JP7323238B2 - アミノキシ酸系抗がん幹細胞化合物およびその方法 - Google Patents

アミノキシ酸系抗がん幹細胞化合物およびその方法 Download PDF

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Description

開示された発明は、概して、合成小分子およびそのがん治療用薬物としての使用の分野にある。
腫瘍は不均一性である。バルク腫瘍は多様な細胞の集まりであり、代謝、抗原発現、および遺伝子発現等の特徴がそれぞれ異なるため、治療に対する感受性レベルに差がある（非特許文献１）。がん幹細胞（ＣＳＣ）は、自己複製能および腫瘍始原能を示す、腫瘍内の少数の細胞ポピュレーションである（非特許文献２）。該細胞は、従来の化学療法や放射線療法に抵抗性を示すため、腫瘍転移や再発を引き起こす（非特許文献３）。ＣＳＣを選択的に排除することで、現在行われている抗がん治療の治療効果を大きく向上できると期待される（非特許文献４）。
最初のＣＳＣ阻害剤であるサリノマイシンは、乳房ＣＳＣに対して１６０００種の化合物をハイスループットスクリーニングして同定された（非特許文献５）。追跡研究により、サリノマイシンが様々な種類のがん細胞に有効であることが報告された。サリノマイシンがマイトファジーを誘導する能力、細胞ＡＴＰ濃度を激減させる能力、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル経路を阻害する能力は、サリノマイシンのＣＳＣに対する毒性と関連付けられている。しかしながら、近年、卵巣がん細胞のサイドポピュレーションは、ＡＢＣ薬物トランスポーターシステムをより高度に発現することでサリノマイシンの毒性を回避し得ることが開示されたため、サリノマイシンの抗がん剤としての可能性が制限されるおそれがある（非特許文献６）。サリノマイシン以外にも、チゲサイクリン、ドキシサイクリン、ニクロサミド、アルテスネート等の分子も、他の独立したスクリーニングでＣＳＣ阻害剤として同定された（非特許文献７）。これらはいずれも、ミトコンドリア呼吸を阻害し得る。
ＣＳＣの代謝は非ＣＳＣとは異なることが報告された。ワールブルク効果により、分化した腫瘍細胞は主に解糖に依存するが、ＣＳＣは、高度に解糖性であるか、またはＯＸＰＨＯＳ依存性であり得る。いずれの場合も、ミトコンドリアはＣＳＣ機能において重要な役割を果たす（非特許文献８）。ミトコンドリア質量の増加、ミトコンドリア膜電位の過分極、および抗酸化剤濃度の上昇が、ＣＳＣの幹細胞性と関連することが報告されている（非特許文献９）。このような発見により、ミトコンドリア標的化合物がＣＳＣに対して有効であり得る理由が示された。
上述した化合物の中には、前臨床研究が行われているものや、臨床試験に入ったことが報告されているものもあるが、現在に至るまで、さらなる有望な結果は報告されていない。したがって、ＣＳＣを標的とする新たな分子の発見および開発が強く求められている。
Ｍｅａｃｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０１：３２８－３３７（２０１３） Ｒｅｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１４：１０５－１１１（２００１） Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ８：５４５－５５４（２００８） Ｄｉｎｇｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：２６０３－２６１０（２００６） Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３８：６４５－６５９（２００９） Ｂｏｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ２１：１２９１－１２９３（２０１６） Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ４７５：１６１１－１６３４（２０１８） Ｓａｎｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ １１４：１３０５－１３１２（２０１６） Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．４７：１５４－１６７（２０１７）
がんを標的とするための化合物、組成物、および方法が開示される。また、がん幹細胞を排除することによりがんを標的とするための化合物、組成物、および方法が開示される。また、がん幹細胞を標的とするための化合物、組成物、および方法が開示される。また、ミトコンドリアを介してがん幹細胞および他の疾患を標的とするための化合物、組成物、および方法が開示される。また、ミトコンドリア膜電位、ミトコンドリア活性酸素種産生、細胞呼吸、アポトーシス、およびオートファジーの調節を介してがん幹細胞を標的とするための化合物、組成物、および方法が開示される。上記化合物は、がん幹細胞およびがん細胞の死を誘導できる合成小分子である。特定の実施形態において、上記化合物は、卵巣がん幹細胞等の１種以上のがん幹細胞に対して選択的である。
式Ｉ：
Figure 0007323238000001
 （式中、Ａは、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のポリアリール、置換もしくは非置換のポリヘテロアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のヘテロアラルキル、置換もしくは非置換のポリアラルキル、置換もしくは非置換のポリヘテロアラルキル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、または置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０ヘテロシクリルであり；Ｂは、それぞれ独立して、下記構造：
Figure 0007323238000002
 （式中、Ｘ、Ｘ’、およびＸ’’は、独立して、Ｏ、存在しない、Ｓ、ＮＲ２、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルキレン、または置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０ヘテロシクリル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアルコキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキニル、置換もしくは非置換のアミノアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）、置換もしくは非置換のアラルキルであり；Ｙ、Ｙ’、およびＹ’’は、独立して、置換もしくは非置換のアルキル、存在しない、Ｏ、Ｓ、ＮＲ３、置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のポリアリール、置換もしくは非置換のポリヘテロアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のヘテロアラルキル、置換もしくは非置換のヘテロアラルキル、置換もしくは非置換のポリアラルキル、置換もしくは非置換のポリヘテロアラルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０ヘテロシクリル、または置換もしくは非置換のアミノアルキルであり；Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ４である）を有し；Ｌ１およびＬ２は、独立して、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｏ－、存在しない、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲｉｖ－、－ＮＲｉｖＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２－、－ＳＯ２ＮＲｉｖ－、－ＣＨ２Ｒｉｖ－、－ＮＲｉｖＨ－、－ＮＲｉｖ－、－ＯＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＯＣＯＮＲｉｖ－、－ＮＲｉｖＣＯＯ－、－ＮＨＣＯＮＨ－、－ＮＲｉｖＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯＮＲｉｖ－、－ＮＲｉｖＣＯＮＲｉｖ－、－ＣＨＯＨ－、－ＣＲｉｖＯＨ－、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルキレン、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノ、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアルコキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０ヘテロシクリル、置換もしくは非置換のアミノアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルカリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、置換もしくは非置換のカルボキシアルキル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアシル、または置換もしくは非置換のアミノカルボニルであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲｉｖは、独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアルコキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０ヘテロシクリル、置換もしくは非置換のアミノアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルカリール、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換のアシルであり；Ｃは、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のポリアリール、置換もしくは非置換のポリヘテロアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のヘテロアラルキル、置換もしくは非置換のポリアラルキル、置換もしくは非置換のポリヘテロアラルキル、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキニル、非置換もしくは置換Ｃ３－Ｃ２０ヘテロシクリル、置換もしくは非置換のアミノアルキル、置換もしくは非置換のアルカリール、置換もしくは非置換のカルボキシアルキル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアシル、または置換もしくは非置換のアミノカルボニル、またはＨであり；ｎは、１～５の整数である）を有する、細胞死を誘導可能な化合物が本明細書で提供される。
特定の実施形態において、Ａは、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のポリアリール、置換もしくは非置換のポリヘテロアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のヘテロアラルキル、置換もしくは非置換のポリアラルキル、置換もしくは非置換のポリヘテロアラルキル、または置換もしくは非置換のアルキルであり；Ｌ１は、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、または－Ｓ（Ｏ）２－である。
特定の実施形態において、Ａは、それぞれ式：（Ｒ７－）ａ（アリール）、（Ｒ７－）ａ（アラルキル）、または（Ｒ７－）ａ（アルキル）を有する置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換のアルキルであり、Ｒ７は、それぞれ独立して、Ｆ３Ｃ－、Ｆ－、Ｃｌ－、Ｏ２Ｎ－、ＮＣ－、ＭｅＯ－、ＨＯ－、ＨＣ（Ｏ）－、（Ｒ８）２Ｎ－であり、Ｒ８は、それぞれ独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアルコキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０ヘテロシクリル、置換もしくは非置換のアミノアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルカリール、置換もしくは非置換のアラルキル、または置換もしくは非置換のアシルであり、ａは、０、１、２、または３である。
特定の実施形態において、Ａは電子吸引性基を含む。
特定の実施形態において、上記電子吸引性基は、ＣＦ３、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨＯ、または置換もしくは非置換のカルボニル、スルホニル、トリフルオロアセチル、もしくはトリフルオロメチルスルホニルである。
特定の実施形態において、Ａは、非置換もしくは置換Ｃ１－１８アルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のアラルキルであり、上記置換Ｃ１－１８アルキル、置換アリール、または置換アラルキルは、酸素含有、窒素含有、または硫黄含有部位を含む。
特定の実施形態において、Ｌ１およびＬ２は、Ｂに隣接する原子のうち少なくとも１つが酸素、窒素、または硫黄となるように選択される。
特定の実施形態において、Ｘは、置換もしくは非置換のヘテロシクリルであり、上記ヘテロシクリルは、酸素含有、窒素含有、もしくは硫黄含有部位または電子吸引性基で置換されていてもよい。
特定の実施形態において、上記電子吸引性基は、ＣＦ３、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、またはＣＨＯである。
特定の実施形態において、Ｙ、Ｙ’、またはＹ’’は、それぞれ独立して、置換もしくは非置換のＣ１－１０アルキル、置換もしくは非置換のアラルキルであり、上記置換アルキルまたは置換アラルキルは、酸素含有、窒素含有、もしくは硫黄含有部位または電子吸引性基を含む。
特定の実施形態において、上記電子吸引性基は、ＣＦ３、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、またはＣＨＯである。
特定の実施形態において、Ｌ２は、ＮＲ１０、Ｏ、Ｓ、または存在せず、Ｒ１０は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアルコキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０ヘテロシクリル、置換もしくは非置換のアミノアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルカリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、置換もしくは非置換のカルボキシアルキル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアシル、または置換もしくは非置換のアミノカルボニルであり、Ｃは、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアルコキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０ヘテロシクリル、アミノアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルカリール、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０アラルキル、置換もしくは非置換のカルボキシアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０アシル、または置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０アミノカルボニルである。
特定の実施形態において、Ｃは、式：－（アリール）（－Ｒ１１）ｂを有する置換もしくは非置換のアリール、－Ｒ１１、または－Ｏ－Ｒ１１であり、Ｒ１１は、それぞれ独立して、－ＣＦ３、－Ｆ、Ｃ－Ｃｌ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｏ－Ｍｅ、－ＯＨ、－ＮＲ１２であり、Ｒ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアルコキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０ヘテロシクリル、置換もしくは非置換のアミノアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルカリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、置換もしくは非置換のカルボキシアルキル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアシル、または置換もしくは非置換のアミノカルボニルであり、ｂは、０、１、２、または３である。
特定の実施形態において、Ｂは、
Figure 0007323238000003
 （式中、ＸはＯまたは存在せず、Ｙは－ＣＲ１３Ｒ１４－であり、Ｒ１３は、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５、－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ６Ｈ５、－Ｃ１－４アルキル、または－Ｏ－Ｃ１－４アルキルであり、Ｒ１４はＨであり、ＺはＯである）であり；ｎは１であり；Ａは式：（Ｒ７－）ａ（フェニル）－を有し、Ｌ１は－Ｃ（Ｏ）－であり、ａは２であり、Ｒ７はそれぞれＦ３Ｃ－であり；Ｃは、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５、－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ６Ｈ５、－Ｃ１－４アルキル、または－Ｏ－Ｃ１－４アルキルであり；Ｌ２は、ＮＨ、Ｏ、またはＳである。
特定の実施形態において、Ｂは、
Figure 0007323238000004
 （式中、ＸはＯまたは存在せず、Ｙは－ＣＲ１３Ｒ１４－であり、Ｒ１３は、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５、－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ６Ｈ５、－Ｃ１－４アルキル、－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、－ＣＨ２－（フェニル）（－Ｒ１５）ｃ、－ＣＨ２－Ｏ－（フェニル）（－Ｒ１５）ｃ、－Ｃ１－４アルキル－Ｒ１５、または－Ｏ－Ｃ１－４アルキル－Ｒ１５であり、Ｒ１４はＨであり、Ｒ１５は、それぞれ独立して、－ＣＦ３、－Ｆ、Ｃ－Ｃｌ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｏ－Ｍｅ、－ＯＨ、－ＮＨであり、ｃは１または２であり、ＺはＯである）であり；ｎは１であり；Ａは、（Ｒ７－）ａ（フェニル）－ＣＯ－、Ｃ６Ｈ５－ＣＨ２－、Ｃ６Ｈ５－Ｏ－ＣＨ２－、Ｃ１－４アルキル－、またはＣ１－４アルキル－Ｏ－であり、ａは２であり、Ｒ７は、それぞれ独立して、Ｆ３Ｃ－、Ｆ－、Ｃｌ－、Ｏ２Ｎ－、ＮＣ－、ＭｅＯ－、ＨＯ－、ＨＮ－であり；Ｌ１は－Ｃ（Ｏ）－または存在せず；Ｃは、－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５、－ＣＨ２－Ｏ－Ｃ６Ｈ５、－Ｃ１－４アルキル、－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、－ＣＨ２－（フェニル）（－Ｒ１６）ｄ、－ＣＨ２－Ｏ－（フェニル）（－Ｒ１６）ｄ、－Ｃ１－４アルキル－Ｒ１６、または－Ｏ－Ｃ１－４アルキル－Ｒ１６であり、Ｒ１６は、それぞれ独立して、－ＣＦ３、－Ｆ、Ｃ－Ｃｌ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｏ－Ｍｅ、－ＯＨ、－ＮＨであり、ｄは１または２であり；Ｌ２は、ＮＨ、Ｏ、またはＳである。
下記構造：
Figure 0007323238000005
 （式中、Ｒ１’～Ｒ５’は、それぞれ独立して、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアルコキシアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルケニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０シクロアルキニル、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０ヘテロシクリル、置換もしくは非置換のアミノアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルカリール、置換もしくは非置換のアリールアルキル、置換もしくは非置換のカルボキシアルキル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアシル、または置換もしくは非置換のアミノカルボニルである）を有する化合物が本明細書で提供される。
Figure 0007323238000006
 からなる群より選択される細胞死誘導化合物が本明細書で提供される。
特定の実施形態において、上記化合物は薬物として使用される。
特定の実施形態において、上記化合物は、卵巣、肺、皮膚、筋肉、脳、肝臓、心臓、血液、腎臓、または脾臓細胞を含むがこれらに限定されないがんの治療に使用される。
特定の実施形態において、上記化合物は、がん幹細胞の阻害によるがんの治療に使用される。
一実施形態において、上記がんは卵巣がんである。
一実施形態において、上記がんは肝臓がんである。
特定の実施形態において、上記化合物は、がん幹細胞を阻害するための方法として使用される。
特定の実施形態において、上記化合物は、ミトコンドリア機能に影響を与えることにより誘導されるがんまたは他の疾患の治療に使用される。特定の実施形態において、上記影響を受けるミトコンドリア機能は、ミトコンドリア膜電位の脱分極、スーパーオキシド産生、および呼吸の減衰である。
少なくとも、式（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、または水和物、および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が本明細書で提供される。一実施形態において、上記医薬組成物はがんの治療に使用される。一実施形態に置いて、上記がんは卵巣がんである。別の実施形態において、上記がんは肝臓がんである。
特定の実施形態において、上記医薬組成物は、別の抗がん剤と組み合わせて使用される。
医薬として同時に、別々に、または時間差で使用される組み合わせ製品として、本明細書に記載の化合物および別の化学療法化合物を含む医薬製品が本明細書で提供される。一実施形態において、上記医薬製品は、がんの治療に使用される。一実施形態において、上記がんは卵巣がんである。別の実施形態において、上記がんは肝臓がんである。
本明細書に開示された化合物を投与する工程を含むがんまたは増殖性疾患を治療する方法が本明細書で提供される。
対象においてがん幹細胞を阻害する方法であって、それを必要とする上記対象に、本明細書に開示された化合物を治療有効量で投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。上記がん幹細胞は、卵巣、肺、皮膚、筋肉、脳、肝臓、心臓、血液、腎臓、または脾臓がん幹細胞を含むがこれらに限定されない。
対象においてがん幹細胞を阻害する方法であって、それを必要とする上記対象に、本明細書に開示された化合物を治療有効量で投与する工程を含む方法が本明細書で提供される。特定の実施形態において、上記がん幹細胞は卵巣細胞ではない。
がん幹細胞を阻害することでがんを治療する方法であって、上記がん幹細胞は、（ｉ）ミトコンドリア膜の脱分極の誘導、（ｉｉ）活性酸素種の産生、（ｉｉｉ）ミトコンドリア呼吸の減衰により阻害される、方法が本明細書で提供される。
特定の実施形態において、上記化合物は、がん細胞および正常細胞よりもがん幹細胞の細胞死を最大６０倍の選択性で誘導する。
特定の実施形態において、上記がん幹細胞（ＣＳＣ）はオートファジー抑制およびアポトーシスを受ける。特定の実施形態において、上記化合物は、（ｉ）ＣＳＣのポピュレーションを減少させるか、（ｉｉ）ＣＳＣのスフェア形成能を低下させるか、または（ｉｉｉ）ＣＳＣの生体内腫瘍播種能を低下させる。
本明細書に開示された医薬組成物を含むキットが本明細書で提供される。
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された図面を少なくとも１枚含む。カラー図面が付いた本特許または特許出願の刊行物の写しは、請求および必要な手数料の支払い時に特許庁によって提供される。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、開示された方法および組成物のいくつかの実施形態を例示し、明細書の記載とともに、開示された方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。
実施例の項で説明する合成化合物の化学構造を示す図である。 浮遊培養で卵巣がんＨＥＹ Ａ８細胞が形成したスフェロイドでは、ＣＤ１３３抗原表現型を有する細胞のポピュレーションが多くなることを示す棒グラフである。 濃度５μＭの実施例１～１４のＨＥＹ Ａ８ ＣＳＣに対する細胞毒性を示す棒グラフである。 各種濃度の化合物ｓｆｆ－２－１１２、ｓｆｆ－２－１２４、ｓｆｆ－２－１３２、およびｓｆｆ－２－１００（「実施例１、３、４、および１４」）の卵巣がん細胞Ｈｅｙ Ａ８、ＳＫＯＶ３、および対応するＣＳＣに対する比較毒性を示す線グラフである。細胞生存率は、表示した濃度（μＭ）の分子と４８時間インキュベートした後に測定した。 化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）が接着細胞においてＣＤ１３３抗原表現型を有する細胞のポピュレーションを減少させることができることを示す棒グラフである。 化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）で処理した細胞のスフェア形成能が著しく低下したことを示す棒グラフである。 細胞を化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）により生体外で処理した後、それらのマウスでの腫瘍形成能が著しく低下したことを示す線グラフである。 化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）の添加後、直ちにミトコンドリア膜電位が脱分極したことを示す線グラフである。ミトコンドリア膜電位は、経時（秒）のＪＣ－１赤／緑比率によりモニターした。 化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）がＨｅｙ Ａ８細胞でスーパーオキシド産生を誘導したことを示す線グラフである。スーパーオキシドは、ＨＫＳＯＸ－２の相体蛍光強度の経時（秒）変化をモニターすることで測定した。 化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）が濃度依存的にがん細胞呼吸を減衰させたことを示す線グラフである。酸素消費率（ＯＣＲ）は、ｓｅａｈｏｒｓｅＸＦ２４アナライザーで測定した。 化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）ががん幹細胞のアポトーシス細胞死を選択的に誘導したことを示す画像である。ａ）細胞をアネキシンＶおよびＰＩで染色した。ｂ）アポトーシス関連タンパク質ＰＡＲＰ、カスパーゼ３、カスパーゼ９、および内部マーカーとしてのチューブリンのイムノブロット。 オートファジー関連タンパク質Ｐ６２およびＬＣ３のイムノブロットｐａｇｅである。ＧＡＰＤＨを内部マーカーとして用いた。これらの結果から、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）が、がん幹細胞のオートファジーを選択的に抑制したことがわかる。 各種濃度の化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）およびｓｆｆ－２－１２４（「実施例３」）のＣＤ１３３低発現および高発現の肝臓がん細胞Ｈｕｈ７に対する比較毒性を示す線グラフである。細胞生存率は、表示した濃度（μＭ）の分子と４８時間インキュベートした後に測定した。
がん幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍成長および腫瘍形成に関与する腫瘍内のサブポピュレーションである。該細胞は現在行われているがん治療の多くに抵抗性を示す。がんを治療するための方法が本明細書において提供される。ＣＳＣの阻害によりがんを治療するための方法が本明細書で提供される。薬剤耐性卵巣ＣＳＣを選択的に除去する方法が本明細書で提供される。がん細胞またはがん幹細胞の死を誘導することで肝臓がんを治療する方法が本明細書で提供される。卵巣がん細胞、卵巣ＣＳＣ、肝臓がん細胞、および肝臓ＣＳＣの死を誘導するアミノキシ酸単位を有する化合物が本明細書で提供される。α－アミノキシ酸は、アミンおよびαカーボン単位に追加の酸素が挿入されたアミノ酸類似体である。該酸は生体安定性が極めて高い。入手が容易で構造的モジュール性が高いため、薬物スクリーニングおよび創薬のためのライブラリの構築に可能性をもたらす。
がん細胞およびＣＳＣの死を誘導できる化合物が本明細書で提供される。提供される化合物は、腫瘍形成を阻害できる。上記化合物は、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００倍を超える選択性でがん細胞よりもＣＳＣの死を選択的に誘導できる。特定の実施形態において、上記化合物は、がん細胞およびＣＳＣのアポトーシス細胞死を誘導できる。特定の実施形態において、上記化合物は、がん細胞およびＣＳＣのオートファジー抑制を誘導できる。特定の実施形態において、上記化合物は、ミトコンドリア膜電位の脱分極、活性酸素種の産生、ミトコンドリア呼吸の減衰を含むがこれらに限定されない細胞のミトコンドリア機能に影響を与えることで、細胞死を誘導する。特定の実施形態において、上記化合物は、リソソームｐＨを乱し得る。特定の実施形態において、上記化合物は、α－アミノキシ酸スキャフォールドを含む合成小分子である。
本発明者らは、卵巣がん幹細胞に対してアミノキシ酸ライブラリをスクリーニングした。アミノキシ酸モノマーおよびジペプチドを含む１４種の化合物が、卵巣ＨＥＹ Ａ８ ＣＳＣに対して毒性を示すものとして同定された。
さらに、化合物ｓｆｆ－２－１１２、ｓｆｆ－２－１２４、ｓｆｆ－２－１３２、およびｓｆｆ－２－１００の卵巣がんＨＥＹ Ａ８細胞、ＳＫＯＶ３細胞、およびこれらに対応するＣＳＣ、ならびに正常細胞に対するＩＣ５０値を評価した。これら４種の分子は、卵巣がん細胞および正常細胞よりも卵巣ＣＳＣの死を最大６０倍の選択性で誘導できることがわかった。化合物ｓｆｆ－２－１１２およびｓｆｆ－２－１３２を選択してさらなる研究を行った。これらの分子は、ＨＥＹ Ａ８細胞のＣＤ１３３＋細胞ポピュレーション、スフェア形成能および生体内腫瘍播種能を低減できることが明らかとなった。本発明はまた、化合物ｓｆｆ－２－１１２またはｓｆｆ－２－１３２が、ミトコンドリア膜電位の脱分極、スーパーオキシドの産生、および呼吸の減衰を誘導することにより、細胞のミトコンドリア機能に影響を与え得ることも示した。処理後、がん細胞はオートファジー抑制およびアポトーシスを受けた。
また、化合物ｓｆｆ－２－１１２およびｓｆｆ－２－１２４の肝臓がんＨｕｈ７細胞に対するＩＣ５０値を評価した。肝臓ＣＳＣ用マーカーとしてＣＤ１３３を用いた。これら２種の化合物は、肝臓がん細胞（ＣＤ１３３－）およびＣＳＣ（ＣＤ１３３＋）をいずれも殺滅できることがわかる。
＜１．アミノキシ酸ライブラリからの化合物は卵巣ＣＳＣの死を選択的に誘導できる＞
アミノキシ酸は標準的なペプチドカップリングの手順で合成した。その構造を図１に示す。ＣＳＣは、浮遊条件下でスフェロイド培養することで得る。これらのスフェアは実際に、卵巣ＣＳＣを表し得ると報告されているＣＤ１３３抗原表現型を有する細胞のポピュレーショが著しく多いことが確認されている（図２）。化合物で４８時間処理した後、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）発光試薬でＣＳＣの細胞生存率を測定した。化合物ｓｆｆ－３－８５（「実施例２」）は用量１０μＭで用い、その他の化合物は全て濃度５μＭで用いた。実験はいずれも３回実施され、データは平均値±ＳＤで提示する。
アミノキシ酸モノマーおよびジペプチドを含む１４種の化合物が、ＨＥＹ Ａ８ ＣＳＣに対して毒性を示すものとして同定された。さらに、化合物ｓｆｆ－２－１１２、ｓｆｆ－２－１２４、ｓｆｆ－２－１３２、およびｓｆｆ－２－１００の接着がんＨＥＹ Ａ８、ＳＫＯＶ３細胞、およびＣＳＣに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値を求めた。図４に示す通り、これら３種の化合物はいずれも、接着がん細胞よりもＣＳＣに対して優れた選択性を示すことが明らかとなった。とりわけ化合物ｓｆｆ－２－１３２は、ＣＳＣに対する選択性が、がん細胞に対する選択性に比べて最大６０倍高い。また、他の正常細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、およびＭＤＣＫに対するこれらの化合物の毒性を試験し、ＩＣ５０値を表１にまとめた。これらのデータから、化合物ｓｆｆ－２－１１２、ｓｆｆ－２－１２４、ｓｆｆ－２－１３２、およびｓｆｆ－２－１００は、卵巣がん細胞および正常細胞よりも卵巣ＣＳＣの死を選択的に誘導できることがはっきりと示唆された。
Figure 0007323238000007
＜２．化合物ｓｆｆ－２－１１２およびｓｆｆ－２－１３２は、細胞のＣＤ１３３＋ポピュレーションおよび腫瘍形成能を低減できる＞
ＣＤ１３３は卵巣ＣＳＣマーカーであることが報告されている。細胞を合成分子で処理した後、ＣＤ１３３＋細胞のポピュレーションを測定した。ＨＥＹ Ａ８細胞をタキソール（１００ｎＭ）、濃度１５μＭの化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）で処理した。０．１％ＤＭＳＯを含有する培地をネガティブコントロールとして用いた。図５の結果から、ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）および化合物ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）は、ＤＭＳＯ処理群と比較して、ＣＤ１３３＋細胞のポピュレーションを著しく減少させたことが明らかとなった。
浮遊培養におけるスフェア形成能は、がん細胞株中のＣＳＣの数と相関する。図６の結果から、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）が、ＤＭＳＯ処理群と比較して、卵巣がん細胞のスフェア形成能を著しく低下させたことがわかる。さらに、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）で処理した後の細胞の生体内腫瘍播種能を評価した。タキソールをネガティブコントロールとして用いた。ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）または化合物ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）の前処理によって、タキソール前処理群および未処理群と比較して、腫瘍の大きさが著しく減少したことが確認できる（図７）。これらの知見から、卵巣がんスフェア内のＣＳＣは、タキソールに抵抗性があるが、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）の処理には感受性があることがわかる。
＜３．合成分子は、細胞のミトコンドリア機能に影響し、細胞アポトーシスを誘導し、かつ細胞オートファジーを阻害できる＞
化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）のミトコンドリア膜電位に対する効果をＨｅｙ Ａ８細胞およびＣＳＣにおいて検討した（図８）。図８ａに示すデータから、ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）は、ミトコンドリア膜電位を用量依存的に脱分極できることがわかった。動態研究により、これら２種の分子が添加時に３０秒以内にミトコンドリア膜電位を脱分極したことがわかった（図８ｂ）。
また、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）のＲＯＳ産生誘導能をＨＥＹ Ａ８細胞で評価した（図９）。ＲＯＳ産生はスーパーオキシド蛍光プローブＨＫＳＯＸ－２ｍでモニターした。蛍光強度が増大したことから、スーパーオキシドの産生が示された（ｎ＝５０～１００細胞）。
その後、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）は細胞呼吸に影響し得ることもわかった。ＸＦ２４細胞外フラックスアナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞の酸素消費率（ＯＣＲ）を測定した。ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）を添加した後、ＯＣＲが直ちに上昇した。しかし、その後、続くＦＣＣＰ、アンチマイシンＡ、およびロテノンの添加に対する細胞呼吸応答は著しく低下した（図１０）。これらの結果から、呼吸鎖が両化合物から影響を受けることがわかった。このような効果は、合成分子の添加量が多いほど顕著であった。
加えて、本発明は、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２の上述した効果により、ＨＥＹ Ａ８がん細胞およびＣＳＣがいずれもアポトーシスを起こしたことを明らかにした。図１１ａに示す通り、ＣＳＣのＤＭＳＯ処理単独では、４．９２％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）により５μＭで処理すると、２１．０％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。実施例５により５μＭで処理すると、３０．４％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。がん細胞の場合、ＤＭＳＯ処理単独では１．７３％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。実施例１により３０μＭで処理すると、８．２１％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。化合物ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）により５μＭで処理すると、３０．４％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。がん細胞の場合、ＤＭＳＯ処理単独では１．７３％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。実施例４により３０μＭで処理すると、１．３０％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。ＣＳＣに対する化合物の濃度は、がん細胞に対する濃度の６分の１であったにもかかわらず、ＣＳＣのアポトーシス細胞ポピュレーションは、がん細胞の場合よりはるかに多かった。
ＣＳＣにおいてはまた、化合物の濃度ががん細胞の場合の濃度の１０分の１であっても、タンパク質ＰＡＲＰ１、カスパーゼ３、およびカスパーゼ９の活性化が観察された（図１１ｂ）。これらの結果から、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）が卵巣ＣＳＣに対して高い選択性を有することがさらに明らかとなった。
最後に、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）で処理した細胞においてオートファジーが阻害されたことが明らかとなった。ＣＳＣにおいては、化合物の濃度ががん細胞の場合の濃度の１０分の１であっても、このような効果はより顕著であった。
実施例１．化合物の合成
下記の一般手順に従って、化合物ｓｆｆ－３－８５、ｓｆｆ－３－１００、ｓｆｆ－３－１０１（「実施例２、９、および１０」）を合成した（スキームＩ）。
Figure 0007323238000008
 スキーム１．化合物ｓｆｆ－３－８５、ｓｆｆ－３－１００、およびｓｆｆ－３－１０１（「実施例２、９、および１０」）の合成
Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．，Ｃｈｅｍ．，２００１，６６，７３０３－７３１２に記載された手順に従って出発材料Ｓ１を調製した。化合物Ｓ１（１ｍｍｏｌ、１当量）のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３（１：１、１０ｍｌ）溶液にＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２Ｏ（１．６ｍｍｏｌ、１．６当量）を添加した。室温で２．５時間撹拌した後、反応混合物を真空で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、５％ＮａＨＣＯ３および食塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して遊離アミンの粗生成物を得て、さらに精製することなくそのまま次工程で用いた。この遊離アミンをＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）に溶解させた溶液に飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５ｍＬ）を添加した。その後、３，５－ビス（トリフルオロメチル）ベンゾイルクロリド（１．２ｍｍｏｌ、１．２当量）を滴下した。１時間撹拌した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。まとめた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して化合物Ｓ２を得て、そのまま次工程で用いた。Ｈ２雰囲気で化合物Ｓ２のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液に１０％（ｗ／ｗ）Ｐｂ／Ｃを添加した。室温で２時間撹拌した後、反応混合物をセライト（登録商標）で濾過した。濾液を真空で濃縮して化合物Ｓ３を得て、そのままペプチドカップリングに用いた。遊離酸Ｓ３のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液にＥＤＣＩ（１．５ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＨＯＡｔ（１．３ｍｍｏｌ、１．３当量）、およびアニリン（１．１ｍｍｏｌ、１．１当量）を順に添加した。反応物を室温で一晩撹拌した後、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、５％ＮａＨＣＯ３、０．５Ｎ ＨＣｌ、および食塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して、化合物ｓｆｆ－３－８５、ｓｆｆ－３－１００、およびｓｆｆ－３－１０１（「実施例２、９、および１０」）を得た。
Figure 0007323238000009
 化合物ｓｆｆ－３－８５：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．７３（ｓ，１Ｈ），１０．１７（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｓ，２Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ）７．２９－７．２５（ｍ，２Ｈ），７．１３（ｔ，Ｊ＝７．３７Ｈｚ，１Ｈ），４．６２－４．６０（ｍ，１Ｈ），１．６０（ｄ，Ｊ＝６．９９Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７０．６，１６５．７，１３７．７，１３３．２，１３３．０（ｑ，２ＪＣ，Ｆ＝３３．８Ｈｚ），１２９．６，１２８．２，１２６．５，１２５．５，１２３．２（ｑ，１ＪＣ，Ｆ＝２７２．３Ｈｚ），１２０．８，８４．７，１８．０；１９Ｆ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ－６３．０
Figure 0007323238000010
 化合物ｓｆｆ－３－１００：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．５０（ｓ，１Ｈ），１０．１１（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｓ，２Ｈ），８．０５（ｓ，１Ｈ），７．６８－７．６７（ｍ，２Ｈ），７．３５－７．３２（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．１４－７．１１（ｍ，１Ｈ），４．６４－４．６３（ｍ，１Ｈ），４．０８－４．０７（ｍ，１Ｈ），３．８９－３．８６（ｍ，１Ｈ），１．２７（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６７．３８，１６５．３７，１３８．７５，１３４．３３，１３３．７９（ｑ，２ＪＣ，Ｆ＝３４．７Ｈｚ），１３０．３７，１２８．８３，１２７．３８，１２６．０３，１２４．０５（ｑ，２ＪＣ，Ｆ＝２７３．７Ｈｚ），１２１．２７，８８．３１，７６．３２，６３．８１，２８．８０；１９Ｆ（４７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ－６３．０；Ｃ２２Ｈ２３Ｆ６Ｎ２Ｏ４（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値４９３．１４７８，実測値４９３．０９７１
Figure 0007323238000011
 １Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）δ８．３３（ｓ，２Ｈ），８．０８（ｓ，１Ｈ），７．５７－７．５６（ｍ，２Ｈ），７．３２－７．２６（ｍ，４Ｈ），７．１１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｓ，１Ｈ），４．７２－４．８０（ｍ，１Ｈ），３．３４－３．３３（ｍ，１Ｈ），３．２３－３．１８（ｍ，１Ｈ），１．２９（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）δ１６８．３５，１６３．７４，１５３．０６，１３６．３６，１３２．５２，１３１．２１（ｑ，２ＪＣ，Ｆ＝３７．４Ｈｚ），１３０．４８，１２９．２６，１２７．８４，１２６．９８，１２４．６４，１２３．７７，１２３．２１，１２２．０７（ｑ，２ＪＣ，Ｆ＝２７２．７Ｈｚ），１１９．３０，８６．５８，７７．８０，３６．４２，２７．３５；１９Ｆ（４７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ－５９．９；Ｃ２８Ｈ２７Ｆ６Ｎ２Ｏ４（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値５６９．１７９１，実測値５６９．１８８０
スキーム２に記載した手順に従って化合物ｓｆｆ－２－１２４（「実施例３」）を合成した。
Figure 0007323238000012
 スキーム２．化合物ｓｆｆ－２－１２４（「実施例３」）の合成
Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．，Ｃｈｅｍ．，２００１，６６，７３０３－７３１２に記載された手順に従って出発材料Ｓ４を調製した。化合物３－Ｓ８（１５３．３ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）溶液に同量のＣＦ３ＣＯＯＨ（２．５ｍＬ）を注射器を用いて室温で添加した。室温で３時間撹拌した後、反応混合物を真空で濃縮した。残渣をトルエンで２回共沸させて遊離酸化合物Ｓ５を白色固体として得て、さらに精製することなくそのまま次工程で用いた。
化合物Ｓ５のＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）溶液にＥＤＣＩ（１３２．３ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（８１．７ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、およびアニリン（４６．６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を順に添加した。反応物を室温で一晩撹拌した後、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、５％ＮａＨＣＯ３、０．５Ｎ ＨＣｌ、および食塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して、化合物Ｓ６（２４０．７ｍｇ、９９％収率）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．４７（ｓ，１Ｈ），７．８５－７．８４（ｍ，２Ｈ），７．７８－７．７５（ｍ，４Ｈ），７．３７－７．３４（ｍ，２Ｈ），７．１３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），４．９１（ｄｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，３．６Ｈｚ，１Ｈ），２．２３－２．１６（ｍ，１Ｈ），１．９９－１．８５（ｍ，２Ｈ），１．１６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），１．０５（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６８．９，１６４．４，１３７．７，１３５．２，１２９．１，１２８．８，１２４．６，１２４．１，１２０．０，８７．２，４２．０，２５．０，２３．４，２１．９；Ｃ２０Ｈ２１Ｎ２Ｏ４（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値３５３．１４９６，実測値３５３．１４９２
化合物Ｓ６（１４０．９ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３（１：１、５ｍＬ）溶液にＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２Ｏ（４０．１ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２．５時間撹拌した後、反応混合物を真空で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、５％ＮａＨＣＯ３および食塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して化合物Ｓ７の粗生成物を得て、さらに精製することなくそのまま次工程で用いた。
化合物Ｓ７をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解させた溶液に飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２．５ｍＬ）を添加した。その後、３，５－ビス（トリフルオロメチル）ベンゾイルクロリド（１１０．６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を滴下した。一晩撹拌した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。まとめた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗油をフラッシュカラムクロマトグラフィで精製して、化合物ｓｆｆ－２－１２４（８６．９ｍｇ、４７％収率）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ１０．５１（ｓ，１Ｈ），９．８８（ｓ，１Ｈ），８．３１（ｓ，２Ｈ），８．１９（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３６－７．３２（ｍ，２Ｈ），７．１３－７．０９（ｍ，１Ｈ），４．５１（ｄｄ，Ｊ＝９．６，３．８Ｈｚ，１Ｈ），１．９０－２．０２（ｍ，１Ｈ），１．８３－１．７０（ｍ，２Ｈ），１．０６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），１．０１（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１７２．２，１６４．８，１３９．１，１３５．２，１３３．１（ｑ，２ＪＣ，Ｆ＝２２．５Ｈｚ），１３９．９，１２９．０，１２７．１，１２５．７，１２４．４（ｑ，１ＪＣ，Ｆ＝２７０．０Ｈｚ），１２１．３，８６．６，４２．０，２５．９，２３．６，２２．３；１９Ｆ（３７６ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ－６３．０；Ｃ２１Ｈ２０Ｆ６Ｎ２Ｏ３Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値４８５．１２７６，実測値４８５．１２８３
Figure 0007323238000013
 スキーム３．化合物ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）の合成
化合物Ｓ８（７９４．８ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液にＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２Ｏ（４００．５ｍｇ、８．０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２．５時間撹拌した後、反応混合物を真空で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、５％ＮａＨＣＯ３および食塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して化合物Ｓ９の粗生成物を得て、さらに精製することなくそのまま次工程で用いた。
化合物Ｓ９をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解させた溶液に、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１０ｍＬ）を添加した。その後、３，５－ビス（トリフルオロメチル）ベンゾイルクロリド（５５３．１ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を滴下した。一晩撹拌した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。まとめた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗油をフラッシュカラムクロマトグラフィで精製して、化合物ｓｆｆ－２－１３２（８６２．６ｍｇ、８５％収率）を無色油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ１０．１７（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｓ，２Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ），７．３６－７．２９（ｍ，５Ｈ），４．６３（ｔ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ），４．５７（ｑ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９３－３．８７（ｍ，２Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６９．０，１６３．４，１３７．４，１３３．８，１３２．２（ｑ，２ＪＣ，Ｆ＝３４．０Ｈｚ），１２８．５，１２８．０，１２７．９，１２７．６，１２５．３，１２３．０（ｑ，１ＪＣ，Ｆ＝２７１．３Ｈｚ），８３．４，７７．４，７３．７，６９．２，２８．１；１９Ｆ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ－６３．０；Ｃ２３Ｈ２３Ｆ６ＮＯ５Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値５３０．１３７８，実測値５３０．１３９５
Figure 0007323238000014
 スキーム４．化合物ｓｆｆ－３－８６（「実施例５」）の合成
化合物ｓｆｆ－２－１３２（１５２．２ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．５ｍＬ）溶液に同量のＣＦ３ＣＯＯＨ（１．５ｍＬ）を注射器を用いて室温で添加した。室温で３時間撹拌した後、反応混合物を真空で濃縮した。残渣をトルエンで２回共沸させて遊離酸化合物Ｓ１０を白色固体として得て、そのままアミドカップリングに用いた。
化合物Ｓ１０（７１．９ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１．５ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（１９ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を添加し、次いでＥｔＣＯＯＣｌ（１７．４ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を－２０℃のアルゴン雰囲気下で添加した。２０分間撹拌した後、乾燥ＴＨＦ（０．５ｍｌ）に溶解させた４－フルオロアニリン（２０．０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。その後、水１０ｍｌを添加し、混合物をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。まとめた有機層を５％ＮａＨＣＯ３および食塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して粗油を得て、フラッシュカラムにより精製することで化合物ｓｆｆ－３－８６（５２．３ｍｇ、６２％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．４２（ｂｒ，１Ｈ），１０．３５（ｂｒ，１Ｈ），８．１５（ｓ，２Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｓ，２Ｈ），７．２７－７．２３（ｍ，５Ｈ），６．９９（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），４．６８－４．６６（ｍ，１Ｈ），４．５７（ＡＢｑ，ＪＡＢ＝１５．１Ｈｚ，２Ｈ），４．１０（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９３（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，７．９Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６６．７，１６５．５，１６０．２（ｄ，１ＪＣ，Ｆ＝２３７．８Ｈｚ），１３７．６，１３３．９，１３３．１，１３３．０（ｑ，２ＪＣ，Ｆ＝３４．１５Ｈｚ），１２９．２，１２８．９，１２８．５，１２８．２，１２６．７，１２５．５（ｑ，１ＪＣ，Ｆ＝２７２．２Ｈｚ），１２２．３（ｄ，３ＪＣ，Ｆ＝７．２Ｈｚ），１１６．２（ｄ，２ＪＣ，Ｆ＝２１．８Ｈｚ），８７．８，７４．６，７０．５；１９Ｆ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ－６２．９；Ｃ２５Ｈ２０Ｆ７Ｎ２Ｏ４（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値５４４．１２２８，実測値５４５．１２６５
Figure 0007323238000015
 スキーム５．化合物ｓｆｆ－３－８７（「実施例６」）の合成
化合物Ｓ１０（５１．２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．５ｍＬ）溶液にＥＤＣＩ（２８．９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４．２ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、およびイソブチルアルコール（２５．３ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を順に添加した。反応物を室温で一晩撹拌した後、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、５％ＮａＨＣＯ３、０．５Ｎ ＨＣｌ、および食塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して化合物ｓｆｆ－３－８７（４７．４ｍｇ、８２％収率）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．２８（ｂｒ，１Ｈ），８．２１（ｓ，２Ｈ），７．９６（ｓ，１Ｈ），７．２９－７．２５（ｍ，５Ｈ），４．８７（ｂｒ，１Ｈ），４．５９－４．４９（ｍ，２Ｈ），４．０５－３．９３（ｍ，４Ｈ），１．９７－１．８９（ｍ，１Ｈ），０．９２（ｓ，３Ｈ），０．９０（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６９．９２，１３７．１６，１３２．０４（ｑ，２ＪＣ，Ｆ＝３３．８Ｈｚ），１２８．４１，１２７．９０，１２７．７５，１２７．５０，１２７．２３，１２４．９８，１２２．８９（ｑ，１ＪＣ，Ｆ＝２７２．９Ｈｚ），８２．６６，７３．６４，７１．８０，６８．８６，２７．６５，１８．８９；１９Ｆ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ－６２．９；Ｃ２３Ｈ２４Ｆ６ＮＯ５（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値５０９．１５５３，実測値５０９．１５８７
Figure 0007323238000016
 スキーム６．化合物ｓｆｆ－３－９１（「実施例７」）の合成
化合物Ｓ８（３００ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液にＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２Ｏ（１５０．２ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２．５時間撹拌した後、反応混合物を真空で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、５％ＮａＨＣＯ３および食塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して化合物Ｓ９の粗生成物を得て、さらに精製することなくそのまま次工程で用いた。
化合物Ｓ９（９３．６ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解させた溶液に飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２．５ｍＬ）を添加した。次いで、４－トリフルオロメチルベンゾイルクロリド（８０．９ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を滴下した。１時間撹拌した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。まとめた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗油をフラッシュカラムクロマトグラフィで精製して化合物Ｓ１１（９５．０ｍｇ、６１％収率）を白色固体として得た。
化合物Ｓ１１（７０．０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）溶液にＥＤＣＩ（４５．８ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（２８．３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、およびアニリン（１８．６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を順に添加した。反応物を室温で一晩撹拌した後、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、５％ＮａＨＣＯ３、０．５Ｎ ＨＣｌ、および食塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して、化合物ｓｆｆ－３－９１（６３．８ｍｇ、８７％収率）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．４７（ｓ，１Ｈ），９．９６（ｓ，１Ｈ），７．７９－７．６３（ｍ，６Ｈ），７．３５－７．２６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，７Ｈ），７．１２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７０－４．５７（ｍ，３Ｈ），４．１７（ｄｄ，Ｊ＝１１．１，２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９７（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，９．２Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６６．４７，１６５．９２，１３７．５８，１３７．２４，１３４．３５（ｑ，２ＪＣ，Ｆ＝３２．８Ｈｚ），１３３．７２，１２８．９８，１２８．６９，１２８．２８，１２８．０８，１２７．７２，１２５．８５，１２４．６１，１２３．４２（ｑ，１ＪＣ，Ｆ＝２７４．２Ｈｚ），１１９．９２，８６．９５，７３．９４，７０．１４；１９Ｆ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ－６３．１；Ｃ２４Ｈ２２Ｆ３Ｎ２Ｏ４（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値４５９．１４４８，実測値４５９．１５０２
Figure 0007323238000017
 スキーム７．化合物ｓｆｆ－３－９８－２およびＡｍｙ－１－４（「実施例８および１１」）の合成
Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．，Ｃｈｅｍ．，２００１，６６，７３０３－７３１２に記載された手順に従って出発材料Ｓ１３を調製した。化合物Ｓ１３（１ｍｍｏｌ、１当量）のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３（１：１、１０ｍｌ）溶液にＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２Ｏ（１．６ｍｍｏｌ、１．６当量）を添加した。室温で２．５時間撹拌した後、反応混合物を真空で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、５％ＮａＨＣＯ３および食塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して遊離アミンＳ１４の粗生成物を得て、さらに精製することなくそのまま次工程で用いた。遊離アミンＳ１４をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）に溶解させた溶液に飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５ｍＬ）を添加した。その後、３，５－ビス（トリフルオロメチル）ベンゾイルクロリド（１．２ｍｍｏｌ、１．２当量）を滴下した。１時間撹拌した後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。まとめた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して粗油を得て、シリカゲルカラムクロマトグラフィで精製することで化合物Ｓ１５を得た。
化合物Ｓ１５のＣＨ２Ｃｌ２溶液に同量のＣＦ３ＣＯＯＨを注射器を用いて室温で添加した。室温で３時間撹拌した後、反応混合物を真空で濃縮した。残渣をトルエンで２回共沸して遊離酸化合物Ｓ１６を得て、そのままアミドカップリングに用いた。遊離酸Ｓ１６のＣＨ２Ｃｌ２溶液にＥＤＣＩ（１．５ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＨＯＡｔ（１．３ｍｍｏｌ、１．３当量）、およびアニリン（１．１ｍｍｏｌ、１．１当量）を順に添加した。反応物を室温で一晩撹拌した後、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、５％ＮａＨＣＯ３、０．５Ｎ ＨＣｌ、および食塩水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製して、化合物ｓｆｆ－３－９８－２およびＡｍｙ－１－４（「実施例８および１１」）を得た。
Figure 0007323238000018
 化合物ｓｆｆ－３－９８－２：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．４２（ｓ，１Ｈ），１０．２９（ｓ，１Ｈ），８．１６（ｓ，２Ｈ），８．０３（ｓ，１Ｈ），７．７０－７．６９（ｍ，２Ｈ），７．３６－７．２６（ｍ，７Ｈ），７．１３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７５－４．５４（ｍ，３Ｈ），４．３８－４．３７（ｍ，１Ｈ），１．３４（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６６．６４，１６５．２７，１３８．５４，１３８．０３，１３３．４９，１３３．０８（ｑ，２Ｊ＝３４．８Ｈｚ），１２９．６０，１２９．２７，１２８．８２，１２８．４７，１２８．１４，１２６．７０，１２５．２７，１２３．１７（ｑ，１Ｊ＝２６３．５Ｈｚ），１２０．４４，８９．５９，７６．５５，７２．１７，１４．４９．１９Ｆ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ－６２．９；Ｃ２６Ｈ２３Ｆ６Ｎ２Ｏ４（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値５４１．１４７８，実測値５４１．１４６５
Figure 0007323238000019
 化合物Ａｍｙ－１－４：１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１７０．６４，１６５．１３，１３８．１２，１３４．２７，１３２．４０（ｑ，２Ｊ＝３３．９Ｈｚ，１Ｃ），１２９．０６，１２８．２３，１２５．７８，１２４．８５，１２３．６２（ｑ，１Ｊ＝２６９．１４Ｈｚ），１２０．５１，９０．１７，３８．３１，２６．３０，１３．４７，１１．３５
Figure 0007323238000020
Ｈ．－ｙ．Ｚｈａ，Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ（ＰｈＤ、香港大学、香港、２０１２）に記載の手順に従って化合物Ａｍｙ－１－８の出発材料を調製した。スキーム７に記載の手順と同様の手順で、化合物Ａｍｙ－１－８を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１２．６１（ｓ，１Ｈ），１０．８９（ｓ，１Ｈ），１０．２５（ｓ，１Ｈ），８．３９（ｓ，２Ｈ），８．３４（ｓ，１Ｈ），７．６３－７．５８（ｍ，３Ｈ），７．３３－７．２７（ｍ，４Ｈ），７．０８－６．９７（ｍ，３Ｈ），４．８９－４．８７（ｍ，１Ｈ），３．３１－３．２８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６９．０３，１６２．９０，１３８．７９，１３６．４８，１３４．５９，１３１．０１（ｑ，２ＪＣ，Ｆ＝３３．３Ｈｚ），１２９．１６，１２８．６４，１２７．８７，１２５．８６，１２４．３８，１２４．２０，１２３．４４（ｑ，１ＪＣ，Ｆ＝２７３．１Ｈｚ），１２１．４０，１１９．９９，１１８．８６，１１８．８３，１１１．７９，１０９．１３，８６．１２，２７．４７；１９Ｆ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ－６１．４；Ｃ２６Ｈ２０Ｆ６Ｎ３Ｏ３（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値５３５．１３２５，実測値５３６．１３５７
Figure 0007323238000021
Ｆ．－Ｆ．Ｓｈｅｎ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ α－ａｍｉｎｏｘｙ ａｃｉｄ－ｂａｓｅｄ ｃａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｓ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔｓ（ＰｈＤ、香港大学、香港、２０１８）に記載の手順で、化合物ｓｆｆ－２－１００を白色固体として得た（７３％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１１．２２（ｂｒ，１Ｈ），１０．００（ｓ，１Ｈ），９．７６（ｂｒ，１Ｈ），８．０８（ｓ，２Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），７．６４（ｓ，１Ｈ），７．６２（ｓ，１Ｈ），７．３０－７．２６（ｍ，１２Ｈ），７．１０－７．０６（ｍ，１Ｈ），４．６２－４．５２（ｍ，４Ｈ），４．０３（ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９２－３．８７（ｍ，１Ｈ），３．４２（ｄ，Ｊ＝１３．６２Ｈｚ，１Ｈ），３．１１－３．０５（ｍ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１７２．０，１７０．４，１６９．０，１３８．９，１３８．８，１３７．５，１３４．８，１３３．０（ｑ，２ＪＣ，Ｆ＝３３．２Ｈｚ），１３０．７，１２９．７，１２９．４，１２９．３，１２８．９，１２８．７，１２８．６，１２７．８，１２６．１，１２５．６，１２４．４（ｑ，１ＪＣ，Ｆ＝２７２．３Ｈｚ），１２１．４，８８．３，８４．８，７４．５，６９．６，３８．８；１９ＦＮＭＲ（３７６．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ－６２．９；Ｃ３４Ｈ３０Ｆ６Ｎ３Ｏ６（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：計算値６９０．２０３３，実測値６９０．２００３
実施例２．ｓｆｆ－２－１１２、ｓｆｆ－３－８５、ｓｆｆ－２－１２４、ｓｆｆ－２－１３２、ｓｆｆ－３－８６、ｓｆｆ－３－８７、ｓｆｆ－３－９１、ｓｆｆ－３－９８－２、ｓｆｆ－３－１００、ｓｆｆ－３－１０１、Ａｍｙ－１－４、Ａｍｙ－１－８、ｓｆｆ－２－１００、およびＦＰＭ－１－８７（実施例１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４）を含む１４種の化合物が卵巣ＨＥＹ Ａ８ ＣＳＣに対して毒性を示した。
材料および方法
細胞培養
ヒト卵巣癌細胞株ＨＥＹ Ａ８およびＳＫＯＶ３は、Ａｌｉｃｅ Ｗｏｎｇ教授のグループ（香港大学）から寄贈された。１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培地において、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で細胞を成長させた。スフェアの単離および培養は、無血清の幹細胞選択的条件で、Ｉｐ ｅｔｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０１４，５，９１３３－９１４９に記載の通り行った。要約すると、プレーティングから１～２週間後、非接着性球状細胞クラスターが観察でき、これらを低速遠心分離により単一細胞から分離した。８～１０回目の継代後、非接着性球状細胞クラスターが明瞭なスフェアとして出現した。この選択条件を用いて、ＨＥＹ Ａ８スフェア（ＨＥＹ Ａ８ ＳＰ）またはＳＫＯＶ３スフェア（ＳＫＯＶ３ ＳＰ）を酵素的に解離し、幹細胞選択的条件下で３日以内にスフェアに再形成させることができた。分化させるために、解離したスフェア細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを添加した培地（ＭＣＤＢ１０５：Ｍ１９９＝１：１）で組織培養プレートにプレーティングした。
毒性試験
１００ｍｍペトリ皿中の無血清ＭＣＤＢ１０５培地１０ｍＬに、ＨＥＹ Ａ８ ＳＰ細胞（５×１０４）をトリプリケートで７日間プレーティングしてスフェアを形成した。化合物を最終濃度５μＭで添加した。さらに、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離で回収し、培地を除去した。次いで、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試薬１００μＬを各管に添加して、振盪させながら１０分間インキュベートした。その後、試薬を９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で細胞生存率を測定した。
結果
アミノキシ酸系化合物の小規模ライブラリをスクリーニングした後、ｓｆｆ－２－１１２、ｓｆｆ－３－８５、ｓｆｆ－２－１２４、ｓｆｆ－２－１３２、ｓｆｆ－３－８６、ｓｆｆ－３－８７、ｓｆｆ－３－９１、ｓｆｆ－３－９８－２、ｓｆｆ－３－１００、ｓｆｆ－３－１０１、Ａｍｙ－１－４、Ａｍｙ－１－８、ｓｆｆ－２－１００、およびＦＰＭ－１－１８７（実施例１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４）を含む１４種の分子が、ＨＥＹ Ａ８ ＣＳＣの細胞生存率を著しく低下させた（図１）。なかでも、化合物ｓｆｆ－２－１１２、ｓｆｆ－２－１３２、およびｓｆｆ－２－１００が最も高い毒性を示した。
実施例３．化合物ｓｆｆ－２－１１２、ｓｆｆ－２－１２４、ｓｆｆ－２－１３２、およびｓｆｆ－２－１００は、がん細胞よりもＨＥＹ Ａ８およびＳＫＯＶ３ ＣＳＣの死を選択的に誘導できる。
材料および方法
９６ウェルプレート中の完全培地０．１ｍＬに、ＨＥＹ Ａ８またはＳＫＯＶ３がん細胞をトリプリケートで２４時間プレーティングした。その後、培地を、様々な濃度の化合物を含む新たに調製した培地に交換した。細胞をさらに４８時間インキュベートした。次いで、製造元の指示に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試薬で細胞生存率を測定した。マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で５５０ｎｍにおける発光を測定した。
１００ｍｍペトリ皿中の無血清ＭＣＤＢ１０５培地１０ｍＬに、ＨＥＹ Ａ８ ＳＰ細胞またはＳＫＯＶ３ ＳＰ細胞（５×１０４）をトリプリケートで７日間プレーティングしてスフェアを形成した。次いで、各種濃度の薬物を添加した。さらに、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離で回収し、培地を除去した。次いで、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試薬１００μＬを各管に添加し、振盪させながら１０分間インキュベートした。その後、試薬を９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で細胞生存率を測定した。
結果
図４に示すように、３種の化合物はいずれも、ＣＳＣよりも卵巣がん細胞に対して選択性を示した。とりわけ、化合物ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）が最高の選択性を示した。化合物ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）のＨＥＹ Ａ８ ＣＳＣに対するＩＣ５０値は１．０±０．９μＭであり、Ｈｅｙ Ａ８がん細胞に対しては５２．９±１．９μＭ、ＳＫＯＶ３ ＣＳＣに対しては１．０±０．９μＭ、ＳＫＯＶ３がん細胞に対しては６３．４±８．９μＭであった。さらなる検討では、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）およびｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）に注目した。
実施例４．化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）はＣＤ１３３＋細胞のポピュレーションを減少させることができる。
材料および方法
ＨＥＹ Ａ８細胞を濃度２．５×１０４細胞／ｍＬでＤＭＥＭ培地に懸濁させた懸濁液を６０ｍｍ細胞培養ディッシュに播種した。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で細胞を２４時間３７℃でインキュベートした後、新鮮な培地、またはパクリタキセル（１００ｎＭ）、ｓｆｆ－２－１１２（１５μＭ）、もしくは化合物ｓｆｆ－２－１３２（１５μＭ）を含む培地４ｍＬを添加した。０．１％ＤＭＳＯを含む培地をネガティブコントロールとして用いた。３日後、培地を除去し、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄した後、製造元の指示に従ってＰＥ結合ＣＤ１３３抗体で染色した。フローサイトメトリーで蛍光を測定した。
結果
ＣＤ１３３は卵巣がん細胞のがん幹細胞マーカーであることが報告されている。化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）がＣＳＣポピュレーションに与える具体的な影響を評価するために、ＨＥＹ Ａ８細胞のＣＤ１３３をＰＥ結合ＣＤ１３３抗体で測定した（図５）。最終濃度１０ｎＭのタキソールをネガティブコントロールとして用いた。化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）による処理後、ＣＤ１３３＋細胞ポピュレーションは２１．８％から１２．６％に減少した。化合物ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）による処理後、卵巣がん細胞中のＣＤ１３３＋細胞ポピュレーションは２１．８％から１．９％と、約１０分の１に減少した。対照的に、パクリタキセルによる処理では、ＣＤ１３３＋細胞ポピュレーションは２１．８％から３１．６％に増加した。これらの結果から、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）はＨＥＹ Ａ８ ＣＳＣポピュレーションを選択的に減少させることができることが確認された。
実施例５：化合物ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）はスフェロイド形成を低減できる。
材料および方法
濃度１５μＭもしくは３０μＭの化合物ＤＭＳＯ ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）でＨｅｙ Ａ８細胞を４８時間処理した。次いで、細胞培養ディッシュ中の完全培地で細胞を３日間回復および成長させた。その後、細胞を５×１０４細胞／ｍＬの密度で低接着ディッシュに５日間移して、スフェアを形成させた。各ディッシュ中のスフェア数を数えた。
結果
浮遊培養条件でのスフェロイド形成がＣＳＣポピュレーションと相関することは周知である。卵巣がんＨＥＹ Ａ８細胞の浮遊培養時スフェロイド形成能に対するｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）の効果についても評価した。化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）での処理の結果、コントロールと比較して、スフェア数が著しく減少した（図６）。
実施例６：ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）は生体内腫瘍形成能を低減できた。
材料および方法
化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）による処理後の細胞の生体内腫瘍播種能を評価した。タキソールをネガティブコントロールとして用いた。この実験のために、懸濁培地で２日間、ＨＥＹ Ａ８ ＣＳＣをｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）、ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）、またはタキソールによりそれぞれ前処理した。次いで、薬物を含まない完全培地で細胞を１０日間増殖させた。その後、１０６個の細胞をマウスに皮下注射した。注射後２５日間、腫瘍の大きさを測定した。
結果
図７に示すように、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）による前処理の結果、タキソールまたはＤＭＳＯ前処理と比較して、腫瘍播種能が著しく低下した。これらの知見から、卵巣ポピュレーション内のＣＳＣは、パクリタキセルに対しては抵抗性があるが、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）による処理に対しては感受性があることがわかった。
実施例７：化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）はミトコンドリア膜電位を脱分極できた。
材料および方法
ＨＥＹ Ａ８細胞を５×１０４細胞／ｍＬの濃度でＤＭＥＭ培地に懸濁させた懸濁液を３０ｍｍ細胞培養ガラスボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）に播種した。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で細胞を２４時間３７℃でインキュベートした。培地を吸引し、細胞をＰＢＳバッファで２回洗浄した。次いで、２．５μＭ ＪＣ－１を含むＨＢＳＳバッファ１ｍＬを添加した。細胞を３７℃で２０分間インキュベートしてから、バッファを吸引した。細胞をＰＢＳバッファで２回洗浄し、カチオントランスポーターで１０分間処理した。ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ７８０（赤チャンネル：λｅｘ＝５４３ｎｍ、緑チャンネル：λｅｘ＝４８８ｎｍ）を用いた共焦点イメージングで蛍光をモニターした。ＺＥＮおよびＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージを用いて定量データを得た。
結果
図８ａに示すように、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）は、用量依存的にＨＥＹ Ａ８細胞のミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）を効果的に脱分極できる。また、ＨＥＹ Ａ８細胞中のＭＭＰに関してこの化合物の動態研究を行った。最終濃度１０μＭの化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）を１８０秒の時点で添加した。各画像の間隔は３０秒であった。ＪＣ－１の赤／緑蛍光比率が低下していることから、ＭＭＰが脱分極したことがわかる。図８ｂに示す結果から、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）を添加した際、直ちにＭＭＰが脱分極した。
実施例８．化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）はミトコンドリア中でスーパーオキシド産生を誘導できた。
材料および方法
ＨＥＹ Ａ８細胞を５×１０４細胞／ｍＬの濃度でＤＭＥＭ培地に懸濁させた懸濁液を３０ｍｍ細胞培養ガラスボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）に播種した。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で細胞を２４時間３７℃でインキュベートした。培地を吸引し、細胞をＰＢＳバッファで２回洗浄した。次いで、４μＭ ＨＫＳＯＸ－２ｍを含むＨＢＳＳバッファ１ｍＬを添加した。細胞を３７℃で３０分間インキュベートしてから、バッファを吸引し、ＨＢＳＳバッファで２回洗浄した。ＨＢＳＳバッファ０．８ｍＬ中で細胞をイメージングした。共焦点顕微鏡（ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ７１０、赤チャンネル：λｅｘ＝５４３ｎｍ）で蛍光をモニターした。ｔ＝１８０秒において、ＨＢＳＳバッファ０．２ｍＬ中の化合物を添加して、最終濃度を５μＭとした。ＺＥＮおよびＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて定量データを得た。
結果
化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）の場合、３０分以内にスーパーオキシド産生が約２倍に増加したことが検出された。
実施例９．化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）は細胞呼吸に影響を与えることができた。
材料および方法
酸素消費率（ＯＣＲ）を測定するＸＦ２４細胞外フラックスアナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、細胞呼吸を測定した。接着Ｈｅｙ Ａ８細胞を５００００細胞／ウェルでその培養培地２００ｍＬに播種し、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で２４時間３７℃でインキュベートした。次いで、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加した無血清の高グルコースＤＭＥＭ６７０μＬ／ウェルで培地を交換した。予めプログラムされた通り、オリゴマイシン（最終濃度１μＭまで）、ＦＣＣＰ（最終濃度５００ｎＭまで）、アンチマイシンＡおよびロテノン（最終濃度０．５μＭまで）を添加した際、既定の時間間隔で細胞外フラックスアナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ）を用いて酸素消費率（ＯＣＲ）を測定した。
結果
化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）または化合物ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）を添加した後、ＯＣＲは直ちに上昇した。しかし、その後、続くＦＣＣＰ、アンチマイシンＡ、およびロテノンの添加に対する細胞呼吸応答は著しく低下した（図１０）。これらの結果から、呼吸鎖が両化合物から影響を受けることがわかった。このような効果は、合成分子の添加量が多いほど顕著であった。
実施例１０．化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）は細胞アポトーシスを誘導できた。
材料および方法
ＨＥＹ Ａ８細胞を５×１０４細胞／ｍＬの濃度でＤＭＥＭ培地に懸濁させた懸濁液を６０ｍｍ細胞培養ディッシュに播種した。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で細胞を２４時間３７℃でインキュベートした後、新鮮な培地、または化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）もしくはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）を各種濃度で含む培地４ｍＬを添加した。０．１％ＤＭＳＯ含む培地をネガティブコントロールとして用いた。２日後、培地を吸引し、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄した後、製造元の指示に従ってＰＩおよびアネキシンＶで染色した（Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８＆Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩアナライザー）で分析した。
免疫染色実験のために、各種濃度の化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）または化合物ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）で細胞を４８時間処理し、その後、ＰＢＳバッファで２回洗浄し、０．１％ベンゾナーゼを含む２×ＳＤＳバッファで溶解させた。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００を用いたＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造元の指示に従ってタンパク質抽出物を定量した。タンパク質ライセート（およそ５０μｇ／レーン）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜を膜ブロッキング液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに１時間インキュベートした。次いで、穏やかに撹拌しながら、ブロッキング液中で関連一次抗体を用いてブロットを４℃で一晩プロービングした。膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳで５分間３回洗浄し、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。抗原をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で検出した。ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してイメージングを行った。
結果
図１１ａに示すように、ＣＳＣのＤＭＳＯ処理単独では、４．９２％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）により５μＭで処理すると、２１．０％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。化合物ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）により５μＭで処理すると、３０．４％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。がん細胞の場合、ＤＭＳＯ処理単独では、１．７３％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）により３０μＭで処理すると、８．２１％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。
化合物ｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）により３０μＭで処理すると、１．３０％のアネキシンＶ陽性細胞が産生された。ＣＳＣに対する化合物の濃度は、がん細胞に対する濃度の６分の１であったにもかかわらず、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）で処理したＣＳＣのアポトーシス細胞ポピュレーションは、がん細胞の場合よりもはるかに多かった。
ＣＳＣにおいてはまた、化合物の濃度ががん細胞の場合の濃度の１０分の１であっても、タンパク質ＰＡＲＰ１、カスパーゼ３、およびカスパーゼ９の活性化が観察された（図１１ｂ）。これらの結果から、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）が卵巣ＣＳＣに対して高い選択性を有することがさらに明らかとなった。
実施例１１．化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）は細胞オートファジーを抑制できた。
材料および方法
ＨＥＹ Ａ８がん細胞およびＣＳＣを化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）で２４時間処理した。その後、細胞をＰＢＳバッファで２回洗浄し、溶解させて免疫染色を行った。免疫染色方法は実施例１０に記載した方法と同じであった。
結果
ＣＳＣ中のＬＣ３－ＩＩおよびｐ６２のレベルがいずれも上昇していることから、オートファジーが抑制されたことがわかった。ＣＳＣにおいては、化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）の濃度ががん細胞の場合の濃度の１０分の１であっても、このような効果はより顕著であった。
実施例１２．化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１３２（「実施例４」）は肝臓がんＨｕｈ７細胞およびＣＳＣの死を誘導できた。
材料および方法
Ｈｕｈ－７細胞を、製造元の指示に従ってＰＥ結合ＣＤ１３３抗体（ＨＣＣがん幹細胞マーカー）で染色した。その後、フローサイトメトリーでＣＤ１３３＋細胞（Ｈｕｈ７がん幹細胞）およびＣＤ１３３－細胞を分別し、新鮮なＤＭＥＭ培地を含む９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、培地を、各種用量の化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１２４（「実施例３」）を含む新鮮な培地に変更した。４８時間後、細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光試薬で分析した。
結果
化合物ｓｆｆ－２－１１２（「実施例１」）またはｓｆｆ－２－１２４（「実施例３」）は、ＣＤ１３３－およびＣＤ１３３＋細胞の両方の死を誘導できる。化合物ｓｆｆ－２－１２４の場合、ｈｕｈ７がん幹細胞（ＣＤ１３３＋ポピュレーション）に対する毒性がＣＤ１３３－細胞に対する毒性よりも高かった。
上述した特定の実施形態の説明は、本開示の一般的性質を十分に明らかにすることで、他者が、関連する技術分野の当業者が備える知識（本明細書に引用され、参照により組み込まれる文献の内容を含む）を適用して、過度の実験を行うことなく、本開示の一般概念から逸脱せずに、かかる特定の実施形態を種々の用途に容易に修正および／または適合させることができるようにするものである。したがって、このような適合および修正は、本明細書に示された教示および指導に基づいて、開示された実施形態の意味および均等物の範囲内にあると意図される。本明細書中の用語または語句は、説明を目的とするものあって限定を目的とするものではなく、本明細書の用語または語句は、本明細書に示された教示および指導に照らして、関連する技術分野の当業者の知識と組み合わせて、当業者によって解釈されるべきであることを理解すべきである。
以上、本開示の様々な実施形態について説明したが、これらは例として示されたものであり、限定するものではないことを理解すべきである。本開示の思想および範囲から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更がなされ得ることは、関連する技術分野の当業者には明らかであろう。したがって、本開示は、上述した例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、下記特許請求の範囲およびその均等物に従ってのみ定義されるべきである。

Claims (10)

  1. Figure 0007323238000022
     からなる群より選択される細胞死誘導化合物。
  2. がん治療用薬物として使用される、請求項１に記載の化合物。
  3. 上記がんは、卵巣がんおよび肝臓がんからなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
  4. がん幹細胞阻害剤として使用される、請求項１に記載の化合物。
  5. 上記がん幹細胞は、卵巣がん幹細胞および肝臓がん幹細胞からなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
  6. ミトコンドリア機能に影響を与えることまたはリソソームｐＨを乱すことにより誘導されるがんまたは他の疾患の治療のための薬物として使用される、請求項１に記載の化合物。
  7. 上記ミトコンドリア機能は、ミトコンドリア膜電位の脱分極、ミトコンドリアの形態変化、スーパーオキシド産生、および呼吸の減衰のうち少なくとも１つから選択される、請求項６に記載の化合物。
  8. 少なくとも、請求項１に記載の化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、または水和物、および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  9. Figure 0007323238000023
     から選択される化合物、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、または水和物、および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  10. さらに、別の抗がん剤を含む、請求項８または９に記載の医薬組成物。
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Shen, Fang-Fang et al.，Mediating K+/H+ Transport on Organelle Membranes to Selectively Eradicate Cancer Stem Cells with a Small Molecule，Journal of the American Chemical Society ，2020年，142(24)，pp.10769-10779
Yang, Dan et al.，Novel Turns and Helices in Peptides of Chiral α-Aminoxy Acids，Journal of the American Chemical Society，1999年，121(3)，pp.589-590

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