JP2014208687A - トランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質および脂質集合体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】イオン相互作用によって脂質集合体との複合体を形成するトランスフェクションエンハンサー要素(TEE)を含む脂質集合体。TEEは次式[疎水性部分−pH感受性親水性部分]で示され、pH感受性親水性部分は、pka2〜6の弱酸、又は酸性基と弱塩基との組合せを含むpKa3〜8の双性イオン構造である脂質(脂質−TEE)。
【選択図】なし
Description
(I)脂質−[疎水性部分−pH感受性親水性部分]
に従う、脂質部分および1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素(TEE)を含む脂質であって、
前記1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素(TEE)は、一般式(II):
(II)疎水性部分−pH感受性親水性部分
を有し、
式中、各TEEのpH感受性親水性部分は独立に、pKa2〜6の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むpKa3〜8の双性イオン構造であり、ただし前記脂質が、次の構造(III)、(IV)、または(V)のうちの1つではないことを条件とする、脂質が提供される。
PE−アミド結合−X−COOH (III)
式中、PEは、ホスファチジルエタノールアミン部分であり、Xは、3〜20個の原子の鎖長を有し、場合によっては1個または複数のヘテロ原子を含む置換または非置換の飽和または不飽和炭素含有直鎖である;
(II)疎水性部分−pH感受性親水性部分
(式中、TEEのpH感受性親水性部分は、pKa2〜6の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含み、pKa3〜8である双性イオン構造である)
を有する使用も包含する。
(I)脂質−[疎水性部分−pH感受性親水性部分]
を有してもよい。
疎水性部分−pH感受性親水性部分 (II)
(各TEEの前記pH感受性親水性部分は独立に、pka2〜6の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むpKa3〜8の双性イオン構造である)
を有する脂質集合体が提供される。
脂質部分−[疎水性部分−pH感受性親水性部分] (I)
に従う、1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質(脂質−TEE)を含み、
前記トランスフェクションエンハンサー要素(TEE)は、一般式(II):
疎水性部分−pH感受性親水性部分 (II)
(前記TEEの前記pH感受性親水性部分は、pka2〜6の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むpKa3〜8の双性イオン構造である)
を有する脂質集合体が提供される。
1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素(TEE)を組み込み、またはイオン相互作用によって1種または複数の個々のトランスフェクションエンハンサー要素との複合体を形成する1種または複数の脂質を含む脂質集合体、特にリポソームを効率的に使用して、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで細胞をトランスフェクトできることが明らかになった。
生体膜にわたる濃度勾配の消失を具体的に記載するために広く使用される。これは、前記過程が起こる実際の機序にかかわりなく、生体膜にわたる輸送、またはそれにわたる拡散、その透過もしくは浸透を含む。
平衡状態で二相系の1−オクタノールおよび水に分配された化合物の各濃度の比である。オクタノール−水分配係数(logP)は、化合物の親油性または疎水性を記載するために使用される。
1−オクタノール中の分子のすべての(非イオン化およびイオン化)種の平衡濃度と水相中の同じ種の平衡濃度の比である。
解離性混合物の分配係数logDは、以下の通り定義される。
logD = log (Σ(ci H2O)/ Σ (ci org))、式中
ci H2Oは、水中のi番目の微細種の濃度であり、
ci orgは、有機相中のi番目の微細種の濃度である。
本明細書では、任意の核酸含有分子を指し、これには、DNAまたはRNAが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドという用語は、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは、未修飾RNAもしくはDNAでも、修飾RNAもしくはDNAでもよい。したがって、本明細書では、例えばポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるRNA、一本鎖領域、またはさらに典型的には二本鎖領域、または一本鎖および二本鎖の領域の混合物とすることができるDNAおよびRNAを含む混成分子を指す。
本明細書では、2個以上、しばしば4個以上、通常は11個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子と定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用を含めて、多くの要因に依存する。オリゴヌクレオチドは、例えば適切な配列のクローニングおよび制限、ならびにNarang et al., Meth. Enzymol., 68, 90-99, 1979のホスホトリエステル方法;Brown et al., Method Enzymol., 68, 109-151, 1979のホスホジエステル方法;Beaucage et al., Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862, 1981のジエチルホスホラミダイト方法;Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191, 1981のトリエステル方法;または自動合成方法;およびUS 4,458,066の固体支持方法などの方法による直接化学合成を含めて、任意の適当な方法で調製することができる。
両親媒性分子を含む超分子集合体である。ある態様では、両親媒性物質は、脂質または洗浄剤と呼ばれ、別の態様では、このような物質は、生体膜を形成すること、または生体膜に挿入することが知られている。超分子集合体は、さらに無極性分子からの油を含んでもよい。したがって、本発明の超分子集合体は、様々な粒径およびラメラ性のリポソーム、ミセル、逆ミセル、立方もしくは六方脂質相、渦巻形、エマルジョン、ダブルエマルジョン、または実質的に脂質、油、もしくは両親媒性物質から構築される他の多量体集合体を含む。
本発明の一態様では、親水性部分は、pH値約4と生理的pHの7.4との間において親水性で応答する弱酸である。表1aの式(1)〜(3)のカルボキシル基、バルビツル酸またはその誘導体、特にキサンチンまたはその誘導体は、このようなpH応答性親水性部分を表すが、これらに限定されない。
キサンチン、ピリミジン(ウラシル)、またはバルビツル酸の他の誘導体を、下記の表1bに開示し、pH4.0およびpH7.4におけるそれらのlogD値に関して分析する。(100)〜(129)の化合物のメトキシエチル部分は、上述されたようにTEEの疎水性部分を表し、またはそれで置換されていてもよい。
logD=logP+log(1+10(pH−pKa));
式中、logPは非イオン化の形の分配係数である。式は、ゼロイオン強度の条件を反映し、logDの極めて低い値は、高pHにおける酸について計算されている。イオン強度が約0.15Mである生理的条件下で、塩形成は、このようなlogDの極値を限定している。
pH−pKaに対して曲線をプロットすると、別の分析によって、logDの同一のシフトが明らかになる(図3を参照のこと)。
本発明のTEEは、生体脂質膜の透過に寄与する疎水性部分を含む。このような疎水性部分の化学的表現としては、最小鎖長が6個の元素である直鎖状、分枝状、または環状鎖が挙げられる。本発明の多くの態様では、鎖元素は炭素原子である。本発明のいくつかの態様では、鎖元素は、2個以上の他の鎖元素と共有結合を形成することができるヘテロ原子を含むことができる。水素原子またはハロゲン原子は、鎖に置換することができるが、鎖の元素ではない。疎水性部分は、7個以上の元素を含むことができ、40個までの元素を含んでもよい。本発明のいくつかの態様では、疎水性部分は、6〜12個の元素を含む。本発明の他の態様では、疎水性部分は、12〜20個の元素を含む。本発明のさらに他の態様では、疎水性部分は実に20〜40個の元素を含む。
TEEの構成は、その物理化学的パラメータによって支配されている。TEEは、環境の酸性化に応答して親水性−疎水性変化を起こす。この変化は、pHに対して応答する上述した親水性部分によって媒介される。このような応答は、最小振幅が0.5 logDであるべきであり、それによってlogDのより高い絶対値は、より低いpHで実現される。一態様では、このような振幅は、1 logDより大きく、これは、このようなTEEの水相から膜の疎水性内部への分布が10倍より好ましくなることを意味する。別の態様では、このような振幅は、1.5より大きく、いくつかの態様では、親水性の形と疎水性の形との間の振幅は、2 logD単位より大きい。
本発明の一態様では、親水性部分は、生理的pHとわずかに酸性条件のおよそpH4との間のpH値に応答する。このようなわずかに酸性条件は、エンドソームまたはリソソームのような細胞小臓器内で見られる。したがって、TEEは、細胞へのエンドサイトーシスによる取り込み後に、脂質凝集体またはリポソームのエンドソーム脱出を媒介することができる可能性がある。進行中の炎症の腫瘍組織または領域も、わずかに酸性の環境を提供し、したがってTEEは、これらの領域内に脂質凝集体またはリポソームを蓄積するのに有用であり得る。蓄積は、具体的には腫瘍もしくは間質細胞、または免疫系の細胞、または炎症性領域に存在する線維芽細胞で起こり得る。
好ましい態様では、logD(7.4)は1より大きく、いくつかの態様では、logD(7.4)は3より大きい。本発明の他の態様では、TEEのlogD(7.4)は、10より小さく、いくつかの態様では、logD(7.4)は7より小さい。
前記置換基は、1種または複数のpH感受性親水性部分、低級アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルチオ、またはアルキルチオアルキルから選択され、「低級」は1〜6個の原子を意味し、
Lj、Lk、またはLlからのLはいずれも独立に、存在しないか、あるいは独立に−CH2−、−O−、−S−、−N(H)C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)N(H)−、−C(O)−、−C(O)N(H)−、−N(H)C(O)O−、−CH=N−、−OC(O)−、−N=CH−、−S−S−、−NH−、−N(R13)(R14)−(ただし、R13およびR14は独立に、HもしくはC1〜C6アルキルであり、またはR13もしくはR14の一方は、存在しなくてもよい)、または
TEE中のC原子の総数は、6〜40個であり、pは≦40である;
あるいは
−ステロール (VII)
式中、前記ステロールは、1種または複数の親水性部分、−OH、−SH、または低級アルキル、アルキレン、アルケニル、もしくはアルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルチオ、もしくはアルキルチオアルキルで置換されていてもよく、「低級」は1〜6個の原子を意味する。
R1、R2、R3、およびR4は独立に、TEEの疎水性部分、水素、0〜5個の不飽和部位を有する直鎖状、分枝状、もしくは環状の非置換もしくは置換C1〜C10アルキル、アルキレン、またはヘテロアルキル、あるいはアリール基であり、前記基は、−O−または−S−から選択される0〜5個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、前記基中の第1の原子ではなく、前記置換基は、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択され、R1、R2、およびR3は、代替としてかつ独立にアルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基とすることができ、Dは、C、または0〜3個の不飽和部位を有し、かつ−O−、−S−から選択される0〜5個のヘテロ原子を含む非置換もしくは置換環状アルキル基もしくアリール基であり、前記置換基は、アルキル基、アルキレン基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択され、Y1、Y2、およびY3は独立に、OまたはSであり、
Gは、CまたはNとすることができ、GがNであるとき、R1またはR2の一方は、存在しないことがあり、R1およびR2はR4と定義される;
あるいは
R5、R6、R7、またはR9は、独立にTEEの疎水性部分、水素、0〜5個の不飽和部位を有する直鎖状、分枝状、もしくは環状の非置換もしくは置換C1〜C10アルキル、アルキレン、またはヘテロアルキル、あるいはアリール基とすることができ、前記基は、−O−または−S−から選択される0〜5個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、前記基中の第1の原子ではなく、前記置換基は、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択され、
R8はOまたはSHであり、
M3はNまたはCであり、
M2はCまたは−O−であり、M2が−O−である場合、R6は存在せず、
M1はNまたはCまたは−O−であり、M1が−O−である場合、R5は存在せず、
M1、M2、またはM3がCであるとき、R5、R6、またはR7は、さらにアルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基とすることができ、R5、R6、またはR7と定義されたさらなる置換基R5’、R6’、またはR7’は、C原子に結合していてもよい;
あるいは
Y1*およびY2*は独立に、OまたはSである。
このような弱塩基のpkaは、窒素原子のβ位もしくはγ位のヘテロ原子によって、または空間的に近接した置換、例えば窒素原子のα位もしくはβ位での置換によって影響される可能性があることが当技術分野で知られている。好ましいヘテロ原子は−O−または−S−である。−I効果をもつ置換基は、このような弱塩基のpkaを低下させることができ、アルコキシ基、アルキルチオ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。+I効果をもつ置換基は、このような弱塩基のpkaを増大させることができ、例えばアルキル基が挙げられる。窒素原子のβ位またはγ位におけるヘテロ原子、および窒素原子のα位またはβ位における置換基は、TEEの疎水性部分の一部分でもよい。
TEEの次の化学的表現は、さらに本発明の教示を説明するはずである。しかし、本発明の範囲は、下記に示す具体例に決して限定されない。好ましいTEEは、次の属性を有する。
疎水性部分の鎖元素の数:8〜40
logD(7.4):1〜10
logD(7,4)−logD(4):>1
弱酸のpKa:2〜6
双性イオン形成のための能力をもつ弱塩基のpKa:4.5〜7
本発明の一態様では、TEEは、親水性部分として1種または複数のカルボン酸基を含む。
いくつかの態様では、疎水性部分は、シクロアルカン、シクロアルケン、もしくはシクロアルキンなどの環状構造、または芳香族環構造を形成することができる。
下記の表で、環状要素の少数の表現を分析し、他の要素の既知の構造寄与から、より多くの環状要素を開発することができる。言うまでもなく、環状要素を、特に上記で分析した基でさらに置換することが可能である。
本発明の特定の変形では、疎水性部分の環系は、ステロール中などのより複雑な環系とすることができる。この場合も、さらなる置換は、ステロール主鎖に存在することができ、下記に示す分析は、ステロールの天然誘導体、例えばステラン主鎖の3位、7位、および12位におけるヒドロキシル基置換について、logDのいくつかの局面を詳述している。
上記の考察は、言うまでもなく、構造的に異なる親水性部分を含むTEEに移すことができる。TEEの疎水性部分の構造要素の寄与は、1種または複数の親水性部分の化学的性質にかかわりなく同一でない場合、類似している。バルビツル酸またはキサンチンを含むTEEのいくつかの特定の化学的表現は、開示のこの部分を限定することなく、このようなTEEの構成を示すことができる(化合物17〜23)。
TEEは、本発明内では脂質集合体と総称されるミセル、リポプレックス、渦巻形、エマルジョン滴など脂質、またはリポソーム、または他の超分子凝集体に組み合わせる必要がある。
本発明の別の態様では、脂質集合体を生成した後、TEEをこのような集合体にグラフトすることができる。このようなカップリングを実施するための化学結合技法および方法は、文献、例えばG. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996に広範に報告されている。
本発明の別の態様では、TEEは、例えばビオチンとビオチン結合タンパク質との分子認識、2つの相補的または部分相補的オリゴヌクレオチドの分子認識、またはシクロデキストリンとシクロデキストリンの結合ポケットに適合する分子との分子認識を使用して、DeGrip et al., Biochem. J., 330, 667-674, 1998に開示されている様々な脂質または洗浄剤、WO 06/105361に開示されているステロールまたはアダマンタン単位、WO 06/105361に開示されているステロイドまたはアダマンタン単位などの他のステロールなど脂質集合体系との複合体を形成することができる。
本発明の一実施形態において、1種または複数のTEEを含む脂質は、次の一般式を有することができる。
脂質−(L2)r−(TEE)r (XII)
式中、L2は、存在しないか、または−CH2−、−O−;−S−;−N(H)C(O)−;−C(O)N(H)−;−C(O)O−;−OC(O)N(H)−;−C(O)−;−C(O)N(H)−;−N(H)C(O)O−;−NH−、−CH=N−;−OC(O)−;−N=CH−;−S−S−、−N(R13)(R14)−から選択される連結基であり、R13およびR14は独立に、HもしくはC1−C6アルキルであり、またはR13もしくはR14の一方は、存在しなくてもよく、rは1〜5の整数である。
Xaは、−OPO3 −−;−OPO2−CH2−;−ピロホスフェート−;−OSO3−;−OSO2−;−O−;−NH−;−S−;−N(H)C(O)−;−C(O)−、−C(O)N(H)−;−OC(O)N(H)−;−N(H)C(O)O−;−OC(O)−;−C(O)O−;−N=CH−;−CH=N−;−CH2−;−S−S−;−N(R13)(R14)−(ただし、R13およびR14は独立に、HもしくはC1〜C6アルキルであり、またはR13もしくはR14の一方は、存在しなくてもよい);または
Yaは存在しないか、または非分枝状、分枝状、もしくは環状の置換もしくは非置換アルキル、アルケニル;1〜8個のC原子を有するアルキレン基もしくはアルキニル基もしくはアリール基であり、ここで前記置換基は、1種または複数の−OH;−NH2;−N(R13)(R14)(ただし、R13およびR14は、上記で定義される);−COOH;糖から選択され、あるいはYaは糖;アミノ酸;ジ−もしくはトリペプチド;α−ヒドロキシ酸もしくはβ−ヒドロキシ酸、またはジヒドロキシ酸であり、
Zaは存在しないか、または−O−;−S−;−N(H)C(O)−;−C(O)N(H)−;−C(O)O−;−OC(O)N(H)−;−C(O)−;−C(O)N(H)−;−N(H)C(O)O−;−NH−;−N(R13)(R14)−(R13およびR14は上記のように定義する);−CH=N−;−OC(O)−;−N=CH−;−S−S−から選択される基であり、あるいはZaは、−NH2;−(NH3)+;−(N(R13)(R14)(R15))+(ただし、R13、R14、およびR15は、上記のR13およびR14のように定義する);−C(O)OH;−OH;−C(O)H;−C(O)OR16(ただし、R16はC1〜C6アルキルである);−C(O)NH2の群から選択され、点線は、1種または複数のTEEのあり得るグラフト位置を表す;
本発明のTEEを、脂質に化学結合またはグラフトすることができる。多くの態様では、水に露出した極性脂質頭部基は、1種または複数のTEEをグラフトするのに好ましい位置である。
PE−アミド結合−X−COOH (III)
式中、Xは、3〜20個の原子の鎖長を有し、様々な飽和度および/またはヘテロ原子組成物および/または置換基、ならびにCOOH−基を有する炭素含有直鎖である;
あるいは
あるいは
i)ホスファチジルエタノールアミンによるω−カルボキシ−ケトンの還元的アミノ化
ii)リン脂質、例えばPC、PE、PS中のホスフェート基のエステル化
iii)ω−ジカルボン酸と脂質の遊離ヒドロキシル基とのエステル化
iv)ホスファチジルセリンと末端イソプロピル基内にカルボキシル基を有するコレステロール誘導体の3’ヒドロキシル基とのエステル化
v)3−アミノ−1,2−プロパンジオールジエステルのアミド化またはアルキル化
vi)ホスファチジルグリセロールの酸化およびその後の還元的アミノ化
脂質集合体は、両親媒性分子を含む超分子集合体である。ある態様では、両親媒性物質は、脂質または洗浄剤と呼ばれ、別の態様では、このような物質は、生体膜を形成すること、または生体膜に挿入することが知られている。超分子集合体は、さらに無極性分子からの油を含んでもよい。したがって、本発明の超分子集合体は、様々な粒径およびラメラ性のリポソーム、ミセル、逆ミセル、立方もしくは六方脂質相、渦巻形、エマルジョン、ダブルエマルジョン、または実質的に脂質、油、もしくは両親媒性物質から構築される他の多量体集合体を含む。
この実施形態の別の態様では、ホスファチジルコリンとコレステロールの混合物、またはホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合物が好ましい。DSPC、DPPC、DMPC、POPC、またはDOPCから選択されるホスファチジルコリンの1種または複数をDOPEまたはコレステロールの群から選択される1種または複数の脂質と組み合わせて含む組成物がより好ましい。
この実施形態の別の態様では、効率的に細胞をトランスフェクトするために、これらの脂質集合体を使用してもよい。
(i)帯電した基の少なくとも1つは、pKが4〜8であり、
(ii)カチオン電荷は、pH4で優勢であり、かつ
(iii)アニオン電荷は、pH8で優勢であり、
pH4〜pH8で中性の実効電荷の等電点が生じる。双性イオンはpKが上記の範囲でないので、この定義によれば、両性特性は双性イオン性と異なる。結果として、双性イオンは、様々なpH値にわたって本質的に中性に帯電する。ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンは、双性イオン性の中性脂質である。
a)脂質混合物を水混和性溶媒、好ましくはアルコールにとかした溶液を準備するステップ、ただし前記溶液は、場合によっては酸性化してもよい。
b)核酸薬物の水溶液を準備するステップ、ただし前記溶液は、場合によっては酸性化してもよい。
a)およびb)の溶液の少なくとも1つは、pH<6、好ましくはpH3〜5.5に酸性化しなければならない。
c)1種または複数の混合装置を場合によっては使用して、脂質混合物のアルコール性溶液を核酸の水溶液に、またはその逆に核酸の水溶液を脂質混合物のアルコール性溶液に注入することによって、あるいはa)およびb)の溶液の2つの制御流れを組み合わせることによって、規定量のa)およびb)の溶液を混合するステップ。
d)任意選択である希釈ステップ。
e)pHを7より高くすることによって、またはイオン強度を高め、続いてpHを7より高くすることによって、両性リポソームと核酸との間の相互作用を解消するステップ。
f)封入されていない薬物を除去し、かつ/またはリポソーム懸濁液を濃縮し、かつまたは水相を変え、かつ/または水混和性溶媒を除去するステップ、ただしこれらのステップはそれぞれ独立に、任意選択である。
g)任意選択であるリポソームの無菌化濾過ステップ。
ステップe)とf)の間、および/またはステップf)およびg)の間で、リポソームの1種または複数の凍結/融解サイクルをプロセスの一部分とすることができる。
他の態様では、リポソームの粒径は、70〜150nmで異なってもよく、さらに他の態様では、リポソームの粒径は、130〜250nmで異なってもよい。
本発明によれば、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで細胞をトランスフェクトするために、トランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質を含む脂質集合体を使用してもよい。このような使用に限定することなく、本発明に記載する脂質集合体(例えば、リポソーム)は、例えばオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびDNAプラスミドなど核酸系薬物のための担体としての使用によく適している。これらの薬物は、タンパク質、ポリペプチド、またはRNAのための1種または複数の特定配列をコードする核酸、ならびにタンパク質発現レベルを特異的に制御し、またはとりわけスプライシングおよび人為的切断との干渉によってタンパク質構造に影響を及ぼすことができるオリゴヌクレオチドに分類される。
(16−{2−[2,3−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロポキシ)−ヒドロキシ−ホスホリル−オキシ]−エチルアミノ}−ヘキサデカン酸)(Pal−PEまたはw16−PE)の合成
反応スキーム:
N2雰囲気下、10gの化合物1(16−ヒドロキシ−ヘキサン酸)(1当量)を、1000mlのジクロロメタン中、16gのPCC(クロロクロム酸ピリジニウム)で40℃において15分間酸化した。溶媒を除去し、残渣を酢酸エチルエステルと、その後に続くシリカゲルクロマトグラフィーステップ(溶離液:酢酸エチルエステル)で分離した。
N2雰囲気下、11.8gのDPPE(3)および16gのシアノ水素化ほう素ナトリウム(NaCNBH3)を800mlのCHCl3/CH3OH 1:1に溶解し、65℃に加熱した。9.44gのピリジンを混合物に添加した。4.6gの化合物2(16−オキソ−ヘキサデカン酸)を400mlのCHCl3/CH3OH 1:1に溶解し、最後にさらに反応混合物に滴下した。3時間後、溶媒を除去し、固体を水で2回洗浄した後、再び200mlのCHCl3/CH3OH/H2O 500:100:4に溶解した。2相を分離した後、有機相の溶媒を除去した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した(溶離液:CHCl3/CH3OH/H2O 500:100:4)。生成物を、1H−NMR、HPLC、および薄層クロマトグラフィーによって特徴付けた。
化合物(10−{2−[2,3−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロポキシ)−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ]−エチルアミノ}−デカン酸)(Deca−PEまたはw10−PE)の合成
この合成は、ステップaで10−ヒドロキシデカン酸を使用する代わりに実施例1に従って行った。
Cy3標識アンチセンスオリゴヌクレオチドを封入した両性リポソームの調製
次のリポソーム調製物を下記に示すように調製した。
改変したプロセスで、1つの製剤を調製した。
カルボキシフルオレセイン(CF)を封入した両性リポソームの調製
次のリポソーム調製物を下記に示すように調製した。
Cy3標識アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはカルボキシフルオレセイン(CF)を封入したリポソームによるインビトロトランスフェクション実験
HeLa−細胞は、DSMZ(German Collection of Micro Organism and Cell Cultures)から入手し、DMEM中で維持した。培地は、Gibco−Invitrogenから購入し、5% CO2中、10% FCSを37℃で補充した。細胞を2×104個の細胞/mlの密度で播種し、100μlの培地中で培養した。16時間後、培地を、全量50〜200ngのCy3標識オリゴヌクレオチドまたは0.5mM CF/ウェルを含むリポソーム(L1〜L24)を含有するOpti−MEM I(Gibco)に置換した。細胞培養皿を、450g、37℃で1時間遠心し、続いて5% CO2中、37℃で3時間インキュベートした。トランスフェクション混合物を上記の培地で置換し、細胞をさらに24〜48時間インキュベートした。光学および蛍光顕微鏡法で、10倍または40倍の倍率の対物レンズ(Axionvert S 100, Carl Zeiss Inc.)を使用して、トランスフェクション効率および細胞分布を4時間または24時間後に決定した。
Cy3標識オリゴヌクレオチドを封入したリポソームによるHeLa−細胞のトランスフェクション
図5は、製剤L−1、L−2、およびL−3でトランスフェクトされたHela−細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。リポソーム製剤L−3のトランスフェクション効率は、トランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質をリポソーム膜中に含める(L−1およびL−2)ことによって改善できることがわかる。
カルボキシフルオレセインは、酸性環境(例えば、エンドソーム)中では蛍光シグナルを示さないpH感受性蛍光プローブである。
腫瘍異種移植片を有するマウスにおける両性リポソームの生体内分布
C5.5アンチセンスオリゴヌクレオチドを封入したリポソームの調製
リポソームは、アルコール注入方法で製造した。独得の処方に従って、脂質混合物を、適切なアルコール(L−25ではエタノール、およびL−26ではイソプロパノール/1% HCl)に8mlの体積および適切な濃度(L−25では40mM、およびL−26では20mM)で溶解した。20mM HAc、300mM スクロースの緩衝液(pH4.5)にとかした適切な濃度(L−25では57μg/ml、およびL−26では67μg/ml)のCy5.5標識アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液72mlの体積を、丸底フラスコに移した。ポンプを備えた注入装置を使用して、両方の溶液を混合した。得られたリポソーム懸濁液を、1M トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)HCl(pH8)を用いて全体積の1/10でpH7.5にシフトさせ、PBSに対し透析して、封入されていないCy5.5標識アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去し、続いて濃縮した。
空のリポソーム用の脂質混合物を、エタノール(L−27)またはイソプロパノール/1% HCL(L−28)に濃度50mMで溶解した。有機溶媒中の脂質と水性緩衝液(PBSまたは10mM Hac、300mM スクロース、100mM トリス、pH7.5)を混合することによって、空のリポソームを調製した。リポソーム懸濁液を、PBSに対し透析し、続いて濃縮した。
50μgのリポソームCy5.5標識アンチセンスオリゴヌクレオチド(2mg/kg)を、異種移植片腫瘍(ヒト肝癌)(直径6〜8mm)を有するCD1ヌードマウスの尾静脈に静脈内注射した。群のサイズは、マウス2匹/製剤とした。対照群に対し、150μlのPBSを静脈内投与した。24時間後に、マウスを屠殺し、腫瘍を回収し、凍結した。
リポソーム製剤L−25およびL−26に封入したCy5.5標識アンチセンスオリゴヌクレオチドを静脈内に適用した後、腫瘍組織における蓄積が認められた。図12は、群の両方の動物の腫瘍組織の凍結切片を示す。製剤L−25に比べて、Pal−PE製剤L−26は、腫瘍組織における蓄積が5.4倍改善されたことを示す。PBS緩衝液を投与された動物の腫瘍組織はいずれの蛍光シグナルも示さない。
腫瘍異種移植片を有するマウスにおける両性リポソームによる腫瘍治療
siRNA標的Plk1または非標的スクランブル(scr)siRNAを封入したリポソームの調製
リポソームを、イソプロパノール注入方法で製造した。脂質混合物を、イソプロパノール/1% HClに238mlの体積および適切な濃度(10mM)で溶解した。10mM HAc、300mM スクロース(pH4.0)(NaOHで調整されたpH)にとかした適切な濃度(36μg/ml)のPlk1またはscr siRNA溶液554mlの体積を、丸底フラスコに移した。ポンプを備えた注入装置を使用して、両方の溶液を混合した。得られたリポソーム懸濁液を、136mM Na2HPO4、100mM NaCl(pH9.0)の2倍の体積でpH7.5にシフトさせ、100mM Na2HPO4、50mM NaCl、150mM スクロース(pH7.5)に対し3回透析して封入されていないsiRNAを除去し、続けて9.6mM Na2HPO4、2.4mM KH2PO4、280mM スクロース(pH7.5)で3回透析し、最後に濃縮した。
第1群:生理食塩水(PBS)
第2群:L−46 Plk1、5mg/siRNA(kg)、976μmol/脂質(kg)
第3群:L−47 スクランブル、5mg/kg、616μmol/脂質(kg)
1.Plk1 siRNA:センス 5’−agaccuaccuccggaucaa(dTdT)−3’
アンチセンス 5’−uugauccggagguaggucu(dTdT)−3’
2.Scr siRNA:センス 5’−aacuggguaagcgggcgca(dTdT)−3’
アンチセンス 5’−ugcgcccgcuuacccaguu(dTdT)−3’
125μgのリポソーム活性Plk1またはスクランブルsiRNA(5mg/kg)を、異種移植片腫瘍(ヒト肝癌、Huh7)(直径5mm)を有するCD1ヌードマウスの尾静脈に1週間に2回、1日および4日に3週間静脈内注射した。群のサイズは、マウス5〜7匹/製剤または対照とした。対照群に対し、200μlの生理食塩水を静脈内投与した。注射の日ごとに、腫瘍の体積を測定した。腫瘍重量は実験の終わりに確定した。最後の注射の72時間後に、マウスを屠殺し、腫瘍を回収し、凍結した。
L−46に封入したPlk1 siRNAを3週間にわたって6回静脈内に適用した後、腫瘍増殖の抑制は、生理食塩水またはscr siRNA(L−47)での処置に比べて明らかである(図13)。第2群(L−46 Plk1)の最終腫瘍重量は、それぞれ対照群1または3(生理食塩水またはL−47スクランブル)に比べて明らかに低下している(図14)。
TEEを含む脂質を含むリポソームの融合性
脂質融合をFRET(蛍光共鳴エネルギー転移)シグナルの出現によってモニターするために、蛍光標識リポソームの対検体を調製した。0.3モル%のNBD−PEをドナーリポソームに添加し、0.3モル%のローダミン−PEをレセプターリポソームに添加した。すべての脂質をイソプロパノールに濃度20mMで溶解し、下記に示す混合物を個別に調製した。次いで、個別のアルコール性脂質検体50μlをそれぞれ、下記の緩衝液のいずれかと急速に混合した。
A)360μlの20mM 酢酸/水酸化ナトリウム、pH4
B)360μlの20mM 酢酸/水酸化ナトリウム、pH4、さらに15μgのsiRNAを含む。
C)380μlの10mM 酢酸/10mM リン酸/水酸化ナトリウム、pH7.5。
表31のデータから、試験製剤の大部分は融合性であったことが明らかになる。カチオン性脂質成分としてDC−Cholを含む製剤は、中間のpH値で極めて融合性であるが、中性のpHと酸性のpHとにおいて、安定なリポソームを形成することがわかった。リポソームが中性のpHで生成され、したがって測定の前に酸性のpHに曝露されなかったかどうか、またはこのようなリポソームが酸性のpHで生成され、使用する前に中性にしたかどうかはあまり重要ではなかった。また、siRNAなどのカーゴ分子の存在は、リポソームの融合挙動に影響を与えなかった。
TEEを含むリポソームのインビボでの使用
この試験では、siRNA充填両性リポソームは、標的遺伝子としてApoBを使用して製造した。非標的スクランブルsiRNAを対照のために使用した。
接線流法を使用して、ポリエーテルスルホン膜(Millipore Corporation, Billerica, MA)を備えたPellicon(登録商標)XLカセットで、製剤を20または30倍濃縮した。100mM トリス/H3PO4、150mM スクロース(pH7.4)の5倍の体積を連続添加し、続いてH3PO4によってpH7.4に滴定された20mM トリス、280mM スクロースの緩衝液を連続添加することによって、外側の緩衝液を交換した。
第1群:生理食塩水(PBS)
第2群:L−44 ApoB、8mg/siRNA(kg)、440μmol/脂質(kg)
第3群:L−44 スクランブル、8mg/kg、370μmol/脂質(kg)
第4群:L−45 ApoB、8mg/kg、520μmol/脂質(kg)
第5群:L−45 スクランブル、8mg/kg、560μmol/脂質(kg)
動物に対し、1、2、および3日に注射し、4日に屠殺した。
TEEの疎水性部分の鎖長の影響
中性または双性イオン性脂質および逓増量のTEE−脂質(0モル%、2.5モル%、5モル%、または10モル%)を含む混合物から、リポソームを調製した。ここで、使用したTEEの疎水性部分の鎖長は6〜20で異なった。
A.POPC/DOPE=0.3
B.POPC/Chol=1
w6−PE w6−DPTAP
w10−PE
w12−PE w12−DPTAP
w16−PE w16−DPTAP
w20−DPTAP
カルボキシフルオレセイン(CF)を封入したリポソームによるインビトロトランスフェクション実験
リポソームの調製
次のリポソーム調製物を実施例4に示すように調製した。リポソーム懸濁液を、孔径800/800nmのポリカーボネート膜に19回通して押し出した。
HeLa−細胞は、DSMZ(German Collection of Micro Organism and Cell Cultures)から入手し、DMEM中で維持した。培地は、Gibco−Invitrogenから購入し、5% CO2中、10% FCSを37℃で補充した。細胞を4×104個の細胞/mlの密度で播種し、100μlの培地中で培養した。16時間後、培地を、全量0.05mM CF/ウェルを含むリポソーム(L−46〜L−49)を含有するOpti−MEM I(Gibco)に置換した。細胞培養皿を、5% CO2中、37℃で4時間インキュベートした。蛍光顕微鏡法で露光時間時間を5秒にし、10/100倍対物レンズ(Axionvert S 100, Carl Zeiss Inc.)を使用して、トランスフェクション効率および細胞分布を4時間後に決定した。画像処理する前に、細胞をPBS(pH7.4)で数回(5回)洗浄し、直接(インキュベーション時間20〜30秒)50μlのPBS(pH7.4)中で分析した。対照として、PBS中の遊離CF(0.1mM)を細胞に添加した。
カルボキシフルオレセインは、酸性環境(例えば、エンドソーム)では蛍光シグナルを示さないpH感受性蛍光プローブである。
siRNA標的Plk−1または非標的スクランブル(scr)siRNAを封入したリポソームによるインビトロトランスフェクション実験
リポソームの調製
リポソームを、イソプロパノールまたはエタノール注入方法で製造した。脂質混合物を、イソプロパノール/1% HCl(L−50およびL−51))またはエタノール(L−52およびL−53)に脂質濃度6.7mMで溶解した。脂質溶液を、10mM HAC、300mM スクロース(pH4.0)(Trisで調整したpH)にとかした適切なsiRNA溶液(169μg/ml)に注入し、最終アルコール濃度を30%にした。生成したリポソーム懸濁液を、150mM TRIS(pH8.0)(HClで調整したpH)の2倍の体積でpH7.5にシフトさせ、次いで20mM トリス、280mM スクロース(pH7.4)(HClで調整したpH)に対し透析して、封入されていないsiRNAおよびアルコールを除去した。
HeLa細胞は、DSMZ(German Collection of Micro Organism and Cell Cultures)から入手し、DMEM中で維持した。培地は、Gibco−Invitrogenから購入し、5% CO2中、10% FCSを37℃で補充した。細胞を1.5×104個の細胞/mlの密度で播種し、100μlの培地中で培養した。16時間後、siRNAを含むリポソームをOptimem I(Gibco−Invitrogen)に希釈し、10μlを細胞に添加した(最終体積110μl、および9.1% FCS/ウェル)(5〜40nM Plk1またはスクランブルsiRNA)。10μlのOptimem Iを、無処置細胞にも、細胞を含まないウェルにも添加した。さらに、対照として、細胞に遊離siRNA(10〜80nM Plk−1またはスクランブルsiRNA)を添加した。細胞培養皿を、5% CO2中、37℃で72時間インキュベートした。細胞増殖能/生存率アッセイを使用して、トランスフェクション効率を分析した。
CellTiter−Blue Cell Viabilityアッセイ(Promega, US)を使用することによって、細胞増殖能/生存率を確定した。要するに、トランスフェクションの72時間後に、20μlのCellTiter−Blue試薬をウェルに添加した。37℃で2.5時間インキュベートした後、100μlの培地を黒色マイクロタイタープレート(NUNC, Denmark)のウェルに移した。蛍光プレートリーダーを使用して(励起550nm/発光590nm)、蛍光を記録した。各プレートには、次の対照を含めた。i)細胞を含まないが培地を含むウェル(培地バックグラウンド蛍光のための対照)、およびii)細胞を含むウェル(無処置細胞=モックのトランスフェクトされた細胞)。計算のため、実験ウェル(トランスフェクトされた細胞およびモックのトランスフェクトされた細胞)のすべての値から、培地バックグラウンドの平均蛍光値を減じた。各レプリケートトランスフェクションからの平均蛍光値を、モックのトランスフェクトされた細胞からの平均蛍光値にノーマライズし、これを100%と設定した。
図19は、製剤L−50〜L53によるHela細胞のトランスフェクション後の細胞増殖(%)を示す。10%のTEE−脂質Pal−PEを含み、Plk−1 siRNAを封入した製剤L−50によって、細胞増殖が明らかに増殖約20%に低下することが明らかになる。細胞増殖の低下は用量依存的である。一方、TEE−脂質を含まず、Plk−1 siRNAを封入した製剤L−52は、Hela細胞の細胞増殖を細胞増殖約80%にしか低下することができない。スクランブルsiRNAを封入した製剤L−51とL−53はどちらも、Hela細胞の増殖にわずかにしか影響を及ぼさない。
TEEを含む脂質を含むリポソームの融合性
中性または双性イオン性脂質(POPC/Chol 1:1)および10モル%のTEE−脂質を含む混合物から、リポソームを調製した。ここで、使用したTEEの疎水性部分の鎖長は6〜20で異なった。対照として、TEE−脂質を含まないリポソーム、およびpH感受性親水性部分としてのカルボキシル基がないアルキル鎖を有する脂質を含むリポソーム(C6−PE、C12−PE、C16−PE、C20−PE)を調製した。
w6-PE w6-DPTAP C6-PE
w12-PE w12-DPTAP C12-PE
w16-PE w16-DPTAP C16-PE
w20-DPTAP C20-PE
TEE−脂質を含むリポソームの融合性
FRETに基づく脂質混合アッセイを使用して、脂質混合物の融合性を調査した。脂質融合をFRETシグナルの出現によってモニターするために、0.75モル%のNBD−PE(N−(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール−4−イル)−1,2−ジヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノール−アミン、トリエチルアンモニウム塩)またはローダミン−PE(Lissamine(商標)ローダミンB 1,2−ジヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩)でそれぞれ単一標識されたリポソームを調製した。
リポソーム製剤の融合性に及ぼすTEE−脂質の影響率は、各製剤の0% TEE−脂質と10% TEE−脂質との間のΣFRETの勾配を算出することによって実験データから確定することができる。表38中のほぼすべての製剤の融合性は、脂質混合物中のTEE−脂質によって改善することができる。
siRNA標的Plk−1または非標的スクランブル(scr)siRNAを封入したリポソームによるインビトロトランスフェクション実験
リポソームの調製
リポソームを、イソプロパノール注入方法で製造した。脂質をイソプロパノールに溶解し、混合した。NaAc20mM、スクロース300mM(pH4.0)(HAcで調整したpH)にとかしたsiRNA溶液(163.2または81.5μg/ml)をアルコール性脂質ミックスに添加し、最終アルコール濃度を30%にすることによって、リポソームを生成した。生成したリポソーム懸濁液を、136mM Na2HPO4、100mM NaCl(pH9)の2倍の体積でpH7.5にシフトさせ、最終脂質濃度を1.4mM、および最終イソプロパノール濃度を10%にした。リポソームの調製では、液体ハンドリングロボット(Perkin Elmer, Multiprobe II Ex)を使用した。
HeLa細胞は、DSMZ(German Collection of Micro Organism and Cell Cultures)から入手し、DMEM中で維持した。培地は、Gibco−Invitrogenから購入し、5% CO2中、10% FCSを37℃で補充した。細胞を2×104個の細胞/mlの密度で播種し、100μlの培地中で培養した。16時間後、siRNAを含むリポソームをPBS(Gibco−Invitrogen)に希釈し、10μlを細胞に添加した(最終体積110μl、および9.1% FCS/ウェル)(5〜80nM Plk1またはスクランブルsiRNA)。10μlのPBSを、無処置細胞にも、細胞を含まないウェルにも添加した。さらに、対照として、細胞に遊離siRNA(10〜80nM Plk−1またはスクランブルsiRNA)を添加した。細胞培養皿を、5% CO2下、37℃で72時間インキュベートした。細胞増殖能/生存率アッセイを使用して、トランスフェクション効率を分析した。
CellTiter−Blue Cell Viabilityアッセイ(Promega, US)を使用することによって、細胞増殖能/生存率を確定した。要するに、トランスフェクションの72時間後に、20μlのCellTiter−Blue試薬をウェルに添加した。37℃で2.5時間インキュベートした後、100μlの培地を黒色マイクロタイタープレート(NUNC, Denmark)のウェルに移した。蛍光プレートリーダーを使用して(励起550nm/発光590nm)、蛍光を記録した。各プレートには、次の対照を含めた。i)細胞を含まないが培地を含むウェル(培地バックグラウンド蛍光のための対照)、およびii)細胞を含むウェル(無処置細胞=モックのトランスフェクトされた細胞)。計算のため、実験ウェル(トランスフェクトされた細胞およびモックのトランスフェクトされた細胞)のすべての値から、培地バックグラウンドの平均蛍光値を減じた。各トランスフェクションからの蛍光値を、モックのトランスフェクトされた細胞からの平均蛍光値にノーマライズし、これを100%と設定した。
図21は、製剤L−54〜L69によるHela細胞のトランスフェクション後の相対的細胞増殖を示す。w16−PEを含み、Plk−1 siRNAを封入した製剤はすべて、細胞増殖を低下させる。図22は、細胞増殖の低下が用量依存的であることを示す。一方、TEE−脂質を含まず、Plk−1 siRNAを封入した製剤は、Hela細胞の細胞増殖により低い程度でしか影響を及ぼさない。スクランブルsiRNAを封入した製剤は、Hela細胞増殖に影響を及ぼさない。
6−{2−[2,3−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロポキシ)−ヒドロキシ−ホスホリル−オキシ]−エチルアミノ}−ヘキサン酸(w6−PE)の合成
ステップa.6−オキソヘキサン酸の合成
実施例1のステップaに記載されているように、10gの6−ヒドロキシカプロン酸(1当量)を32.6gのPCC(クロロクロム酸ピリジニウム)(2当量)で37℃において約20分間酸化した。
第2ステップでは、1.11gの6−オキソヘキサン酸、4.72gのDPPE、6.0gのシアノ水素化ほう素ナトリウム(NaCNBH3)、および3.78gのピリジンを使用して、実施例1のステップbに記載されている還元的アミノ化によって、w6−PEを合成した。4時間後に、溶媒を除去し、残渣を2.5リットルのクロロホルム/メタノール/H2O(500:100:4)に溶解し、100mlのH2Oを添加した。2相を分液した後、有機相の溶媒を除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:クロロホルム/メタノール/H2O 500:300:4)で精製した。溶媒を除去し、残渣を10mlのH2Oで洗浄した。混合物をフリットにし、粗生成物を2つの別のシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液1:クロロホルム/メタノール/H2O 500:300:4;溶離液2:クロロホルム/メタノール/H2O 500:100:4)で精製した。生成物の純度を、薄層クロマトグラフィー、1H−NMR、およびLC−MSによって判定した。
12−{2−[2,3−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロポキシ)−ヒドロキシ−ホスホリル−オキシ]−エチルアミノ}−ドデカン酸(w12−PE)の合成
ステップa.12−オキソ−ドデカン酸の合成
実施例1のステップaに記載されているように、14gの12−ヒドロキシドデカン酸(1当量)を27.9gのPCC(クロロクロム酸ピリジニウム)(2当量)で37℃において約25分間酸化した。
第2ステップでは、1.2gの12−オキソ−ドデカン酸、3.88gのDPPE、4.93gのシアノ水素化ほう素ナトリウム(NaCNBH3)、および3.1gのピリジンを使用して、実施例1のステップbに記載されている還元的アミノ化によって、w12−PEを合成した。5時間後に、溶媒を除去し、残渣に100mlのH2Oを添加し、次いで混合物を音波処理した。遠心ステップの後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:クロロホルム/メタノール/H2O 500:100:4)で精製した。生成物の純度を、薄層クロマトグラフィー、1H−NMR、およびHPLCによって判定した。
21−{2−[(2,3−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロポキシ)−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ]−エチルアミノ}−ヘニコサン酸(w21−PE)の合成
ステップa.11−ヨードウンデカン酸の合成
11−ヨードウンデカン酸を、Bergbreiter, J.Org.Chem., 40 (6), (1975)779-782に従って合成した。簡潔に言えば、N2雰囲気下で、250gの11−ブロモウンデカン酸、325gのヨウ化ナトリウム、および2リットルのアセトンを24時間還流した。混合物を分割し、それぞれ4リットルのH2Oに添加した。混合物をフリットにし、粗生成物をメタノールから再結晶し、最後に融点によって特徴付けた。
11−ヨード−ウンデカン酸エチルエステルを、Bergbreiter, J.Org.Chem., 40 /6, (1975)779に従って合成した。簡潔に言えば、246.6gの11−ヨードウンデカン酸、440mlの乾燥エタノール、440mlの乾燥トルオール、および5mlのH2SO4(98%)を混合した。混合物を蒸留し、それによって約400mlの共沸混合物を75℃または76℃でそれぞれ除去した。次いで、15gのK2CO3を添加し、5分後に、混合物を濾過し、最後に浴温度115℃で蒸留した。得られた茶色油を、シリカゲル充填フリットに通す濾過(溶離液:酢酸エチルエステル/石油エーテル 1:7)によって精製した。最終生成物を、1H−NMRおよび薄層クロマトグラフィーによって特徴付けた。
ドコス−21−エン酸エチルエステルを、Bergbreiter et al., J. Org. Chem, 40 (6), (1975), 779-782に従って合成した。
グリニャール試薬
1.55gのマグネシウムを、N2雰囲気下、20mlの乾燥テトラヒドロフラン(THF)およびヨウ素結晶と混合した。次いで、11.09gの11−クロロ−1−ウンデセンを22mlの乾燥THFに溶解し、この溶液を30℃でマグネシウム混合物に徐々に滴下した。さらにヨウ素結晶を添加した後、混合物を45分間還流した。次いで、混合物を反応させ、25分後、再び45分間還流した。
主反応
N2雰囲気下、11.19gのヨウ化銅(I)および100mlのTHFを混合し、−78℃に冷却した。次いで、36.73mlのメチルリチウム(エーテル中1.6M)を滴下した。混合物を0℃にし、次いで再び−78℃に冷却した。グリニャール試薬を滴下した後、混合物を1時間撹拌した。次いで、温度を段階的に20℃まで上げ、再び−78℃まで下げた。ステップbからの11−ヨード−ウンデカン酸エチルエステルを20mlの乾燥THFに溶解し、反応混合物に滴下し、次いで約1時間撹拌させた。次いで、混合物を融解し、一夜後、300mlの飽和NH4Cl溶液および200mlのエーテルに添加した。固体を濾過によって除去し、濾液の相を分液し、水相をエーテルで3回洗浄した。合わせた有機相を塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。次いで、有機溶媒をロータリーエバポレータで除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:1.石油エーテル;2.酢酸エチルエステル/石油エーテル 1:20)で精製し、続いてエタノールから再結晶した。最後に、生成物の純度を、薄層クロマトグラフィー、および1H−NMRによって判定した。
22−ヒドロキシ−ドコサン酸を、Mori et al., Liebigs Ann.Chem., (1991), 253-257に従って合成した。簡潔に言えば、N2雰囲気下、6.6gのドコス−21−エン酸エチルエステルおよび30mlのTHFを混合し、0℃に冷却した。次いで、0.5当量(9ml)のボラン/THF錯体を滴下し、混合物を室温で2時間撹拌させた。1.2mlのH2Oを添加した後、懸濁液再び0℃に冷却し、15mlの3M NaOHおよび2mlの35% H2O2を添加した。混合物を50℃で1時間撹拌した。次いで、温度を室温にし、pHを、2N HClでpH2〜3に調整した。固体をフリットにし、H2Oで洗浄し、CHCl3で3回共蒸留し、CHCl3から再結晶した。さらにTHF中50℃においてNaOH(H2O中3M)で1.5日にわたって処置した後、pHを再びpH2〜3に調整し、粗生成物をフリットにし、H2Oで洗浄し、CHCl3で2回共蒸留した。生成物を、薄層クロマトグラフィーおよび1H−NMRによって特徴付けた。
実施例1のステップaに記載されているように、3.9gの22−ヒドロキシ−ドコサン酸(1当量)を、4.72gのPCC(クロロクロム酸ピリジニウム)(2当量)で還流下に約2時間酸化した。
このステップでは、0.62gの22−オキソ−ドコサン酸、1.21gのDPPE、1.54gのシアノ水素化ほう素ナトリウム(NaCNBH3)、および0.97gのピリジンを使用して、実施例1のステップbに記載されている還元的アミノ化によって、w21−PEを合成した。5時間後に、溶媒を除去し、残渣に40mlのH2Oを添加し、次いで混合物を音波処理した。固体をフリットにした後、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:クロロホルム/メタノール/H2O 500:100:4)で精製した。生成物の純度を、薄層クロマトグラフィー、1H−NMR、およびHPLCによって判定した。
ヘキサデカン酸1−{[(5−カルボキシ−ペンチル)−ジメチル−アンモニウム]メチル−2−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル(w6−DPTAP)の合成
反応スキーム
43.17gの3−(ジメチルアミノ)−1,2−プロパンジオールを1000mlのジクロロメタンに溶解した。73.3gのトリエチルアミンおよび0.01gの4−ジメチルアミノピリジンを添加した後、混合物を0℃に冷却した。次いで、100mlのジクロロメタンに溶解した199.18gのヘキサデカン酸クロリドを滴下した。さらに100mlのジクロロメタンを添加した後、混合物を室温にし、終夜撹拌させた。混合物を濾過し、残渣を300mlのジクロロメタンで洗浄した。ロータリーエバポレータを使用して、濾液の溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:酢酸エチルエステル/石油エーテル 1:1)で精製した。生成物を1H−NMRによって特徴付けた。
N2雰囲気下、32.39gのヘキサデカン酸1−ジメチルアミノメチル−2−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル、9.84gの6−ブロモ−1−ヘキサノール、および500mlのアセトニトリルを混合し、約1日還流した。次いで、混合物を5℃に冷却し、約7時間後に、白色固体を濾過し、酢酸エチルエステルから再結晶した。生成物の純度を、薄層クロマトグラフィーによって判定した。
8.31gの(2,3−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル)−(6−ヒドロキシヘキシル)−ジメチル−アンモニウムブロミドを40mlのジクロロメタンに懸濁し、撹拌下、20mlのジクロロメタンにとかした0.035gのTEMPOを添加した。0.268gのKBrを3mlのH2Oに溶解し、反応に添加した。0.22gのAliquat 336(商標)を添加した後、混合物を氷浴で冷却し、67mlの次亜塩素酸ナトリウム溶液に溶解した1gのNaHCO3を滴下した。200mlのCHCl3を添加する前に、混合物を室温で5時間撹拌した。相を分液し、有機相をNa2SO4で乾燥した。溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:クロロホルム/メタノール 4:1)で精製した。生成物を、1H−NMRおよびLC−MSによって特徴付けた。
ヘキサデカン酸1−{[(11−カルボキシ−ウンデシル)−ジメチル−アンモニウム]メチル−2−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル(w12−DPTAP)の合成
ステップa:(2,3−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル)−(12−ヒドロキシドデシル)−ジメチル−アンモニウムブロミドの合成
実施例19のステップbに記載されているように、22.47gのヘキサデカン酸1−ジメチルアミノメチル−2−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル、10gの12−ブロモ−1−ドデカノール、および500mlのアセトニトリルを使用して、合成を行った。粗生成物を酢酸エチルエステル/メタノール(9:1)から再結晶し、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーおよび1H−NMRによって判定した。
実施例19のステップcに記載されているように、9.21gの(2,3−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル)−(12−ヒドロキシドデシル)−ジメチル−アンモニウムブロミド、0.035gのTEMPO、0.268gのKBr、0.22gのAliquat(商標)、および67mlの次亜塩素酸ナトリウムに溶解した1gのNaHCO3を使用して、w−12−DPTAPを合成した。粗生成物を2つのシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液1:クロロホルム/メタノール 4:1;溶離液2:クロロホルム/メタノール 8:1)で精製した。生成物を、1H−NMRおよびLC−MSによって特徴付けた。
ヘキサデカン酸1−{[(15−カルボキシ−ペンタデシル)−ジメチル−アンモニウム]メチル−2−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル(w16−DPTAP)の合成
ステップa:(2,3−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル)−(16−ヒドロキシヘキサデシル)−ジメチル−アンモニウムブロミドの合成
実施例19のステップbに記載されているように、18.55gのヘキサデカン酸1−ジメチルアミノメチル−2−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル、10gの16−ブロモ−1−ドデカノール、および500mlのアセトニトリルを使用して、合成を行った。粗生成物を酢酸エチルエステル/メタノール(10:1)から再結晶し、生成物の純度を薄層クロマトグラフィーおよび1H−NMRによって判定した。
実施例19のステップcに記載されているように、14gの(2,3−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル)−(16−ヒドロキシヘキサデシル)−ジメチル−アンモニウムブロミド、0.05gのTEMPO、0.382gのKBr、0.3gのAliquat(商標)、および95.6mlの次亜塩素酸ナトリウムに溶解した1.43gのNaHCO3を使用して、w−16−DPTAPを合成した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:クロロホルム/メタノール 8:1)で精製した。生成物を、1H−NMRおよびLC−MSによって特徴付けた。
ヘキサデカン酸1−{[(19−カルボキシ−ノナデシル)−ジメチル−アンモニウム]メチル−2−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル(w20−DPTAP)の合成
ステップa:イコサン−1,20−ジオールの合成
イコサン−1,20−ジオールを、Yoon et al., J. Org. Chem. 1973, 38(16), 2786-2792に従って合成した。簡潔に言えば、N2雰囲気下、25gのエイコサン二酸に、100mlのTHFを添加した。次いで、474.5mlのボラン/THF錯体を1.5時間にわたって滴下した。200mlのTHF/H2O(1:1)を滴下する前に、混合物を終夜還流した。さらに撹拌下、250mlのH2Oに溶解した100gのNaHCO3を添加し、2時間後に、1000mlのH2Oを混合物に添加し、沈殿物を濾過によって除去した。翌日およびその次の日に、白色沈殿物を濾過によって混合物から除去し、乾燥し、酢酸エチルエステルから再結晶した。生成物を、薄層クロマトグラフィーおよび1H−NMRによって特徴付けた。
20−ブロモ−イコサン−1−オールを、Uneyama et al, Tetrahedron Letters, 1991, 32(11), 1459-1462に従って合成した。簡潔に言えば、240mlの石油エーテル、20.34gのイコサン−1,20−ジオール、および280mlのHBr(H2O中48%)を添加する前に、400mlの石油エーテルを加熱した。混合物を終夜還流し、室温でさらに1日インキュベートした。次いで、沈殿物を濾過によって除去し、300mlのジクロロメタンに溶解した。溶液をNa2SO4で乾燥し、シリカゲルに通して濾過した。溶媒を除去し、最後に粗生成物を石油エーテルから再結晶した。生成物の純度を、1H−NMRによって判定した。
実施例19のステップbに記載されているように、17.89gのヘキサデカン酸1−ジメチルアミノメチル−2−ヘキサデカノイルオキシ−エチルエステル、11.33gの20−ブロモ−イコサン−1−オール、および500mlのアセトニトリルを使用して、合成を行った。粗生成物をクロロホルム/メタノール(3:1)から再結晶し、生成物の純度を、薄層クロマトグラフィーおよび1H−NMRによって判定した。
実施例19のステップcに記載されているように、11.45gの(2,3−ビス−ヘキサデカノイルオキシ−プロピル)−(20−ヒドロキシ−イコシル)−ジメチル−アンモニウムブロミド、0.039gのTEMPO、0.294gのKBr、0.2gのAliquat(商標)、および73.7mlの次亜塩素酸ナトリウムに溶解した1.1gのNaHCO3を使用して、w−20−DPTAPを合成した。粗生成物をシリカゲルに通して濾過し、クロロホルム/メタノール(4:1)による洗浄ステップの後、生成物を、1H−NMRおよびLC−MSによって特徴付けた。
ヘキサデカン酸3−{[2−(15−カルボキシ−ペンタデカノイルアミノ)−エトキシ]−ヒドロキシ−ホスホリルオキシ}−2−ヘキサデカノイルオキシ−プロピルエステル(w16−Amid−PE)の合成
反応スキーム:
3gのヘキサデカンジカルボン酸および4.5mlの無水酢酸酸を終夜還流した。次いで、溶媒を除去し、粗生成物をアセトニトリルから再結晶した。
N2雰囲気下、8gのDPPE、160mlのクロロホルム、3.1gのオキサシクロヘプタデカン−2,17−ジオン、4.57gのピリジン、および0.1gのジメチルアミノピリジンを混合し、70℃で終夜撹拌した。次いで、溶媒をロータリーエバポレータで除去し、超音波処理下で、残渣を160mlの1N HClに再懸濁した。翌日に、混合物をフリットにし、固体を80mlの1N HClで洗浄し、次いでクロロホルム/メタノール/H2O(65:25:4)に溶解した。水相を除去し、有機溶媒をロータリーエバポレータで除去した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:クロロホルム/メタノール 9:1)で精製した。生成物を、1H−NMRおよびLC−MSによって特徴付けた。
オクタン二酸モノコレステリルエステル(コレステロールヘミスベレート)の合成
ステップa:オキソナン−2,9−ジオンの合成
N2雰囲気下、50gのスベリン酸および100mlの無水酢酸酸を2時間還流した。溶媒を蒸発させ、200mlのアセトニトリルを残渣に添加し、混合物を冷凍器に終夜保持した。次いで、混合物をフリットにし、得られた残渣を50mlのアセトニトリルで洗浄し、乾燥した。
35gのコレステロールおよび21.2gのオキセパン−2,7−ジオンを丸底フラスコに量り入れた。N2雰囲気下、250mlのトルオール、14.3mlのピリジン、および0.22gの4−ジメチルアミノピリジンを添加した。反応を1日還流した。次いで、溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタン/酢酸エチルエステル(96:4)に溶解し、フリットによってシリカゲルで精製した(溶離液:ジクロロメタン/酢酸エチルエステル(96:4))。生成物を1H−NMRによって特徴付けた。
N−(3−アミノ−プロピル)−N’−[3−(4−{3−[4−(3−アミノプロピルアミノ)−ブチルアミノ]−プロピルアミノ}−ブチルアミノ)−プロピル]−ブタン−1,4−ジアミン(化合物4)の合成
反応スキーム:
Geall et al., Chem. Commun. 1998, 2035に従って、化合物を合成した。簡潔に言えば、10.12gのスペルミンおよび150mlのメタノールを撹拌し、−75℃に冷却した。次いで、5.95mlのトリフルオロ酢酸エチルエステル(99%)を滴下した。温度を0℃に上げ、42.8mlの二炭酸ジ−tert−ブチル(BOC2O)を添加し、反応を室温で終夜撹拌した。約50mlの溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、50mlのH2Oで置換し、200mlのジエチルエーテルで3回抽出した。有機相をNa2SO4で乾燥し、濾過し、真空下で蒸発させた。無色油の粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液1:ジクロロメタン/メタノール/NH4OH(25%)70:10:1;溶離液2:ジクロロメタン/メタノール/NH4OH(25%)50:10:1)で精製した。生成物を、1H−NMRおよびLC−MSによって特徴付けた。
丸底フラスコ中で、36.3gのDCC(N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド)、0.2gの4−ジメチルアミノピリジン、46.7gのp−ニトロフェノール、および16gの無水コハク酸、および600mlの酢酸エチルエステルを混合し、室温で3日間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、黄色の残渣を150mlのクロロホルムから再結晶した。白色生成物をクロロホルムで洗浄し、乾燥し、薄層クロマトグラフィーおよび1H−NMRによって特徴付けた。
Graminski et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 35-40に従って、化合物11を合成した。簡潔に言えば、8.8gの化合物6を100mlのジメチルホルムアミドに溶解した。次いで、1.95 N−メチルモルホリンおよび2.84gの化合物10を添加し、混合物を室温で終夜撹拌させた。溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、黄色油の粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:酢酸エチルエステル/メタノール 9:1)で精製した。溶媒を除去し、残渣を100mlの酢酸エチルエステルおよび100mlの石油エーテルに溶解した。混合物を150mlのH2Oで3回洗浄し、有機相をNa2SO4で乾燥した。濾過した後、溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、生成物を薄層クロマトグラフィー、LC−MS、および1H−NMRによって特徴付けた。
N2雰囲気下、4.68gの化合物11を40mlのテトラヒドロフランに溶解し、反応混合物を氷浴で冷却した。次いで、10.8mlのボラン−ジメチルスルフィド錯体(テトラヒドロフラン中2M)を添加し、反応を室温で終夜撹拌させた。100mlの石油エーテル、20mlの酢酸エチルエステルおよび2mlのメタノールを添加した後、溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(フラッシュクロマトグラフィー;溶離液:酢酸エチルエステル)にかけた。溶媒を除去し、無色油の粗生成物を別のシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:酢酸エチルエステル)で精製した。生成物を、LC−MSおよび1H−NMRによって特徴付けた。
0.92gの化合物12を10mlのメタノールに溶解した。溶液を還流した後、15mlのHCl(37%)と20mlのHCl(2N)の混合物を滴下した。反応混合物を終夜還流した。10mlのH2Oを添加した後、混合物を50mlのジクロロメタンで2回抽出した。水相の溶媒を除去し、生成物を1H−NMRおよびLC−MSによって特徴付けた。
TEEによる化合物4の誘導体化
50mg(0.1mmol)の化合物4の検体をω−ブロモ−α−カルボン酸でアルキル化した。簡潔に言えば、0.3mmolもしくは0.6mmolの6−ブロモヘキサン酸もしくは10−ブロモデカン酸、またはこれら2つの等モル混合物を2mlの乾燥DMFに溶解し、0.1mmolの化合物4をそれぞれの反応に添加した。混合物を50℃で終夜インキュベートし、室温に冷却し、アルキル化度を質量分析法で確定した。
Claims (63)
- 一般式(I):
脂質部分−[疎水性部分−pH感受性親水性部分] (I)
に従う、脂質部分および1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質(脂質−TEE)であって、
前記1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素(TEE)は一般式(II):
疎水性部分−pH感受性親水性部分 (II)
を有し、
式中、各TEEのpH感受性親水性部分は独立に、pka2〜6の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むpKa3〜8の双性イオン構造であり、ただし前記脂質が、次の構造(III)、(IV)、または(V)のうちの1つではないことを条件とする脂質。
PE−アミド結合−X−COOH (III)
(式中、PEは、ホスファチジルエタノールアミン部分であり、Xは、3〜20個の原子の鎖長を有し、場合によっては1個または複数のヘテロ原子を含む置換または非置換の飽和または不飽和炭素含有直鎖である);
- 前記TEEが、疎水性部分および1種または複数のpH感受性親水性部分を特徴とする、請求項1に記載の脂質。
- 前記TEEが、次の一般式のうちの1つを有する、請求項1または請求項2に記載の脂質。
前記置換基は、1種または複数のpH感受性親水性部分、低級アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルチオ、およびアルキルチオアルキルから選択され、
Lj、Lk、またはLlは独立に、存在しないか、あるいは
−CH2−、−O−、−S−、−N(H)C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)N(H)−、−C(O)−、−C(O)N(H)−、−N(H)C(O)O−、−CH=N−、−OC(O)−、−N=CH− −S−S−、−NH−、−N(R13)(R14)−(ただし、R13およびR14は独立に、Hもしくは低級アルキルであり、またはR13もしくはR14の一方は、存在しなくてもよい)、
前記TEE中のC原子の総数は、6〜40個であり、pは≦40である);または
−ステロール (VII)
(式中、前記ステロールは、1種または複数の親水性部分、−OH、−SH、または低級アルキル、アルキレン、アルケニル、もしくはアルキニル、アルコキシ、アルキルアルコキシ、アルキルチオ、もしくはアルキルアルキルチオで置換されていてもよい)。 - 一般式VIにおける前記アミノ酸が、プロリン、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニン、またはそれらのペプチドから選択され、一般式VIにおける前記α−およびβ−ヒドロキシ酸が、グリコール酸、乳酸、およびヒドロキシ酪酸から選択される、請求項3に記載の脂質。
- 前記pH感受性親水性部分が弱酸であり、前記弱酸が、次の構造のうちの1つから選択されるカルボン酸、バルビツル酸もしくは誘導体、キサンチンもしくは誘導体、またはウラシルもしくは誘導体である、請求項1〜請求項4のいずれか一項に記載の脂質。
R1、R2、R3、およびR4は独立に、TEEの疎水性部分、水素、0〜5個の不飽和部位を有する直鎖状、分枝状、もしくは環状の非置換もしくは置換C1〜C10アルキル、アルキレン、またはヘテロアルキル、あるいはアリール基であり、前記基は、−O−または−S−から選択される0〜5個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、前記基中の第1の原子ではなく、前記置換基は、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択され、R1、R2、およびR3は、代替としてかつ独立にアルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基とすることができ、Dは、C、または0〜3個の不飽和部位を有し、かつ−O−、−S−から選択される0〜5個のヘテロ原子を含む非置換もしくは置換環状アルキル基もしくアリール基であり、前記置換基は、アルキル基、アルキレン基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択され、
Y1、Y2、およびY3は独立に、OまたはSであり、
Gは、CまたはNとすることができ、GがNであるとき、R1またはR2の一方は、存在しなくてもよく、R1およびR2はR4と定義される);
あるいは
R5、R6、R7、またはR9は、独立にTEEの疎水性部分、水素、0〜5個の不飽和部位を有する直鎖状、分枝状、もしくは環状の非置換もしくは置換C1〜C10アルキル、アルキレン、またはヘテロアルキル、あるいはアリール基とすることができ、前記基は、−O−または−S−から選択される0〜5個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロ原子は、前記基中の第1の原子ではなく、前記置換基は、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基から選択され、
R8はOまたはSHであり、
M3はNまたはCであり、
M2はCまたは−O−であり、M2が−O−である場合、R6は存在せず、
M1はNまたはCまたは−O−であり、M1が−O−である場合、R5は存在せず、
M1、M2、またはM3がCであるとき、R5、R6、またはR7は、さらにアルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルキルチオ基、アルキルチオアルキル基、ヒドロキシ基、メルカプト基、オキソ基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、ハロ基、またはトリハロメチル基とすることができ、R5、R6、またはR7と定義されたさらなる置換基R5’、R6’、またはR7’は、C原子に結合していてもよい);
あるいは
R10は、TEEの疎水性部分とすることができ、R11およびR12は独立に、水素、ヒドロキシ基、メルカプト基、ホルミル基、ニトロ基、シアノ基、またはハロ基、またはトリハロメチル基とすることができるが、R11およびR12の少なくとも一方はH以外であり、
Y1*およびY2*は独立に、OまたはSである)。 - 前記双性イオン構造の前記弱塩基が、イミダゾール、モルホリン、ピリジン、ピペラジン、または非環状アミンの群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の脂質。
- 前記TEEの前記1種または複数のpH感受性親水性部分がカルボン酸基である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の脂質。
- 前記疎水性部分がアルキル直鎖である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の脂質。
- 前記脂質−TEEが次の一般式:
脂質部分−[(L2)−(TEE)]r
(式中、L2は、存在しないか、または−CH2−、−O−;−S−;−N(H)C(O)−;−C(O)N(H)−;−C(O)O−;−OC(O)N(H)−;−C(O)−;−C(O)N(H)−;−N(H)C(O)O−;−NH−;−N(R13)(R14)−(ただし、R13およびR14は独立に、Hもしくは低級アルキルであり、またはR13もしくはR14の一方は、存在しなくてもよい);−CH=N−;−OC(O)−;−N=CH−;および−S−S−から選択される連結基であり;rは1〜5の整数である)
を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の脂質。 - 前記脂質部分が、−OH基で置換されていてもよいリン脂質およびそのリゾ型、スフィンゴ脂質およびそのリゾ型、コレステロールのようなステロールおよびその誘導体、ジアシルグリセロール/ジアルキルグリセロール、モノアシルグリセロール/モノアルキルグリセロール、グリセリン酸のモノエステル、ジエステル、モノエーテル、もしくはジエーテル、スフィンゴシン/フィトスフィンゴシン/スフィンガニンおよびそれらのN置換誘導体、セラミド、1,2−ジアシル−3−アミノプロパン/1,2−ジアルキル−3−アミノプロパン、1−もしくは2−モノアシル−3 アミノプロパン/1−もしくは2−モノアルキル−3−アミノプロパン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、脂肪酸、ジカルボン酸アルキルエステル、トリカルボン酸ジアルキルエステル、または酒石酸と長鎖アルコールとのエステル、もしくは酒石酸と長鎖カルボン酸とのエステルを含む群から選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の脂質。
- 一般式(XIII)〜(XIX)のうちの1つを有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の脂質。
Xaは、−OPO3−;−OPO2−CH2−;−ピロホスフェート−;−OSO3−;−OSO2−;−O−;−NH−;−S−;−N(H)C(O)−;−C(O)−、−C(O)N(H)−;−OC(O)N(H)−;−N(H)C(O)O−;−OC(O)−;−C(O)O−;−N=CH−;−CH=N−;−CH2−;−S−S−;−N(R13)(R14)−(ただし、R13およびR14は独立に、Hもしくは低級アルキルであり、またはR13もしくはR14の一方は、存在しなくてもよい);または
Yaは存在しないか、または非分枝状、分枝状、もしくは環状の置換もしくは非置換アルキル、アルケニル;1〜8個のC原子を有するアルキレン基もしくはアルキニル基もしくはアリール基であり、ここで前記置換基は、1種または複数の−OH;−NH2;−N(R13)(R14)(ただし、R13およびR14は、上記で定義される);−COOH;糖から選択され、あるいはYaは糖;アミノ酸;ジ−もしくはトリペプチド;α−ヒドロキシ酸もしくはβ−ヒドロキシ酸、またはジヒドロキシ酸であり、Zaは存在しないか、または−O−;−S−;−N(H)C(O)−;−C(O)N(H)−;−C(O)O−;−OC(O)N(H)−;−C(O)−;−C(O)N(H)−;−N(H)C(O)O−;−NH−;−N(R13)(R14)−(R13およびR14は上記のように定義する);−CH=N−;−OC(O)−;−N=CH−;−S−S−から選択される基であり、あるいはZaは、−NH2;−(NH3)+;−(N(R13)(R14)(R15))+(ただし、R13、R14、およびR15は、上記のR13およびR14のように定義される);−C(O)OH;−OH;−C(O)H;−C(O)OR16(ただし、R16は低級アルキルである);−C(O)NH2の群から選択され、点線は、1種または複数のTEEのあり得るグラフト位置を表す);
YaおよびZaは、上記で定義され、ステロールは、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、デスモステロール、フコステロール、22−ケトステロール、20−ヒドロキシステロール、スチグマステロール、22−ヒドロキシコレステロール、25−ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、7−デヒドロコレステロール、ジヒドロコレステロール、19−ヒドロキシコレステロール、5α−コレスト−7−エン3β−オール、7−ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、および/またはデヒドロエルゴステロールから選択され、好ましくは前記ステロールは、コレステロールであり、点線は、1種または複数のTEEのあり得るグラフト位置を表す);
あるいは
- 前記脂質が、2種以上の親水性極性頭部基または様々な位置において置換を可能にする複雑な親水性頭部基を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質。
- 前記脂質が、酒石酸と長鎖アルコールとのエステル;マレイン酸の誘導体;脂肪酸とグルコース、スクロース、もしくはマルトースなどの糖とのエステル;ドデシル−β−グルコピラノシドまたはドデシル−β−マルトシドなどアルキルグリコシドおよびその誘導体;Brij35、Genapolシリーズ、Thesitなどアルキル−エチレングリコール洗浄剤の誘導体、またはホスファチジルイノシトールおよびその誘導体を含む群から選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質。
- 前記脂質が、下記の化合物を含む群から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質。
(式中、RxおよびRyは独立に、0、1、または2個のエチレン性不飽和結合を含むC8〜C30アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはRxまたはRyの一方は、Hとすることができ、R3*およびR4*は独立に、HまたはC1〜C6アルキルである)。 - 前記脂質が、下記の化合物を含む群から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質。
(式中、RxおよびRyは独立に、0、1、または2個のエチレン性不飽和結合を含むC8〜C30アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはRxまたはRyの一方は、Hとすることができ、R*は、0、1、もしくは2個のエチレン性不飽和結合を含むC8〜C30アルキル鎖である)。 - 前記脂質が、下記の化合物を含む群から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質。
(式中、RxおよびRyは独立に、0、1、または2個のエチレン性不飽和結合を含むC8〜C30アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはRxまたはRyの一方は、Hとすることができる)。 - 前記脂質が、下記の化合物を含む群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質。
(式中、RxおよびRyは独立に、0、1、または2個のエチレン性不飽和結合を含むC8〜C30アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはRxまたはRyの一方は、Hとすることができ、m=6〜40である);
(式中、RxおよびRyは独立に、0、1、または2個のエチレン性不飽和結合を含むC8〜C30アルキル鎖またはアシル鎖であり、あるいはRxまたはRyの一方は、Hとすることができ、m=6〜40である);
- 脂質集合体であって、請求項1〜17のいずれか一項に記載の1種もしくは複数の脂質、またはイオン相互作用によって前記脂質集合体との複合体を形成するトランスフェクションエンハンサー要素(TEE)を含み、前記TEEは、次式:
疎水性部分−pH感受性親水性部分 (II)
(各TEEの前記pH感受性親水性部分は独立に、pka2〜6の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むpKa3〜8の双性イオン構造である)
を有する、脂質集合体。 - 前記脂質集合体が、リポソーム、ミセル、逆ミセル、立方もしくは六方脂質相、渦巻形、エマルジョン、ダブルエマルジョン、および実質的に脂質、油、もしくは両親媒性物質からなる他の多量体集合体から選択される、請求項18に記載の脂質集合体。
- 前記TEEが、ポリカチオン性要素との複合体を形成し、アニオン性脂質集合体と組み合わせられる、請求項18または19に記載の脂質集合体。
- 前記ポリカチオン性要素が、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、スペルミン、ジスペルミン、トリスペルミン、テトラスペルミン、オリゴスペルミン、テルミン、スペルミジン、プトレシン、およびリシン、オルニチン、またはアルギニンからのポリマーまたはオリゴマーから選択される、請求項20に記載の脂質集合体。
- 前記TEEが、ポリアニオン性要素との複合体を形成し、カチオン性脂質集合体と組み合わせられる、請求項18または19に記載の脂質集合体。
- 前記ポリアニオン性要素が、アクリル酸、メタクリル酸、グルタミン酸、またはアスパラギン酸のポリマーおよびオリゴマーから選択される、請求項22に記載の脂質集合体。
- 前記脂質集合体が、中性および/またはカチオン性および/またはアニオン性脂質をさらに含む脂質相から形成される、請求項18〜23のいずれか一項に記載の脂質集合体。
- 前記脂質集合体の総電荷が、中性、カチオン性、またはアニオン性である、請求項18〜24のいずれか一項に記載の脂質集合体。
- 前記中性脂質が、ホスファチジルコリン;ホスファチジルエタノールアミン;スフィンゴ脂質;セラミド;セレブロシド;ステロール系脂質、例えばコレステロール;および/またはこのような脂質の誘導体を含む群から選択される、請求項24または請求項25に記載の脂質集合体。
- 前記中性脂質が、DMPC、DPPC、DSPC、POPC、DOPC、DMPE、DPPE、DSPE、POPE、DOPE、ジフィタノイル−PE、スフィンゴミエリン、セラミド、および/またはコレステロールを含む群から選択される、請求項26に記載の脂質集合体。
- 前記カチオン性脂質が、DOTAP、DMTAP、DPTAP、DC−Chol、DAC−Chol、DODAP、DOEPC、TC−Chol、DOTMA、DORIE、DDAP、CTAB、CPyC、DPIM、CHIM、MoChol、HisChol、BGSC、BGTC、DOSPER、DOSC、DOGSDO、DmC4Mo2、DmC3Mo2、C3Mo2、C3Mo3、C4Mo4、C5Mo2、C6Mo2、C8Mo2、PipC2Chol、MoC2Chol、MoC3Chol、N−メチル−PipChol、PyrroC2Chol、PyC2Chol、ImC3Chol、PipeC2Chol、およびこのような脂質の誘導体を含む群から選択される、請求項24または請求項25に記載の脂質集合体。
- 前記アニオン性脂質が、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、chemsおよび別のアニオン性ステロール誘導体、セチルホスフェート、ジアシルグリセロールヘミスクシネート、およびカルジオリピン、ならびに/またはこのような脂質の誘導体を含む群から選択される、請求項24または請求項25に記載の脂質集合体。
- 前記脂質集合体が、DOPE、リゾ脂質、もしくは遊離脂肪酸、またはそれらの混合物を含む群から選択される融合性脂質を含む、請求項18〜29のいずれか一項に記載の脂質集合体。
- 1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む前記1種または複数の脂質の量が、全脂質相の0.1モル%〜90モル%である、請求項18〜30のいずれか一項に記載の脂質集合体。
- 前記脂質集合体が、両性特性を有する脂質相から形成される、請求項18〜31のいずれか一項に記載の脂質集合体。
- 前記脂質集合体が、様々な粒径およびラメラ性のリポソームまたは両性リポソームである、請求項18〜31のいずれか一項に記載の脂質集合体。
- 両性特性を有する脂質相から形成された脂質集合体であって、前記集合体は、一般式(I):
脂質部分−[疎水性部分−pH感受性親水性部分] (I)
に従う、1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質(脂質−TEE)を含み、
前記トランスフェクションエンハンサー要素(TEE)は、一般式(II):
疎水性部分−pH感受性親水性部分 (II)
(式中、前記TEEの前記pH感受性親水性部分は、pka2〜6の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むpKa3〜8の双性イオン構造である)
を有する脂質集合体。 - 前記TEEが、疎水性部分および1種または複数のpH感受性親水性要素を特徴とする、請求項34に記載の脂質集合体。
- TEEが、次の一般式のうちの1つを有する、請求項34または請求項35に記載の脂質集合体。
Lj、Lk、またはLlはそれぞれ独立に、存在しないか、あるいは
−CH2−、−O−、−S−、−N(H)C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)N(H)−、−C(O)−、−C(O)N(H)−、−N(H)C(O)O−、−CH=N−、−OC(O)−、−N=CH− −S−S−、−NH−、−N(R13)(R14)−(ただし、R13およびR14は独立に、HもしくはC1〜C6アルキルであり、またはR13もしくはR14の一方は、存在しなくてもよい)、
TEE中のC原子の総数は、6〜40個であり、pは≦40である);あるいは
−ステロール (VII)
(式中、前記ステロールは、1種または複数の親水性部分、−OH、−SH、または低級アルキル、アルキレン、アルケニル、もしくはアルキニル、アルコキシ、アルキルアルコキシ、アルキルチオ、およびアルキルアルキルチオで置換されていてもよい)。 - 1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む前記1種または複数の脂質の量が、全脂質相の0.1モル%〜90モル%である、請求項34〜36のいずれか一項に記載の脂質集合体。
- 前記両性脂質相が1種または複数の両性脂質を含む、請求項34〜37に記載の脂質集合体。
- 前記両性脂質が、HistChol、HistDG、isoHistSuccDG、アシルカルノシン、HCChol、Hist−PS、およびEDTA−Cholから選択される、請求項38に記載の脂質集合体。
- 前記両性脂質相が、(i)安定なカチオン性脂質および帯電可能なアニオン性脂質、(ii)帯電可能なカチオン性脂質および帯電可能なアニオン性脂質、または(iii)安定なアニオン性脂質および帯電可能なカチオン性脂質から選択される両性脂質混合物を含む、請求項34〜37に記載の脂質集合体。
- 前記脂質相が、20〜90モル%の前記両性脂質混合物、2〜20モル%のDeca−PE、w12−PE、Pal−PE、w21−PE、w12−DPTAP、w16−DPTAP、w20−DPTAP、w12−Amid−PE、およびw16−Amid−PEから選択される1種または複数のTEEを含む1種または複数の脂質、および場合によっては中性または双性イオン性脂質を含む、請求項40に記載の脂質集合体。
- 前記両性脂質混合物が「両性I」脂質対であり、カチオン性脂質とアニオン性脂質のモル比(C/A比)が0.3〜0.7である、請求項40または41に記載の脂質集合体。
- 前記両性脂質混合物が「両性II」脂質対であり、カチオン性脂質とアニオン性脂質のモル比(C/A比)が0.3〜3である、請求項40または41に記載の脂質集合体。
- 前記両性脂質混合物が、DOTAP/Chems、DOTAP/DMG−Succ、DOTAP/DOG−Succ、DODAP/Chems、DODAP/DMG−Succ、DODAP/DOG−Succ、DDAB/Chems、DDAB/DMG−Succ、DDAB/DOG−Succ、DC−Chol/Chems、DC−Chol/DMG−Succ、DC−Chol/DOG−Succ、DAC−Chol/Chems、DAC−Chol/DMG−Succ、DAC−Chol/DOG−Succ、TC−Chol/Chems、TC−Chol/DMG−Succ、TC−Chol/DOG−Succ、MoChol/Chems、MoChol/DMG−Succ、HisChol/DOG−Succ、HisChol/Chems、HisChol/DMG−Succ、HisChol/DOG−Succ、Chim/Chems、Chim/DMG−Succ、Chim/DOG−Succ、DmC4Mo2/Chems、DmC4Mo2/DMG−Succ、およびDmC4Mo2/DOG−Succから選択される、請求項42または43に記載の脂質集合体。
- 前記脂質集合体が両性リポソームである、請求項34〜43のいずれか一項に記載の脂質集合体。
- 前記両性リポソームが、ユニラメラ、オリゴラメラ、またはマルチラメラであり、前記両性リポソームの粒径が、50〜1000nm、好ましくは50〜500nm、より好ましくは70〜250nmで異なる、請求項45に記載の脂質集合体。
- 脂質相が、約10〜20%のホスファチジルコリン、20〜35%のDC−Chol、40〜60%のCHEMSまたはDMGSucc、および約5〜15%のPal−PEまたはDeca−PEを含む、請求項40〜46のいずれか一項に記載の脂質集合体。
- 前記脂質集合体がリポソームであり、脂質相が下記から選択される組合せを含む、請求項18〜47のいずれか一項に記載の脂質集合体。
- 前記脂質集合体が、少なくとも1種の医薬品有効成分を隔絶する、請求項18〜48に記載の脂質集合体。
- 前記医薬品有効成分が、DNAプラスミド、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドから選択される核酸系薬物である、請求項49に記載の脂質集合体。
- 前記核酸が、脊椎動物細胞において1種または複数のRNAへと転写されることが可能であり、前記RNAが、mRNA、shRNA、miRNA、またはリボザイムであり、前記mRNAは1種または複数のタンパク質またはポリペプチドをコードする、請求項51に記載の脂質集合体。
- 前記核酸が、環状DNAプラスミド、直鎖DNA構築物、またはmRNAである、請求項52に記載の脂質集合体。
- 前記核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項50に記載の脂質集合体。
- 前記オリゴヌクレオチドが、デコイオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、転写に影響を及ぼす作用剤、スプライシングに影響を及ぼす作用剤、リボザイム、DNAザイム、またはアプタマーである、請求項53に記載の脂質集合体。
- 前記オリゴヌクレオチドが、腫瘍標的に向けられている、請求項53または請求項54に記載の脂質集合体。
- 前記腫瘍標的が、CEACAM6、BCL−2、EPHA2、CTNNB1、RhoA、PLK1、XIAP、テロメラーゼ、サイクリンD1、K−Ras、EG5、Ki67、アンドロゲン受容体、FoxM1、Akt1、VEGF、KSB、およびCDC25Bから選択される、請求項55に記載の脂質集合体。
- 請求項18〜56のいずれか一項に記載の脂質集合体に隔絶されている医薬品活性成分、およびそのための医薬として許容されるビヒクルを含む医薬組成物。
- ヒトまたは非ヒト動物の炎症性、免疫もしくは自己免疫障害、および/または癌の治療または予防のための医薬品の製造における請求項57に記載の医薬組成物の使用。
- 治療上有効量の請求項57〜58のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することによってヒトまたは非ヒト動物を治療する方法であって、前記脂質集合体は活性剤を隔絶し、特定の1つもしくは複数の臓器、腫瘍、または感染もしくは炎症の部位を標的にする方法。
- 前記脂質集合体は、一般式(I):
脂質部分−[疎水性部分−pH感受性親水性部分] (I)
に従う、1種または複数のトランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質(脂質−TEE)を含み、
前記トランスフェクションエンハンサー要素(TEE)は、一般式(II):
疎水性部分−pH感受性親水性部分 (II)
(前記TEEの前記pH感受性親水性部分は、pka2〜6の弱酸、または酸性基と弱塩基との組合せを含むpKa3〜8の双性イオン構造である)
を有する、細胞のインビボ、インビトロ、またはエキソビボトランスフェクションのための脂質集合体の使用。 - 前記TEEが、疎水性部分および1種または複数のpH感受性親水性要素を特徴とする、請求項60に記載の脂質集合体。
- 前記脂質集合体は、ホスファチジルコリン、スフィンゴミレイン、セラミド、もしくはセレブロシド、またはそれらの混合物の群から選択される中性脂質と、コレステロールもしくはホスファチジルエタノールアミン、またはそれらの混合物との混合物を含む脂質相から形成され、混合物のモル比は1:3〜3:1である、請求項61または62に記載の脂質集合体の使用。
- 前記脂質相が、DOPEまたはコレステロールの群から選択される1種または複数の脂質と組み合わせて、DSPC、DPPC、DMPC、POPC、またはDOPCから選択されるホスファチジルコリンの混合物を含む、請求項62に記載の脂質集合体の使用。
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