JP2013543490A - デユビキチナーゼ阻害剤およびその使用方法 - Google Patents

デユビキチナーゼ阻害剤およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本明細書において、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）を阻害する方法、病原性（ウイルス性、細菌性、真菌性および／または寄生性）の感染を治療する方法、細胞増殖を抑制する方法、神経変性疾患を治療する方法、神経変性疾患または遺伝子障害の１以上の症状を治療する方法、およびそのような化合物を開示する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年９月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／３８６，０５７号に基づく優先権を主張し、当仮出願に記載された全ての記載内容は参照により本明細書に組み込まれる。
ユビキチン化は、細胞内タンパク質に対して、複雑な酵素カスケードが関与して行われる共有結合性の翻訳後修飾である。新たな知見より、ユビキチン化カスケードに属する多くの酵素はいくつかの疾患においてそれぞれ異なる発現または活性化を示すことから、それらの酵素が好適な治療標的となり得ることが示唆されている。
タンパク質のユビキチン化は、脱ユビキチン化酵素（デユビキチナーゼ、ＤＵＢ）による逆反応が可能で、該酵素により調節され得る動的な可逆的プロセスである。ヒトゲノムは、推定上ＤＵＢ活性を有する１００種類近いタンパク質をコードしており、これらのタンパク質は、２つの主要サブグループ、すなわち、ユビキチンＣ末端加水分解酵素（ＵＣＨ）とユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）に大別することができる。ＵＳＰは、ヒトにおけるＤＵＢの最大のサブクラスを構成しているのに対して、ＵＣＨ ＤＵＢは公知の４種類以外に関する報告はない。ＤＵＢは、主に、ユビキチンとタンパク質との結合に対して拮抗的に作用するが、一方でユビキチン前駆体および未結合のポリユビキチン鎖からのユビキチンの切断を促進する働きもある。このように、ＤＵＢは、細胞内の遊離ユビキチンプールのホメオスタシスを調節および維持している。いくつかのＤＵＢに関して、ヒストンの脱ユビキチン化、ＤＮＡ損傷修復、細胞増殖（ＵＳＰ２）およびサイトカインシグナル伝達（ＤＵＢ−Ａ）を調節することが報告されている。ＵＳＰ１４、Ｕｃｈ３７およびＲＰＮ１１などのＤＵＢは、プロテアソーム（１９Ｓ）の調節サブユニットに関与し、プロテアソームの基質上のポリユビキチン鎖を編集することが示されている。
ＤＵＢを阻害する方法を本明細書において開示する。方法は、付加的にまたは代替的にＵＣＨ触媒ドメインの阻害に関する。さらに、病原性の感染を治療する方法および病原性の感染による症状を治療する方法を本明細書において開示する。また、細胞の増殖を抑制するか細胞の生存を低下させる方法を本明細書において開示する。さらに、神経変性障害または神経変性障害の症状を治療する方法を本明細書において開示する。また、遺伝子障害の症状を治療する方法を本明細書において開示する。
本明細書で開示する方法において有用な化合物は、以下の化学式：
（式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、Ｒ３は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、Ｒ４は、ＣＮ、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、Ｒ５は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびＳＨからなる群から選択され、Ｒ６は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）を有する化合物またはその塩を含む。
さまざまな場合において、本明細書で開示する方法において有用な化合物は、化学式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、もしくは（ＩＩＩ）：
（式中、各Ｒ１は、Ｈ、アミド、置換アミド、ハライド、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９からなる群から選択されるが、化学式（ＩＩ）の化合物においては２つのＲ１がいずれも水素である場合は除外され、Ｘは、フルオロまたはクロロであり、Ｒ２は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、Ｈｅｔは、２−ピリジルを除くヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、Ｒ９は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、ｍは、２、３、または４である）を有する化合物またはその塩を含む。具体的な化合物については後述するが、上記した方法の１以上において、そのいずれの化合物を使用してもよい。
さらに、化学式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、もしくは（ＩＩＩ）：
（式中、各Ｒ１は、Ｈ、アミド、置換アミド、ハライド、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９からなる群から選択されるが、化学式（ＩＩ）の化合物においては２つのＲ１がいずれも水素である場合は除外され、Ｘは、フルオロまたはクロロであり、Ｒ２は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、Ｈｅｔは、２−ピリジルを除くヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、Ｒ９は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、ｍは、２、３、または４である）を有する化合物またはその塩を本明細書において開示する。
タンパク質のユビキチン化は、複数の酵素の関与を必要とする厳密に制御されたプロセスであり、これらの酵素により標的タンパク質のリジン残基がユビキチン（Ｕｂ）の単量体または重合鎖で修飾される。ユビキチン経路の酵素群は、真核細胞の細胞周期タイミング、タンパク質分解およびシグナル伝達のメディエータ（ｍｅｄｉａｔｏｒ）である。最近の研究より、Ｕｂ調節は、真核宿主細胞と同様に、原核細胞およびウイルスのライフサイクルのさまざまな段階においても重要であることが示唆されている。したがって、特定のＵｂ調節酵素を阻害または抑制することにより抗菌活性が示される可能性がある。
ＤＵＢは、がん化、細胞周期調節、アポトーシス防御および薬剤耐性に関わるタンパク質の調節において多様な役割を担っていることから、好適な治療標的になると考えられる。最近、ＵＳＰ２およびＵＳＰ９ｘの下方調節が、それぞれサイクリンＤ１およびＭＣＬ−１の分解促進を通じて腫瘍細胞の増殖を抑制することが示されており、腫瘍細胞において特定のＤＵＢの発現を抑制することは、がん遺伝子依存性細胞または薬剤耐性細胞における安全かつ有効な治療となり得ることが示唆されている。また、他の研究により、がん、ウイルス性および細菌性病因ならびに神経変性障害を含む広範囲の疾患におけるＤＵＢの役割も立証されている。ＤＵＢ調節活性を有することが報告されている化合物は少ないが、それらの多くは、ＤＵＢ阻害に伴って抗腫瘍活性、抗増殖活性または抗ウイルス活性を有することが報告されている（例えば、ＵＣＨ−Ｌ１およびＵＳＰ７、ＳＡＲＳプロテアーゼ）。
したがって、本明細書において、ＤＵＢを阻害する方法、ＵＣＨ触媒ドメインを阻害する方法、病原性の感染を抑制または予防する方法、細胞の生存または増殖を抑制する方法、神経変性障害を治療する方法、神経変性障害の１以上の症状を治療する方法、遺伝子障害の１以上の症状を治療する方法、およびＤＵＢを阻害可能な化合物を開示する。本発明により提供される方法においては、ＤＵＢを、例えば、化学式（Ｉ）：
（式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、
Ｒ３は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、
Ｒ４は、ＣＮ、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、
Ｒ５は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびＳＨからなる群から選択され、
Ｒ６は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）の化合物またはその塩と接触させる。
デユビキチナーゼ（ＤＵＢ）
脱ユビキチン化酵素（すなわち、デユビキチナーゼまたはＤＵＢ）は、一般にシステインプロテアーゼであり、サブグループとしてユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）とユビキチンＣ末端加水分解酵素（ＵＣＨ）に分類され得る。ＤＵＢの例としては、例えば、ＵＳＰ５、ＵＳＰ６、ＵＳＰ４、ＵＳＰ８、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ２、ＵＳＰ１１、ＵＳＰ１４、ＵＳＰ７、ＵＳＰ９Ｘ、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１、ＵＳＰ１２、ＵＳＰ１６、ＵＳＰ１５、ＵＳＰ１７、ＵＳＰ１９、ＵＳＰ２０、ＵＳＰ３、ＵＳＰ９Ｙ、ＵＳＰ１８、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２２、ＵＳＰ３３、ＵＳＰ２９、ＵＳＰ２５、ＵＳＰ３６、ＵＳＰ３２、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ２４、ＵＳＰ４２、ＵＳＰ４６、ＵＳＰ３７、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ４７、ＵＳＰ３８、ＵＳＰ４４、ＵＳＰ５０、ＵＳＰ３５、ＵＳＰ３０、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ０８８ペプチダーゼ、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ０９１ペプチダーゼ、ＵＳＰ４５、ＵＳＰ５１、ＵＳＰ３４、ＵＳＰ４８、ＵＳＰ４０、ＵＳＰ３１、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ１２９ペプチダーゼ、ＵＳＰ４９、ＵＳＰ１７様ペプチダーゼ、ＵＳＰ５４、ＵＳＰ５３、ＵＳＰ３９、ＵＣＨ−Ｌ１、ＵＣＨ−Ｌ３、ＵＣＨ−ＢＡＰ１、ＵＣＨ３７、セザンヌ脱ユビキチン化ペプチダーゼ、セザンヌ２、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３、ＴＲＡＢＩＤタンパク質、ＶＣＰ（ｐ９７）／ｐ４７相互作用タンパク質、オツバイン（ｏｔｕｂａｉｎ）１、オツバイン２、ＣｙｌＤタンパク質、ＳＥＮＰ１ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ３ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ６ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ２ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ５ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ７ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ８ペプチダーゼ、ＳＥＮＰ４ペプチダーゼ、Ｐｏｈ１ペプチダーゼ、Ｊａｂ１／ＭＰＮドメイン金属酵素、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ１６５ペプチダーゼ、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ１６６ペプチダーゼ、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ１６７ペプチダーゼ、Ｍｅｒｎａｍｅ−ＡＡ１６８タンパク質、ＣＯＰ９シグナロソームサブユニット６、２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット７、真核細胞翻訳開始因子３サブユニット５、ＩＦＰ３８ペプチダーゼホモログが挙げられる。
考えられる他のＤＵＢとしては、オートファジン（ａｕｔｏｐｈａｇｉｎ）（ＡＴＧ）、卵巣腫瘍（ＯＴＵ）ドメインタンパク質、ジョセフィン（Ｊｏｓｅｐｈｉｎ）ドメイン（ＪＤ）またはマシャド・ジョセフ病（ＭＪＤ）タンパク質、ユビキチン様タンパク質特異的プロテアーゼ（ＵＬＰ）、およびＪＡＭＭ（Ｊａｂ１／ＭＰＮドメイン会合金属イソペプチダーゼ）ドメインタンパク質が挙げられる。
具体的なＤＵＢ阻害剤
本明細書で開示する方法において使用される化合物は、化学式（Ｉ）：
（式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、
Ｒ３は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、
Ｒ４は、ＣＮ、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、
Ｒ５は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびＳＨからなる群から選択され、
Ｒ６は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）の化合物またはその塩を含む。
いくつかの場合において、破線は、二重結合を示す。さまざまな場合において、考えられる具体的なＲ３構造としては、
からなる群から選択されるか、または所望により置換されていてもよいそれらの基であるＲ３が挙げられ、Ｒ７は、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、単糖類、単糖類誘導体、アリール、およびアルキレンアリールからなる群から選択されるか、または所望により置換されていてもよいそれらの基であり、各Ｒ８は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリールおよび置換アリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Ａｒは、アリールまたは置換アリールであり、Ｚは、アルキレン、置換アルキレン、アミノ、または置換アミノであり、Ｚ１は、アルキレンまたは置換アルキレンであり、ｎは、１、２、３、または４である。いくつかの場合において、考えられる具体的なＲ６構造としては、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、フェニル、１−ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｄｙｎｌ）、２−（２Ｈ）−ピラニル、および２−（２Ｈ）−チオピラニル、またはそれらの置換体が挙げられる。いくつかの特定の場合において、Ｒ６は、２−ピリジルまたは置換２−ピリジルである。さまざまな特定の場合において、Ｒ４は、ＣＮである。
いくつかの場合において、Ｒ３は、
である。いくつかの特定の場合において、Ａｒは、フェニルまたは置換フェニルである。
考えられるいくつかの具体的な化合物としては、以下の構造：
または、それらの塩が挙げられる。
さらに考えられる阻害剤としては、
またはそれらの塩が挙げられる。さらに考えられるものとしては、
の構造を有する阻害剤、またはその塩が挙げられる。
いくつかの実施形態において、化学式（Ｉ）の化合物は、化学式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、もしくは（ＩＩＩ）：
（式中、各Ｒ１は、Ｈ、アミド、置換アミド、ハライド、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９からなる群から選択されるが、化学式（ＩＩ）の化合物においては２つのＲ１がいずれも水素である場合は除外され、Ｘは、フルオロまたはクロロであり、Ｒ２は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、Ｈｅｔは、２−ピリジルを除くヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、Ｒ９は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、ｍは、２、３、または４である）の化合物またはその塩である。さまざまな場合において、Ｒ１は、Ｈ、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９からなる群から選択される。さまざまな場合において、Ｒ１は、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍモルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換モルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍスルホキシモルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換スルホキシモルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍピロリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換ピロリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍピペラジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換ピペラジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍピペリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換ピペリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ヘテロシクロアルキル、および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。さまざまな場合において、Ｒ１は、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨ（ＣＯ）アルキレン−ビオチンである。さまざまな場合において、本発明の化合物は、化学式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物である。
いくつかの場合において、Ｒ２は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ３−６シクロアルキルであり、ヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、アルコキシ、および置換アルコキシのうちの１以上で所望により置換されていてもよい。いくつかの特定の場合において、化学式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物のＲ１は、Ｈ、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９からなる群から選択される。さまざまな場合において、Ｒ１は、Ｈ、アミド、置換アミド、およびハライドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ９は、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、Ｎ（Ｍｅ）２、Ｎ（Ｅｔ）２、Ｏ（ＣＨ２）２ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ２）２ＯＨ、Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ２）、
からなる群から選択される。
いくつかの場合において、上記化学式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物は、具体的に、
の構造を有する化合物を除く。
本明細書において使用される用語「アルキル」は、１〜４０個の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖の炭化水素基を指し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシルなどを含むが、これらに限定されない。１〜６個の炭素原子のアルキルも考えられる。用語「アルキル」は、「架橋アルキル」、すなわち、二環式または多環式炭化水素基、例えば、ノルボルニル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、またはデカヒドロナフチルを含む。アルキル基は、例えば、ヒドロキシ（ＯＨ）、ハライド、チオール（ＳＨ）、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびアミノで所望により置換されていてもよい。特に、本明細書に記載の化合物において、上記アルキル基は、１〜４０個の炭素原子からなり、好ましくは１〜２５個の炭素原子からなり、好ましくは１〜１５個の炭素原子からなり、好ましくは１〜１２個の炭素原子からなり、好ましくは１〜１０個の炭素原子からなり、好ましくは１〜８個の炭素原子からなり、好ましくは１〜６個の炭素原子からなることが考えられる。「ヘテロアルキル」は、ヘテロアルキルが酸素、窒素、および硫黄からなる群から独立に選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含むこと以外は、アルキルと同様に定義される。
本明細書において、用語「シクロアルキル」は、環状炭化水素基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル、およびシクロペンチルを指す。「ヘテロシクロアルキル」は、その環が酸素、窒素、および硫黄からなる群から独立に選択される１〜３個のヘテロ原子を含むこと以外は、シクロアルキルと同様に定義される。ヘテロシクロアルキル基の例は、ピペリジン（ｐｉｐｅｒｄｉｎｅ）、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ジヒドロフラン、モルホリン、チオフェンなどを含むが、これらに限定されない。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、例えば、アルキル、アルキレンＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＮＨ２、オキソ（＝Ｏ）、アリール、ハロアルキル、ハロ、およびＯＨからなる群から独立に選択される１〜３個の基で所望により置換されていてもよい飽和または部分不飽和環系であり得る。ヘテロシクロアルキル基は、さらにアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキレンアリール、またはアルキレンヘテロアリールで所望によりＮ−置換されていてもよい。
本明細書において使用される用語「アルケニル」は、少なくとも１個の炭素二重結合を含む２〜１０個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素基を指し、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニルなどを含むが、これらに限定されない。用語「シクロアルケニル」は、１以上の二重結合を有するシクロアルキル基を指す。「ヘテロシクロアルケニル」は、１以上のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｏ、またはそれらの組合せ）を有するシクロアルケニル基を指す。
本明細書において使用される用語「アルキニル」は、少なくとも１個の炭素三重結合を含む２〜１０個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素基を指し、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニルなどを含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される用語「ハライド」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを指す。
本明細書において使用される用語「アルキレン」は、置換基を有するアルキル基を指す。例えば、用語「アルキレンアリール」は、アリール基で置換されたアルキル基を指す。アルキレン基は、所望により選択されるアルキル置換基として先に列挙した１以上の置換基で所望により置換されていてもよい。例えば、アルキレン基は、−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２−であり得る。
本明細書において、用語「アリール」は、単環式または多環式芳香族基、好ましくは単環式または二環式芳香族基を指し、例えば、フェニルまたはナフチルを指す。特に断りのない限り、アリール基は、非置換であってもよく、また例えば、ハロ、アルキル、アルケニル、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ，ＮＣ、ＯＨ、アルコキシ、アミノ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２アルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立に選択される１以上の置換基、特に１〜４個の置換基で置換されていてもよい。アリール基の例は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、クロロフェニル、メチルフェニル、メトキシフェニル、トリフルオロメチルフェニル、ニトロフェニル、２，４−メトキシクロロフェニルなどを含むが、これらに限定されない。
本明細書において、用語「ヘテロアリール」は、１または２個の芳香族環を含み、該芳香族環において少なくとも１個の窒素原子、酸素原子、または硫黄原子を含む単環式または二環式環系を指す。特に断りのない限り、ヘテロアリール基は、非置換であってもよく、また例えば、ハロ、アルキル、アルケニル、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ，ＮＣ、ＯＨ、アルコキシ、アミノ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２アルキル、アリール、およびヘテロアリールから選択される１以上の置換基、特に１〜４個の置換基で置換されていてもよい。いくつかの場合において、ヘテロアリール基は、アルキル基およびアルコキシ基のうちの１以上で置換されている。ヘテロアリール基の例は、チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、チオフェニル、イソキノリル、インドリル、トリアジニル、トリアゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル、およびチアジアゾリルを含むが、これらに限定されない。本明細書において、ヘテロアリールは、用語「Ｈｅｔ」と交換可能に使用される。いくつかの場合において、「Ｈｅｔ」は、
からなる群から選択されるか、またはそれらの置換体である。いくつかの場合において、Ｈｅｔは、２−ピリジル、３−ピリジル、および／または４−ピリジルを除く。いくつかの特定の場合において、Ｈｅｔは、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、および置換アミノのうちの１以上で置換されている。
本明細書において使用される用語「アルコキシ」は、−−Ｏ−−結合によって親分子に共有結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基を指す。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシなどを含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される用語「チオアルキル」は、アルキル基に結合した１以上のチオ基を指す。
本明細書において使用される用語「チオエーテル」は、−−Ｓ−−結合を介して親分子に共有結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基またはシクロアルキル基を指す。チオエーテル基の例は、−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣ（ＣＨ３）３などを含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される用語「ヒドロキシアルキル」は、アルキル基に結合した１以上のヒドロキシ基を指す。
用語「アジド」は、−Ｎ３基を指す。用語「ニトロ」は、−ＮＯ２基を指す。
本明細書において使用される用語「アミノ」は、−ＮＲ２（式中、Ｒは、それぞれ独立して、水素、所望により置換されていてもよいアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロアルキル、所望により置換されていてもよいシクロアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されていてもよいアリール、または所望により置換されていてもよいヘテロアリールである）を指す。アミノ基の例は、ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ３）、およびＮ（ＣＨ３）２を含むが、これらに限定されない。いくつかの場合において、Ｒは、それぞれ独立して水素またはアルキルである。
本明細書において使用される用語「アミド」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒまたは−ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ（式中、各Ｒは、それぞれ独立して、水素、所望により置換されていてもよいアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロアルキル、所望により置換されていてもよいシクロアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されていてもよいアリール、または所望により置換されていてもよいヘテロアリールである）を指す。いくつかの場合において、アミド基は、−ＮＨＣ（Ｏ）アルキルまたは−ＮＨＣ（Ｏ）Ｈである。さまざまな場合において、アミド基は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（置換アルキル）である。アミド基の例は、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３であるが、これに限定されない。
本明細書において、置換体は、非置換の親構造の１以上の水素原子が別の原子または基で置換されたものである。本明細書において使用される「置換基」は、以下の群から選択される基を意味する。
（Ａ）−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＯ２、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換アルコキシ、非置換アリールオキシ、トリハロメタンスルホニル、トリフルオロメチル、ならびに
（Ｂ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）から選択される少なくとも１個の置換基で置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アミノ、アミド、カルボニル、チオカルボニル、アルコキシカルボニル、シリル、スルホニル、スルホキシル、アルコキシ、アリールオキシ、およびヘテロアリール、
（ｉ）−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＯ２、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換アルコキシ、非置換アリールオキシ、トリハロメタンスルホニル、トリフルオロメチル、および
（ｉｉ）以下の（ａ）および（ｂ）から選択される少なくとも１個の置換基で置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アミノ、アミド、カルボニル、チオカルボニル、アルコキシカルボニル、シリル、スルホニル、スルホキシル、アルコキシ、アリールオキシ、およびヘテロアリール、
（ａ）−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＯ２、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換アルコキシ、非置換アリールオキシ、トリハロメタンスルホニル、トリフルオロメチル、および
（ｂ）−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＯ２、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換アルコキシ、非置換アリールオキシ、トリハロメタンスルホニル、トリフルオロメチルから選択される少なくとも１個の置換基で置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アミノ、アミド、カルボニル、チオカルボニル、アルコキシカルボニル、シリル、スルホニル、スルホキシル、アルコキシ、アリールオキシ、およびヘテロアリール。
本明細書において使用される用語「カルボキシ」または「カルボキシル」は、−ＣＯＯＨまたはその脱プロトン体−ＣＯＯ−を指す。Ｃ１−１０カルボキシは、所望により置換されていてもよい、カルボキシ構造を有するアルキル基またはアルケニル基を指す。例としては、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ３、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アルコキシカルボニル」は、−（ＣＯ）−Ｏ−アルキル（式中、アルキル基は、所望により置換されていてもよい）を指す。アルコキシカルボニル基の例は、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基などを含むが、これらに限定されない。
用語「アルキルカルボニル」は、−（ＣＯ）−アルキル（式中、アルキル基は、所望により置換されていてもよい）を指す。アルキルカルボニル基の例は、メチルカルボニル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基などを含むが、これらに限定されない。
用語「スルホンアミド」は、−ＳＯ２ＮＲ２（式中、Ｒは、それぞれ独立して、水素、所望により置換されていてもよいヘテロアルキル、所望により置換されていてもよいシクロアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されていてもよいアリール、または所望により置換されていてもよいヘテロアリールである）を指す。いくつかの場合において、スルホンアミド基は、−ＳＯ２ＮＲ２（式中、Ｒは、それぞれ独立して、水素または所望により置換されていてもよいアルキルである）である。スルホンアミド基の例は、−ＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）２および−ＳＯ２ＮＨ２を含むが、これらに限定されない。
用語「スルホニル」は、−ＳＯ２Ｒ（式中、Ｒは、それぞれ独立して、水素、所望により置換されていてもよいアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロアルキル、所望により置換されていてもよいシクロアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されていてもよいアリール、または所望により置換されていてもよいヘテロアリールである）を指す。いくつかの場合において、スルホニル基は、−ＳＯ２アルキル（式中、アルキル基は、所望により置換されていてもよい）である。スルホニル基の１つの例は、メチルスルホニル（例えば、−ＳＯ２ＣＨ３）である。
用語「スルホキシル」は、−ＳＯＲ（式中、各Ｒは、それぞれ独立して、水素、所望により置換されていてもよいアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロアルキル、所望により置換されていてもよいシクロアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されていてもよいアリール、または所望により置換されていてもよいヘテロアリールである）を指す。スルホニル基の１つの例は、メチルスルホニル（例えば、−ＳＯＣＨ３）である。
いくつかの場合において、上記置換基は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、アルコキシカルボニル、ニトロ、シリル、トリハロメタンスルホニル、トリフルオロメチル、およびアミノ（モノ置換アミノ基およびジ置換アミノ基を含む）、ならびに保護基を有するそれらの誘導体からそれぞれ独立して選択される１以上の基である。
上記置換基の保護誘導体を形成し得る保護基は、当業者に公知であり、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ； ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００６などの文献に見出すことができる。置換基が「所望により置換されていてもよい」と記載されている場合、その置換基は、上述した置換基で置換されていてもよい。
不斉炭素原子が存在してもよい。そのような異性体（ジアステレオ異性体および鏡像異性体ならびにそれらの混合物を含む）はすべて、本開示の範囲に含まれることが意図される。いくつかの特定の場合において、化合物は、互変異性体として存在し得る。すべての互変異性体は、本開示の範囲に含まれることが意図される。同様に、化合物がアルケニル基またはアルケニレン基を含む場合は、その化合物にはシス異性体およびトランス異性体が存在する可能性がある。本開示の範囲において、シス異性体、トランス異性体、ならびにシス異性体およびトランス異性体の混合物が考えられる。
本開示の治療剤の塩（例えば、薬学的に許容可能な塩）は、適切な塩基または酸を化学量論的当量の治療剤と反応させることによって調製することができる。
薬学的に許容可能な塩を形成するために一般に使用される酸は、無機酸（二硫化水素、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸およびリン酸など）、有機酸（ｐａｒａ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、二酒石酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ベシル酸、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸、ギ酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、乳酸、シュウ酸、ｐａｒａ−ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸および酢酸など）、ならびに関連の無機酸および有機酸を含む。したがって、このような薬学的に許容可能な塩としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオン酸塩、ヘキシン−１，６−ジオン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、Ｏ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩などが挙げられる。一実施形態において、薬学的に許容可能な酸付加塩は、塩酸および臭化水素酸などの鉱酸により形成されたもの、および特にマレイン酸などの有機酸により形成されたものを含む。
薬学的に許容可能な塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンにより形成され得る。化合物の薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な陽イオンにより調製してもよい。好適な薬学的に許容可能な陽イオンは、当業者に周知であり、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類金属陽イオン、アンモニウム陽イオン、および第４級アンモニウム陽イオンを含む。また、薬学的に許容可能な塩基付加塩としては、炭酸塩または炭酸水素塩も可能である。陽イオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄などである。好適なアミンは、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカインを含む。
同様に、当業者に一般に公知の方法によって、治療剤の薬学的に許容可能な誘導体（例えば、エステル）、代謝産物、水和物、溶媒和物およびプロドラッグを調製してもよい。したがって、別の実施形態では、活性化合物のプロドラッグである化合物を提供する。一般に、プロドラッグは、インビボで代謝されて（例えば、脱アミノ、脱アルキル、脱エステル化などの代謝変換によって）活性化合物を提供する化合物である。「薬学的に許容可能なプロドラッグ」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを呈することなく患者に対して薬学的に好適に使用できるとともに目的の用途に対して有効である化合物を意味し、治療剤の薬学的に許容可能なエステルや、可能である場合、両性イオン形態を含む。本明細書において、用語「薬学的に許容可能なエステル」は、インビボで加水分解するエステルを指し、ヒトの体内で容易に分解して親化合物またはその塩を遊離するエステルを含む。好適なエステル基としては、例えば、薬学的に許容可能な脂肪族カルボン酸、特に、アルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカンジオン酸由来のエステル基（アルキル基またはアルケニル基がそれぞれ６個以下の炭素原子を有する場合有利である）が挙げられる。具体的なエステルの代表例としては、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、アクリル酸エステル、およびエチルコハク酸エステルが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能なプロドラッグの種類の例は、Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｓｔｅｌｌａ， Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｖｏｌ． １４ ｏｆ ｔｈｅ Ａ．Ｃ．Ｓ． Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ， ａｎｄ ｉｎ Ｒｏｃｈｅ， ｅｄ．， Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８７に記載されており、いずれも本明細書において参照により援用される。
また、本明細書に記載の化合物および組成物は、代謝産物も含み得る。本明細書において、用語「代謝産物」は、実施形態に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、類似体もしくは誘導体の代謝により生じる物質であって、開示の治療剤と同様の活性をインビトロまたはインビボで示す物質を意味する。また、本明細書に記載の化合物および組成物は、水和物および溶媒和物も含み得る。本明細書において、用語「溶媒和物」は、溶質（本明細書においては治療剤）と溶媒によって形成される複合体を指す。実施形態の目的に即した好ましい溶媒は、溶質の生物活性を妨げない溶媒である。溶媒は、例えば、水、エタノール、または酢酸であり得る。
治療方法
本明細書で開示する方法は、障害を治療する方法、例えば、ＤＵＢ活性に関連する障害またはＤＵＢ活性の調節により影響を受ける障害などを治療する方法、またはＤＵＢ活性に関連する障害および／またはＤＵＢ活性の調節により影響を受ける障害を治療するための医薬の調製における、本明細書で開示する化合物の使用を含む。さらに考えられるのは、ＵＣＨ触媒ドメインを阻害することを伴う治療の方法である。考えられる具体的な障害としては、病原性の感染、がん、発達障害および神経変性障害、Ｒｉｄｄｌｅ症候群、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびＤＵＢを要するまたはＤＵＢにより調節される遺伝子障害（例えば、ファンコーニ貧血）が挙げられる。
いくつかの場合において、本明細書において提供される方法は、ＤＵＢの活性調節により影響を受ける障害を有する対象を同定すること、およびその対象に本明細書で開示するような化合物を投与することをさらに含む方法である。
さまざまな場合において、本明細書において提供される方法は、予防の方法であり、本明細書で開示するような化合物または組成物を、障害の発症前に投与する。いくつかの特定の場合において、上記方法は、ＤＵＢ活性に関連するおよび／またはＤＵＢ調節により影響を受ける障害（例えば、本明細書で開示するようなウイルス、細菌、および／または寄生体）を罹患するおそれのある対象を同定すること、および本明細書で開示するような化合物の有効量を投与することをさらに含む。
いくつかの場合において、本明細書において提供される方法は、細胞における病原性の感染を抑制する方法であって、本明細書で開示するような化合物を病原性の感染を抑制する量投与することを含む方法である。さまざまな場合において、細胞を上記化合物と接触させる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、動物の細胞、より具体的には、哺乳類の細胞または鳥類の細胞、さらにより具体的にはヒトの細胞である。さまざまな場合において、上記方法は、病原性の感染による症状を治療することを含む。考えられる病原性の感染は、本明細書内に別途記載する。さまざまな実施形態において、上記方法は、病原性の感染および／または病原性の感染による症状を有するヒトを同定すること、および本明細書で開示するような化合物の有効量を投与して病原性の感染を抑制することをさらに含む。
いくつかの場合において、本明細書において提供される方法は、細胞の増殖を抑制する方法であって、細胞を本明細書で開示するような化合物の有効量と接触させて増殖を抑制することを含む方法である。いくつかの場合において、上記細胞は、がん細胞である。考えられるがん細胞は、本明細書内に別途記載する。さまざまな場合において、上記化合物は、上記細胞の内因性のＤＵＢを阻害し、増殖を抑制する。
さまざまな場合において、本明細書において提供される方法は、神経変性疾患を治療する方法であって、本明細書で開示するような化合物の有効量を、治療を必要とする対象に投与することを含む方法である。考えられる神経変性疾患は、本明細書内に別途記載する。いくつかの場合において、上記方法は、上記神経変性疾患の１以上の症状を治療する。
また、本明細書で開示する方法は、遺伝子障害の１以上の症状を治療する方法であって、本明細書で開示するような化合物の有効量を、治療を必要とする対象に投与することを含む方法である。さまざまな場合において、上記化合物は、ＤＵＢを阻害して遺伝子障害の１以上の症状を緩和する。考えられる遺伝子障害は、本明細書内に別途記載する。
いくつかの場合において、本明細書で開示する方法は、第２の治療剤を投与することをさらに含む。第２の治療剤は、本明細書で開示するような化合物と同時にまたは時間差をおいて（例えば、約１時間〜約１２時間の間隔を空けて）投与してもよい。これら２種の剤を同時に投与する場合は、これらの剤を合わせて１つの製剤として調製してもよく、また別々の製剤として調製して同時にまたは約３０分以内の時間差をおいて投与してもよい。考えられる第２の剤としては、例えば、抗ウイルス剤、抗寄生体剤、抗菌剤、抗がん剤、遺伝子障害の１以上の症状を治療する剤、および／または神経変性障害を治療する剤が挙げられる。
病原性の感染
本明細書で開示する方法および化合物は、病原性の感染の治療において有用であり、例えば、病原性の感染または病原性の感染の症状の予防、抑制および／または緩和において有用である。いくつかの場合において、本明細書で開示する方法および化合物は、病原性の感染による症状の治療において有用である。
食品および水道に対する故意の汚染は、米国国民全体における健康および健康関連サービスならびに世界中で従事している米国軍隊にとって大きな脅威である。水および食品を媒介するカテゴリーＢに属する病原体の多くは、この種のバイオテロリズムの有力な候補とならしめる特定の性質を有する（例えば、低感染用量、高安定性）。この潜在的な脅威を阻止するために、これら特定の病原体に対して防御または予防することが可能な方法または剤が緊急に必要とされている。理想的には、広範囲の脅威に対して防御することが可能な剤が望ましい。本明細書で開示する化合物は、複数の病原体に対して広い活性を有する。例えば、ＷＰ１１３０は、カテゴリーＡおよびＢに属する種々の病原体、ならびにこれらと同科に属する関連する病原体による感染、具体的には、マウスノロウイルス、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）およびトキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）による感染、ならびにノーウォークウイルス複製の強力な阻害剤である。また、ＷＰ１１３０は、脳心筋炎ウイルス、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスおよびラクロス（Ｌａ Ｃｒｏｓｓｅ）ウイルスに対する抗ウイルス活性も示す。特定の細胞において、ＷＰ１１３０がデユビキチナーゼを阻害すると、細胞内の細胞質およびアグリソームコンパートメントにユビキチン化タンパク質が蓄積する。これにより、標的細胞内に病原体の感染または複製にとっては好ましくない環境が確立されると考えられる。したがって、ＷＰ１１３０は、複数の病原体を効果的に抑制することができる抗菌剤として使用されている。この化合物ならびに化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）および／または（ＩＩＩ）で表される他の化合物は、カテゴリーＡおよび／もしくはＢの病原体、ならびに／またはこれらと同科に属する関連する病原体による感染を阻止する。
感染機序においてＤＵＢを利用する病原体が考えられる。いくつかの場合において、上記病原体は、感染細胞の内因性のＤＵＢを利用する。さまざまな場合において、上記病原体は、病原体自体の内因性のＤＵＢを利用する。
考えられる病原性の感染による疾患または障害としては、胃腸炎、脳炎、気道感染（例えば、ＳＡＲＳ、インフルエンザ）、ウイルス誘発性がん、狂犬病、出血熱（例えば、クリミア・コンゴ、デング）、リフトバレー熱、リステリア症、またはトキソプラズマ症が挙げられる。考えられる病原性の感染による疾患または障害としては、髄膜炎、心筋炎、肝炎、菌血症、および皮膚感染も挙げられる。
考えられる病原体としては、ウイルス性、細菌性、真菌性、および寄生性の病原体が挙げられる。考えられる病原性ウイルスとしては、カリシウイルス（例えば、ノロウイルス、サポウイルス）、ピコルナウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アルテリウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、パピローマウイルス、卵巣腫瘍（ＯＴＵ）様プロテアーゼをコードするウイルス、バキュロウイルス、またはナイロウイルスが挙げられる。考えられる他の病原性のウイルスとしては、ポリオーマウイルスおよびレトロウイルスが挙げられる。
考えられる具体的なウイルスとしては、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、シンドビスウイルス（ＳｉＮＶ）、ラクロスウイルス（ＬａＣＶ）、ノーウォークウイルス、エプスタイン・バール（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス、デングウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パピローマウイルス、およびインフルエンザが挙げられる。さらに考えられる具体的なウイルスとしては、サイトメガロウイルス、ＢＫウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびＨＩＶが挙げられる。
考えられる細菌としては、クラミジア、エシェリヒア、サルモネラ、イェルシニア、バークホルデリア、ヘモフィルス、リステリア、およびマイコバクテリウムが挙げられる。考えられる他の細菌としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、より具体的にはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）が挙げられる。
考えられる寄生体または真菌類としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、トキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、エントアメーバヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、セストダ（Ｃｅｓｔｏｄａ）、クロノルキス（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ）、オピストルキス（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）、ストロンギロイデス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｉｄｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、およびクリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。
がん
本明細書で開示する方法および化合物は、がんの治療、例えば、がんまたはがんの症状の予防、抑制および／または緩和において有用である。いくつかの場合において、がんを治療する上記方法は、ＤＵＢ（例えば、がんの生存または増殖に関与するＤＵＢ）を阻害することを含む。さまざまな場合において、がんを治療するための上記化合物は、ＷＰ１１３０である。
（式中、Ｐｒは、ｎ−プロピル基を示す。）
考えられる具体的ながんとしては、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、黒色腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、形質細胞異形成、骨髄増殖性障害、膠芽腫、カポジ肉腫、および鼻咽頭癌腫（ＥＢＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。考えられる他のがんとしては、肺がん、結腸がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、および固形腫瘍が挙げられる。
投薬および医薬製剤
本明細書において使用される用語「治療に有効な量」および「予防に有効な量」は、同定された疾患または症状を治療、緩和または予防するのに十分な化合物の量、または検出可能な治療効果、予防効果または抑制効果を発揮するのに十分な化合物の量を指す。このような効果は、例えば、病態の改善、症状の軽減によって、または本明細書に記載の任意のアッセイまたは臨床診断検査によって検出することができる。対象に対する正確な有効量は、対象の体重、大きさおよび健康、症状の性質および程度、ならびに投与のために選択される治療剤または治療剤の組合せに依存する。所定の状況における治療および予防に有効な量は、臨床医の技量および判断の範囲内である通常の試験により決定することができる。
治療剤の用量は、交互に（ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ）、ｍｇ／ｋｇ単位で示される投与量として投与され得る。本明細書に開示する治療剤の考えられるｍｇ／ｋｇ投与量としては、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇが挙げられる。ｍｇ／ｋｇ単位の投与量の具体的な範囲としては、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、および約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
本明細書において、本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤を用いて医薬組成物として調製することができる。本明細書に記載の化合物または該化合物を含む組成物は、疾患または症状の治療を可能にする任意の経路によって投与される。投与の一経路は、経口投与である。また、本明細書に記載の化合物または該化合物を含む組成物は、非経口（静脈内、腹腔内、肺内、皮下または筋肉内など）、クモ膜腔内、局所、経皮、直腸内、経口、鼻内または吸入を含む、任意の標準的な投与経路を使用して患者に送達することができる。また、消化管内で活性化合物の放出を制御して体液と接触させ、かつ該活性化合物の実質的に一定かつ有効な血漿レベルを提供するために、本明細書に記載の化合物を徐放製剤として調製してもよい。この目的のために、上記化合物の結晶体を、生分解性ポリマー、水溶性ポリマーまたはこれらの混合物、さらに必要に応じて好適な界面活性剤を配合して構成されるポリマーマトリクス内に組み込んでもよい。この場合、「組み込む」とは、ポリマーのマトリクス内に微粒子を包含させることを意味し得る。また、制御放出製剤は、公知の分散技術または乳化コーティング技術による分散微粒子または乳化微小液滴のカプセル化によっても得ることができる。
投与は、単回投与であってもよく、また本明細書で開示するような化合物を一定期間にわたって複数回に分けて投与するか、または持続放出が可能な製剤もしくは投与方法（例えば、ポンプ）により投与してもよい。実施形態の化合物をどのような方法を用いて対象に投与しようとも、投与される化合物の量および選択される投与経路は、病態に対して効果的な治療が提供されるように選択されるべきである。
一実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、個々の投与方法および剤形に応じて、１以上の薬学的に許容可能な賦形剤（担体、溶媒、安定化剤、補助薬、希釈剤など）を用いて調製される。本発明に係る医薬組成物は、一般に、生理学的に適合可能なｐＨとなるように調製されるべきであり、製剤および投与経路に応じて、約ｐＨ３〜約ｐＨ１１、好ましくは約ｐＨ３〜約ｐＨ７の範囲であり得る。別の実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８の範囲に調節される。より詳細には、本発明に係る医薬組成物は、治療または予防に有効な量の、本明細書に記載の少なくとも１つの化合物を、１以上の薬学的に許容可能な賦形剤とともに含有することができる。また、本発明に係る医薬組成物は、必要に応じて、本明細書に記載の化合物を組み合せて含有することも、細菌感染の治療または予防に有用な第２の活性成分（例えば、抗細菌（ａｎｔｉ−ｂｉｃｔｅｒｉａｌ）剤または抗菌（ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）剤）を含有することもできる。
例えば、非経口投与または経口投与のための製剤として最も一般的なものは、固形剤、液剤、乳剤または懸濁剤であり、肺内投与のための吸入可能な製剤は、一般に、液剤または散剤である。また、医薬組成物は、投与の前に生理学的に適合可能な溶媒を用いて再構築される凍結乾燥固体として調製してもよい。また、医薬組成物は、シロップ剤、クリーム、軟膏、錠剤などとして調製してもよい。
用語「薬学的に許容可能な賦形剤」は、本明細書に記載の化合物などの薬剤の投与のための賦形剤を指す。この用語は、過度の毒性を示すことなく投与され得る任意の医薬賦形剤を指す。
薬学的に許容可能な賦形剤は、投与される個々の組成物、およびその組成物を投与するために使用される個々の方法により決定されるものでもある。したがって、医薬組成物の好適な製剤には多種多様な形態が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照）。
好適な賦形剤としては、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子といった大型で代謝の遅い高分子などの担体分子が挙げられる。他の賦形剤の例としては、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、および／またはヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、油、水、生理食塩水、グリセロールおよび／またはエタノール）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが挙げられる。また、リポソームも薬学的に許容可能な賦形剤の定義に含まれる。
本明細書に記載の医薬組成物は、目的の投与方法に好適な任意の形態に調製される。例えば、経口使用を目的とする場合、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁剤、非水性液剤、分散性散剤もしくは顆粒剤（微粉化粒子またはナノ粒子を含む）、乳剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤として調製することができる。経口使用を目的とする組成物は、医薬組成物の製造分野で公知の任意の方法にしたがって調製することができ、そのような組成物は、口当たりの良い製剤を提供するために１以上の剤（甘味剤、着香剤、着色剤および保存剤を含む）を含有してもよい。
錠剤と共に使用される特に好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、例えば、不活性希釈剤（セルロース、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなど）、崩壊剤（架橋ポビドン、トウモロコシスターチ、またはアルギン酸など）、結合剤（ポビドン、スターチ、ゼラチン、またはアラビアゴムなど）、および潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなど）が挙げられる。
錠剤は、コーティングされていなくてもよく、また消化管での崩壊および吸収を遅らせて長期間にわたって持続作用を提供できるように公知の手法（マイクロカプセル化を含む）によってコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの放出遅延物質を単独で使用してもよく、またロウとともに使用してもよい。
また、経口用製剤は、活性成分を不活性な固体希釈剤（例えばセルロース、ラクトース、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合した硬ゼラチンカプセルであってもよく、また活性成分を非水性媒質または油性媒質（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ピーナッツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油など）と混合した軟ゼラチンカプセルであってもよい。
別の実施形態において、医薬組成物は、実施形態の化合物を懸濁剤の製造に好適な少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と混合した懸濁剤として調製してもよい。
さらに別の実施形態において、医薬組成物は、好適な賦形剤を添加することによって懸濁剤の調製に好適な分散性散剤および顆粒剤として調製してもよい。
懸濁剤に関連して使用される好適な賦形剤としては、懸濁化剤（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴム、アラビアゴム）、分散剤または湿潤剤（例えば、天然のホスファチド（例えば、レシチン）、酸化アルキレンと脂肪酸（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）との縮合産物、酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコール（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）との縮合産物、酸化エチレンと、脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステル（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）との縮合産物）、および増粘剤（例えば、カルボマー、蜜ロウ、固体パラフィンまたはセチルアルコール）が挙げられる。また、懸濁剤は、１以上の防腐剤（例えば、酢酸、ｐ−ヒドロキシ−安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ−安息香酸ｎ−プロピル）、１以上の着色剤、１以上の着香剤、および１以上の甘味剤（スクロースまたはサッカリンなど）を含有してもよい。
また、本発明に係る医薬組成物は、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、植物油（オリーブ油またはラッカセイ油など）、鉱油（液体パラフィンなど）、またはこれらの混合物であってもよい。好適な乳化剤としては、天然ゴム（アラビアゴムおよびトラガントゴムなど）、天然のホスファチド（大豆レシチンまたは脂肪酸由来のエステルもしくは部分エステルなど）、無水ヘキシトール（モノステアリン酸ソルビタンなど）、および上記部分エステルと酸化エチレンとの縮合産物（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなど）が挙げられる。また、乳剤は、甘味剤および着香剤を含有してもよい。シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤（グリセロール、ソルビトール、またはスクロースなど）を用いて調製してもよい。また、そのような製剤は、粘滑剤、防腐剤、着香剤または着色剤を含有してもよい。
また、本発明に係る医薬組成物は、滅菌された注射可能な製剤（滅菌された注射可能な水性乳剤または油性懸濁剤など）の形態であってもよい。この乳剤または懸濁剤は、当業者により、上述したものを含む好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して調製することができる。また、滅菌された注射可能な製剤は、毒性がなく非経口で許容可能な希釈剤または溶媒を用いて調製された、滅菌された注射可能な液剤または懸濁剤（１，２−プロパン−ジオールを用いて調製された液剤など）であってもよい。
また、滅菌された注射可能な製剤は、凍結乾燥粉末として調製してもよい。使用することができる許容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。また、滅菌された不揮発性油も、溶媒または懸濁媒質として使用することができる。この目的のために、無刺激性（ｂｌａｎｄ）の不揮発性油（合成モノまたはジグリセリドを含む）を使用してもよい。また、脂肪酸（例えば、オレイン酸）も同様に、注射剤の調製に使用することができる。
安定な水溶性剤形の医薬組成物を得るために、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩を、有機酸または無機酸の水性溶液（コハク酸、より好ましくは、クエン酸の０．３Ｍ溶液など）に溶解してもよい。可溶性の塩が得られない場合は、化合物を好適な１種の共溶媒または２種以上を好適に組み合わせた共溶媒に溶解してもよい。好適な共溶媒の例としては、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００、ポリソルベート８０、グリセリンなどが挙げられ、その濃度は全量の約０％〜約６０％の範囲である。一実施形態においては、活性化合物をＤＭＳＯに溶解したものを水で希釈する。
また、本発明に係る医薬組成物は、活性成分の塩形態を適切な水性ビヒクル（水、等張食塩水または等張デキストロース溶液など）に溶解した溶液の形態であってもよい。また、送達により適したものになるように（例えば、溶解度、生物活性または口当たりの良さの改善、副作用の低減など）化学構造または生化学的構造の置換または付加によって、例えばエステル化、グリコシル化、ＰＥＧ化などによって、修飾を施した化合物も考えられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物は、経口投与を目的として、溶解度の低い化合物に適した脂質系製剤として調製してもよい。一般に、脂質系製剤とすることにより、そのような化合物の経口バイオアベイラビリティを向上させることができる。
この場合、医薬組成物は、治療または予防に有効な量の本明細書に記載の化合物とともに、中鎖脂肪酸およびそのプロピレングリコールエステル（例えば、食用脂肪酸（カプリル脂肪酸およびカプリン脂肪酸など）のプロピレングリコールエステル）ならびに薬学的に許容可能な界面活性剤（ポリオキシル４０硬化ヒマシ油）からなる群から選択される少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む。
いくつかの実施形態において、水溶液における溶解促進剤としてシクロデキストリンを添加してもよい。シクロデキストリンの例としては、α−、β−、およびγ−シクロデキストリンのヒドロキシプロピル誘導体、ヒドロキシエチル誘導体、グルコシル誘導体、マルトシル誘導体、およびマルトトリオシル誘導体が挙げられる。具体的なシクロデキストリン系溶解促進剤は、ヒドロキシプロピル−ｏ−シクロデキストリン（ＢＰＢＣ）であり、これは、上記組成物のいずれに添加しても実施形態の化合物の水溶解特性をさらに向上させることができる。一実施形態において、上記組成物は、約０．１％〜約２０％のヒドロキシプロピル−ｏ−シクロデキストリン、より好ましくは約１％〜約１５％のヒドロキシプロピル−ｏ−シクロデキストリン、さらにより好ましくは約２．５％〜約１０％のヒドロキシプロピル−ｏ−シクロデキストリンを含む。使用される溶解促進剤の量は、組成物中の本発明の化合物の量に依存する。
併用療法
また、実施形態の方法は、病態を治療するための、本明細書に記載の１以上の化合物と、１以上の別の治療剤との併用を含む。したがって、例えば、併用する活性成分は、（１）１つの製剤とした組合せ製剤として調製し、同時に投与または送達してもよく、（２）別々の製剤として交互でまたは並行して送達してもよく、または（３）当該技術分野で公知の任意の他の組合せ治療レジメンにより送達してもよい。交互療法（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）において送達される場合、本明細書に記載の方法は、活性成分を、例えば、別々の液剤、乳剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、もしくはカプセル剤として、または別個の注射器に充填した注射剤として、順次投与または送達することを含む。一般に、交互療法においては、各活性成分の有効量を順次（すなわち、連続して）投与するが、同時療法（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｔｈｅｒａｐｙ）においては、２以上の活性成分の有効量を一緒に投与する。また、間欠的併用療法をさまざまな順序で使用してもよい。
いくつかの場合において、本明細書で開示する化合物は、第２の治療剤（例えば、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗寄生体剤、および／または化学療法剤（例えば、抗がん剤））とともに投与および／または製剤化される。
本発明において使用可能な抗ウイルス剤としては、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ドコサノール（ｄｏｃｏｓａｎｏｌ）、リバビリン（ｒｉｂａｒｉｖｉｎ）、インターフェロンなど；酢酸セルロース、カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）およびカラギナン、プレコナリル（ｐｌｅｃｏｎａｒｉｌ）、アマンタジン（ａｍａｎｔｉｄｉｎｅ）、リマンチジン（ｒｉｍａｎｔｉｄｉｎｅ）、ホミビルセン（ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）、ジドブジン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、ザナミビル（ｚａｎａｍｉｖｉｒ）、オセルタミビル（ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）、ブリブジン（ｂｒｉｖｕｄｉｎｅ）、アバカビル（ａｂａｃａｖｉｒ）、アデホビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ）、アンプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、アルビドール（ａｒｂｉｄｏｌ）、アタザナビル（ａｔａｚａｎａｖｉｒ）、アトリプラ（ａｔｒｉｐｌａ）、シドフォビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）、コンビビル（ｃｏｍｂｉｖｉｒ）、エドクスジン（ｅｄｏｘｕｄｉｎｅ）、エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）、エムトリシタビン（ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）、エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、エンテカビル（ｅｎｔｅｃａｖｉｒ）、ファムシクロビル（ｆａｍｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ホスアンプレナビル（ｆｏｓａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、ホスカルネット（ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）、ホスホネット（ｆｏｓｆｏｎｅｔ）、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ガーダシル（ｇａｒｄａｓｉｌ）、イバシタビン（ｉｂａｃｉｔａｂｉｎｅ）、イムノビル（ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン（ｉｄｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、ロピナビル（ｌｏｐｉｎａｖｉｒ）、ロビリド（ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、ｍｋ−０５１８、マラビロク（ｍａｒａｖｉｒｏｃ）、モロキシジン（ｍｏｒｏｘｙｄｉｎｅ）、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、ネキサビル（ｎｅｘａｖｉｒ）、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド類似体、オセルタミビル（ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）、ペンシクロビル（ｐｅｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ペラミビル（ｐｅｒａｍｉｖｉｒ）、ポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、リマンタジン（ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）、テノホビル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）、テノホビル ジソプロキシル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ ｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌ）、チプラナビル（ｔｉｐｒａｎａｖｉｒ）、トリフルリジン（ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、トリジビル（ｔｒｉｚｉｖｉｒ）、トロマンタジン（ｔｒｏｍａｎｔａｄｉｎｅ）、ツルバダ（ｔｒｕｖａｄａ）、バラシクロビル（ｖａｌａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、バルガンシクロビル（ｖａｌｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ビクリビロック（ｖｉｃｒｉｖｉｒｏｃ）、ビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）、ビラミジン（ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ）、ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、モルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）オリゴヌクレオチド、リボザイム、プロテアーゼ阻害剤、アセンブリ阻害剤（例えば、リファンピシン）、およびジドブジンが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において使用可能な抗菌剤としては、β−ラクタム系抗生物質（天然ペニシリン、半合成ペニシリン、天然セファロスポリン、半合成セファロスポリン、セファマイシン、１−オキサセフェム（ｏｘａｃｅｐｈｅｍ）、クラブラン酸、ペネム（ｐｅｎｅｍ）、カルバペネム、ノカルジシン、モノバクタム（ｍｏｎｏｂａｃｔａｍ）など）；テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、アントラサイクリン；アミノグリコシド；ヌクレオシド（Ｎ−ヌクレオシド、Ｃ−ヌクレオシド、炭素環式ヌクレオシド、ブラストサイジンＳなど）；マクロライド（１２員環マクロライド、１４員環マクロライド、１６員環マクロライドなど）；アンサマイシン（ａｎｓａｍｙｃｉｎ）；ペプチド（ブレオマイシン、グラミシジン、ポリミキシン、バシトラシン、ラクトン結合を含有する大員環状ペプチド抗生物質、アクチノマイシン、アンホマイシン（ａｍｐｈｏｍｙｃｉｎ）、カプレオマイシン、ジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）、エンジュラシジン（ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎｓ）、ミカマイシン（ｍｉｋａｍｙｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ステンドマイシン（ｓｔｅｎｄｏｍｙｃｉｎ）、バイオマイシン、ヴァージニアマイシンなど）；シクロヘキシミド；シクロセリン；バリオチン（ｖａｒｉｏｔｉｎ）；サルコマイシンＡ；ノボビオシン；グリセオフルビン；クロラムフェニコール；マイトマイシン；フマギリン；モネンシン；ピロルニトリン；ホスホマイシン（ｆｏｓｆｏｍｙｃｉｎ）；フシジン酸；Ｄ−（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシン；Ｄ−フェニルグリシン；エンジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）；ベンジルペニシリン（カリウム、プロカイン、ベンザチン）、フェノキシメチルペニシリン（カリウム）、フェネチシリンカリウム、プロピシリン、カルベニシリン（ジナトリウム、フェニルナトリウム、インダニルナトリウム）、スルベニシリン、チカルシリンジナトリウム、メチシリンナトリウム、オキサシリンナトリウム、クロキサシリンナトリウム、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、アンピシリン、メズロシリン、ピペラシリンナトリウム、アモキシシリン、シクラシリン、ヘクタシリン（ｈｅｃｔａｃｉｌｌｉｎ）、スルバクタムナトリウム、タランピシリン塩酸塩、バカンピシリン塩酸塩、ピブメシリナム、セファレキシン、セファクロル、セファログリシン、セファドロキシル、セフラジン、セフロキサジン、セファピリンナトリウム、セファロチンナトリウム、セファセトリルナトリウム、セフスロジンナトリウム、セファロリジン、セファトリジン、セフォペラゾンナトリウム、セファマンドール、ベホチアン（ｖｅｆｏｔｉａｍ）塩酸塩、セファゾリンナトリウム、セフチゾキシムナトリウム、セフォタキシムナトリウム、セフメノキシム塩酸塩、セフロキシム、セフトリアキソンナトリウム、セフタジジム、セフォキシチン、セフメタゾール、セフォテタン、ラタモキセフ、クラブラン酸、イミペネム、アズトレオナム、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン塩酸塩、デメチルクロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、ドキシシサイクリン、ロリテトラサイクリン、ミノサイクリン、ダウノルビシン塩酸塩、ドキソルビシン、アクラルビシン、カナマイシン硫酸塩、ベカナマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン硫酸塩、ジベカシン、アミカシン、ミクロノマイシン、リボスタマイシン、ネオマイシン硫酸塩、パロモマイシン硫酸塩、ストレプトマイシン硫酸塩、ジヒドロストレプトマイシン、デストマイシンＡ、ハイグロマイシンＢ、アプラマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン硫酸塩、スペクチノマイシン塩酸塩、アストロマイシン硫酸塩、バリダマイシン、カスガマイシン、ポリオキシン、ブラストサイジンＳ、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、リン酸オレアンドマイシン、トリアセチルオレアンドマイシン（ｔｒａｃｅｔｙｌｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ）、キタサマイシン、ジョサマイシン、スピラマイシン、タイロシン、イベルメクチン、ミデカマイシン、ブレオマイシン硫酸塩、ペプロマイシン硫酸塩、グラミシジンＳ、ポリミキシンＢ、バシトラシン、コリスチン硫酸塩、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム、エンラマイシン、ミカマイシン、ヴァージニアマイシン、硫酸カプレオマイシン、バイオマイシン、エンビオマイシン、バンコマイシン、アクチマイシンＤ、ネオカルジノスタチン、ベスタチン、ペプスタチン、モネンシン、ラサロシド、サリノマイシン、アンホテリシンＢ、ニスタチン、ナタマイシン、トリコマイシン、ミトラマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、塩酸パルミチン酸クリンダマイシン、フラボホスホリポール、シクロセリン、ペシロシン（ｐｅｃｉｌｏｃｉｎ）、グリセオフルビン、クロラムフェニコール、クロラムフェニコールパルミチン酸エステル、マイトマイシンＣ、ピロルニトリン、ホスホマイシン、フシジン酸、ビコザマイシン、チアムリン、またはシッカニンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、抗ウイルス剤は、病原性物質の産生を阻害する。この場合、細菌は、病原性因子（毒素など）の産生が妨げられ、免疫系によって排除され得る。例えば、以下を参照のこと。Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２０１０ Ｓｅｐ １５；５０１（２）：２１４−２０． Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｊｕｎ １５； Ｄａｒｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２０１０ Ｊｕｌ；６５（７）：１４２４−７． Ｅｐｕｂ ２０１０ Ａｐｒ ３０； Ｂｒｙｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０１０ Ｍａｒ ２；４９（８）：１６１６−２７； Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ． ２００９ Ｏｃｔ １；４６１（７２６４）：６２１−６． Ｅｐｕｂ ２００９ Ｓｅｐ １６； ｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ２００９ Ｏｃｔ ８；５２（１９）：５７８９−９２； Ｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ （Ｅｄｉｎｂ）． ２００８ Ａｕｇ；８８ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ２５−３３； Ｂｒｙｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ． ２００８ Ｍａｒ １３；３（３）：１３７−４５； Ｃａｓｅｎｇｈｉ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｍｅｄ． ２００７ Ｎｏｖ ６；４（１１）：ｅ２９３； Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００６ Ｍａｒ；５９（５）：１４１７−２８； ａｎｄ Ｋｌｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ２００８ Ｎｏｖ ２７；５１（２２）：７０６５−７４．
本発明において使用可能な抗寄生体剤としては、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール（ＢＮＰＤ）、β−ニトロスチレン（ＢＮＳ）、ドデシルグアニジン塩酸塩、２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）、グルタルアルデヒド、イソチアゾリン、メチレンビス（チオシアナート）、トリアジン、塩化ｎ−アルキルジメチルベンジルアンモニウム、リン酸トリナトリウム系抗菌剤、酸化トリブチルスズ、オキサゾリジン、硫酸テトラキス（ヒドロキシメチル）ホスホニウム（ＴＨＰＳ）、フェノール、クロム化ヒ酸銅、亜鉛ピリチオン、銅ピリチオン、カーバメート、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カルシウム、臭化ナトリウム、ハロヒダントイン（Ｂｒ、Ｃｌ）、ピリメタミン、スルファジアジン、スルファドキシン、クリンダマイシン、およびスピラマイシンまたはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において使用可能な化学療法剤としては、アルキル化剤（窒素マスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、およびクロランブシルなど）；ニトロソ尿素（カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）など）；エチレンイミン／メチルメラミン（トリエチレンメラミン（ｔｈｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ）（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ））など）；スルホン酸アルキル（ブスルファンなど）；トリアジン（ダカルバジン（ＤＴＩＣ）など）を含む）；代謝拮抗物質（葉酸類似体（メトトレキセートおよびトリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）など）、ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ヂフルオロデオキシシチジンなど）、プリン類似体（６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、フルダラビンリン酸エステル、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）など）を含む）；天然産物（有糸分裂抑制薬（パクリタキセル、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、およびビノレルビンを含む）、タキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、エストラムスチン、およびエストラムスチンリン酸エステルなど）；エピポドフィロ（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｏ）毒素（エトポシドおよびテニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）など）；抗生物質（アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン（ｒｕｂｉｄｏｍｙｃｉｎ））、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）（ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ））、マイトマイシンＣ、およびアクチマイシンなど）；酵素（Ｌ−アスパラギナーゼなど）；生物応答調節物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（インターフェロン−α、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、およびＧＭ−ＣＳＦなど）を含む）；その他の種々の剤（白金配位錯体（シスプラチンおよびカルボプラチンなど）、アントラセンジオン（ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｄｉｏｎｅ）（ミトキサントロンなど）、置換尿素（ヒドロキシ尿素など）、メチルヒドラジン誘導体（Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含む）、副腎皮質抑制剤（ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなど）；ホルモンおよびアンタゴニスト（副腎皮質ステロイドアンタゴニスト（プレドニゾンおよび同等物など）、デキサメタゾンならびにアミノグルテチミドなど；プロゲスチン（ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステル、メドロキシプロゲステロン酢酸エステルおよびメゲストロール酢酸エステル（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ ａｃｅｔａｔｅ）など）；エストロゲン（ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール同等物など）；抗エストロゲン（タモキシフェンなど）；アンドロゲン（テストステロンプロピオン酸エステルおよびフルオキシメステロン／同等物を含む）；抗アンドロゲン（フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体およびロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）など）；非ステロイド系抗アンドロゲン（フルタミドなど）を含む）；キナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、メチル化阻害剤、プロテアソーム阻害剤、モノクローナル抗体、酸化剤、抗酸化剤、テロメラーゼ阻害剤、ＢＨ３模倣剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤、ｓｔａｔ阻害剤、およびナノ粒子を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の例示的な実施形態を詳細に示す以下の実施例を参照することによって本発明はさらに完全に理解されるだろう。しかし、それらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本開示全体におけるすべての引用は、参照により本開示において明示的に援用される。
ＤＵＢ阻害剤の抗がん作用の評価
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、造血幹細胞の染色体異常によって、制御不能なチロシンキナーゼ活性を有するＢｃｒ−Ａｂｌが発現する疾患である。このような所見は、ＣＭＬ患者に対して顕著な臨床有効性を示した最初のＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤であるイマチニブの開発試験および臨床試験により裏付けられている。イマチニブは、ＣＭＬおよびＢｃｒ−Ａｂｌを発現する他の白血病に対する第一選択の治療薬であり、慢性期にイマチニブを投与された患者の大半において、完全な細胞遺伝学的応答が得られている。しかし、寛解期にイマチニブを投与された患者では、分子学的な検討により、多くの場合Ｂｃｒ−Ａｂｌの発現がなおも検出されること、およびイマチニブ治療を中断すると往々にして再発することが示されている。また、進行したＣＭＬ患者においてはイマチニブ応答の得られる期間が限定的であることは一般的であり、どのステージにおいてもイマチニブに対する耐性は生じる可能性がある。イマチニブ耐性の獲得および疾患の進行においては、多くの場合、イマチニブの結合およびキナーゼ阻害に影響を及ぼすＢｃｒ−Ａｂｌの変異および翻訳後修飾が観察されることが特徴である。イマチニブ耐性疾患における分子上の変化は、より高い親和性でＢｃｒ−Ａｂｌに結合するかまたはイマチニブ耐性に関わるイマチニブ非感受性キナーゼを阻害する第二世代のチロシンキナーゼ阻害剤を用いて克服できるものもある。しかし、これらの阻害剤の活性も、変異などの過程により制限される可能性がある。いくつかの知見により、Ｂｃｒ−Ａｂｌがタンパク質の足場として機能することにより、キナーゼ活性に完全には依存しないシグナル伝達複合体を構成し得ることが示唆されている。このような所見より、場合によっては、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質のレベルを調節する化合物の方がＣＭＬ治療に対して高い有効性や適性を示す可能性があることが示唆される。
ＤＵＢ阻害活性を有する低分子のＷＰ１１３０は、Ｂｃｒ−Ａｂｌのユビキチン化を速やかに誘導し、それによりＢｃｒ−Ａｂｌは細胞質からアグリソーム（ａｇｇｒｅｓｏｍｅ）と呼ばれるコンパクトな細胞内タンパク質複合体へと移行される。このような修飾により、下流のＢｃｒ−Ａｂｌ発がんシグナル伝達は失われる。ＷＰ１１３０は、デユビキチナーゼの１つであるＵｓｐ９ｘを直接阻害する。Ｕｓｐ９ｘは、多くの腫瘍（血液悪性腫瘍を含む）で発現する抗アポトーシスタンパク質Ｍｃｌ−１の安定性を調節することが近年報告されている。Ｍｃｌ−１は、造血悪性腫瘍における薬剤耐性および生存に関与する。ＷＰ１１３０によるＵｓｐ９ｘ阻害は、Ｍｃｌ−１レベルの低下およびＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼシグナル伝達の阻害を伴い、ひいては速やかなアポトーシスの開始につながる。これらの結果により、ユビキチンサイクルの特定のレギュレータ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）を標的とすることは発がんタンパク質シグナル伝達を阻害し、上昇したアポトーシス閾値を低下させる新規の治療方法となることが示唆される。
抗がん治療薬としてのＷＰ１１３０の作用機序について検討した。ＣＭＬ細胞において発現および活性化される複数のキナーゼをスクリーニングした結果、ＷＰ１１３０によりＢｃｒ−Ａｂｌの下方調節のみが検出された。これを精査したところ、ＷＰ１１３０の作用は細胞の細胞質画分内で開始されることが示された。これは、主に細胞質に存在するＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質に対する選択性を説明し得るものでもある。Ｊａｋ２、ＬｙｎおよびＰＩ３−Ｋなどの他のキナーゼは、膜画分において検出されるか、または膜貫通受容体に会合していることが報告されている。いくつかの種類の腫瘍を分析したところ、ＨＥＲファミリー、ｃ−ｋｉｔおよびＦｌｔ−３などの膜貫通キナーゼがＷＰ１１３０に対して非感受性であることが示され、これにより、ＷＰ１１３０が特定の細胞質キナーゼに対して選択性を示すという所見が裏付けられた。しかし、Ｂｃｒ−Ａｂｌを発現しない血液腫瘍では、ＷＰ１１３０に応答してＪａｋ２が急速にユビキチン化されてアグリソームへと輸送される。このことは、これまでに報告された、ＷＰ１１３０およびこれより低活性の誘導体（ＷＰ１０６６およびＷＰ１０３４など）のＪａｋ／Ｓｔａｔ阻害活性を説明し得る。本明細書で報告した活性結果および過去の所見に基づくと、ＷＰ１１３０は、Ｂｃｒ−Ａｂｌなどのタンパク質のユビキチン化に至る一連のイベントを開始させる。このユビキチン修飾により、タンパク質が細胞小器官に輸送または移行されるようシグナルが発せられ、Ｂｃｒ−Ａｂｌの場合、主な移行先はアグリソームであると考えられる。アグリソームは、通常、タンパク質の誤った折り畳みまたは過剰生成に応答して形成され、過剰なタンパク質が細胞代謝の妨げとなるのを防いで細胞を保護すると考えられている。しかし、Ｂｃｒ−Ａｂｌの場合、シグナル伝達の喪失は、短期間であっても、ＣＭＬ細胞のアポトーシスの開始を伴う。この点で、ＷＰ１１３０によって開始されたＢｃｒ−Ａｂｌのコンパートメント化は、細胞保護プロセスを細胞破壊プロセスへと変化させると言える。ＷＰ１１３０によるＤＵＢ活性の阻害という所見に基づくと、ＤＵＢの標的が、上記で見られたＷＰ１１３０の活性に関与していると考えられる。
ＷＰ１１３０によるタンパク質ユビキチン化およびそのアポトーシス活性の一部に関しては、あるサブセットのＤＵＢ酵素の存在が根底にあると考えられる。ＷＰ１１３０と接触させたＣＭＬ細胞において、全体的なＤＵＢ活性に大きな変化は検出されなかったが、Ｕｓｐ９ｘなどの特定のＤＵＢの阻害は検出された。Ｕｓｐ９ｘ活性は、細胞、細胞溶解液および酵素調製物を用いたアッセイにおいて、Ｂｃｒ−Ａｂｌの輸送やアポトーシスの誘導に必要な濃度のＷＰ１１３０によって影響を受けた。最近の報告により、Ｕｓｐ９ｘは、脱ユビキチン化によってＭｃｌ−１のプロテアソーム分解を阻害し、その結果、Ｍｃｌ−１の安定性の向上およびＭｃｌ−１の半減期の延長をもたらすことが示唆されている（例えば、Ｓｃｈｗｉｃｋａｒｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４６３：１０３−１０７ （２０１０）を参照）。ＷＰ１１３０処理細胞において、Ｕｓｐ９ｘ活性の阻害とともに、Ｍｃｌ−１レベルが低下した。Ｕｓｐ９ｘ阻害がＢｃｒ−Ａｂｌの輸送に関与するか否かを調べるために、ＣＭＬ細胞においてＵｓｐ９ｘの発現を抑制したところ、Ｍｃｌ−１の下方調節は見られたが、Ｂｃｒ−Ａｂｌのユビキチン化またはその細胞局在化には影響がなかった。Ｕｓｐ９ｘの発現および活性は、複数の腫瘍において、Ｍｃｌ−１制御と密接な関係にあるが、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害に対してはあまり応答しないＣＭＬ幹細胞の生存率の維持にも非常に重要な働きをしている可能性がある。複数の研究により、初期段階の白血病前駆細胞は多くの上流カスケードの活性化（Ｂｃｒ−Ａｂｌ活性化およびサイトカインによるＳｔａｔ活性化を含む）により、Ｍｃｌ−１を過剰発現することが示されている。
最近まで、がん化した細胞におけるＭｃｌ−１活性のモジュレータ（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）としてのＵｓｐ９ｘの役割は知られていなかったが、Ｕｓｐ９ｘの阻害剤は、多くの場合において、治療上重要である。この点で、ＷＰ１１３０はＣＭＬをベースとした治療に非常に適している。なぜなら、ＷＰ１１３０は、アグリソームへのキナーゼ隔離によるＢｃｒ−Ａｂｌのシグナル伝達（ＣＭＬ幹細胞の生存の安定化に不可欠と考えられる）への間接的な作用を有し、Ｕｓｐ９ｘ活性を直接阻害するからである。Ｍｃｌ−１レベルの制御におけるＵｓｐ９ｘの重要性を考慮すると、ＷＰ１１３０のような化合物は、Ｕｓｐ９ｘ活性およびＭｃｌ−１保護が関わるアポトーシス耐性を克服するのに有用である。
すべての化合物の２０ｍＭストック溶液（ＤＭＳＯ中）を作製し、−２０℃で冷凍保存した。これらを水性媒質で希釈してから使用した。本研究において使用した他の試薬は、以下の供給元から得た：ボルテゾミブ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；ケンブリッジ、ＭＡ）、Ｍｉｎｉ−ＣｏｍｐｌｅｔｅおよびＰｈｏｓＳＴＯＰ阻害カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナポリス、ＩＮ）、Ｕｂ−ＡＭＣ、血球凝集素標識ユビキチンビニルメチルスルホン（ＨＡ−ＵｂＶｓ）、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣ、ＭＧ−１３２、ラクタシスチン（Ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ）および２０Ｓヒトプロテアソーム（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）。また、Ｒａｐ８０−アガロースビーズアフィニティマトリクス、アタキシン（Ａｔａｘｉｎ）−アガロースビーズアフィニティマトリクスおよび精製ポリユビキチン鎖（Ｋ−４８／Ｋ−６３結合型）も、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍから入手した。１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）は、ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウーバーン、ＭＡ）から購入した。
細胞株および患者サンプル−Ｋ５６２、Ｋ５６２Ｒ、ＢＶ−１７３、ＢＶ−１７３ＲおよびＷＤＴ−２の各細胞株の増殖・維持は、過去の報告に記載の方法と同様に行った。ＢａＦ３細胞も同じ培地で維持したが、培地には、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ロッキーヒル、ＮＪ）を添加した。また、ＢａＦ３細胞は、過去の報告に記載の方法と同様に、野生型または変異型Ｂｃｒ−Ａｂｌを用いて、または上流にｅＧＦＰコード配列をインフレームで挿入したＢｃｒ−Ａｂｌ発現ベクターを用いて形質転換した。すべての細胞は、加湿雰囲気中３７℃で培養および維持した。
患者由来の標本は、イマチニブ治療による疾患の継続的な制御が達成できなかったＣＭＬ患者から提供されたものである。単核細胞は、血液サンプルから密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）によって分離した後、ＰＢＳで洗浄して細胞培養培地に再懸濁し（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ウシ胎仔血清）、５％ＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で一晩インキュベートした後、阻害剤で処理した。
プラスミドおよび電気穿孔法−ｅＧＦＰコード領域は、ＥｃｏＲ１制限部位を有する５’プライマー：ＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧ（配列番号１）およびＥｃｏＲＶ制限部位を有する３’プライマー：ＧＡＴＡＴＣＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧ（配列番号２）を用いて、ＰＣＲによりｐＬＥＧＦＰｃからクローニングした。ｐ２１０Ｂｃｒ／Ａｂｌｃ ＤＮＡ（ｐＳＧ５由来）を含有するｐＢＳｓｋ＋ベクターをＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲ１部位を平滑化した。ｅＧＦＰフラグメントをＣｌａＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、ｐＢＳｓｋ＋／ｐ２１０Ｂｃｒ／Ａｂｌに挿入することによって、５’標識ｅＧＦＰｐ２１０Ｂｃｒ／Ａｂｌを作製した。ｐＭＸ／ｅＧＦＰｐ２１０Ｂｃｒ／Ａｂｌは、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて、ｅＧＦＰｐ２１０Ｂｃｒ／ＡｂｌをＩＲＥＳ ｅＧＦＰ欠失ｐＭＸｐｕｒｏベクターに挿入することによって構築した。ＢａＦ３細胞に、ｐＭＸ／ｅＧＦＰｐ２１０Ｂｃｒ／ＡｂｌまたはｐＭＸ／ｅＧＦＰｐ１２０Ｂｃｒ／Ａｂｌ−Ｔ３１５Ｉ（ｐＳＧ５−Ｂｃｒ／Ａｂｌ／Ｔ３１５ＩベクターからＫｐｎ１／ＢｓｒＧ１部位を利用してサブクローニングすることにより構築）を電気穿孔法により導入した。すべての変異およびベクターへの挿入断片は、シーケンシングによって確認した。細胞は、ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ；２週間）耐性の有無により選抜し、ｅＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ−ＩＩ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で選別することによってＢｃｒ−Ａｂｌ発現細胞を濃縮した。Ｂｃｒ−Ａｂｌ発現およびサイトカイン非依存性は、免疫ブロット法およびイマチニブとのインキュベーション（ＩＬ−３は添加したまま）によるアポトーシス誘導によって確認した。
溶解液の調製、抗体およびウエスタンブロット法−１×レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）還元サンプル緩衝液中で細胞ペレットを煮沸および超音波処理することにより、全細胞溶解液を調製した。界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分を調製するために、細胞に冷却した等張溶解緩衝液［Ｍｉｎｉ−ＣｏｍｐｌｅｔｅおよびＰｈｏｓＳＴＯＰとともに１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５％トリトンＸ−１００および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む］を加えて氷上で１５分間処理することにより溶解し、２０，０００ＲＣＦで１０分間遠心分離した。清澄化した上清を、界面活性剤可溶性細胞画分として使用した。残存するペレットをレムリ還元サンプル緩衝液で洗浄および抽出し、軽く超音波処理して、界面活性剤不溶性画分を得た。等量の細胞溶解液または等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードして電気泳動を行い、ニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎｎ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）への転写を行った。タンパク質の検出は、免疫ブロット法によって行った。
この実験に使用した抗体は、以下の供給元から購入した：抗ｐＹ−Ｓｔａｔ５、ｐＹ−ＣｒｋＬ、抗ＰＡＲＰ、抗Ｍｃｌ−１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダンバース、ＭＡ）、抗アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）、ポリクローナル抗ＡＢＬ（Ｋ１２）、モノクローナル抗ＡＢＬ（ＳＨ２ドメイン、８Ｅ９）、抗ユビキチンクローンＰ４Ｄ１、抗ＨＳＰ９０、抗ＨＳＰ７０、抗Ｊａｋ２、抗ＣｒｋＬ、抗α−チューブリン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ／マウス／ラットＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルーズ、ＣＡ）、抗ＨＡクローン３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナポリス、ＩＮ）および抗Ｕｓｐ９ｘ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、モントゴメリー、ＴＸ）。
プロテアソーム活性アッセイ−２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性の測定はは、蛍光発生基質であるＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣを用いて行った。プロテアソーム阻害のインビボアッセイにおいては、細胞をＷＰ１１３０（５μＭ）またはＭＧ１３２（５μＭ）で２時間処理し、氷冷した溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００）を加えて溶解した。溶解液を２０，０００ＲＣＦで１０分間遠心分離することにより清澄化し、各サンプルからそれぞれ等量のタンパク質を採取して、１００μＭの蛍光発生基質とともに３７℃でインキュベートした。２０Ｓプロテアソームに対する直接的な阻害を調べるインビトロアッセイにおいては、精製した２０Ｓヒトプロテアソーム（２００ｎｇ）をＷＰ１１３０（５μＭ）、ＭＧ１３２（５μＭ）またはラクタシスチン（５μＭ）とともに３７℃で３０分間インキュベートした後、基質を加えた。蛍光強度は、分光光度計を用いて励起波長３６０ｎｍおよび蛍光波長４６０ｎｍで測定した。アッセイは３重測定で行い、統計学的有意性は、対応のあるスチューデントのｔ−検定により求めた。
活性酸素種（ＲＯＳ）アッセイ−白血病細胞（１×１０６）を、ＤＭＳＯ、ＷＰ１１３０（５μＭ）またはＲＯＳ含有量に対する正エフェクタ［Ｈ２Ｏ２（０．５ｍＭ）］もしくは負エフェクタ［ＤＴＴ（１ｍＭ）］により３７℃で２時間処理した。上記細胞を洗浄して、１０μＭ ＤＣＦＤＡを含有するＰＢＳに再懸濁し、さらに１５分間暗所でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、上記細胞を９６ウェルプレートのウェルに移し、分光光度計を用いて励起波長４９２ｎｍおよび蛍光波長５２０ｎｍで蛍光強度を測定した。アッセイは３重測定で行い、統計学的有意性は、対応のあるスチューデントのｔ−検定により求めた。
共焦点顕微鏡法−対照のｅＧＦＰ−Ｂｃｒ／Ａｂｌ形質転換ＢａＦ３細胞および処理したｅＧＦＰ−Ｂｃｒ／Ａｂｌ形質転換ＢａＦ３細胞を、それぞれＰＢＳで２回洗浄した後、４％ホルムアルデヒドを用いて１５分間固定した。上記細胞を、Ｃｙｔｏｐｒｏ遠心分離機（Ｗｅｓｃｏｒ、ローガン、ＵＴ）を用いて、ポリリジンでコーティングされたスライド上に塗抹し、０．５％トリトンＸ−１００による膜透過処理を５分間行った。次いで、スライドをブロッキング溶液（５％ヤギ血清）に浸し、室温で１時間インキュベートした。一次抗体（１：１００）とのインキュベーションを、室温で４時間または４℃で一晩行い、スライドを０．２％トリトンＸ−１００／ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。２次抗体として、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ抗マウス免疫グロブリン抗体およびＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ抗ウサギ免疫グロブリン抗体を使用した。スライドを３回洗浄し、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。オリンパス共焦点顕微鏡ＦＶ−５００（東京、日本）を用いて画像を取得した。
インビトロ脱ユビキチン化アッセイ−Ｕｂ−ＡＭＣプロテアーゼアッセイ。細胞に５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５％ＮＰ−４０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する氷冷したＤＵＢ緩衝液を加えて溶解した。簡単に説明すると、非処理の細胞または処理した細胞から調製した５μｇの清澄化溶解液を、反応液量を１００μＬとして、５００ｎＭ Ｕｂ−ＡＭＣとともに３７℃でインキュベートし、ＡＭＣに基づく蛍光の発生を、分光蛍光計を用いてｅｘ／ｅｍ ３８０／４８０で記録した。５００μｇの細胞溶解液からＵＳＰ９ｘを免疫沈降させ、反応液量を１００μＬとして、ＮＥＭ、ＷＰ１１３０またはＤＭＳＯを含有するＤＵＢ緩衝液中で３０分間インキュベートした。５００ｎＭ Ｕｂ−ＡＭＣを加えることによって反応を開始させ、ＡＭＣに基づく蛍光の発生を記録した。
Ｕｂ鎖分解。精製したポリユビキチン鎖（Ｋ−４８／Ｋ−６３結合型）のインビトロ分解試験は、過去の報告に記載の方法と同様に行った。非処理の細胞またはＷＰ１１３０で処理した細胞から、ＤＵＢ緩衝液を用いて５μｇの溶解液を調製し、Ｋ４８−またはＫ−６３結合型鎖（１μｇ）とともに３７℃で１０分間インキュベートした。鎖の分解の程度をユビキチン免疫ブロット法により評価した。
デユビキチナーゼ標識アッセイ 細胞内のデユビキチナーゼの活性変化を測定するために、白血病細胞にＤＵＢ緩衝液（５０ｍＭトリス ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を加えて４℃で１０分間処理することにより溶解した。溶解液を２０，０００ＲＣＦで１０分間遠心分離し、その上清をＤＵＢ標識に使用した。それぞれ等量の溶解液を５００ｎｇのＨＡ−ＵｂＶｓとともに室温で１時間インキュベートした後、還元サンプル緩衝液中で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＨＡ免疫ブロット法により、標識されたＤＵＢを検出した。
Ｂｃｒ−Ａｂｌに対する選択性を確認するために、ＣＭＬ細胞内で発現する複数のキナーゼ（Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ｃ−Ａｂｌ、ＢＣＲ、アクチン、Ｊａｋ２、ｇｐ１３０、Ｌｙｎ、Ａｋｔ、Ｐｔ−３Ｋ、Ｊｎｋ、Ｅｒｋ１／２を含む）がＷＰ１１３０によって下方調節されるかどうかを調べた（５μＭ ＷＰ１１３０で２時間）。ＷＰ１１３０処理によりＢｃｒ−Ａｂｌのタンパク質レベルのみが減少したことから、ＷＰ１１３０はこのキメラタンパク質に対して特異性を有することが示唆された。ｅＧＦＰ−Ｂｃｒ−Ａｂｌで形質転換したＢａＦ３細胞を、非処理のままにするか、または５μＭイマチニブもしくはＷＰ１１３０で２時間処理し、それぞれ等量のタンパク質を含有する細胞溶解液を調製して、含まれるＢｃｒ−Ａｂｌおよびアクチンの量を調べた。ＢａＦ３細胞において、ｅＧＦＰ標識Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ＷＴ）の発現は確認されたが、ＷＰ１１３０処理によりこの異所的に発現したＢｃｒ−Ａｂｌは速やかに下方調節されることが確認された。Ｂｃｒ−Ａｂｌの野生型（ＷＴ）およびＴ３１５Ｉ変異体を発現する安定なＢａＦ３細胞株を構築したところ、いずれの細胞株も、ＷＰ１１３０が誘導するアポトーシスに対して高い感受性を示した。ＢａＦ３細胞を、Ｔ３１５Ｉ Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異を含むｅＧＦＰ−Ｂｃｒ−ＡｂｌとＴ３１５Ｉ Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異を含まないｅＧＦＰ−Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｗ／Ｔ）で形質転換し、イマチニブまたはＷＰ１１３０を用いて指示濃度で７２時間処理した後、ＭＴＴ染色により細胞の増殖および生存を調べた。また、蛍光顕微鏡法により、ＷＰ１１３０のｅＧＦＰ−Ｂｃｒ−Ａｂｌに対する作用についても調べた。ＷＰ１１３０でインキュベートすることにより、ｅＧＦＰ−Ｂｃｒ−Ａｂｌがコンパクトで高密度のＢｃｒ−Ａｂｌ集積体に速やかに蓄積されることが確認された。
ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄｅｎａｍｙｃｉｎ）およびその類似体によるＨｓｐ９０の阻害が、Ｂｃｒ−Ａｂｌの安定性および細胞内分布に影響することが報告されている。そこで、Ｈｓｐ９０阻害剤（１７−ＡＡＧ）の抗増殖効果を、ＷＰ１１３０と比較した。ＷＰ１１３０および１７−ＡＡＧはいずれも、野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ＢＶ−１７３）またはＴ３１５Ｉ変異型Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ＢＶ−１７３Ｒ）を発現するＣＭＬ株において抗増殖効果を示したが、アポトーシスの開始においては差異が見られた。１７−ＡＡＧで処理した細胞では、Ｈｓｐ９０とＢｃｒ−Ａｂｌの会合が抑制され、これによりユビキチン化を経てＢｃｒ−Ａｂｌが下方調節されると考えられる。しかし、ＷＰ１１３０で処理した場合は、Ｂｃｒ−ＡｂｌとＨｓｐ９０との会合は促進された。このことは、Ｂｃｒ−Ａｂｌの下方調節の機序が異なっていることを示唆するものである。Ｈｓｐ９０の阻害によりＨｓｐ７０が誘導されることから、細胞内のユビキチン化タンパク質のレベルおよびＨｓｐ７０タンパク質のレベルに対するＷＰ１１３０および１７−ＡＡＧの影響を調べた。ユビキチン化タンパク質のレベルは１７−ＡＡＧによる影響を全く受けなかったが、Ｈｓｐ７０は１７−ＡＡＧにより誘導された。ＷＰ１１３０により、界面活性剤可溶性細胞画分におけるユビキチン化タンパク質が速やかに増加し、より後の測定時点では界面活性剤不溶性画分にもかなりの量の蓄積が見られた。ＷＰ１１３０で処理した細胞においても、Ｈｓｐ７０のレベルは増加したが、Ｈｓｐ９０の阻害に関連したものではなかった。
ＢＶ−１７３細胞を５μＭ ＷＰ１１３０で０、１または２時間処理した後、全細胞溶解液、界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分中のＢｃｒ−Ａｂｌ、ｐＹ−Ｓｔａｔ５、およびＪａｋ２のタンパク質レベルを調べた。ＢＶ−１７３細胞およびＢＶ−１７３Ｒ細胞を５μＭ ＷＰ１１３０で２時間処理した後、界面活性剤可溶性細胞溶解液および界面活性剤不溶性細胞溶解液を用いて、Ｂｃｒ−ＡｂｌについてＫ１２抗体によるブロットを行った。Ｋ５６２Ｒ細胞を５μＭ ＷＰ１１３０で２時間処理した後、全細胞画分、界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分に含まれるタンパク質中のＢｃｒ−Ａｂｌ、Ｊａｋ２、ｐＹ−Ｌｙｎ、およびＬｙｎについて調べた。Ｔ３１５Ｉ変異を有するｅＧＦＰ−Ｂｃｒ−Ａｂｌで形質転換したＢａＦ３細胞を５μＭ ＷＰ１１３０で０、０．５、１、２、４、または６時間処理した後、界面活性剤可溶性細胞溶解液を用いて、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ｐＹ−Ｓｔａｔ５、Ｓｔａｔ５、およびＰＡＲＰについて免疫ブロットを行った。イマチニブ治療が進行中の２名のＣＭＬ患者から得られた単核細胞を５μＭ ＷＰ１１３０で４時間処理した後、界面活性剤可溶性細胞画分または界面活性剤不溶性細胞画分を示すそれぞれ等量の細胞溶解液中に含まれるＢｃｒ−Ａｂｌについて調べた。また、Ｂｃｒ−Ａｂｌの基質であるリンタンパク質（ｐＹ−Ｓｔａｔ５、ｐＹ−ＣｒｋＬ）およびそれらの総タンパク質レベルについて調べるために、界面活性剤可溶性細胞画分を用いて免疫ブロットを行った。ユビキチン化はタンパク質の分解や細胞内輸送を媒介すると考えられることから、ＷＰ１１３０処理細胞におけるＢｃｒ−Ａｂｌ含有量を調べた。ＷＰ１１３０で処理した結果、Ｂｃｒ−Ａｂｌは界面活性剤可溶性画分から界面活性剤不溶性細胞画分へと速やかにかつほぼ完全に輸送されていた。Ｂｃｒ−Ａｂｌの不溶性画分へのコンパートメント化とともに、Ｓｔａｔ５のリン酸化の阻害が見られたが、Ｊａｋ２への影響は見られなかった。しかし、全細胞抽出物におけるＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質の含有量には有意な変化は見られなかった。また、イマチニブ耐性ＣＭＬ細胞（Ｔ３１５Ｉ−Ｂｃｒ−Ａｂｌを発現するＢＶ−１７３ＲおよびＬｙｎキナーゼを過剰発現するＫ５６２Ｒなど）においても、界面活性剤不溶性細胞画分におけるＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質の含有量の増加が観察されたが、Ｊａｋ２およびＬｙｎの界面活性剤に対する溶解性においてはＷＰ１１３０による影響は見られなかった。Ｂｃｒ−Ａｂｌを発現するＢａＦ３形質移入体において、界面活性剤可溶性画分からのＢｃｒ−Ａｂｌの喪失とともに、基質のリン酸化（ｐＹ−Ｓｔａｔ５）阻害およびアポトーシスの開始（ＰＡＲＰ開裂）が見られた。また、イマチニブ耐性患者由来の初代培養ＣＭＬ細胞をＷＰ１１３０でインキュベートした場合にも、Ｂｃｒ−Ａｂｌの界面活性剤不溶性画分への移行や、Ｂｃｒ−Ａｂｌ基質（ｐＹ−Ｓｔａｔ５、ｐＹ−ＣｒｋＬ）のリン酸化阻害が見られた。界面活性剤不溶性画分には、細胞骨格タンパク質およびアグリソームと呼ばれる細胞構造の構成要素が豊富に含まれている。これらの結果より、ＷＰ１１３０はＢｃｒ−Ａｂｌのコンパートメント化によってＢｃｒ−Ａｂｌ基質のリン酸化を阻害することが示唆される。
Ｋ５６２細胞を５μＭ ＷＰ１１３０とともに３０分間インキュベートした後、界面活性剤可溶性細胞抽出物に対してＨｓｐ９０の免疫沈降を行い、次いで、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ユビキチンまたはＨｓｐ９０について免疫ブロットを行った。Ｋ５６２細胞をＷＰ１１３０（５μＭ）、Ｈ２Ｏ２（５００ｍＭ）またはＤＴＴ（１ｍＭ）とともに３７℃で２時間インキュベートした後、細胞を洗浄して再び播種し、ＤＣＦＤＡを含む培地中、３７℃で２０分間インキュベートした。ＤＣＦＤＡに基づく蛍光量を測定し、処理サンプルにおけるＲＯＳ生成の指標として使用した。他の２つのＣＭＬ細胞株（ＷＤＴ−２、ＢＶ−１７３）においても、同様の結果が得られた。Ｋ５６２細胞を非処理のままにするか、または５μＭのＷＰ１１３０またはＭＧ−１３２により３７℃で２時間処理し、それぞれ調製したタンパク質溶解液をプロテアソームの基質とともにインキュベートした後、蛍光発生基質の切断によるプロテアソーム活性を求めた。精製した２０Ｓプロテアソームを５μＭ ＭＧ−１３２、ラクタシスチンまたはＷＰ１１３０とともにインキュベートした後、プロテアソーム活性を測定した。他の２つのＣＭＬ細胞株においても、同様の結果が得られた。Ｋ５６２細胞を５０ｎＭ ボルテゾミブ（Ｂｚ）または５μＭ ＷＰ１１３０で処理した後、界面活性剤可溶性細胞溶解液、界面活性剤不溶性細胞溶解液および全細胞溶解液をそれぞれ等量用いて、Ｂｃｒ−Ａｂｌまたはユビキチンについて免疫ブロットを行った。ＢｚおよびＷＰはいずれも、ユビキチン含有量を増加させたが、Ｂｃｒ−Ａｂｌおよび界面活性剤不溶性のユビキチン化タンパク質のレベルに影響を及ぼしたのはＷＰのみだった。ユビキチン化タンパク質の含有量は、プロテアソーム阻害、タンパク質シャペロン活性の喪失またはタンパク質の誤った折り畳みを引き起こす細胞の酸化亢進によって増加する可能性がある。しかし、ＷＰ１１３０処理細胞においては、Ｈｓｐ９０のＢｃｒ−Ａｂｌとの会合阻害も、活性酸素種の増加も観察されなかった。さらに、ＷＰ１１３０は、ＣＭＬ細胞においても、精製した２０Ｓプロテアソームサブユニット調製物においても、２０Ｓプロテアソーム活性を抑制しなかった。これにより、ＷＰ１１３０がプロテアソーム阻害剤として作用する可能性は排除された。ＷＰ１１３０と強力な２０Ｓプロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブとを比較して、両者がタンパク質ユビキチン化およびＢｃｒ−Ａｂｌコンパートメント化に対して共通の作用を有している否かを確認した。いずれの化合物も、ユビキチン化タンパク質の含有量を増加させたが、界面活性剤不溶性のユビキチン化タンパク質の蓄積を誘導したのはＷＰ１１３０のみであった。ＷＰ１１３０処理により、界面活性剤可溶性画分に含まれるＢｃｒ−Ａｂｌが減少して、界面活性剤不溶性画分へと移行したが、全体のＢｃｒ−Ａｂｌ含有量には変化が見られなかった。ボルテゾミブは、ユビキチン化タンパク質のレベルを上昇させたが、Ｂｃｒ−Ａｂｌの界面活性剤に対する溶解性またはタンパク質レベルに対しては影響を及ぼさなかった。
ＷＰ１１３０処理細胞においてＢｃｒ−Ａｂｌがユビキチン化されているかどうかを確認するために、ＣＭＬ細胞をＷＰ１１３０で短時間（３０分間）処理して、界面活性剤可溶性画分からＢｃｒ−Ａｂｌを回収した（直接的免疫沈降による）。ＷＰ１１３０は、ＣＭＬ細胞においてＢｃｒ−Ａｂｌのユビキチン化および輸送を促進する働きがある。ＷＤＴ−２細胞をビヒクル単独（対照）または５μＭ ＷＰ１１３０により３７℃で３０分間処理した後、それぞれ等量の溶解液から全細胞溶解液、界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分を調製し、含まれるＢｃｒ−Ａｂｌまたはユビキチンについて調べた。ＷＰ処理細胞または対照細胞からそれぞれ等量のタンパク質（４００μｇ）を含む界面活性剤可溶性細胞溶解液を調製して、１％ＳＤＳで６０℃で処理し、０．１％ＳＤＳに希釈し、抗Ａｂｌ（Ｋ１２）を用いて免疫沈降を行った。免疫沈降物を洗浄し、ゲル上で分離し、Ａｂｌまたはユビキチンについて免疫ブロットを行った。Ｋ５６２細胞またはＢＶ−１７３細胞をＷＰまたは対照で処理し、それぞれ等量のタンパク質を含む界面活性剤可溶性細胞溶解液に対して、Ａｂｌの免疫沈降を行った後、Ａｂｌおよびユビキチンについてブロットを行った。また、対照細胞および処理細胞からそれぞれ得られた等量の溶解液（２００μｇ）に対して、Ｋ４８結合型またはＫ６３結合型ユビキチンポリマーを用いて親和性濃縮（Ｋ４８結合型の場合はアタキシンを、Ｋ６３結合型の場合はＲａｐ８０を使用）を行った。結合したタンパク質を溶出し、Ａｂｌの免疫ブロットを行った。ｅＧＦＰ−Ｂｃｒ−Ａｂｌ形質転換ＢａＦ３細胞をビヒクル単独または５μＭ ＷＰ１１３０で４時間処理し、細胞を固定した後、スライド上にサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）により塗抹し、膜透過処理を行った。反応性部位をブロックした後、スライドを抗ユビキチン抗体（１：１００）とともにインキュベートし、洗浄後、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ抗体を用いて抗原の検出を行った。スライドを再度洗浄し、核を検出するためにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。ＷＰ１１３０処理細胞から免疫沈降により回収したＢｃｒ−Ａｂｌの免疫ブロット分析より、界面活性剤可溶性抽出物から回収したＢｃｒ−Ａｂｌはやや減少していたが、ユビキチン化Ｂｃｒ−Ａｂｌは顕著に増加することが示された。ブロット分析により、ＷＰ１１３０処理細胞の不溶性画分においては、Ｂｃｒ−Ａｂｌおよびユビキチン化タンパク質の有意な増加が確認された。ＷＰ１１３０によるＢｃｒ−Ａｂｌ修飾がＢｃｒ−Ａｂｌへの特定のユビキチンポリマーの転移によるものか否かを調べるために、可溶性細胞溶解液に対して、Ｋ４８結合型またはＫ６３結合型ユビキチンポリマーに対して高い親和性を有するタンパク質（Ｋ４８結合型の場合はアタキシン、Ｋ６３結合型の場合はＲａｐ８０）が結合したアガロースビーズを用いて免疫沈降を行い、タンパク質溶出物を用いて、Ｂｃｒ−Ａｂｌについて免疫ブロットを行った。ＷＰ１１３０処理細胞において、Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｋ６３結合型ユビキチンポリマーの方が多く回収されたことから、Ｂｃｒ−Ａｂｌ上のＫ６３結合型ユビキチンポリマーの増加が、Ｂｃｒ−Ａｂｌの界面活性剤不溶性複合体への移行のためのシグナルの基礎となっていると考えられる。
ｅＧＦＰ−Ｂｃｒ−Ａｂｌ形質転換ＢａＦ３細胞を用いて、共焦点顕微鏡法によりＢｃｒ−Ａｂｌのユビキチン化および細胞内分布についてさらに調べた。ＷＰ１１３０処理により、Ｂｃｒ−Ａｂｌとユビキチンとが集積して、アグリソームに似た核近傍（ｊｕｘｔａ−ｎｕｃｌｅａｒ）複合体を形成した。生化学的に分析したところ、ＷＰ１１３０処理細胞における該複合体には、アグリソームであることを定義するように、Ｂｃｒ−Ａｂｌとともに他のタンパク質も含まれることが分かった。これらの結果より、ＷＰ１１３０は（主としてＫ６３結合型ポリマーによる）Ｂｃｒ−Ａｂｌのユビキチン化を促進し、Ｂｃｒ−Ａｂｌのアグリソームへの移行を引き起こすと考えられる。
立体的にアクセス可能な求電子性β炭素を２個有する交差共役（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）α，β−不飽和ジエノンは、イソペプチダーゼまたはデユビキチナーゼ（ＤＵＢ）に対する阻害活性に関わる分子決定因子である。この決定因子がＷＰ１１３０に存在したことから、ＷＰ１１３０のＤＵＢ阻害活性の可能性が調べられることになった。非処理の細胞またはＷＰ１１３０で処理した細胞から得られた溶解液を、精製したユビキチンポリマー（Ｕｂ１〜Ｕｂ５）とともにインキュベートし、該ポリマーの相対的な回収量を免疫ブロット法によって評価した。ＷＰ１１３０で処理したＣＭＬ細胞から得られた溶解液においては、Ｋ４８結合型およびＫ６３結合型ユビキチンポリマーのいずれも分解から部分的に保護されることが示された。これは、ＷＰ１１３０によるＤＵＢ阻害の可能性を裏付けるものであった。ＤＵＢ阻害をより詳しく調べるために、非処理のＣＭＬ細胞、ＷＰ１１３０で処理（１〜８時間）したＣＭＬ細胞、またはＮ−エチルマレイミド［ＮＥＭ］で処理したＣＭＬ細胞の溶解液を蛍光性ＤＵＢ基質（Ｕｂ−ＡＭＣ）とともにインキュベートし、経時的にＤＵＢ活性をモニタした。非特異的なＤＵＢ阻害剤ＮＥＭで処理した細胞から得られた溶解液は、基質の加水分解を完全に阻害したが、ＷＰ１１３０で処理したＣＭＬ細胞の溶解液は、Ｕｂ−ＡＭＣの加水分解を限定的にしか阻害しなかった。これらの結果より、ＷＰ１１３０によるユビキチン変化は、１種のＤＵＢまたは限定的なサブセットに属するＤＵＢの阻害により起こる可能性が示された。特定のＤＵＢ活性への影響を調べるために、過去の報告に記載の方法と同様に、ＣＭＬ細胞をＷＰ１１３０で処理し、溶解液をＨＡで標識された不可逆性のＤＵＢ基質であるＨＡ−ＵｂＶＳとともにインキュベートした。ＤＵＢが共有結合を介してこの構築物で修飾されることで、ＤＵＢ活性をＨＡ免疫ブロット法により分析することが可能になる。ＷＰ１１３０によるＤＵＢ活性の阻害は、ＨＡで標識されたＷＰ１１３０感受性ＤＵＢの減少によって検出することができる。ＷＰ１１３０処理細胞の溶解液は、Ｕｓｐ９ｘと同定される、極めて高い分子量を有するＤＵＢに対して標識する能力が低いことが示された。Ｕｓｐ９ｘは、主に、界面活性剤に可溶性の細胞質画分で発現しており、Ｕｓｐ９ｘの回収量やタンパク質含有量にＷＰ１１３０処理による影響は見られなかった。ＷＰ１１３０がＵｓｐ９ｘ活性に直接影響を与えるかどうかを調べるために、ＣＭＬ細胞の溶解液をＷＰ１１３０とともに１時間インキュベートした後、ＤＵＢ基質であるＨＡ−ＵｂＶｓとともにインキュベートし、ＨＡブロット法により分析した。Ｕｓｐ９ｘの標識化は、ＷＰ１１３０の存在下で完全に阻害されたことから、ＷＰ１１３０はＵｓｐ９ｘを直接阻害すると考えられる。また、矢印で示した他のＤＵＢもＷＰ１１３０による影響を受けたことから、特異性や選択性に関してはまだ不明であるが、他のＤＵＢもＷＰ１１３０の標的であると考えられる。直接的なＤＵＢ阻害を確認するために、Ｕｓｐ９ｘを免疫沈降して十分に洗浄し、ＷＰ１１３０とともにインキュベートした後、蛍光性ＤＵＢ基質であるＵｂ−ＡＭＣを用いてＤＵＢ活性を調べた。この基質の加水分解速度を測定し、ＤＭＳＯでインキュベートした場合と、ＷＰ１１３０でインキュベートした場合とで比較して、ＷＰ１１３０によるパーセントＤＵＢ阻害率を算出した。正常ＩｇＧ免疫沈降物、およびＵｓｐ９ｘ免疫沈降物のＮＥＭ処理物においては、基質の加水分解は見られなかった。対照の反応と比較したところ、ＷＰ１１３０によりＵｓｐ９ｘ活性は＞８０％低下した。これより、ＷＰ１１３０は、Ｕｓｐ９ｘに対して阻害活性を有するサブセット特異的ＤＵＢ阻害剤として作用することが示された。
最近の報告により、Ｕｓｐ９ｘは、Ｍｃｌ−１の脱ユビキチン化および分解を制御することが示されている。ＷＰ１１３０によるＵｓｐ９ｘ阻害がＣＭＬ細胞のＭｃｌ−１レベルに影響を与えるかどうかを調べるために、全細胞抽出物を用いて、Ｍｃｌ−１について免疫ブロットを行った。ＷＰ１１３０は、Ｕｓｐ９ｘ阻害と同調して経時的にＭｃｌ−１レベルを減少させ、イマチニブ感受性ＣＭＬ細胞およびイマチニブ耐性ＣＭＬ細胞のいずれにおいても有効であった。Ｂｃｒ−ＡｂｌまたはＪａｋ２の阻害によってもＵｓｐ９ｘ活性が低下するか否かを確認するために、ＣＭＬ細胞をＷＰ１１３０、Ｂｃｒ−Ａｂｌ選択的阻害剤（イマチニブ）、Ｊａｋ２選択的阻害剤（ＴＧ１０１２０９）またはマルチキナーゼ阻害剤（ダサチニブ）で４時間処理した後、細胞溶解液をＨＡ−ＵｂＶｓによる標識化および直接的なＵｓｐ９ｘ免疫ブロットに供した。また、直接的なＵｓｐ９ｘ阻害を確認するために、細胞溶解液をＷＰ１１３０でインビトロ処理（５μＭ、３０分間）したものも用意した。ＷＰ１１３０は、Ｕｓｐ９ｘ活性を効果的に低下させたが、試験に用いたキナーゼ阻害剤にはいずれも有意なＵｓｐ９ｘ阻害活性は見られなかった。
白血病および骨髄腫におけるＤＵＢ阻害
ユビキチン化およびユビキチン様タンパク質修飾は、ほとんどの細胞内タンパク質の機能および運命の方向付けに大きな役割を担っている。罹患した細胞では、このような修飾経路における複数の重要な酵素が増幅されるかまたは修飾されていることから、そのような活性を阻害または調節する低分子の開発が行われている。このような修飾経路における特定の酵素を選択的に標的とする方法は大きく進展し、臨床効果を示すものもある。ＤＵＢはユビキチンサイクルにおいて特化した役割を有するだけでなく、複数のシグナル伝達経路および発がんタンパク質の制御においてもその役割が新たに発見されていることから、ＤＵＢ阻害剤は抗がん剤として有用である。ＷＰ１１３０は、ポリユビキチン化タンパク質の蓄積を誘導し、腫瘍細胞のアポトーシスを促進する能力を有することから、有用な抗がん剤として同定されている。
ユビキチンアルデヒドおよびユビキチンビニルスルホン（ＵｂＶＳ）などの強力な作用を有するペプチド性不可逆的ＤＵＢ阻害剤が知られている。しかし、分子量が大きく、細胞内バイオアベイラビリティが低いため、それらの治療効果は制限されている。その他に、Ｄ１２−プロスタグランジンＪ２などの低分子化合物が、細胞内でユビキチンイソペプチダーゼ活性を阻害し（ＩＣ５０＝約３０μＭ）、ユビキチン化タンパク質の細胞内蓄積および細胞死を引き起こすことが示されている。この化合物において、ＤＵＢ阻害活性に必要とされる重要な分子決定因子である、立体的にアクセス可能なβ炭素を有するα，β−不飽和ケトンが確認されたことが、同様の活性を有するさらなる阻害剤（ジベンジリデンアセトン（ＤＢＡ；ＩＣ５０＝約２０〜４０μＭ）、クルクミン（ＩＣ５０＝約８０〜１００μＭ）、およびシコシン（ｓｈｉｋｏｃｃｉｎ）（ＮＳＣ−３０２９７９；ＩＣ５０＝約１５μＭ）など）の同定へとつながった。しかし、これらの化合物の影響を受ける特定のＤＵＢのプロファイルについての報告はない。
本明細書では、複数のインビボアッセイおよびインビトロアッセイを用いて、作用機序の観点から、ＷＰ１１３０が部分的に選択性を有するＤＵＢ阻害剤として作用することを証明している。本明細書におけるデータにより、ＷＰ１１３０が主要な細胞内デユビキチナーゼ（ＵＳＰ５、ＵＣＨ−Ｌ１、ＵＳＰ９ｘ、ＵＳＰ１４、およびＵＣＨ３７など）の活性を抑制することが示されている。複数種のＤＵＢの阻害により、（ｉ）ポリユビキチン化タンパク質／未結合のポリユビキチン鎖の蓄積量の増加、（ｉｉ）単量体ユビキチンプールの減少、（ｉｉｉ）ポリユビキチン分解の速度低下、（ｉｖ）個々のＤＵＢ活性の全体的な低下、および（ｖ）ＤＵＢに調節されるｐ５３およびＭｃｌ−１などの発がんタンパク質の細胞内レベル／活性への影響といった複数の細胞内変化をもたらすことが予測される。ＵＳＰ５およびＵＣＨ３７は、Ｋ４８結合型およびＫ６３結合型ポリユビキチン化タンパク質のいずれも脱ユビキチン化することが知られている。
プロテアソーム阻害または細胞内ＤＵＢ活性の阻害によって生じる、細胞内のユビキチン化タンパク質の顕著な増加は、アグリソーム形成の引き金になると考えられる。ストレス条件下でアグリソームが形成されると、細胞内で一時的に細胞保護イベントが起こり、大量に蓄積されたユビキチン化タンパク質がアグリソームを含む不溶性画分へと移行する。データによれば、ＷＰ１１３０処理によって、ポリユビキチン化されたＪａｋ２およびＢｃｒ−Ａｂｌが界面活性剤不溶性のアグリソームに蓄積し、それにより腫瘍細胞の増殖が抑制されることが示唆されている。
したがって、増殖、生存および成長因子シグナル伝達において重要な役割を担う発がんタンパク質がアグリソーム（ここでは発がんタンパク質は機能できない）へ移行することは、腫瘍細胞にとっては不利になることが予想される。しかし、そのような発がん性キナーゼの調節に重要な役割を担っているＤＵＢは、現在不明である。ＣＭＬおよび黒色腫の異種移植マウスモデルにおいて、ＷＰ１１３０による処置は、インビボにおいて腫瘍の成長を効果的に抑制する。これらの所見から、ＷＰ１１３０はＤＵＢ活性に対する作用を通じて治療剤として機能することが示唆される。
なお、ＷＰ１１３０の標的ＤＵＢの中に、特定のがん遺伝子およびアポトーシスレギュレータ（Ｍｃｌ−１およびｐ５３を含む）の安定性および代謝回転の重要なレギュレータであることが最近示されたＤＵＢがあることは注目すべきである。その他に、がん化およびユビキチン化タンパク質のプロテアソームへの移行の制御において直接的な役割を担うことが示唆されているＤＵＢも存在する。さらに、ＷＰ１１３０の標的と考えられているＤＵＢの中には、調節不能な細胞増殖および腫瘍細胞のがん遺伝子依存において役割を担うことが最近示されたものもある。
細胞培養、化学試薬および酵素−ヒト多発性骨髄腫ＭＭ１．Ｓ細胞およびヒトマントル細胞リンパ腫Ｚ１３８細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）を含むＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させた。ヒト胎児由来腎臓細胞２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）などの付着細胞株は、１０％ＦＢＳを含有するダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。すべての細胞は、加湿雰囲気中３７℃で培養および維持した。ＲＰＭＩ−１６４０およびＤＭＥＭは、ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）から購入した。
プラスミドおよびｓｉＲＮＡトランスフェクション−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１０５細胞／ウェル）をトランスフェクションの２４時間前に６ウェルプレートに播種した。トランスフェクションは、各ウェル５００ｎｇのＨＡ標識ユビキチン（ＷＴ／６３Ｏ／４８Ｏ）とＦｕｇｅｎｅＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）とを用いて、製造元のプロトコルにしたがって行った。トランスフェクション後、一晩インキュベートして、細胞を２つのウェルに分割し、さらに２４時間インキュベートした後、ビヒクル単独（ＤＭＳＯ）またはＷＰ１１３０で処理した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＵＳＰ９ｘおよびＵＳＰ５のノックダウンは、ＵＳＰ９ｘおよびＵＳＰ５に対するＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ−ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（各３０ｎＭ）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００とを用いて行った。トランスフェクションから７２時間後に、タンパク質レベルをウエスタンブロット法によって推定した。
ウエスタンブロット法−細胞ペレットを１×レムリ還元サンプル緩衝液中で煮沸および超音波処理することにより、全細胞溶解液を調製した。界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分を調製するために、細胞に冷却した等張溶解緩衝液［Ｍｉｎｉ−ＣｏｍｐｌｅｔｅおよびＰｈｏｓＳＴＯＰとともに１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５％トリトンＸ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む］を加えて氷上で１５分間処理することにより溶解し、２０，０００ＲＣＦで１０分間遠心分離した。清澄化した上清を、界面活性剤可溶性細胞画分のストックとして使用した。残存するペレットを等量の沸騰した１×レムリ還元サンプル緩衝液中で超音波処理することにより、界面活性剤不溶性画分を抽出した。等量の細胞溶解液または等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードして電気泳動を行った。
この実験に使用した抗体は、以下の供給元から購入した：抗アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）、抗ユビキチンクローンＰ４Ｄ１、抗ＨＤＡＣ６、抗ＨＳＰ９０、抗ＨＳＰ７０、抗２０Ｓプロテアソーム、抗ＨＤＡＣ６、ヤギ抗ウサギ／マウス／ラットＩｇＧ標識セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルーズ、ＣＡ）、抗フロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）１、抗ＭＣＬ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）、抗ｐ５３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、ＭＡ）、抗ＵＳＰ９ｘ、抗ＵＳＰ５（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、モントゴメリー、ＴＸ）、抗ＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ダンバース、ＭＡ）、抗ＨＡクローン３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ インディアナポリス、ＩＮ）。
細胞内分画−Ｚ１３８細胞を５μＭ ＷＰ１１３０またはＤＭＳＯで２時間処理した後、細胞を溶解し、さらに処理して細胞質画分、膜画分、核画分および細胞骨格画分に分離した。ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、ＣＡ）を用い、製造元の取扱説明書にしたがって各画分を抽出した。各画分の純度を調べるために、画分ごとにマーカーを加えた。
共焦点顕微鏡法−ＷＰ１１３０またはＤＭＳＯで４時間処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、４％ホルムアルデヒドを用いて１５分間固定した。細胞に０．５％トリトンＸ−１００を加えて、５分間膜透過処理を行った。次いで、スライドをブロッキング溶液（５％ヤギ血清）に浸し、室温で１時間インキュベートした。一次抗体（１：１００）を用いたインキュベーションを４℃で一晩行い、スライドを０．２％トリトンＸ−１００／ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。２次抗体として、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ抗マウス免疫グロブリン抗体およびＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ抗ウサギ免疫グロブリン抗体を使用した。スライドを３回洗浄し、核を検出するためにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。オリンパスＦｌｕｏＶｉｅｗ（登録商標）５００（東京、日本）を用いて画像を取得した。それぞれの画像は、サンプルごとに得られたＺスタック（Ｚ＝０．５μｍ）画像を示す。
ＭＴＴによる細胞増殖評価およびアポトーシス分析−細胞を９６ウェルプレートに５，０００細胞／ウェルで播種し、濃度が異なるＷＰ１１３０の存在下、ＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で３日間インキュベートした。２０μＬの５ｇ／Ｌ ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）溶液を各ウェルに加えて、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、細胞に１０％ＳＤＳ緩衝液を加えて溶解し、対照波長６３０ｎｍに対する５７０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。細胞の増殖が５０％阻害される濃度（ＩＣ５０値）を算出した。
アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ染色およびヨウ化プロビジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ）（ＰＩ）染色を用いて、ＷＰ１１３０処理細胞におけるアポトーシスを測定した。簡単に説明すると、１０５／ｍＬの細胞を組織培養プレートから回収し、室温で２５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。培地上清を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。次いで、細胞を０．４ｍｌの冷却したアネキシンＶ結合緩衝液に再懸濁し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロビジウムを加えた。サンプルを暗所にて室温で１０分間インキュベートし、ナイロンメッシュでろ過し、ＦａｃＳｃａｎアナライザー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、サンノゼ、ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
精製したＤＵＢをそれぞれ至適濃度（ＵＳＰ５；２０ｎＭ、ＵＣＨ−Ｌ１；２０ｎＭ、ＵＣＨ−Ｌ３；５ｎＭ、ＵＳＰ９ｘ；５００μｇのＺ１３８細胞溶解液から免疫沈降させた）に調製し、反応液量１００μＬとして、ＷＰ１１３０、ビヒクル単独（ＤＭＳＯ）または１ｍＭ ＮＥＭ（ＤＵＢ阻害における陽性対照）を含有するＤＵＢ緩衝液中で３０分間インキュベートした。５００ｎＭ Ｕｂ−ＡＭＣを加えて反応を開始し、ＡＭＣに基づく蛍光の発生を分光蛍光計を用いてｅｘ／ｅｍ ３８０／４８０で記録した。
デユビキチナーゼ標識アッセイ−細胞内のデユビキチナーゼの活性変化を測定するために、Ｚ１３８細胞およびＨＥＫ２９３細胞にＤＵＢ緩衝液（５０ｍＭトリス ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を加えて４℃で１０分間処理することにより溶解した。溶解液を２０，０００ＲＦＣで１０分間遠心分離し、上清をＤＵＢ標識に使用した。それぞれ等量の溶解液を５００ｎｇのＨＡ−ＵｂＶｓとともに室温で１時間インキュベートした後、還元サンプル緩衝液中で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写した後、ＨＡ免疫ブロット法を用いて、標識されたＤＵＢを検出した。
マントル細胞リンパ腫Ｚ１３８細胞は、ＷＰ１１３０処理の２〜４時間後にＰＡＲＰ開裂を示したことから、ＷＰ１１３０（ＩＣ５０＝約１μＭ）に対して高いアポトーシス感受性を示すことが分かった。ＷＰ１１３０を、マントル細胞腫瘍に対する臨床的な有効性が認められているＡＧ４９０またはボルテゾミブと直接比較することにより、各化合物のアポトーシスの開始および活性における差異を明らかにした。ＷＰ１１３０は、ボルテゾミブと同様に、ＨＥＫ２９３細胞に対しても、他のさまざまな骨髄およびリンパ系起源の腫瘍細胞株に対しても強力な抗増殖特性を示した。
ＷＰ１１３０で処理したＺ１３８細胞の全細胞抽出物（ＷＣＥ）を分析したところ、ユビキチン化タンパク質の顕著な蓄積が濃度依存的に示された。Ｋ５６２、ＭＭ．１Ｓ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３を含む、ＷＰ１１３０で処理した他の細胞においても、タンパク質のユビキチン化の亢進が同様に見られた。ＷＰ１１３０およびプロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブとは対照的に、ＡＧ４９０で処理したＺ１３８細胞においては、より長い時間インキュベートしても、細胞内のタンパク質ユビキチン化における変化は見られなかったことから、ＷＰ１１３０とその親化合物ＡＧ４９０とでは作用機序が異なることが示唆される。
ＷＰ１１３０でインキュベートしたＺ１３８細胞においては、界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分のいずれも、ユビキチン化タンパク質の経時的な蓄積が見られた。ボルテゾミブ処理では、不溶性のユビキチン化タンパク質の有意な蓄積は見られず、８時間処理しても、界面活性剤不溶性画分におけるユビキチン含有量はほとんど変化しなかった。これらの結果より、ＷＰ１１３０で処理した細胞とボルテゾミブで処理した細胞とではタンパク質ユビキチン化の機序および下流エフェクタが異なることが示唆される。プロテアソーム阻害に続いてユビキチン化タンパク質の蓄積が起こる可能性があることから、ＷＰ１１３０の２０Ｓプロテアソーム活性に対する影響を調べた。ＷＰ１１３０でインキュベート（５μＭ、２時間）した場合、プロテアソームキモトリプシン様活性の有意な低下はインビボ（ｐ値＞０．０７）でもインビトロ（ｐ値＞０．７８）でも見られなかった。一方、ＭＧ−１３２（公知のプロテアソーム阻害剤）は、いずれのアッセイにおいてもプロテアソーム活性を大幅に阻害した。これらの結果より、ＷＰ１１３０は、ＭＧ−１３２またはボルテゾミブと異なり、２０Ｓプロテアソームの活性を直接阻害するものではないことが示唆される。また、酸化ストレスもユビキチン化タンパク質の蓄積に関与すると考えられているが、ＷＰ１１３０で処理した細胞においては、活性酸素種の生成量の増加は見られなかった。
ＷＰ１１３０に応答して蓄積するユビキチンの結合様式をさらに明確にするために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ユビキチン（ＷＴ／Ｋ４８のみ／Ｋ６３のみ）のＨＡ標識変異体を発現するプラスミドをトランスフェクションした。ＨＥＫ２９３Ｔ形質移入体をＷＰ１１３０で処理したところ、Ｋ４８結合型ポリユビキチン鎖を含有するユビキチン化タンパク質も、Ｋ６３結合型ポリユビキチン鎖を含有するユビキチン化タンパク質も蓄積量が増加した。プロテアソーム阻害では、Ｋ４８結合型ユビキチン鎖を含有するタンパク質の蓄積は促進されるが、Ｋ６３結合型ユビキチン鎖に対しては限定的な影響しか見られない。
アグリソーム形成−ユビキチン化タンパク質の不溶性凝集体は、一般に、アグリソームと呼ばれる核周囲構造と関わりがある。プロテアソーム阻害、折り畳まれていないタンパク質応答、熱ショック応答または酸化ストレスは、アグリソーム形成を誘導すると考えられる。アグリソームには、ポリユビキチン化タンパク質とともに、ＨＳＰ９０／７０、２０ＳプロテアソームおよびＨＤＡＣ６が豊富に含まれる。ＷＰ１１３０処理細胞においては、ユビキチン化タンパク質が界面活性剤不溶性画分へと速やかに蓄積されることから、細胞内分画を行い、処理後にユビキチン化タンパク質を多く含む細胞内コンパートメントを同定した。すべての細胞内画分において、ユビキチン化タンパク質の含有量に何らかの変化は見られたが、ＷＰ１１３０処理細胞の細胞骨格コンパートメントにおいては、ユビキチン化タンパク質結合体の顕著な蓄積が見られた。この細胞内分画により、ＷＰ１１３０処理後にユビキチン化タンパク質を多く含む細胞骨格画分には、アグリソームマーカータンパク質が存在することが示された。ＷＰ１１３０処理によって正真正銘アグリソームが形成されることを確認するために、ＨＥＫ２９３細胞をユビキチン、ＤＡＣ６および２０Ｓプロテアソームなどの主要なアグリソームマーカーで染色した。ＷＰ１１３０処理細胞において、ポリユビキチン化タンパク質の核近傍堆積物にアグリソームのマーカーが局在することが示された。
デユビキチナーゼ阻害剤として作用するＷＰ１１３０−細胞内のデユビキチナーゼ阻害により、プロテアソーム阻害が起こらなくても、分子量の大きなユビキチン化タンパク質が増加する可能性がある。Ｚ１３８細胞を５μＭ ＷＰ１１３０で２時間処理したところ、単量体ユビキチンが速やかに減少した後、未結合／遊離のポリユビキチン鎖（Ｕｂ４〜５）レベルが増加した。一方、ボルテゾミブ処理による、遊離ユビキチンまたは未結合のユビキチン鎖のレベルへの有意な影響は見られなかった。この所見により、ＷＰ１１３０はデユビキチナーゼ活性の阻害によりユビキチンのリサイクルを抑制し、ユビキチン化タンパク質の蓄積を誘導し得ることが示唆される。ＷＰ１１３０処理細胞におけるＤＵＢ活性への影響を直接評価するために、対照細胞および処理した細胞の細胞溶解液をユビキチン−ＡＭＣとともにインキュベートし、基質の切断により生成される蛍光をＤＵＢ活性の指標として測定した。Ｚ１３８細胞を、１、２、または４時間、５μＭ ＷＰ１１３０、５０ｎＭ ボルテゾミブ、もしくは１ｍＭ ＮＥＭで処理するか、または処理せず、次いで細胞抽出物（５μｇ）を蛍光発生基質とともにインキュベートした。ＷＰ１１３０処理により、Ｚ−１３８細胞におけるＤＵＢ活性は有意に低下し、４時間で５０％近く低下した（ｐ値＝０．００９５）。興味深いことに、ボルテゾミブで処理した細胞においては、ＤＵＢ活性の変化は全く見られなかったものの、ＮＥＭ（公知のＤＵＢ阻害剤）処理では、細胞内のＤＵＢ活性が１時間で８０％低下した。
精製したＫ４８結合型またはＫ６３結合型ポリユビキチン鎖のインビトロ脱ユビキチン化／分解に対する、ＷＰ１１３０処理の効果を調べた。ＷＰ１１３０で処理（２時間）した細胞または非処理の細胞の溶解液を、１μｇの未結合のポリユビキチン鎖とともに３７℃で５、１０および１５分間インキュベートした。非処理の細胞の溶解液では、ポリユビキチン鎖がほぼ完全に分解したが、ＷＰ１１３０処理細胞の溶解液では、限定的な分解しか見られなかった。ＷＰ１１３０処理細胞の溶解液において、Ｋ４８結合型およびＫ６３結合型ポリユビキチン鎖のいずれも分解が阻害されたことは、ＷＰ１１３０処理により、両方のユビキチン結合様式の蓄積量が増加するという上述の所見とも一致する。これらの結果より、ＷＰ１１３０処理によって、Ｋ４８特異的ユビキチン結合およびＫ６３特異的ユビキチン結合の分解にそれぞれ必要とされる細胞内のＤＵＢ酵素が阻害されることが示唆される。
インビトロにおけるＷＰ１１３０のデユビキチナーゼ酵素阻害−血球凝集素標識ユビキチンビニルメチルスルホン（ＨＡ−ＵｂＶｓ）は、ＤＵＢ自殺基質として作用し、活性ＤＵＢ酵素と共有結合して付加物を形成する。種々の細胞において先に示したように、抗ＨＡ抗体を用いたＨＡブロット法により、特定の細胞内ＤＵＢを同定することができる。特定のＤＵＢの活性変化は、対照細胞および処理した細胞の溶解液におけるＨＡ標識量をモニタすることによって測定することができる。Ｚ１３８細胞を、ＷＰ１１３０（１、５、または１０μＭ）またはＡＧ４９０（２５０μＭ）で１時間処理して、溶解した。２０μｇの清澄化上清を２００ｎＭのＨＡ−ＵｂＶＳとともに３７℃で１時間インキュベートした。ＷＰ１１３０処理細胞では、ＵＳＰ９ｘ、ＵＳＰ５、ＵＳＰ１４およびＵＣＨ３７を示すＤＵＢに対する標識量が用量依存的かつ経時的に減少した。これとは対照的に、ＡＧ４９０で処理した細胞においては、ＤＵＢに対する標識量に全く変化は見られなかった。これにより、親分子であるチロホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）とＷＰ１１３０とでは活性および作用機序が異なることが確認された。ＷＰ１１３０による直接的なＤＵＢ阻害を確認するために、細胞溶解液を用いてインビトロ分析を行った。簡単に説明すると、非処理のＺ１３８細胞溶解液をビヒクル単独または５μＭ ＷＰ１１３０とともに３７℃で１時間インキュベートした後、ＨＡ−ＵｂＶｓで標識した。細胞溶解液をＷＰ１１３０とともにインキュベートした場合、細胞をＷＰ１１３０で処理した場合と同種のＤＵＢにおいて、ＨＡ標識量が減少することが示された。これにより、ＷＰ１１３０はＤＵＢを直接阻害することが示唆された。
ＷＰ１１３０がＤＵＢ活性を直接阻害するかどうかを確認するために、ＵＳＰ５、ＵＣＨ−Ｌ１およびＵＣＨ−Ｌ３などの精製ＤＵＢをビヒクル単独またはＷＰ１１３０とともに、ＤＵＢ緩衝液中、３７℃で３０分間インキュベートした。ＵＳＰ９ｘをＺ１３８細胞溶解液から免疫沈降させて、ＤＵＢ緩衝液で調製し、ＵＳＰ９ｘ結合ビーズをビヒクル単独またはＷＰ１１３０とともに３０分間インキュベートした。Ｕｂ−ＡＭＣ（５００ｎＭ）を各反応液に加え、蛍光量を３０分間にわたって毎分モニタした。対照ＤＵＢおよびＷＰ１１３０処理ＤＵＢによる基質の切断において直線性領域の終点で観察された最大蛍光をＤＵＢ活性および％阻害を推定するための指標として使用した。５μＭ ＷＰ１１３０処理により、ＵＳＰ９ｘ、ＵＳＰ５およびＵＣＨ−Ｌ１の活性は８０％以上低下したが、ＵＣＨ−Ｌ３活性に対しては全く阻害が見られなかったことから、ＷＰ１１３０は部分的な選択性を有することが示唆される。ＨＡ−ＵｂＶｓ標識によってもＵＳＰ５活性の阻害が確認され、ＷＰ１１３０とのインキュベーションにより、ＨＡ標識量は約８０％減少することが示された。
ＤＵＢによるアポトーシス促進タンパク質レベルおよび抗アポトーシスタンパク質レベルの調節−ＵＳＰ５は、未結合のポリユビキチン鎖のレベルの維持に大きな役割を果たすことが知られている。ＵＳＰ５の阻害によって、ユビキチン化ｐ５３と競合する遊離ポリユビキチン鎖が蓄積することにより、ｐ５３が安定化することが報告されている。また、リンパ腫および他の腫瘍におけるＭＣＬ−１とＵＳＰ９ｘのレベルの増加には正の相関がある。ＵＳＰ９ｘをｓｉＲＮＡでノックダウンしたところ、腫瘍細胞のＭＣＬ−１が速やかに分解され、アポトーシス刺激に対する感受性が増大した。
ＷＰ１１３０処理によって、ｐ５３タンパク質レベルの増大が観察された。Ｚ１３８細胞をシクロヘキシミド（５０μｇ／ｍＬ）およびＷＰ１１３０で同時処理したところ、ｐ５３タンパク質の誘導というよりも該タンパク質の安定化が確認された。さらに、ＷＰ１１３０処理によりＭＣＬ−１レベルの速やかな低下も観察された。ＭＣＬ−１レベルの調節におけるＵＳＰ９ｘの役割、およびｐ５３レベルの調節におけるＵＳＰ５の役割を再確認するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＵＳＰ９ｘおよびＵＳＰ５をｓｉＲＮＡでノックダウンした。ＵＳＰ９ｘの阻害によりＭＣＬ−１レベルは約５０％減少し、ＵＳＰ５の阻害によりｐ５３レベルは約２倍に増加した。これらの結果より、ＷＰ１１３０は細胞内のＤＵＢ活性を選択的に阻害することにより、抗アポトーシスタンパク質の安定性も、アポトーシス促進タンパク質の安定性も調節することが示された。
ＷＰ１１３０のＤＵＢ阻害により誘導されるアポトーシス−ＷＰ１１３０は、ＤＵＢの活性部位に存在するシステインのスルフヒドリル基（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）とマイケル付加反応により相互作用するとされているα，β−不飽和カルボニル基（例えば、Ｓｔｒａｕｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２１：１８５−２１０ （２００１）を参照）を含有する。ＡＧ４９０にも同様のカルボニル基は存在するが、ＡＧ４９０では細胞における明確なＤＵＢ阻害活性は見られない。Ｚ１３８細胞を、１ｍＭ ＤＴＴの存在下および非存在下にて、ＷＰ１１３０（０．３〜５μＭ）とともにインキュベートした。興味深いことに、ＤＴＴの存在下では、ＷＰ１１３０によるアポトーシス誘導および抗増殖作用が完全に阻止された。この所見は、ＷＰ１１３０によるユビキチン化の誘導およびＤＵＢ阻害がＤＴＴの存在下で阻止されることに関係する。ＷＰ１１３０によるアポトーシス誘導およびＤＵＢ阻害活性がＤＴＴの存在下で阻止されることから、ＷＰ１１３０による活性ＤＵＢの抑制はＷＰ１１３０のアポトーシス作用の直接の原因であることが示唆される。
ＷＰ１０５１およびＷＰ１０５２は、初期に開発されたＷＰ１１３０の２つの化学的類似体である。ＷＰ１０５１は腫瘍細胞の増殖抑制に効果的であった（ただし用量はＷＰ１１３０より高い）が、ＷＰ１０５２は、抗腫瘍特性を全く示さなかった。このことは、ＷＰ１０５１およびＷＰ１０５２が化学的には同一で構造的に異なる異性体であるため、予想外であった。ＷＰ１１３０のアポトーシス特性／抗増殖特性は、細胞内のＤＵＢを抑制し、ユビキチン化タンパク質の蓄積を誘導する能力に関係する。そこで、ＷＰ１０５１およびＷＰ１０５２がタンパク質のユビキチン化およびＤＵＢ活性に影響を与え得るかどうかを調べた。Ｚ１３８細胞を指示濃度のＷＰ１０５１およびＷＰ１０５２で処理したところ、ＷＰ１０５１はユビキチン化タンパク質の蓄積を用量依存的に誘導したが、ＷＰ１０５２はユビキチン化タンパク質に対して全く影響を与えなかった。ＷＰ１０５１またはＷＰ１０５２で処理した細胞の溶解液におけるＤＵＢ標識プロファイルを調べた結果、ＷＰ１０５１はＵＳＰ９ｘに対応するＤＵＢの活性を抑制したが、ＷＰ１０５２はＤＵＢ阻害を全く示さなかった。これらの結果より、このクラスの化合物のＤＵＢ阻害によって正確な化学構造活性相関が示されることが分かった。
ＤＵＢ阻害剤の抗ウイルス活性
ＭＮＶは、初代培養または株化のマウスマクロファージおよびマウス樹状細胞において容易に複製する。ＭＮＶ侵入阻害剤を同定することを目的として、関与する特定のキナーゼについて調査が進められた結果、Ｊａｋ２キナーゼ輸送の誘導物質であるＷＰ１１３０ならびに化学的に関連する化合物ＷＰ１０５１およびＷＰ１０５２が得られた。
ＭＮＶ−１に感染させたＲＡＷ２６４．７細胞をＷＰ１１３０またはＷＰ１０５１で前処理したところ、細胞生存率には影響はなかったが、感染から８および１２時間（ｈｐｉ）後のウイルス力価は低下した。構造的に関連するＷＰ１０５２による前処理ではウイルス力価の低下は見られなかった。ＲＡＷ２６４．７細胞を播種し、一晩放置して付着させた。翌日、培養培地を吸引し、阻害剤（５μＭ ＷＰ１１３０、２０μＭ ＷＰ１０５２、または２０μＭ ＷＰ１０５１）またはＤＭＳＯビヒクル対照（処理なし）を含有する培地に置き換えた。プレインキュベーションを３７℃で３０分間行った後、細胞を氷上にてＭＮＶ−１（ＭＯＩ＝５）に感染させた。ウイルスを除去し、化合物を再度加え、８または１２時間静置した。ウイルス力価はプラークアッセイにより求めた。細胞生存率をＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定したところ、８０％超を維持していた。このＭＮＶ−１感染抑制レベル（対数減少率：約２）は、高用量のＩＦＮα（１０００Ｕ／ｍｌ）（非常に強力な公知の抗ウイルス性分子）で前処理したＲＡＷ２６４．７細胞で見られる抑制レベルと同等である。ＭＮＶ−１のライフサイクルは、９〜１２時間であると推定される。
レプリコン系におけるＷＰ１１３０によるノーウォークウイルス（ＮＶ）複製の抑制
ヒトノロウイルス（ノーウォークウイルスを含む）感染の研究に現在利用できる確立された細胞培養系はない。したがって、細胞におけるＮＶ複製を研究し、取扱いに細心の注意を要するヒトノロウイルスに対する抗ウイルス剤を同定するために、ＮＶレプリコンを有する細胞を開発した。簡単に説明すると、ＮＶのＲＮＡゲノムのｃＤＮＡコンセンサス配列（クローニングしたもの）を含有するプラスミドＮＶ１０１を、主要なカプシドタンパク質であるＯＲＦ２内にネオマイシン耐性遺伝子をコードするように作製した。得られたプラスミドをｐＮＶ−Ｎｅｏと名付けた。ｐＮＶ−Ｎｅｏから得られたＲＮＡ転写産物をＨｕｈ−７にトランスフェクションした。Ｇ４１８の存在下で生細胞コロニーを選択し、ＨＧ２３細胞と名付けた。全長ゲノムおよびサブゲノムＮＶ ＲＮＡ種（センスおよびアンチセンス）の発現ならびに非構造性タンパク質の発現を、ノーザンブロット分析、免疫蛍光アッセイおよびウエスタンブロット分析によりそれぞれ確認した。このレプリコンを有する細胞を用いて、ＷＰ１１３０の抗ＮＶ作用について調べた。すなわち、ＨＧ２３細胞を５μＭ ＷＰ１１３０で処理して、ＷＰ１１３０のＮＶ複製に対する作用を調べた。この実験において、強力な抗ウイルス性分子であるインターフェロン（ＩＦＮ）−αを陽性対照として使用した。４８時間処理した後に、ＮＶゲノムをｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。全ＲＮＡを調製して定量的リアルタイムＰＣＲに供し、ＮＶゲノムおよびβ−アクチンを検出した。阻害剤によるＮＶゲノムの減少率は、偽処理（ｍｏｃｋ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のものを基準として算出し、次いで、各ゲノムレベルをβ−アクチンレベルで標準化した。ＷＰ１１３０のＨＧ２３細胞に対する非特異的な細胞毒性作用は、細胞毒性アッセイキット（ＡｎａＳｐｅｃ、サンノゼ、ＣＡ）を用いてモニタした。ＨＧ２３細胞において、ＷＰ１１３０は５μＭで有意な抗ＮＶ作用を示し、これはＩＦＮαと同等レベルであった。しかし、１０μＭより高い濃度では、化合物による細胞毒性がＨＧ２３細胞において観察された。このように、ＷＰ１１３０は、抗ウイルス剤が現在利用可能でないマウスノロウイルスおよびヒトノロウイルスに対して抗ウイルス活性を有する。
広い抗ウイルス活性を有するＷＰ１１３０
ＷＰ１１３０がノロウイルスの複製を阻害するというデータに基づき、より広範囲のウイルスに対しても抗ウイルス活性を示すかどうかを調べた。ＲＮＡゲノムを有するウイルス群を対象にしたところ、ＷＰ１１３０は脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、シンドビスウイルス（ＳｉＮＶ）、ラクロスウイルス（ＬａＣＶ）の感染を阻止し、水疱性口内炎（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）（ＶＳＶ）の感染は阻止しないことが分かった。ＥＭＣＶは、カリシウイルス科（ノロウイルスを含む）に最も近縁のピコルナウイルス科に属する（＋）センスＲＮＡウイルスである。シンドビスウイルスは、トガウイルス科（南北アメリカに見られる東部／西部／ベネズエラ馬脳炎ウイルスに関連する科）に属する（＋）センスＲＮＡウイルスである。カテゴリーＢのラクロスウイルスおよび水疱性口内炎は、それぞれブニヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス）およびラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス）に属する（−）センスゲノムを有するＲＮＡウイルスである。ウイルスゲノムの極性がＷＰ１１３０の有効性を決定づけているようには見えないが、このデータより、ＷＰ１１３０が広い抗ウイルス作用を有することが示された。さらに重要なことに、ＷＰ１１３０は、カテゴリーＡ（ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、Ｂ（東部／西部／ベネズエラ馬脳炎ウイルス）、およびＣ（狂犬病、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス）に属する病原体を含む科のウイルスに対しても活性を有する。
ＷＰ１１３０の抗細菌活性
リステリア・モノサイトゲネスは、該細菌で汚染された食品の摂取により死に至る可能性のあるリステリア症を起こすグラム陽性桿状細菌である。リステリア・モノサイトゲネスは、マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７などの非食細胞および食細胞に感染する通性の細胞内病原体である。細菌は食胞から逃避して細胞内複製を始める。細胞内でこのようなライフサイクルを示すことから、この食物媒介病原体に対するＷＰ１１３０の有効性について試験を行った。マウスマクロファージをＬ．モノサイトゲネスに感染させる前にＷＰ１１３０で前処理するか、または対照として感染後にこの化合物で処理した。ＲＡＷ２６４．７細胞を播種し、一晩放置して付着させた。翌日、培養培地を吸引し、５μＭ ＷＰ１１３０またはＤＭＳＯビヒクル対照を含有する培地に置き換えた。プレインキュベーションを３７℃で３０分間行った後、細胞をＬ．モノサイトゲネス株１０４０３Ｓ（ＭＯＩ＝１）と３７℃で３０分間接触させて感染させた。細胞をＰＢＳおよび１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する培地で３回洗浄し、ＷＰ１１３０を細胞に再度加えた。後処理に関しては、感染後１時間経ってからＷＰ１１３０を加えた。感染から８時間後に、ＲＡＷ２６４．７細胞を滅菌水中で溶解し、細菌を増殖培地プレートに接種した。これを３７℃で２４時間インキュベートした後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を求めて、ビヒクル対照に対して標準化した。細胞生存率をＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定したところ、８０％超を維持していた。細胞をＷＰ１１３０で前処理すると、ビヒクル対照群または後処理群と比べて、増殖した細菌は有意に少なかった。興味深いことに、感染から１時間後にＷＰ１１３０で処理した場合は、コロニー形成単位の低下は見られなかった。このことは、この化合物がリステリアのライフサイクルの早い段階で作用していることを示す。これらのデータより、ＷＰ１１３０は、抗ウイルス活性に加えて抗細菌性を有することが分かる。したがって、ＷＰ１１３０は、広いスペクトルを有する抗菌剤として優れた候補化合物であると言える。
ＷＰ１１３０の抗寄生体活性
トキソプラズマ・ゴンヂは、寄生性原生動物に属する原虫であり、トキソプラズマ症の原因病原体である。トキソプラズマ症を予防および治療する現在の薬物療法は、効果が限定的であるとともに重篤な副作用を引き起こす可能性もある。Ｔ・ゴンヂは、ほとんどすべての有核細胞に感染する偏性細胞内病原体である。この寄生体は、タキゾイトとブラディゾイトという２つの形態を有する。半数体であるタキゾイトは、急速に分裂し、可逆的に潜伏性のブラディゾイトとなって、慢性感染の特徴とされる細胞内組織嚢胞を形成する。感染中、トキソプラズマは、寄生体胞（ｐａｒａｓｉｔｏｐｈｏｒｏｕｓ ｖａｃｕｏｌｅ）と呼ばれる細胞内コンパートメントを形成し、これを宿主細胞の機能を調節するためのプラットホームとして利用する。そこで、ＷＰ１１３０の抗寄生体機能について試験を行った。
初代培養ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）をＷＰ１１３０またはビヒクル対照の存在下で２４時間タキゾイトに感染させた。ＨＦＦ細胞を播種し、一晩放置して付着させた。翌日、培養培地を吸引し、５μＭ ＷＰ１１３０またはＤＭＳＯビヒクル対照を含有する培地に置き換えた。ＷＰ１１３０またはビヒクル対照存在下、１．２５×１０５のタキゾイト（ＲＨ株）（ＭＯＩ＝１）をチャンバースライドの各ウェルに加えた。感染から２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて１５分間固定した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、免疫蛍光顕微鏡法により分析した。抗ＳＡＧ１抗体（Ｔ・ゴンヂの免疫優勢表面抗原（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｇｉｇｅｎ））で寄生体を染色した後、Ａｌｅｘａ５９４標識２次抗体およびＤＡＰＩで染色した。液胞中の寄生体数を計数して、定量分析を行った。感染細胞の免疫蛍光分析により、ＷＰ１１３０は液胞当たりの寄生体数を有意に減少させることが示され、よってＷＰ１１３０は寄生体の複製を阻害することが実証された。これらのデータより、ＷＰ１１３０は、複数の異なる種類の細胞（初代培養細胞を含む）で、広範囲の病原体に対して抗菌活性を示すことが示された。
ＷＰ１１３０誘導体の抗ウイルス活性
ＲＡＷ２６４．７細胞またはスイスウェブスター（Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウス由来の初代培養骨髄由来マクロファージを播種し、一晩放置して付着させた。翌日、培養培地を吸引し、阻害剤（５μＭ ＷＰ１１３０または５μＭ ＷＰＤＴＴ）またはＤＭＳＯ（ビヒクル対照）を含有する培地に置き換えた。抗ウイルス作用を有する陽性対照として、ＩＦＮ−βで細胞を処理した。プレインキュベーションを３７℃で３０分間行った後、細胞を氷上にてＭＮＶ−１（ＭＯＩ＝５）に感染させた。ウイルスを除去し、化合物を再度加え、８または１２時間静置した。ＷＰＤＴＴによっても、ＷＰ１１３０と同様にウイルス力価の低下が見られた。
宿主に対して細胞毒性を示さないＷＰ１１３０の抗ウイルス活性
ＲＡＷ２６４．７細胞を、ＭＮＶ−１に感染させる前に、濃度が異なるＷＰ１１３０で前処理した。感染後１２時間の時点で、各濃度におけるウイルス力価および細胞生存率（ＷＳＴ−１生存率アッセイ、Ｒｏｃｈｅ）を比較した。抗ウイルス活性を示すＥＣ５０は１．９μＭと推定され、生存率に対するＩＣ５０は７．６μＭと推定された。これらの値から治療指数を約４．０と算出した。
ＷＰ１１３０によるタンパク質ユビキチン化の亢進およびＵｓｐ９ｘ対応ＤＵＢ活性の抑制
ＲＡＷ２６４．７細胞を５μＭ ＷＰ１１３０で２時間処理した後、等量のタンパク質を含有する細胞溶解液（２０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質を分離し、抗ユビキチン抗体を用いた免疫ブロット法によりユビキチン化タンパク質のレベルを調べた。ＲＡＷ２６４．７細胞を５μＭ ＷＰ１１３０またはビヒクル単独（対照）とともに２時間インキュベートした後、細胞溶解液を調製し、ＨＡ−ＵｂＶＳ（２００ｎｇ）とともにさらに１時間インキュベートした後、ＨＡブロット法によりＤＵＢ活性を検出した。次いで、同じ膜を用いて、Ｕｓｐ９ｘについてもブロットを行った。その結果、ＲＡＷ２６４．７細胞をＷＰ１１３０でインキュベートすることによりＵｓｐ９ｘが阻害されることが示された。また、ＨＥＫ２９３溶解液に対しても、Ｕｓｐ９ｘについて免疫ブロットを行った。
ＭＮＶ−１感染により誘導されるＤＵＢ活性のＷＰ１１３０による阻害
ＲＡＷ２６４．７細胞を非処理のままにするか、または指示濃度のＷＰ１１３０で２時間処理し、次いで、細胞を偽感染させるか、またはＭＮＶ−１に感染させた（ＭＯＩ＝５）。細胞を３７℃でさらに２時間インキュベートした後、細胞溶解液を調製し、ＨＡ−ＵｂＶＳ（２００ｎｇ）とともにさらに１時間インキュベートした後、ＨＡブロット法によりＤＵＢ活性を検出した。ＭＮＶ−１感染により、複数種のＤＵＢの活性が増大した。また、抗ウイルス作用を示すのに有効な濃度のＷＰ１１３０を使用した場合、ＭＮＶ−１感染によって誘導されるＤＵＢ活性が抑制されることが分かった。これより低い濃度のＷＰ１１３０（１．２５μＭ）は、ＭＮＶ−１の阻害にも、ＭＮＶ−１感染に伴うＤＵＢ活性化の阻害にも効果的ではなかった。これらの結果より、ＷＰ１１３０の抗ウイルス活性は、ＭＮＶ−１感染によって誘導されるＤＵＢ活性化の阻害に関わることが示唆される。
化学合成経路
本明細書で開示する化合物は、熟練した通常の化学者が容易に利用可能な任意の手段によって調製することができる。これらの化合物の一部について合成経路の例を以下のスキームに示す。当業者であれば、これらの合成スキームを容易に改変して本明細書に記載の化合物に到達することができるだろう。
１−（４−（メトキシメトキシ）−フェニル）ブタン−１−オン（２）。五酸化リン（２１．６ｇ、１５２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１８０ｍＬ）中にメチラール（４１．７ｇ、５４８ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシブチロフェノン（１；５．０ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に、窒素雰囲気下、室温で加えた。４８時間後、反応液を約５００ｍＬの氷冷した２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に加え、十分に撹拌した。水層を反応フラスコに再導入して暗色のスラッジ状残渣と反応させ（気体の発生）、次いでワークアップ（ｗｏｒｋｕｐ）反応液と再度合わせた。十分に混合した後、そのまま放置して層を分離させた。有機層を分取し、水層を少量のジクロロメタンを用いて抽出した。抽出液を合わせて、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、５．７ｇの透明な琥珀色油状物を得た。これをシリカゲルカラム（３５×７５ｍｍ）を用いたフラッシュクロマトグラフィに供して、Ｈｘａ／ＥｔＯＡｃ／アセトン ８：１：１を用いて溶出し、４．１ｇ（６５％）の薄い膜状の無色透明の油状物（ＴＬＣにて単一スポットを示した、Ｒｆ＝０．４０）と、１ｇのやや純度の低い透明な黄色油状物とを得た。
１−（４−（メトキシメトキシ）フェニル）ブタン−１−オンオキシム（３）。塩酸ヒドロキシルアミン（２．７ｇ、３９．４ｍｍｏｌ）を、エタノール（３０ｍＬ）中に１−（４−（メトキシメトキシ）−フェニル）ブタン−１−オン（４．１ｇ、１９．７ｍｍｏｌ）およびピリジン（９４．６７ｇ、５９．１ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に加えて、１．５時間加熱還流し、そのまま放置して冷却した。エタノールの大部分を減圧濃縮により留去し、残渣に水とジクロロメタンとを加えて液液分配を行った。層を分離し、水相をジクロロメタンを用いて２回抽出した。抽出液を合わせて水で２回洗浄し、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、５．１ｇのやや不透明な無色の粘性液体を得た。これをシリカゲルカラム（５０×７０ｍｍ）を用いたフラッシュクロマトグラフィに供して、Ｈｘａ／ＥｔＯＡｃ／アセトン ８：１：１を用いて溶出し、３．４ｇ（７７％）の雪白色の結晶性固体を得た（ｍｐ ７４〜７６℃）。
１−（４−（メトキシメトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（４）。テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中に１−（４−（メトキシメトキシ）フェニル）ブタン−１−オンオキシム（３．４ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）を含む溶液を、テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中に水素化リチウムアルミニウム（１．８３ｇ、４５．７ｍｍｏｌ）を撹拌させた懸濁液に、窒素雰囲気下、室温で滴下した。気体の発生が止まってから、反応液を徐々に加熱して還流した。７時間加熱還流した後、反応液をそのまま放置して冷却し、さらに１．０ｇの水素化リチウムアルミニウムを反応液に加えた。これを４時間加熱還流した後、再度そのまま放置して冷却した。さらに０．２ｇの水素化リチウムアルミニウムを加えて１時間加熱還流した後、そのまま放置して冷却した。３ｍＬの水を滴下した後、３ｍＬの１５％水酸化ナトリウム水溶液、次いで９ｍＬの水を加えた。析出物が十分に粒状になるまで撹拌した後、反応液をろ過し、残渣をテトラヒドロフランで２回洗浄した。ろ液／洗浄液を減圧濃縮して得られた残渣をジクロロメタンに溶解し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、残渣として２．９ｇの淡紫色の粘性液体を得た。これをシリカゲルカラム（５０×９０ｍｍ）を用いたフラッシュクロマトグラフィに供して、Ｈｘａ／ＥｔＯＡｃ／アセトン ８：１：１を用いて溶出し、透明な黄金色の油状物として０．４ｇの純粋な生成物を得るとともに、１．４ｇ（合計で５７％）のやや純度の低い物質を得た。
２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（メトキシメトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（５）。塩化オキサリル（１．０３ｇ、８．１５ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）中にシアノ酢酸（０．６７ｇ、７．９ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液（１〜２滴のＤＭＦを加えたもの）に、窒素雰囲気下、氷浴温度で滴下した。反応液を１時間撹拌し、次いで一部を、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中に１−（４−（メトキシメトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（１．１ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に、窒素雰囲気下、氷浴温度でゆっくりと加えた。反応液をそのまま放置して徐々に室温に戻し、２０時間後に、５０ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム水溶液に加えて撹拌し、ジクロロメタンを用いて３回抽出した。抽出液を合わせて飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させて、減圧濃縮し、１．５ｇの暗紫色の粘性液体を得た。これをシリカゲル（４３〜６０μｍ）カラム（５０×７０ｍｍ）を用いたフラッシュクロマトグラフィに供して、Ｈｘａ／ＥｔＯＡｃ １：１を用いて溶出し、１．０ｇ（６９％）の透明な暗色油状物を得た（ＴＬＣにて単一スポットを示した）。
（Ｅ）−３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（メトキシメトキシ）フェニル）ブチル）アクリルアミド（６）。β−アラニン（１．４２ｇ、１６ｍｍｏｌ）および６−ブロモピリジン−２−カルボキシアルデヒド（７４４ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を順次、エタノール／水（２８ｍＬ／１７ｍＬ）中に２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（メトキシメトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（２７６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に室温で加えた。７２時間後、ＴＬＣ（２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンにおいて）を実施し、これにより単一の生成物と複数の出発物質の存在が確認された。反応液に重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチルとを加えて液液分配を行った。分離した有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して淡琥珀色の油状物（８３０ｍｇ）を粗生成物として得た。この粗生成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製し、標題化合物を黄色油状物（２５３ｍｇ）として５７％の収率で得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.59 (dd, J = 7.9, 7.5 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.82 (s, 1H), 5.19 (s, 2H), 3.85 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 3.49 (s, 3H), 1.67 (m, 2H), 1.39 (m, 2H), 0.94 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 質量スペクトルES+; m/z = 444.0 (m + 1) および 466.0 (m + Na+).
（Ｅ）−３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−ヒドロキシフェニル）ブチル）アクリルアミド（７）。３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（メトキシメトキシ）フェニル）ブチル）アクリルアミド（１４ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）をＨＣｌ／ＭｅＯＨ（１．２５Ｍ、２ｍＬ）に溶解し、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンにおいて）により、単一の生成物の存在が確認された。反応液に重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチルとを加えて液液分配を行った。分離した有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して淡琥珀色の固体（２０ｍｇ）を粗生成物として得た。この粗生成物を分取ＴＬＣにより精製し、標題化合物を淡黄色固体（１２ｍｇ）として９５％の収率で得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 7.55 (dd, J = 7.8, 7.5 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 6.78 (s, 1H), 6.68 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 3.78 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 1.62 (m, 2H), 1.34 (m, 2H), 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H). 1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 161.9, 157.2, 151.4, 142.0, 140.8, 139.0, 131.9, 129.4, 128.9, 124.5, 116.5, 115.8, 115.2, 49.5, 29.2, 20.09, 13.7; 質量スペクトルES+; m/z = 422 (m + Ma+)；mp （195℃で分解開始）．元素分析：C = 56.73 %, H = 4.51 %, N = 10.33 %. (calc: C = 57.01 %, H = 4.53 %, N = 10.50 %)．
３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−メトキシフェニル）ブチル）アクリルアミド（８および９）：アセトン中に３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−ヒドロキシフェニル）ブチル）アクリルアミド（２１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を含む溶液に、ＭｅＩ（３２．６μＬ、０．５２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム粉末（７．２５ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で４時間撹拌した後、酢酸エチルを加えた。次いで、有機層を水（１回）と、飽和食塩水（１回）とで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して黄色油状物を粗生成物として得た。この粗生成物を分取ＴＬＣプレートを用いて精製し、（Ｅ）−３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−メトキシフェニル）ブチル）アクリルアミド（８）を淡黄色固体（９．２ｍｇ、４２％収率）として、および（Ｚ）−３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−メトキシフェニル）ブチル）アクリルアミド（９）を白色固体（４．４ｍｇ、２０％収率）として得た。質量スペクトルＥＳ＋、ｍ／ｚ＝４１４．０（ｍ＋Ｈ＋）。Ｅ−異性体（８）：1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 7.59 (t, J = 7.7, 1H), 7.52 (d, J = 8.0, 1H), 7.27 (d, J = 8.7, 2H), 7.22 (d, J = 7.4, 1H), 6.83 (d, J = 8.9, 2H), 6.81 (s, 1H), 3.89 - 3.83 (m, 2H), 3.81 (s, 3H), 1.65 (dd, J = 15.4, 7.9, 2H), 1.39 (dd, J = 15.1, 7.5, 2H), 0.94 (t, J = 7.4, 3H)．Ｚ−異性体（９）：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.83 (s, 1H), 7.79 (d, J = 7.6, 1H), 7.61 (t, J = 7.8, 1H), 7.52 (d, J = 7.9, 1H), 7.15 (d, J = 8.8, 2H), 6.93 (d, J = 8.8, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.84 - 3.79 (m, 2H), 1.57 (dd, J = 14.8, 7.1, 5H), 1.37 (dq, J = 15.0, 7.5, 2H), 0.94 (t, J = 7.4, 3H)．
（Ｅ）−２−シアノ−３−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−Ｎ−（１−（４−（メトキシメトキシ）フェニル）ブチル）アクリルアミド（１０）：β−アラニン（７１．３ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）および１Ｈ−イミダゾール−２−カルボアルデヒド（１９．２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を順次、エタノール／水（２．０ｍＬ／０．８ｍＬ）中に２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（メトキシメトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（５；２７．６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に室温で加えた。７２時間後、ＴＬＣ（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンにおいて）を実施し、これにより単一の生成物の形成が確認された。反応液に重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチルとを加えて液液分配を行った。分離した有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して淡琥珀色油状物（５５ｍｇ）を粗生成物として得た。この粗生成物をカラムクロマトグラフィにより精製し、標題化合物を黄色油状物（２３ｍｇ）として６５％の収率で得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 10.59 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.17 - 7.13 (m, 2H), 7.12 - 7.07 (m, 2H), 5.22 (s, 2H), 3.86 - 3.75 (m, 2H), 3.51 (s, 3H), 1.64 - 1.53 (m, 2H), 1.36 (m, 2H), 0.93 (t, J = 7.3, 3H). 質量スペクトルES+, m/z = 355.1 (m + H+)．
（Ｅ）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−ヒドロキシフェニル）ブチル）−３−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）アクリルアミド（１１）：（Ｅ）−２−シアノ−３−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−Ｎ−（１−（４−（メトキシメトキシ）フェニル）ブチル）アクリルアミド（１４．８ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）をＨＣｌ／ＭｅＯＨ（１．２５Ｍ、２ｍＬ）に溶解し、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣにより、単一の生成物の存在が確認された。反応液に重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチルとを加えて液液分配を行った。分離した有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して淡琥珀色固体（９ｍｇ）を粗生成物として得た。この粗生成物を酢酸エチル／ヘキサンから再結晶化し、標題化合物を淡黄色固体（６ｍｇ）として４６％の収率で得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3/CD3OD) δ 7.84 (m, 1H), 7.28 (m, 1H), 7.18 (s, 1H), 6.99 (d, J = 6.8, 2H), 6.82 (d, J = 7.8, 2H), 3.73 (m, 2H), 1.53 (m, 2H), 1.30 (m, 2H), 0.88 (t, J = 7.1, 3H). 質量スペクトルES+, m/z = 311.1 (m + H+)．
１−（４−（２−メトキシエトキシ）フェニル）プロパン−１−オン（１３）：炭酸セシウム（５．７ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（２５ｍＬ）中に４−ヒドロキシプロピオフェノン（１２；２．５ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に、窒素雰囲気下、室温で加えた後、ブロモメチルメチルエーテル（１．４３ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）を加えた。２０時間後、反応液を２００ｍＬの水に加えて撹拌し、次いで、ジクロロメタンを用いて３回抽出した。抽出液を合わせて、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、３．４ｇの外見上結晶質の淡黄色固体を得た（ｍｐ ３１〜３５℃；質量スペクトルＥＳ＋ ｍ／ｚ＝２０９（ｍ＋１））。
１−（４−（２−メトキシエトキシ）フェニル）プロパン−１−オンオキシム（１４）：塩酸ヒドロキシルアミン（２．２７ｇ、３２．７ｍｍｏｌ）を、エタノール（２５ｍＬ）中に１−（４−（２−メトキシエトキシ）フェニル）プロパン−１−オン（３．４ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）およびピリジン（３．８７ｇ、４９．０ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に加えて、４時間加熱還流し、そのまま放置して冷却した。エタノールの大部分を濃縮により留去し、残渣に水とジクロロメタンとを加えて液液分配を行った。層を分離し、水相をジクロロメタンを用いて２回抽出した。抽出液を合わせて水で２回洗浄し、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を濃縮により留去し、次いで残渣をトルエンに溶解し、再度濃縮した。この操作をもう一度繰り返した後、残渣を減圧乾燥させて、３．５２ｇの生成物をクリーム色の結晶性固体として得た（ｍｐ ７４〜８０℃；質量スペクトルＥＳ＋ ｍ／ｚ＝２２４（ｍ＋１））。
１−（４−（２−メトキシエトキシ）フェニル）プロパン−１−アミン（１５）：テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中に１−（４−（２−メトキシエトキシ）フェニル）プロパン−１−オンオキシム（１．５ｇ、６．７ｍｍｏｌ）を含む溶液を、テトラヒドロフラン（４８ｍＬ）中に水素化リチウムアルミニウム（０．７８ｇ、２０．５５ｍｍｏｌ）を撹拌させた懸濁液に、窒素雰囲気下、室温で滴下した。１８時間後、反応液を３時間還流加熱し、そのまま放置して冷却した。０．８ｍＬの水を滴下した後、０．８ｍＬの１５％水酸化ナトリウム水溶液、次いで２．４ｍＬの水を加えた。数分後、反応液をろ過し、残渣をテトラヒドロフランで２回洗浄した。ろ液および洗浄液を合わせて減圧濃縮し、１．３４ｇの透明な黄金色の油状物を得た。これをシリカゲルカラム（５×１０ｃｍ）を用いたフラッシュクロマトグラフィに供して、Ｈｘａ／ＥｔＯＡｃ／アセトン ８：１：１を用いて溶出し、０．８３ｇの生成物を透明な黄金色の油状物として得た（質量スペクトルＥＳ＋ ｍ／ｚ＝２１０（ｍ＋１））。
２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−メトキシエトキシ）フェニル）プロピル）アセトアミド（１６）：塩化オキサリル（０．１９ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（５ｍＬ）と２滴のジメチルホルムアミドとの混合液中にシアノ酢酸（０．１０７ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に、窒素雰囲気下、氷浴温度で加えた。２時間後、一部の溶液を、テトラヒドロフラン／ジクロロメタン １：１（４ｍＬ）中に１−（４−（２−メトキシエトキシ）フェニル）プロパン−１−アミン（０．２５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．１３ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を含む溶液に０〜５℃で加え、そのまま放置してゆっくりと室温に戻した。４時間後、８０ｍＬの水を加え、３０分以上後に、ジクロロメタン（３０ｍＬ）を加えた。層を分離し、水層をさらにジクロロメタンを用いて抽出した。抽出液を合わせて、１Ｎ重炭酸ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、不透明な琥珀色粘性液体を得た。これをＥｔＯＡｃ／Ｈｘａ １：１に溶解し、シリカゲルの短カラムで加圧下にてろ過した。流出液を減圧濃縮し、０．２４ｇの生成物を不透明な淡琥珀色粘性液体として得た（次の工程に十分な純度であった）。
（Ｅ）−３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−メトキシエトキシ）フェニル）プロピル）−アクリルアミド（１７）：カリウムｔ−ブトキシド（０．０１４ｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）を、ジメチルスルホキシド（１０ｍＬ）中に６−ブロモ−２−ピリジンカルボキシアルデヒド（０．０９４ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）および２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−メトキシエトキシ）−フェニル）プロピル）アセトアミド（０．０７ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に、窒素雰囲気下、室温で加えた。２６時間後、反応液に水を加えて振盪し、次いで酢酸エチルで複数回抽出した。抽出液を合わせて水で洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、０．１０ｇの透明な琥珀色粘性液体を得た。これをシリカゲルカラム（５×１０ｃｍ）を用いたフラッシュクロマトグラフィに供して、ジクロロメタン／ＥｔＯＡｃ（１０：０から徐々に１２：１に変化）を用いて勾配をかけて溶出し、０．０４０ｇの生成物を透明な淡黄色の粘性液体として得た（質量スペクトルＥＳ＋ ｍ／ｚ＝４４４、４６６（ｍ＋１，ｍ＋２３））。
３−（６−ブロモ−ピリジン−２−イル）−２−シアノ−３−（２，３−ジヒドロキシ−４−メルカプト−ブチルスルファニル）−Ｎ−（１−フェニル−ブチル）−プロピオンアミド（１９）：アセトニトリル（６ｍＬ）中にＷＰ１１３０（１８；０．０５ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を含む溶液を、アセトニトリル（１３ｍＬ）中にジチオトレイトール（２ｇ、１３ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に室温で加えた。２０時間後、ＴＬＣ［Ｈｘａ／ＥｔＯＡｃ １：１］を実施し、これにより出発物質が存在せず、単一の生成物が存在することが確認された。反応液を、アセトニトリルを含むシリカゲル短カラムでろ過し、ろ液から溶媒を減圧留去して無色の粘性液体を得た。この粘性液体を酢酸エチルに溶解し、酢酸エチルを含むシリカゲルカラム（３５×７０ｍｍ）を用いたフラッシュクロマトグラフィに供し、透明な黄色油状物（０．０２ｇ）を得た。これを放置すると結晶化が始まった（質量スペクトルＥＳ＋；ｍ／ｚ＝５６０、５６２（ｍ＋２３）および５３８、５４０（ｍ＋１））。
３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノ−３−（（２，３−ジヒドロキシプロピル）チオ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−フェニルブチル）プロパンアミド（２０）。チオグリセロール（４２μＬ、０．５ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（０．５ｍＬ）中にＷＰ１１３０（１９ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に加えて、室温で１７時間撹拌した。反応液に水とジクロロメタンとを加えて液液分配を行った。分離した有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。分取ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル（６：４）を用いて溶出）で精製することにより、２０（２０ｍｇ、８２％）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ４９２．０（Ｍ＋Ｈ）＋）。
１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（２１）。２−（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩（６２４ｍｇ、３．６５ｍｍｏｌ）を、無水アセトン（６ｍＬ）中にｐ−ヒドロキシブチロフェノン（２００ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に加えた後、炭酸カリウム（６６８ｍｇ、４．８４ｍｍｏｌ）を加えて、４８時間加熱還流した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水（２回）および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィに供して、１：１ ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出し、２１（３１５ｍｇ、９８％）を淡黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ２６４．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
１−（４−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（２２）。２−（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩の代わりに、２−（ジメチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩を使用した以外は２１の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗油状物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（１：１ ヘキサン／酢酸エチルから酢酸エチルへの勾配溶出）により精製し、２２（５８０ｍｇ、８１％）を淡黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ２３６．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
１−（４−（２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（２３）。２−（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩の代わりに、１−（２−クロロエチル）ピロリジン塩酸塩を使用したこと以外は２１の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗油状物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（３：１ ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出）により精製し、２３（４５５ｍｇ、８７％）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ２６２．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
１−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（２４）。２−（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩の代わりに、Ｎ−（２−クロロエチル）モルホリン塩酸塩を使用したこと以外は２１の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗油状物が得られた。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ（１：１ ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出）により精製し、２４（５５０ｍｇ、定量的）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ２７８．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２５）。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１５５ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）を、メタノール（２ｍＬ）中に１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（２１；１８６ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）および酢酸アンモニウム（１．６３ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）を懸濁させた液に加えて、４０℃で７２時間加熱した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２回）および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して粗生成物２５（１１０ｍｇ、５９％）を黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ２６５．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。さらなる精製は行わずに、このまま次の工程で使用した。
１−（４−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２６）。１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（２１）の代わりに、１−（４−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（２２）を使用した以外は２５の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより、粗生成物２６（４１０ｍｇ、７３％）を黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ２３７．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
１−（４−（２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２７）。１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（２１）の代わりに、１−（４−（２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（２３）を使用した以外は２５の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより、粗生成物２７（１８８ｍｇ、４５％）を黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ２６３．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
１−（４−（２−モルホリノエトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２８）。１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（２１）の代わりに、１−（４−（２−モルフォリノエトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（２４）を使用した以外は２５の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより、粗生成物２８（３９０ｍｇ、７０％）を淡黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ２７９．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（２９）。ＤＭＦ（２ｍＬ）中にシアノ酢酸（３７ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を含む氷冷溶液に、７−アザ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ；５９ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ；１６５ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；１６７μＬ、０．９５８ｍｍｏｌ）および１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２５；１１５ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１８時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２回）および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して濃黄色の油状物を得た。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（５：９５ メタノール／ジクロロメタンを用いて溶出）で精製することにより、２９（１１６ｍｇ、８０％）を黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ３３２．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（３０）。１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２５）の代わりに、１−（４−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２６）を使用した以外は２９の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（５：９５ メタノール／ジクロロメタンを用いて溶出）により精製し、３０（３２０ｍｇ、６１％）を濃黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ３０４．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（３１）。１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２５）の代わりに、１−（４−（２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２７）を使用した以外は２９の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（５：９５ メタノール／ジクロロメタンを用いて溶出）により精製し、３１（１４０ｍｇ、６０％）を濃黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ３３０．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−モルフォリノエトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（３２）。１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２５）の代わりに、１−（４−（２−モルフォリノエトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２８）を使用した以外は２９の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（メタノール／ジクロロメタンの４：９６混合液を用いて溶出）により精製し、３２（３７０ｍｇ、７６％）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ３４６．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（Ｅ）−３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アクリルアミド（３３）。エタノール（２ｍＬ）中に２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（２９；１１６ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を含む溶液に、β−アラニン（４９９ｍｇ、５．６ｍｍｏｌ）および水（２ｍＬ）を加えた。６−ブロモピコリンアルデヒド（２６０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１８時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２回）および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して固体の粗生成物を得た。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（５：９５ メタノール／ジクロロメタンを用いて溶出）で精製することにより、３３（１４０ｍｇ、８０％）を濃黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ＝４９９．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（Ｅ）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）−３−（６−フルオロピリジン−２−イル）アクリルアミド（３４）。６−ブロモピコリンアルデヒドの代わりに、６−フルオロピコリンアルデヒドを使用した以外は３３の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（４：９６ メタノール／ジクロロメタンを用いて溶出）により精製し、３４（１０５ｍｇ、６１％）を黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ４３９．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（Ｅ）−３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アクリルアミド（３５）。２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（２９）の代わりに、２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）−ブチル）アセトアミド（３０）を使用した以外は３３の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（４：９６ メタノール／ジクロロメタンを用いて溶出）により精製し、３５（１２０ｍｇ、７６％）を黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ４７１．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（Ｅ）−２−シアノ−３−（６−フルオロピリジン−２−イル）−Ｎ−（１−（４−（２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）ブチル）アクリルアミド（３６）。６−ブロモピコリンアルデヒドの代わりに６−フルオロピコリンアルデヒドを使用し、かつ２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（２９）の代わりに２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（３１）を使用した以外は３３の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（４：９６ メタノール／ジクロロメタンを用いて溶出）により精製し、３６（６５ｍｇ、３５％）を淡黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ４３７．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（Ｅ）−２−シアノ−３−（６−フルオロピリジン−２−イル）−Ｎ−（１−（４−（２−モルフォリノエトキシ）フェニル）ブチル）アクリルアミド（３７）。６−ブロモピコリンアルデヒドの代わりに６−フルオロピコリンアルデヒドを使用し、かつ２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（２９）の代わりに２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−モルフォリノエトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（３２）を使用した以外は３３の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（４：９６ メタノール／ジクロロメタンを用いて溶出）により精製し、３７（１３０ｍｇ、７７％）を淡黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ４５３．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（Ｅ）−２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）−３−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）アクリルアミド（３８）。６−ブロモピコリンアルデヒドの代わりに１Ｈ−イミダゾール−２−カルボアルデヒドを使用し、かつ２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（２９）の代わりに２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（３０）を使用した以外は３３の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（８：９２ メタノール／ジクロロメタンを用いて溶出）により精製し、３８（８０ｍｇ、６３％）を淡黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ４５３．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（Ｓ）−２−シアノ−Ｎ−（１−フェニルブチル）アセトアミド（３９）。１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２５）の代わりに、（Ｓ）−１−フェニルブチルアミンを使用した以外は２９の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（７：３ ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出）により精製し、３９（３７５ｍｇ、５８％）を白色固体として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ２１７．１．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（Ｓ，Ｅ）−２−シアノ−３−（６−フルオロピリジン−２−イル）−Ｎ−（１−フェニルブチル）アクリルアミド（４０）。６−ブロモピコリンアルデヒドの代わりに６−フルオロピコリンアルデヒドを使用し、かつ２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（２９）の代わりに（Ｓ）−２−シアノ−Ｎ−（１−フェニルブチル）アセトアミドを使用した以外は３３の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（８：２ ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出）により精製し、４０（１１５ｍｇ、９６％）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ３２４．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（Ｓ，Ｅ）−２−シアノ−３−（６−クロロピリジン−２−イル）−Ｎ−（１−フェニルブチル）アクリルアミド（４１）。６−ブロモピコリンアルデヒドの代わりに６−クロロピコリンアルデヒドを使用し、かつ２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（２９）の代わりに（Ｓ）−２−シアノ−Ｎ−（１−フェニルブチル）アセトアミドを使用した以外は３３の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（８：２ ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出）により精製し、４１（１０５ｍｇ、９５％）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ３４０．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（Ｓ，Ｅ）−２−シアノ−３−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−Ｎ−（１−フェニルブチル）アクリルアミド（４２）。６−ブロモピコリンアルデヒドの代わりに１Ｈ−イミダゾール−２−カルボアルデヒドを使用し、かつ２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（２９）の代わりに（Ｓ）−２−シアノ−Ｎ−（１−フェニルブチル）アセトアミドを使用した以外は３３の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（１：１ ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出）により精製し、４２（９２ｍｇ、９４％）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ２９５．１ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
１−（４−（２−（２−（２−ヨードエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（４３）。２−（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩の代わりに、１，２−ビス−（２−ヨードエチルオキシ）エタンを使用した以外は２１の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（４：１ ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出）により精製し、４３（３．８５ｇ、５２％）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ４０７．０ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（２−（２−（２−（４−ブチリルフェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）イミドジカルボン酸 １，３−ビス−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４４）。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミノジカルボキシレート（３．０５ｇ、１４．０７ｍｍｏｌ）およびカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．５８ｇ、１４．０７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に加えて、１５分間撹拌した後、１−（４−（２−（２−（２−ヨードエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（４３；３．８１ｇ、９．３８ｍｍｏｌ）を加えて、窒素雰囲気下、１８時間撹拌し、次いで２００ｍＬの酢酸エチルに加えた。この溶液を水（２回）および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して液体を得た。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（３：１ ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出）により精製し、４４（２．２７ｇ、４９％）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ４９６．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（２−（２−（２−（４−（１−アミノブチル）フェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）イミドジカルボン酸 １，３−ビス−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４５）。１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−オン（２１）の代わりに、（２−（２−（２−（４−ブチリルフェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）イミドジカルボン酸 １，３−ビス−ｔ−ブチルエステル（４４）を使用した以外は２５の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（酢酸エチルを用いて溶出）により精製し、４５（７３０ｍｇ、７３％）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ４９７．３ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（２−（２−（２−（４−（１−（２−シアノアセトアミド）ブチル）フェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）イミドジカルボン酸 １，３−ビス−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４６）。１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブタン−１−アミン（２５）の代わりに、（２−（２−（２−（４−（１−アミノブチル）フェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）イミドジカルボン酸 １，３−ビス−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４５）を使用した以外は２９の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（３：２ ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出）により精製し、４６（９５ｍｇ、８４％）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ５６４．３ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（Ｅ）−（２−（２−（２−（４−（１−（３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノアクリルアミド）ブチル）フェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）イミドジカルボン酸 １，３−ビス−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４７）。２−シアノ−Ｎ−（１−（４−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）ブチル）アセトアミド（２９）の代わりに、（２−（２−（２−（４−（１−（２−シアノアセトアミド）ブチル）フェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）イミドジカルボン酸 １，３−ビス−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４６）を使用した以外は３３の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（７：３ ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出）により精製し、４７（１０５ｍｇ、８５％）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ７３１．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
Ｎ−（２−（２−（２−（４−（１−（（Ｅ）−３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノアクリルアミド）ブチル）フェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド（４８）。（Ｅ）−（２−（２−（２−（４−（１−（３−（６−ブロモピリジン−２−イル）−２−シアノアクリルアミド）ブチル）フェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）イミドジカルボン酸 １，３−ビス−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４７；１０５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（０．３ｍＬ）の混合物をジクロロメタン（３ｍＬ）に加えて、１．５時間撹拌した。この溶液を濃縮し、残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、Ｄ−ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（４９ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（７５μＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を氷浴温度で加えて、同温度で２時間撹拌し、次いでジクロロメタンと水とを加えて液液分配を行った。有機相を水（２回）および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（７：９３ メタノール／ジクロロメタンを用いて溶出）で精製することにより、４８（５５ｍｇ、５１％）を淡黄色油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ７５７．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（２−（２−（２−（４−（１−（２−（ジエトキシホスホリル）アセトアミド）ブチル）フェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）イミドジカルボン酸 １，３−ビス−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４９）。４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；１９７ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ；３０９ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）の混合物を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中にジエチルホスホノ酢酸（１２９μＬ、０．８０５ｍｍｏｌ）および（２−（２−（２−（４−（１−アミノブチル）フェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）イミドジカルボン酸 １，３−ビス−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４５；４００ｍｇ、０．８０５ｍｍｏｌ）を撹拌させた溶液に加えて、窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌し、次いで１００ｍＬの酢酸エチルに加えた。この溶液を１Ｎ ＨＣｌ水溶液（２回）および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（酢酸エチルを用いて溶出）で精製することにより、４９（５４０ｍｇ、定量的）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ６７５．３ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
（Ｅ）−（２−（２−（２−（４−（１−（３−（６−ブロモピリジン−２−イル）アクリルアミド）ブチル）フェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）イミドジカルボン酸 １，３−ビス−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５０）。テトラヒドロフラン（１．０ｍＬ）中にＮａＨ（５２ｍｇ（鉱油中に６０％含有）、１．３１ｍｍｏｌ）を懸濁させた液に、テトラヒドロフラン（２ｍＬ）中に（２−（２−（２−（４−（１−（２−（ジエトキシホスホリル）アセトアミド）ブチル）フェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）イミドジカルボン酸 １，３−ビス−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４９；２９５ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を含む溶液を氷浴温度で加えて、室温で３０分間撹拌し、次いでテトラヒドロフラン（２ｍＬ）中に６−ブロモピコリンアルデヒド（８１ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を含む液を滴下した。反応液をさらに３０分間撹拌し、次いで水を用いて慎重に急冷した。この溶液を酢酸エチルを用いて抽出し（３回）、有機溶媒による抽出液を合わせて飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（７：３ ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出）で精製することにより、５０（２０５ｍｇ、６７％）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ７０６．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
Ｎ−（２−（２−（２−（４−（１−（（Ｅ）−３−（６−ブロモピリジン−２−イル）アクリルアミド）ブチル）フェノキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド（５１）。シアノアクリルアミド４７の代わりに、アクリルアミド５０を使用した以外は４８の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（７：９３メタノール／ジクロロメタンを用いて溶出）により精製し、５１（５０ｍｇ、定量的）を透明な油状物として得た（ＭＳ（ＥＳ＋） ｍ／ｚ ７３１．２ （Ｍ＋Ｈ）＋）。
ＤＵＢ阻害活性に関する化合物評価
ＣＭＬ、骨髄腫およびマントル細胞リンパ腫の各細胞株を対象として、化合物のＤＵＢ阻害活性およびアポトーシス活性の有無をスクリーニングし、ＷＰ１１３０と比較した。選択した化合物による細胞増殖および生存に対する効果をＷＰ１１３０と比較して表１に示す。例えば、「高感度」な化合物とは、ＷＰ１１３０より高い阻害活性を有する化合物であり、「低感度」な化合物とは、ＷＰ１１３０より低い阻害活性を有する化合物である。また、選択した化合物のＤＵＢ阻害の有無についても、細胞（表２）および細胞より分離したＤＵＢ（Ｕｓｐ９ｘ−ＵＣＨドメイン）酵素調製物（表３）を用いて調べた。これらのアッセイにおいて使用した方法の概要は、例えば、以下の文献に記載されている。Ｋａｐｕｒｉａ， ｅｔ ａｌ．， Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｂｌｏｃｋｓ Ｊａｋ２ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｊａｋ２ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ， ２０１１， ｉｎ ｐｒｅｓｓ； Ｋａｐｕｒｉａ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＷＰ１１３０ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａｇｇｒｅｓｏｍｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２０１０． ７０（２２）： ｐ． ９２６５−７６； Ｓｕｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｃｒ−Ａｂｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｐ９ｘ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｌｏｃｋ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ＣＭＬ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｂｌｏｏｄ， ２０１１． １１７（１１）： ｐ． ３１５１−６２； Ｋａｐｕｒｉａ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ２０１１． ８２（４）： ｐ． ３４１−９； ａｎｄ Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｕｓｚ， ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ Ｂｃｒ／Ａｂｌ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ＷＰ１１３０ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ， ２００７． １０９（８）： ｐ． ３４７０−８．
化合物のウイルス阻害活性
また、表４に示すように、種々のウイルスに対する、化合物の抗ウイルス作用についても調べた。ノーウォークウイルスのゲノム力価の測定は、レプリコン含有細胞株をＷＰ１１３０で２４時間処理した後、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施することにより行った（Ｃｈａｎｇ，Ｓｏｓｎｏｖｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ． ２００６）。その他の実験は以下のように実施した。細胞を５μＭの化合物により３７℃で３０分間前処理した。細胞へのウイルス感染は氷上で１時間行った。次いで、細胞を洗浄して、未結合のウイルスを除去した。細胞を化合物の存在下でさらに８〜１２時間インキュベートした後、ウイルス力価をプラークアッセイにより測定した（Ｗｏｂｕｓ，Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ． ２００４）。
細胞をＷＰ１１３０で前処理（５μＭで３０分間）したところ、プラークアッセイにより求めたウイルス力価は、マウスノロウイルス、ラクロスウイルス、脳心筋炎ウイルス、およびシンドビスウイルスにおいて低下し、２〜２．５の対数減少率を示した。また、レプリコン細胞株において、ヒトノロウイルスであるノーウォークウイルスのゲノム力価は５０％低下することがｑＲＴ−ＰＣＲによって示された。複数の細胞株（マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７、初代培養マウスマクロファージ、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞Ｖｅｒｏ、ヒト神経細胞Ｂｅ２−ｃ、ヒト肝細胞Ｈｕｈ−７細胞）で試験を行った結果、化合物の阻害作用は細胞の種類に依存しないことが分かった。
プラークアッセイにおけるウイルス力価の低下（２〜２．５の対数減少率）は、マウスノロウイルスに感染させたＲＡＷ２６４．７細胞およびラクロスウイルスに感染させたＢｅ２−ｃ細胞において化合物３３を使用した場合にも同様に観察された。
他の化合物については、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるマウスノロウイルス阻害活性に関してのみ、プラークアッセイによる試験を行った。化合物３５、４０および４１により、ウイルス力価の低下が見られ、対数減少率は２であった。これらより作用は弱いが、化合物３８および４２によってもウイルス力価の低下が見られ、対数減少率は０．５であった。
他の化合物については、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるマウスノロウイルス阻害活性に関してのみ、プラークアッセイによる試験を行った。化合物３５、４１、４０、３４および３６により、ウイルス力価の低下が見られ、対数減少率は２であった。これらより作用は弱いが、化合物３７、３８および４２によってもウイルス力価の低下が見られ、化合物３７による対数減少率は１であり、化合物３８および４２による対数減少率は０．５であった。
ビオチン化化合物４８により、プラークアッセイにおけるマウスノロウイルスの力価の低下が見られ、対数減少率は１．５であったが、ビオチン化空プローブ５１においてはマウスノロウイルスの力価の低下は見られなかった。
化合物の真菌類に対する阻害活性
また、ＷＰ１１３０は、初代培養ヒト包皮線維芽細胞において、アピコンプレックス門（ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａｎ）に属するトキソプラズマ・ゴンヂの複製を阻害する。細胞をＷＰ１１３０で処理し、タキゾイト（ＲＨ株）（ＭＯＩ＝１）に２４時間感染させた後、免疫蛍光法を用いて寄生体含有液胞を計数した。寄生体を１個のみ含有する液胞数は約３倍に増加し、寄生体を４個含有する液胞数は約５分の１に減少した。
化合物の細菌感染に対する阻害活性
ＲＡＷ２６４．７マクロファージを５μＭ ＷＰ１１３０で処理したところ、感染後８時間の間にリステリア・モノサイトゲネスの力価は３〜１０分の１に低下した。力価は、細胞内のコロニー形成単位を経時的に測定することにより求めた。上記マクロファージと接種細菌との接触は、ＭＯＩ＝１で３０分間行った。ＷＰ１１３０処理および感染の前にリポ多糖類およびインターフェロン−γで活性化した初代培養骨髄由来マクロファージにおいても、同様の効果が観察された。またＷＰ１１３０処理によって、感染後８時間の間にＲＡＷ２６４．７マクロファージ内のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の生存は３〜４分の１に低下した。また、この効果は、ＭＲＳＡに感染したヒト子宮頸管上皮ＨｅＬａ細胞においても観察された。ＲＡＷ２６４．７細胞において３３および４０を使用した場合にも、同様の細菌生存の低下がＭＲＳＡにおいて見られた。

Claims (79)

  1. 化学式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、もしくは（ＩＩＩ）：
    （式中、各Ｒ１は、Ｈ、アミド、置換アミド、ハライド、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９からなる群から選択されるが、化学式（ＩＩ）の化合物においては２つのＲ１がいずれも水素である場合は除外され、
    Ｘは、フルオロまたはクロロであり、
    Ｒ２は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、
    Ｈｅｔは、２−ピリジルを除くヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、
    Ｒ９は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、
    ｍは、２、３、または４である）を有する化合物であって、
    の構造を有する化合物を除く化合物、またはその塩。
  2. Ｒ２が、ヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、アルコキシおよび置換アルコキシのうちの１以上で所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキルまたはＣ３−６シクロアルキルである、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ１が、Ｈ、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９からなる群から選択される、請求項１または２に記載の化合物。
  4. Ｒ１が、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍモルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換モルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍスルホキシモルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換スルホキシモルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍピロリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換ピロリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍピペラジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換ピペラジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍピペリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換ピペリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ヘテロシクロアルキル、および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される、請求項１または２に記載の化合物。
  5. Ｒ９が、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、Ｎ（Ｍｅ）２、Ｎ（Ｅｔ）２、Ｏ（ＣＨ２）２ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ２）２ＯＨ、Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ２）、
    からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
  6. Ｈｅｔが、
    からなる群から選択されるか、またはそれらの置換体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
  7. Ｈｅｔがアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノおよび置換アミノのうちの１以上で置換されている、請求項６に記載の化合物。
  8. Ｒ１が、Ｈ、アミド、置換アミドおよびハライドからなる群から選択される、請求項６または７に記載の化合物。
  9. 化学式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の構造を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
  10. からなる群から選択される化合物またはその塩。
  11. からなる群から選択される化合物またはその塩。
  12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物と担体とを含む組成物。
  13. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  14. 経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、クモ膜腔内投与、眼内投与または吸入投与に適した、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 細胞を、増殖を抑制する量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
  16. 前記細胞ががん細胞である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記がん細胞が、ウイルス誘発性がん、カポジ肉腫、鼻咽頭癌腫（ＥＢＶ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、黒色腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、形質細胞異形成、骨髄増殖性障害または膠芽腫である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記がんが、肺がん、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、固形腫瘍または結腸がんである、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記化合物が前記細胞の内因性の脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）を阻害する、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記化合物がＤＵＢのユビキチンＣ末端加水分解酵素（ＵＣＨ）触媒ドメインを阻害する、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 脱ユビキチン化酵素（Ｄｕｂ）を化学式（Ｉ）：
    （式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、
    Ｒ３は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、
    Ｒ４は、ＣＮ、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、
    Ｒ５は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびＳＨからなる群から選択され、
    Ｒ６は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）の化合物またはその塩と接触させることを含む、脱ユビキチン化酵素を阻害する方法。
  22. 病原体または細胞を化学式（Ｉ）：
    （式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、
    Ｒ３は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、
    Ｒ４は、ＣＮ、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、
    Ｒ５は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびＳＨからなる群から選択され、
    Ｒ６は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）の化合物またはその塩と接触させることを含む、細胞における病原性の感染を抑制する方法。
  23. 病原体に感染した細胞を化学式（Ｉ）：
    （式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、
    Ｒ３は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、
    Ｒ４は、ＣＮ、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、
    Ｒ５は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびＳＨからなる群から選択され、
    Ｒ６は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）の化合物またはその塩と接触させることを含む、病原性の感染による症状を治療する方法。
  24. 前記症状が、胃腸炎、脳炎、気道感染、ＳＡＲＳ、インフルエンザ、ウイルス誘発性がん、狂犬病、出血熱、リフトバレー熱、リステリア症およびトキソプラズマ症から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記症状が、髄膜炎、心筋炎、肝炎、菌血症または皮膚感染である、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記病原体が、ウイルス、細菌、真菌または寄生体である、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ウイルスが、カリシウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アルテリウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、パピローマウイルス、卵巣腫瘍（ＯＴＵ）様プロテアーゼをコードするウイルス、バキュロウイルスまたはナイロウイルスである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ウイルスがポリオーマウイルスまたはレトロウイルスである、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記ウイルスが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、シンドビスウイルス（ＳｉＮＶ）、ラクロスウイルス（ＬａＣＶ）、ノーウォークウイルス、エプスタイン・バール（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス、デングウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パピローマウイルスおよびインフルエンザからなる群から選択される、請求項２６または２７に記載の方法。
  30. 前記ウイルスが、サイトメガロウイルス、ＢＫウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスまたはＨＩＶである、請求項２６または２７に記載の方法。
  31. 前記細菌が、クラミジア、エシェリヒア、サルモネラ、イェルシニア、バークホルデリア、ヘモフィルス、リステリアおよびマイコバクテリウムからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  32. 前記細菌が黄色ブドウ球菌である、請求項２６に記載の方法。
  33. 前記細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記寄生体または真菌が、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、トキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、エントアメーバヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、セストダ（Ｃｅｓｔｏｄａ）、クロノルキス（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ）、オピストルキス（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）、ストロンギロイデス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｉｄｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびクリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  35. 前記化合物が脱ユビキチン化酵素（Ｄｕｂ）を阻害する、請求項２２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記脱ユビキチン化酵素が前記病原体の内因性の脱ユビキチン化酵素である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記脱ユビキチン化酵素が前記細胞の内因性の脱ユビキチン化酵素である、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記細胞が哺乳類の細胞である、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記細胞がヒトの細胞である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記細胞が動物の細胞である、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記細胞が鳥類の細胞である、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記破線が二重結合を示す、請求項２１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. Ｒ３が、
    からなる群から選択されるか、または所望により置換されていてもよいそれらの基であり、
    Ｒ７が、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、単糖類、単糖類誘導体、アリール、およびアルキレンアリールからなる群から選択されるか、または所望により置換されていてもよいそれらの基であり、
    各Ｒ８が、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリールおよび置換アリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、
    Ａｒがアリールまたは置換アリールであり、
    Ｚがアルキレン、置換アルキレン、アミノまたは置換アミノであり、
    Ｚ１がアルキレンまたは置換アルキレンであり、
    ｎが１、２、３、または４である、請求項２１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. Ｒ６が、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、フェニル、１−ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｄｙｎｌ）、２−（２Ｈ）−ピラニル、および２−（２Ｈ）−チオピラニルから選択されるか、またはそれらの置換体である、請求項２１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. Ｒ６が２−ピリジルまたは置換２−ピリジルである、請求項４４に記載の方法。
  46. Ｒ４がＣＮである、請求項２１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. Ｒ３が、
    である、請求項２１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 化学式（Ｉ）の化合物が、
    からなる群から選択されるか、またはそれらの塩である、請求項２１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 化学式（Ｉ）の化合物が、化学式（ＩＩ）もしくは（ＩＩＩ）：
    （式中、各Ｒ１は、Ｈ、アミド、置換アミド、ハライド、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９からなる群から選択されるが、化学式（ＩＩ）の化合物においては２つのＲ１がいずれも水素である場合は除外され、
    Ｒ２は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、
    Ｈｅｔは、２−ピリジルを除くヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、
    Ｒ９は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、
    ｍは、２、３、または４である）の化合物またはその塩を含む、請求項２１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  50. Ｒ２が、ヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、アルコキシおよび置換アルコキシのうちの１以上で所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキルまたはＣ３−６シクロアルキルである、請求項４９に記載の方法。
  51. Ｒ１が、Ｈ、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９からなる群から選択される、請求項４９または５０に記載の方法。
  52. Ｒ９が、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、Ｎ（Ｍｅ）２、Ｎ（Ｅｔ）２、Ｏ（ＣＨ２）２ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ２）２ＯＨ、Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ２）、
    からなる群から選択される、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. Ｈｅｔが、
    からなる群から選択されるか、またはそれらの置換体である、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. Ｈｅｔがアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノおよび置換アミノのうちの１以上で置換されている、請求項５３に記載の方法。
  55. Ｒ１が、Ｈ、アミド、置換アミドおよびハライドからなる群から選択される、請求項５３または５４に記載の方法。
  56. 化学式（Ｉ）の化合物が、化学式（ＩＩａ）：
    （式中、各Ｒ１は、Ｈ、アミド、置換アミド、ハライド、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９からなる群から選択され、
    Ｘは、フルオロまたはクロロであり、
    Ｒ２は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、
    Ｒ９は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、
    ｍは、２、３、または４である）の化合物またはその塩を含む、請求項２１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  57. Ｒ２が、ヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、アルコキシおよび置換アルコキシのうちの１以上で所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキルまたはＣ３−６シクロアルキルである、請求項５６に記載の方法。
  58. Ｒ１が、Ｈ、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍモルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換モルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍスルホキシモルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換スルホキシモルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍピロリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換ピロリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍピペラジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換ピペラジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍピペリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換ピペリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ヘテロシクロアルキル、および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される、請求項５６または５７に記載の方法。
  59. Ｒ９が、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、Ｎ（Ｍｅ）２、Ｎ（Ｅｔ）２、Ｏ（ＣＨ２）２ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ２）２ＯＨ、Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ２）、
    からなる群から選択される、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 以下の構造：
    （式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、
    Ｒ３は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、
    Ｒ４は、ＣＮ、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、
    Ｒ５は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびＳＨからなる群から選択され、
    Ｒ６は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）を有する化合物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、神経変性疾患を治療する方法。
  61. 以下の構造：
    （式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、
    Ｒ３は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、
    Ｒ４は、ＣＮ、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、
    Ｒ５は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびＳＨからなる群から選択され、
    Ｒ６は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）を有する化合物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、神経変性疾患に伴う１以上の症状を治療する方法。
  62. 以下の構造：
    （式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、
    Ｒ３は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、
    Ｒ４は、ＣＮ、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、
    Ｒ５は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびＳＨからなる群から選択され、
    Ｒ６は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）を有する化合物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、遺伝子疾患に伴う１以上の症状を治療する方法。
  63. 前記破線が二重結合を示す、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. Ｒ３が、
    からなる群から選択されるか、または所望により置換されていてもよいそれらの基であり、
    Ｒ７が、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、単糖類、単糖類誘導体、アリール、およびアルキレンアリールからなる群から選択されるか、または所望により置換されていてもよいそれらの基であり、
    各Ｒ８が、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリールおよび置換アリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、
    Ａｒがアリールまたは置換アリールであり、
    Ｚがアルキレン、置換アルキレン、アミノまたは置換アミノであり、
    Ｚ１がアルキレンまたは置換アルキレンであり、
    ｎが１、２、３、または４である、請求項６０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. Ｒ６が、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、フェニル、１−ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｄｙｎｌ）、２−（２Ｈ）−ピラニル、および２−（２Ｈ）−チオピラニルから選択されるか、またはそれらの置換体である、請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. Ｒ６が２−ピリジルまたは置換２−ピリジルである、請求項６４に記載の方法。
  67. Ｒ４がＣＮである、請求項６０〜６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. Ｒ３が、
    である、請求項６０〜６７のいずれか１項に記載の方法。
  69. 化学式（Ｉ）の化合物が、
    からなる群から選択されるか、またはそれらの塩である、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  70. 化学式（Ｉ）の化合物が、
    からなる群から選択されるか、またはそれらの塩である、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  71. 化学式（Ｉ）の化合物が、化学式（ＩＩ）、（ＩＩａ）もしくは（ＩＩＩ）：
    （式中、各Ｒ１は、Ｈ、アミド、置換アミド、ハライド、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９からなる群から選択されるが、化学式（ＩＩ）の化合物においては２つのＲ１がいずれも水素である場合は除外され、
    Ｘは、フルオロまたはクロロであり、
    Ｒ２は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、
    Ｈｅｔは、２−ピリジルを除くヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、
    Ｒ９は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、
    ｍは、２、３、または４である）の化合物またはその塩を含む、請求項６０〜６８のいずれか１項に記載の方法。
  72. Ｒ２が、ヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、アルコキシおよび置換アルコキシのうちの１以上で所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキルまたはＣ３−６シクロアルキルである、請求項７１に記載の方法。
  73. Ｒ１が、Ｈ、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９からなる群から選択される、請求項７１または７２に記載の方法。
  74. Ｒ１が、Ｈ、−（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＲ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮＨＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍモルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換モルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍスルホキシモルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換スルホキシモルホリニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍピロリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換ピロリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍピペラジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換ピペラジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍピペリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍ置換ピペリジニル、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＮ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＭｅ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＭｅ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＥｔ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ＮＨＥｔ、−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２ヘテロシクロアルキル、および−Ｏ（ＣＨ２）ｍＯ（ＣＨ２）２置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される、請求項７１または７２に記載の方法。
  75. Ｒ９が、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、Ｎ（Ｍｅ）２、Ｎ（Ｅｔ）２、Ｏ（ＣＨ２）２ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ２）２ＯＨ、Ｎ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２Ｎ（Ｍｅ２）、
    からなる群から選択される、請求項７１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. Ｈｅｔが、
    からなる群から選択されるか、またはそれらの置換体である、請求項７１〜７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. Ｈｅｔがアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノおよび置換アミノのうちの１以上で置換されている、請求項７６に記載の方法。
  78. Ｒ１が、Ｈ、アミド、置換アミドおよびハライドからなる群から選択される、請求項７６または７７に記載の方法。
  79. 前記化合物が化学式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の構造を有する、請求項７１〜７８のいずれか１項に記載の方法。
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