CN110563742A - 一种鸡桑根标准化提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸡桑根标准化提取物及其制备方法和应用,该提取物包含以下活性组分:Cudraflavone B 12.12mg/g;Morusingin L 1.86mg/g;Cudraflavone C 14.03mg/g;Kuwanon C 7.70mg/g;Austraone A 1.42mg/g;Morusin 8.53mg/g;Mulberrofuran G 12.74mg/g;Mulberrofuran F 43.42mg/g;Moracenin B 86.51mg/g;Kuwanon H 4.36mg/g;经活性测试结果表明,此鸡桑根提取物及其组分具有保肝活性,可用作制备保肝药物。

Description

一种鸡桑根标准化提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物提取分离技术领域,具体涉及一种鸡桑根标准化提取物及其制备方法和应用。
背景技术
在世界医药科技飞速发展的今天,人们面临的疾病越来越多样,许多威胁人类生命的疾病要达到治愈的效果仍然很难,在此严峻的形势下,医药工作者致力于开发更加温和、治疗效果更优的治疗方法和药物,也取得了一定的成果。但是,化学合成药物在临床应用中,已经不能满足治疗要求,更加迫切的是,其为人体带来的副作用也愈加受到重视。天然药物拥有悠久的使用历史,在人类疾病史上扮演着重要的角色,它们通过自然选择形成了自己独特的化学成分,这些化学成分同时具有更加适应人体的药理活性。
桑属植物在我国作药用已有十分悠久的历史,树皮、枝、叶、果实、根均可入药。其干燥的根皮,中药中称作桑白皮,其主要功效为清肺、凉血、利湿。据《药性论》记载:“桑白皮,主要治疗因体内湿气过重而显现的浮肿,肺部的气喘,打通体内谁的排泄通道,祛除体内多余的水气,补气血以及阴阳俱虚,治头痛”;《本草纲目》记载:“桑白皮,长于利小水,乃实则泻其子也,故肺中有水气及肺火有余者宜之。‘十剂’云,燥可去湿,桑白皮、赤小豆之属是矣。宋医钱乙治肺气热盛,咳嗽而后喘,面肿身热,泻白散。桑白皮、地骨皮皆能泻火从小便去,甘草泻火而缓中,粳米清肺而养血,此乃泻肺诸方之准绳也。元医罗天益言其泻肺中伏火而补正气,泻邪所以补正也。若肺虚而小便利者,不宜用之”。
鸡桑是桑属植物主要的一个变种,其叶形较小,且部分有3-5裂,因此别名小叶桑。在我国大量分布于陕西、安徽、河北、台湾、广西、云南、贵州等,资源丰富,生长环境多为石灰岩地带。鸡桑叶具有清肺热,止咳平喘的作用,鸡桑根具有清肺热、祛湿、抑制血热的功效,在我国部分地区,鸡桑根的干燥根皮,被用作中药“桑白皮”。经对现有技术的文献检索发现,对于鸡桑的研究多集中于叶子及茎皮部分,对根的化学成分及其活性研究较少,未见鸡桑根提取物及其组分在保肝方面应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种鸡桑根标准化提取物及其制备方法和应用,本发明涉及的鸡桑根提取物具有较好的保肝活性,可用于制备保肝类药物。
本发明的第一个目的是提供一种鸡桑根标准化提取物,该提取物包含以下组分:
Cudraflavone B:12.12mg/g;
Morusingin L:1.86mg/g;
Cudraflavone C:14.03mg/g;
Kuwanon C:7.70mg/g;
Austraone A:1.42mg/g;
Morusin:8.53mg/g;
Mulberrofuran G:12.74mg/g;
Mulberrofuran F:43.42mg/g;
Moracenin B:86.51mg/g;
Kuwanon H:4.36mg/g。
本发明的第二个目的是提供上述鸡桑根标准化提取物的制备方法,包括以下步骤:
S1、将鸡桑根粉碎,过100目筛,先用无水乙醇常温渗漉提取2~3次,每次24h,每次料液比1:5g/mL,过滤,将每次乙醇提取液合并得到鸡桑根-EtOH提取液;滤渣用水提取2~3次,每次24h,每次料液比1:5g/mL,过滤,合并每次水提取液后得到鸡桑根-Water提取液;
S2、将S1制得的鸡桑根-EtOH提取液和鸡桑根-Water提取液合并,浓缩,即得到鸡桑根-EtOH-Water提取物。
本发明的第三个目的是提供上述鸡桑根标准化提取物在制备保肝药物方面的应用。
本发明具有以下有益效果:所得的鸡桑根提取物具有较好的保肝活性,可用于制备保肝类药物,并且从鸡桑根中分离鉴定了12个天然化合物,其中10个作为提取物的主要组分,具有保肝活性。
附图说明
图1为本发明实施例中鸡桑根标准化提取物的提取流程图;
图2为本发明实施例中鸡桑根标准化提取物的高效液相色谱图;其中,A为标准品色谱图,B为提取物色谱图;
图3为提取物中10个黄酮类组分降低LDH释放。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白,以下结合实施例和附图对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
如图1所示,本发明一种鸡桑根标准化提取物的制备方法,包括以下步骤:
步骤1、取鸡桑根8.0kg,并粉碎;
步骤2、将粉碎的鸡桑根过100目筛,先用无水乙醇常温渗漉提取两次,每次24h,每次无水乙醇40L,过滤,将两次乙醇提取液合并得到鸡桑根-EtOH提取液;滤渣再用水提取常温渗滤提取两次,每次24h,每次水40L,过滤,合并每次水提取液后得到鸡桑根-Water提取液;
步骤3、将上述鸡桑根-EtOH提取液和鸡桑根-Water提取液合并,并减压浓缩,即得到鸡桑根-EtOH-Water提取物。
为了分析上述鸡桑根-EtOH-Water提取物中的成分,本发明还提供了上述鸡桑根根标准化提取物的提取分离过程,包括以下步骤:
步骤一,称取干燥的鸡桑根7.8kg,粉碎,过100目筛,乙醇-水溶液常温渗滤提取,得提取液;所述乙醇的体积分数为75%,料液比1:5(g/mL);
步骤二,提取液合并,过滤,减压浓缩提取液,得浸膏;所述减压回收条件具体为50℃、0.09Mpa,得浸膏0.91kg;
步骤三,硅胶柱色谱洗脱,所述色谱洗脱使用的硅胶柱的目数为100~200目;以二氯甲烷与甲醇的体积比为(100~0)∶1的梯度进行洗脱,洗脱梯度:二氯甲烷与甲醇的体积比分别为100~70:1、70~45:1、45~15:1、15~0:1,得鸡桑根4个不同极性主要馏分。
上述鸡桑根4个不同极性馏分,分别运用硅胶、CHP-20P、聚酰胺、Sephadex LH-20等柱层析技术从鸡桑根中分离得到12个化合物,通过核磁共振技术(1H NMR、l3C NMR),紫外光谱技术(UV)现代波谱技术确定了其结构,包括6个黄酮类(化合物1-6),查尔酮衍生的Diels-Alder型加和物(化合物7-10),2个茋类化合物(化合物11,12);分别为:Cudraflavone B(化合物1);Morusingin L(化合物2);Cudraflavone C(化合物3);KuwanonC(化合物4);Austraone A(化合物5);Morusin(化合物6);Mulberrofuran G(化合物7);Mulberrofuran F(化合物8);Moracenin B(化合物9);Kuwanon H(化合物10),Morcin M(化合物11);Cathafuran B(化合物12)。
其中,上述鸡桑根提取物中检测的化合物为化合物1~10,结构如下所示:
为了确定上述化合物1~10的含量,本发明还提供了上述鸡桑根标准化提取物的定量分析方法,包括以下步骤:
步骤一:用电子天平准确称取各对照品化合物2.0mg,用甲醇溶解并用稀释定容到1mL,摇匀,配制成2mg/mL的对照品溶液,放入4℃冰箱中保存,分别精密吸取上述各化合物对照品溶液10μL、40μL、80μL、150μL、200μL、500μL,并用甲醇定容至1mL,摇匀,配制成浓度为20μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、1000μg/mL的系列标准溶液,4℃冰箱中保存待用。
步骤二:用高效液相色谱仪分别对浓度为80μg/mL的10种标准品溶液进行检测,选择不同的流动相梯度洗脱方法,根据检测结果不断调整色谱条件,确定最佳色谱条件和吸收波长,最佳色谱条件为:色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18 column(250×4.6mm,5μm),流动相:乙腈(B)-0.1%乙酸水溶液(D),洗脱梯度:5-25%B,0-8min;25-50%B,8-18min;50-75%B,18-28min;75-85%B,28-40min;85-95%B,40-58min;95-5%B,58-65min,流速:1mL/min,柱温:30℃,进样量:5μL,检测波长:210nm。
用高效液相色谱仪分析上述配制的各化合物的系列标准溶液,进样量5μL,分别记录各化合物的峰面积,以标准溶液浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,各化合物标准曲线及其参数见表1,表1结果表明,各化合物浓度在20-1000μg/mL范围内时峰面积与浓度呈良好的线性关系,R2值均大于0.999。
表1各化合物标准曲线
步骤三:精密称取干燥的鸡桑根-EtOH-Water提取物2.5g,放入25mL带塞锥形瓶中,加入75%的乙醇溶液25mL,充分溶解,上清液经0.45μm微孔滤膜过滤,取1mL注入HPLC样品瓶中,4℃下保存待用。
分别精密吸取5μL各对照品溶液和供试品溶液,用高效液相色谱仪进行检测,如图2所示,图2A为标准品色谱图,图2B为提取物色谱图,根据检测结果,对比保留时间和紫外吸收峰,找出各对照品化合物对应的峰,记录其峰面积并用标准曲线法计算各化合物的含量,测定结果见表2,表2显示了化合物9Moracenin B含量相对较高。
表2鸡桑根标准化EtOH-Water提取物中化合物1~10含量
下面对上述鸡桑根提取物进行保肝活性药效学研究。
(1)提取物体内动物实验
主要仪器和试剂:UV-7504紫外分光光度计,深圳迈瑞BS-420全自动生化分析仪,组织切片机、包埋机、脱水机,匀浆器,离心机,试剂盒(丙二醛MDA、还原型谷胱甘肽GSH均为南京建成赛浩科技有限公司提供,甘油三酯(TG)、谷氨酸氨基转移酶ALT、天门冬氨酸转移酶AST均为深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供),无水乙醇(分析纯),甲醛(分析纯)。
实验动物:由西安交通大学医学院实验动物中心提供的SPF级昆明种雌性小鼠50只,体重18-22g,生产许可证号:SCXK(陕)2012-003,SPF级,动物饲料垫料同上,试验动物房为屏障系统,使用许可证号:SYXK(陕)2012-006,温度20-25℃,相对湿度45-65%。
实验分组及剂量设计:将雌性小鼠随机分为五组,每组10只,鸡桑根提取物设低、中、高三个剂量组(0.5g/kg、1.0g/kg、3.0g/kg),另设蒸馏水阴性对照组和50%乙醇模型对照组,用乙醇(分析纯)造成肝损伤模型,乙醇浓度为50%(以蒸馏水稀释),灌胃量12mL/kg.bw(折合乙醇的剂量为6000mg/kg.bw)。
实验方法:采用酒精性肝损伤模型法,三个剂量组给予不同剂量的提取物样品,阴性对照组和模型对照组给予蒸馏水,按20mL/kg.bw每天经口灌胃一次,每周称两次体重,以此调整受试样品剂量,试验第30天时将模型对照组和三个剂量组一次经口灌胃给予50%乙醇溶液,剂量为12mL/kg.bw,阴性对照组给予同体积的蒸馏水,禁食16h后于小鼠摘眼球取血,然后将其处死取肝脏称重,用肝组织进行生化指标检测及组织病理学检查。
检测指标:肝匀浆中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)及甘油三酯(TG)和血清中谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸转移酶(AST)的测定:MDA和GSH测定试剂盒由南京建成赛浩科技有限公司提供,用UV-7504紫外分光光度计测定;TG、ALT和AST测定用BS-420全自动生化分析仪,试剂盒由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供。
病理观察材料:从动物肝左叶中部做横切面取材、切片、染色、镜下观察脂滴在肝脏中的分布、范围和面积。
病理观察方法:每例动物肝组织用40倍物镜连续观察组织切片,根据阳性细胞多少和分布的范围,按0、1、2、3、4分进行评分,将所得分数的平均值作为该例肝组织的脂肪染色评分。
病理诊断标准:病理组织学观察以肝细胞脂滴染色作为观察指标,并根据病理改变程度“0”、“1”、“2”、“3”、“4”量化,进行肝损伤程度的评价。
试验数据统计:用SPSS软件对各实验原始数据进行独立样本T检验。
实验结果:
表3鸡桑根提取物对小鼠肝匀浆中MDA、还原型GSH和TG的影响
注:与模型对照组比较,*P<0.05**P<0.01;与阴性对照组比较,#P<0.05##P<0.01。
表4鸡桑根提取物对小鼠肝血清中ALT、AST的影响
注:与模型对照组比较,*P<0.05**P<0.01;与阴性对照组比较,#P<0.05##P<0.01。
表5鸡桑根对小鼠肝脏病理组织学的影响
注:与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
由表3和表4可见,按12mL/kg.bw的剂量给予小鼠50%乙醇后,与阴性对照组比较,肝损伤模型对照组肝匀浆中MDA值升高、还原型GSH值结果降低,TG值结果升高,差异均有显著性(P<0.01,P<0.05),说明本次实验模型成立,AST显著性升高,差异均有显著性(P<0.05),进一步说明肝损伤模型的成立。与肝损伤模型对照组比较:鸡桑根提取物的中剂量组肝匀浆中MDA值降低,差异有显著性(P<0.05);高、中、低三个剂量组肝匀浆还原型GSH值升高,差异均有显著性(P<0.01);高、中、低剂量组肝匀浆中TG值降低,差异均无显著性(P<0.01);鸡桑根提取物的高剂量组中ALT显著性降低(P<0.05),中剂量组中AST显著性降低(P<0.05);由表5可见,低、中剂量组鸡桑根提取物可显著降低肝损伤程度,说明本发明的鸡桑根标准化提取物为预防酒精性肝脏损伤的有效部位。
(2)化合物体外细胞实验
实验材料及方法:体外在人肝癌细胞系HepG2细胞(来源碧云天生物技术公司,上海,中国)模型上进行LDH释放测定,来评定10个化合物的肝脏保护活性。简言之,将实验分为4组:空白对照,阴性对照,样品最大酶活性对照和实验组。HepG2铺96孔板,每孔约6*103个细胞,待细胞生长达一定融合度时,用1%CCl4预处理细胞6小时,然后弃去上清液,分别用10个化合物处理细胞,使终浓度为50ug/mL,作用24h。对于样品最大酶活性控制,加入LDH释放试剂。将细胞板以400g×5分钟离心,吸出各孔的120μL上清液并转移至新的96孔板。将60μL LDH检测溶液加入每个孔中并在室温下从光中温育30分钟,用Biotek Epoch分光光度计(Winooski,VT,USA)在吸光度(OD)490nm下读板。
实验结果:通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定,评估肝细胞保护作用,CCl4是一种有效的肝毒性化合物,用于诱导人肝癌HepG2细胞损伤模型。由图3可见,1%CCl4在HepG2细胞中诱导了显著细胞毒性,LDH释放达到约60mU mL-1,鸡桑根中的大多数化合物适度降低LDH的释放,化合物1和5比其他化合物更加显著降低LDH的释放。因此,来自鸡桑根的黄酮类化合物减弱了CCl4诱导的细胞毒性,这表明这些黄酮类化合物具有肝细胞保护作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,对发明而言仅仅是说明性的,而非限制性的。本专业技术人员理解,在发明权利要求所限定的范围内可对其进行许多改变,修改,甚至等效,但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种鸡桑根标准化提取物,其特征在于,包含以下组分:
Cudraflavone B:12.12mg/g;
Morusingin L:1.86mg/g;
Cudraflavone C:14.03mg/g;
Kuwanon C:7.70mg/g;
Austraone A:1.42mg/g;
Morusin:8.53mg/g;
Mulberrofuran G:12.74mg/g;
Mulberrofuran F:43.42mg/g;
Moracenin B:86.51mg/g;
Kuwanon H:4.36mg/g。
2.根据权利要求1所述的鸡桑根标准化提取物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将鸡桑根粉碎,过筛,先用无水乙醇常温渗漉提取2~3次,每次24h,每次料液比1:5g/mL,过滤,将每次乙醇提取液合并得到鸡桑根-EtOH提取液;滤渣用水提取2~3次,每次24h,每次料液比1:5g/mL,过滤,合并每次水提取液后得到鸡桑根-Water提取液;
S2、将S1制得的鸡桑根-EtOH提取液和鸡桑根-Water提取液合并,浓缩,即得到鸡桑根-EtOH-Water提取物。
3.根据权利要求1所述的鸡桑根叶标准化提取物在制备保肝药物方面的应用。
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