2(C-3α), 125.3(C-β), 127.1(C-6), 132.9(C-13″), 140.8(C-1′), 154.4(C-3′), 154.9(C-12″), 155.9(C-2), 157.9(C-4, C-10″), 159.7(C-5′), 168.2(C-18″), 173.0(C-16″), 197.7(C-2″)
ESI-MS negative mode m/z[M-H]- : 593, positive mode m/z[M+H]+ : 595

ソウハクヒからのオキシレスベラトロールの製造および分析
実施例１の１−２で製造した酢酸エチルの小分画ＭＡ．Ｅ−２３を逆相シリカゲル（ＲＰ−１８）カラムクロマトグラフィー（メタノール：水＝１：１）処理し、小分画物９個の分画物（ＭＡ．Ｅ−２３０１〜２３０９）を得た。これから得た分画物ＭＡ．Ｅ−２３０１を分取用高速液クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ｓｕｎｆｉｒｅ（登録商標）ｐｒｅｐＣ１８、５μｍ、１９×１５０ｍｍｉ．ｄ．、１７％アセトニトリル、２１０ｎｍ、１２ｍＬ／ｍｉｎ）処理し、分離精製して保持時間約１９分台の前記[化５]のオキシレスベラトロール（１０ｍｇ）を得た。

オキシレスベラトロール：白色粉末
1H-NMR(500 MHz, CD3OD) : 6.12(1H, t, J =2.3 Hz, H-4′), 6.28(2H, m, H-3, H-5), 6.43(2H, d, J =2.3 Hz, H-2′, H-6′), 6.79(1H, d, J =16.3 Hz, H-β), 7.25(1H, d, J =16.3 Hz, H-α), 7.30(1H, d, J =9.2 Hz, H-6).
13C-NMR(125 MHz, CD3OD) : 101.0(C-4′), 102.2(C-5), 104.3(C-2′, C-6′), 107.1(C-3), 116.5(C-1), 123.5(C-α), 125.2(C-β), 127.1(C-6), 140.9(C-1′), 156.0(C-2), 157.9(C-4), 158.2(C-3′, C-5′)
ESI-MS (negative mode) m/z [M-H]- : 243

ソウハクヒからの２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノンの製造および分析
実施例１の１−２で製造した酢酸エチルの小分画ＭＡ．Ｅ−１４を逆相シリカゲル（ＲＰ−１８）カラムクロマトグラフィー（メタノール：水＝１：１→３：１、メタノール、段階濃度勾配システム）処理し、小分画物２０個の分画物（ＭＡ．Ｅ−１４０１〜１４２０）を得た。これから得た分画物ＭＡ．Ｅ−１４０３を逆相シリカゲルクロマトグラフィー（ＲＰ−１８、メタノール：水＝１：１）処理し、６個の小分画（１４０３０１〜１４０３０６）に分け、この中でもＭＡ．Ｅ−１４０３０３を精製して前記[化６]の２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン（５ｍｇ）を得た。

２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン：黄色粉末
1H-NMR(500 MHz, CD3OD) : 2.69(1H, dd, J =3.2, 17.3 Hz, H-3), 3.04(1H, dd, J =13.2, 17.3 Hz, H-3), 5.58(1H, dd, J =3.2, 13.2 Hz, H-2), 5.86(1H, d, J =2.0 Hz, H-6), 5.89(1H, d, J =2.0 Hz, H-8), 6.30(1H, d, J =2.3 Hz, H-3′), 6.32(1H, dd, J =2.3, 8.1 Hz, H-5′), 7.21(1H, d, J =8.1 Hz, H-6′)
13C-NMR(125 MHz, CD3OD) : 41.8(C-3), 74.6(C-2), 94.8(C-8), 95.6(C-6), 102.0(C-9), 102.1(C-3′), 106.5(C-5′), 116.6(C-1′), 127.5(C-6′), 155.5(C-2′), 158.4(C-4′), 164.1(C-5), 164.2(C-10), 167.0(C-7), 197.2(C-4)
ESI-MS (negative mode) m/z [M-H]- : 287

ソウハクヒからのモルシグニンＬの製造および分析
実施例１の１−２で製造した酢酸エチルの小分画ＭＡ．Ｅ−２２を逆相シリカゲル（ＲＰ−１８）カラムクロマトグラフィー（メタノール：水＝１：１→３：１、メタノール、段階濃度勾配システム）処理し、小分画物１３個の分画物（ＭＡ．Ｅ−２２０１〜２２１３）を得た。これから得た分画物ＭＡ．Ｅ−２２１２をＭＣＩゲル（ｓｕｐｅｌｃｏ社製）イオン交換クロマトグラフィー（メタノール：水＝４：１）処理し、分離精製して逆相薄層クロマトグラフィー試験（ＴＬＣ）でＲｆ値０．１５を有し、淡黄色発色の際に黄色の斑点を示す前記[化７]のモルシグニンＬ（５ｍｇ）を得た。

モルシグニンＬ：黄色粉末
1H-NMR(500 MHz, acetone-d6) : 1.05(6H, H-4″, H-5″), 1.42(6H, 2CH₃), 1.60(2H, H-2″), 2.48(2H, H-1″), 5.62(1H, H-3), 6.12(1H, H-10), 6.50(1H, H-5′), 6.54(1H, H-3′), 6.57(1H, H-4), 7.26(1H, H-6′).
13C-NMR(125 MHz, acetone-d6) : 20.3(C-1″), 27.5(2CH₃), 28.5(C-4″, C-5″), 42.2(C-2″), 69.3(C-3″), 77.9(C-2), 98.9(C-10), 100.7(C-4a), 103.2(C-3′), 104.8(C-5a), 107.4(C-5′), 112.0(C-1′), 114.6(C-4), 122.1(C-6), 127.2(C-3), 131.4(C-6′), 152.5(C-9), 156.4(C-2′), 159.1(C-1a), 160.6(C-4′), 161.5(C-7), 162.0(C-8a), 182.7(C-5).
ESI-MS (positive mode) m/z [M+H]+ : 439

ソウハクヒからのジヒドロモリンの製造および分析
実施例１の１−２で製造した酢酸エチルの小分画ＭＡ．Ｅ−２３を逆相シリカゲル（ＲＰ−１８）カラムクロマトグラフィー（メタノール：水＝１：１）処理し、小分画物９個の分画物（ＭＡ．Ｅ−２３０１〜２３０９）を得た。これから得た分画物ＭＡ．Ｅ−２３０１を分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ｓｕｎｆｉｒｅ（登録商標）ｐｒｅｐＣ１８、５μｍ、１９×１５０ｍｍｉ．ｄ．、１７％アセトニトリル、２１０ｎｍ、１２ｍＬ／ｍｉｎ）処理し、分離精製して保持時間約１７分台の前記[化８]のジヒドロモリン（１０ｍｇ）を得た。

ジヒドロモリン(dihydromorin)：黄色粉末
1H-NMR(500 MHz, CD3OD) : 4.74(1H, J=11.5 Hz, H-3), 5.36(1H, J=11.5 Hz, H-2), 5.81(1H, J=2.3 Hz, H-6), 5.85(1H, J=2.3 Hz, H-8), 6.32(1H, H-3′), 6.33(1H, H-5′), 7.20(1H, H-6′).
13C-NMR(125 MHz, CD3OD) : 71.7(C-3), 78.6(C-2), 95.5(C-6), 96.3(C-8), 101.1(C-4a), 102.3(C-5′), 106.5(C-3′), 114.3(C-1′), 129.5(C-6′), 157.3(C-2′), 158.1(C-4′), 163.6(C-5), 164.0(C-8a), 169.3(C-7), 197.0(C-4).
ESI-MS (negative mode) m/z [M-H]- : 303

最終糖化産物生成抑制効能分析実験
５０ｍＭのリン酸緩衝溶液（phosphate buffer、ｐＨ７．４）に溶解している１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を準備した後、０．２Ｍの果糖とブドウ糖を混合して３７℃で７日間培養することにより、最終糖化産物の生成を誘導した。この際、ソウハクヒから抽出した、実施例１〜８で製造された化合物をそれぞれ０．１μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬの濃度で処理し（全ての化合物は１００％エタノールに溶かした）、陽性対照群としては最終糖化産物生成抑制剤として知られているピリドキサミン(pyridoxamine)を使用し、ＢＳＡに果糖とブドウ糖のみを用いて３７℃で７日間培養することにより、最終糖化産物の生成を誘導した。この際、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの濃度で処理した。

本発明に係る実施例および対照群に対して、７日後に蛍光分析用マイクロプレートリーダー（励起(Excitation)：３６０ｎｍ、エミッション(Emission)：４６５ｎｍ）によって、培養液で生成された最終糖化産物の量を測定し、それから抑制効能値（ＩＣ₅₀値）をシグマプロット(Sigma plot)プログラムを用いて計算した。その結果を表１に示す。

生成抑制率は下記の式で計算される。全ての実験はサンプル当たり２個ずつ準備した。少なくとも３回以上の独立的な実験を介して抑制効能値（ＩＣ₅₀値）の平均および標準偏差を計算した。

生成抑制率（％）＝１００−（試験群の蛍光強度−ブランク試験群の蛍光強度）／（対照群の蛍光強度−対照群ブランク試験群の蛍光強度）×１００

また、最終糖化産物に特異的な抗体、および最終糖化産物の種類のうちの代表的な非蛍光性物質であるＣＭＬに特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析法(western blot analysis)を介して、蛍光分析で現れうる偽陽性(false positive)か否かを確認した。その結果を図１に示す。

表１から分かるように、本発明に係る実施例１〜８で製造された化合物は、陽性対照群であるピリドキサミンに比べてモル濃度（μＭ）を基準に３．７倍から３８．７倍まで最終糖化産物生成抑制効果を示した。

また、図１に示すように、本発明に係る実施例１〜８で製造された化合物は、最終糖化産物に特異的な抗体およびＣＭＬ特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析法において、５０μｇ／ｍＬの単一濃度で陽性対照群としてのピリドキサミンと比較して同等以上の抑制効果を観察することができた。

したがって、本発明に係る実施例１〜８で製造された化合物は、糖尿患者の最終糖化産物の生成により引き起こされる糖尿合併症、例えば糖尿病性ネフロパシー、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を治療および予防することが可能な最終糖化産物生成抑制剤およびこれを改善することが可能な健康機能食品として有用である。

Claims

ソウハクヒ(Morus Bark)から単離されたムルベロフランＧ(mulberrofuran G)、ムルベロフランＫ(mulberrofuran K)、クワノンＧ(kuwanon G)、クワノンＺ(kuwanon Z)、オキシレスベラトロール(oxyresveratrol)、２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン(2′ 4′, 5, 7- tetrahydroxyflavanone)、モルシグニンＬ(morusignin L)およびジヒドロモリン(dihydromorin)の中から選ばれる化合物を有効成分として含有する、糖尿合併症の誘発を抑制する最終糖化産物生成抑制剤。
前記糖尿合併症は糖尿病性ネフロパシー、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害疾患の中から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の最終糖化産物生成抑制剤。
ソウハクヒ(Morus Bark)から単離されたムルベロフランＧ(mulberrofuran G)、ムルベロフランＫ(mulberrofuran K)、クワノンＧ(kuwanon G)、クワノンＺ(kuwanon Z)、オキシレスベラトロール(oxyresveratrol)、２’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン(2′ 4′, 5, 7- tetrahydroxyflavanone)、モルシグニンＬ(morusignin L)およびジヒドロモリン(dihydromorin)の中から選ばれる化合物を含有し、糖尿合併症の誘発を抑制する最終糖化産物生成抑制機能を有する健康機能食品。