JP2013540131A - 烏梅抽出物を含有する痴呆（認知症）予防または治療用組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、烏梅（Fructus Mume）の抽出物を含有する痴呆(認知症)の予防または治療用組成物に関するもので、本発明の烏梅抽出物が血管性痴呆動物モデルにおいて慢性血管性脳損傷によって誘導された海馬損傷の正常化（ＥＲＫリン酸化正常化、ＣｈＡＴ増加、ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ正常化）効果及び空間記憶能力改善効果に優れているので、血管性痴呆などのように血管性脳損傷に隋伴する痴呆疾患の予防または治療のための医薬品、痴呆疾患の予防または改善用健康機能食品として有用に使用することができる。

Description

本発明は、烏梅抽出物を含有する痴呆予防または治療用組成物に関するものである。

痴呆（認知症、dementia）は、職業、社会生活及び対人関係で正常な日常生活に障害を与える程に記憶障害がありながら言語障害、方向感覚喪失、計算力低下、性格及び感情変化などの４種の中で、１種以上が示される時に痴呆と診断される。痴呆は、正常な老化とは区分しなければならない病的な症状であり、その原因によってアルツハイマー性痴呆（Alzheimer’s disease）、血管性痴呆（vascular dementia）、その他アルコール中毒、外傷、パーキンソン病の後遺症が原因となる痴呆に区別される。血管性痴呆は、主に脳梗塞または脳卒中などが発生した場合で、発病部位周辺の脳細胞が損傷を被って記憶力喪失などの症状が誘発されることが知られている。一方、アルツハイマー性痴呆は、脳細胞破壊による退行性脳疾患で、初期には記憶力減退、性格の変化及び思考力低下などの症状を示して徐々に進行するが、大部分の患者は８〜１０年以内に肺炎などで死亡することが知られている。最近の疫学研究によると高血圧、糖尿病、高脂血症及び心臓疾患などの脳血管疾患の危険因子が血管性痴呆だけではなくアルツハイマー性痴呆の発病率を増加させるという報告もあったが、いまだに正確な病因や治療法は知られていないのが実情である。

そこで、前記病変及び原因による作用機序別痴呆治療剤としては、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、抗酸化剤、消炎剤、ホルモン製剤、コレステロール低下剤及びベータアミロイド生成遮断剤などがある。前記アセチルコリンエステラーゼは損傷されないで残っているコリン性神経系の活性を増加させることで損傷した認知機能を部分的に回復させようとするものである。

２００８年の痴呆患者は、約４０万名と推算される。急速な高齢化で２０１０年には４６万１０００人、２０２０年には６９万３０００人に急増するという分析も出ている。特に痴呆患者が増えるにつれて、国内の痴呆治療剤市場もまた約１，３００億ウォン規模を越えるほどに急な上昇曲線を示している。

一方、烏梅（Fructus Mume）は、梅（Prunus mume）の熟していない実をかめに入れてふたをした後、泥で封して黒くなるまで加熱したもので、長引いた咳や痰を鎮めて、喉の渇きの解消に良く、神経過敏で胸が息苦しくて消化が良くない時に使用すると良いと知られている。また、前記烏梅は、免疫機能、抗菌作用、血糖降下効果があることが知られていて、従来から烏梅に対する効能研究は、烏梅抽出物を含有するヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ活性抑制効果（特許文献１）、烏梅抽出物から分離したベータシトステロール−Ｏ−Ｄ−グルコースの鎮痛作用（特許文献２）、烏梅抽出物またはその分画物を有効成分として含有する血行改善組成物（特許文献３）などがある。また従来から、梅の実、黄精（ソロモンシール）、葛根及び桂皮抽出物を加減した加味四君子湯が痴呆の予防及び治療に効能があるという研究があるが（特許文献４）。前記加味四君子湯で梅の実抽出物は、消化機能及び糖質代謝を促進して脳に行くエネルギー（ブドウ糖）の供給を円滑にして脳活性を増加させる役割を担当していて、特有の酸味で味感を良くする役割をすると報告されていて、梅の実抽出物による痴呆予防及び治療効能は報告されたことがない。また、今まで梅の実を加工した烏梅抽出物自体の海馬損傷回復作用に対する研究は報告されたことがない。

それで、本発明者らは烏梅抽出物が血管性痴呆動物モデルにおいて記憶空間能力を正常化させて海馬損傷を正常化させる効能に優れていて、痴呆予防または治療用組成物の有効成分として有用に使用できることを確認して本発明を完成した。

韓国特許公開第２００６−００４０２５４号 韓国特許公開第１９９８−００４３９２５号 韓国特許公開第２０１０−００４２４１４号 韓国特許公開第２００５−００３５９０６号

本発明の目的は、烏梅抽出物を有効成分として含有する痴呆予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、烏梅抽出物を有効成分として含有する痴呆予防または改善用健康機能食品組成物を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は烏梅抽出物を有効成分として含有する痴呆の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

また、本発明は烏梅抽出物を有効成分として含有する痴呆の予防または改善用健康機能食品用組成物を提供する。

また、本発明は薬学的に有効な量の烏梅抽出物を痴呆にかかった個体に投与する工程を含む痴呆治療方法を提供する。

また、本発明は薬学的に有効な量の烏梅抽出物を個体に投与する工程を含む痴呆予防方法を提供する。

また、本発明は痴呆治療または予防のための医薬製造のための烏梅抽出物の用途を提供する。

同時に、本発明は痴呆の予防または改善のための健康機能食品製造のための烏梅抽出物の用途を提供する。

以下、本発明を詳しく説明する。

本発明は、烏梅抽出物を有効成分として含有する痴呆予防または治療用薬学的組成物を提供する。

本発明の烏梅抽出物は、
１）烏梅を水、アルコールまたはこれらの混合物で抽出する工程、及び
２）工程１）の抽出物を減圧濃縮及び乾燥させて乾燥粉末を得る工程を含む製造方法によって製造することが好ましいが、前記方法に限定されない。

前記製造方法において、工程１）では烏梅は梅の熟していない実をかめに入れてふたをした後、泥で封合して黒くなるまで加熱したもので、栽培したものまたは市販のものなどを制限なしに使用することができる。

前記製造方法において、工程１）の水は蒸留水を用いることを特徴とし、アルコールはＣ_１ないしＣ_４の低級アルコールを用いることを特徴とし、前記低級アルコールはエチルアルコールまたはメタノールであることを特徴とする。さらに、有機物質は１００％アルコールによる溶出がさらによく、配糖体はアルコール水溶液で溶出がさらによくなされるので、必要によってアルコールまたはアルコール水溶液を選択して使用することができる。抽出時の溶媒は、烏梅分量の２ないし１０倍添加して抽出することが好ましく、３ないし４倍添加して抽出することがさらに好ましいが、それに限定されない。抽出方法は、熱水抽出、冷浸抽出、還流抽出、ろ過または超音波抽出など当業界の一般的な抽出方法を使用し、超音波または熱水抽出することが好ましく、超音波熱併合抽出がさらに好ましいがそれに限定されない。抽出時の溶媒の温度は、２０℃〜１００℃であることが好ましく、９５℃であることがさらに好ましいがそれに限定されない。また、抽出時間は１〜２４時間が好ましく、２時間がさらに好ましいがそれに限定されない。同時に、抽出回収は、１〜５回であることが好ましく、３回反復抽出することがさらに好ましいがそれに限定されない。

前記製造方法において、工程２）の減圧濃縮及び乾燥過程は当業界で用いられる通常の方法によって行なうことができる。

前記痴呆は、血管性痴呆またはアルツハイマー性痴呆であり得、好ましくは血管性痴呆であることが好ましいがそれに限定されない。

本発明の具体的な実施例で、乾燥した烏梅（２ｋｇ）を超音波熱併合抽出機（OM30-EP,SONIMEDI社）に入れて蒸留水８ｌを加えて９５℃で１２０分間抽出して、抽出された抽出液を湯薬乾燥器（EXDRYER,SONIMEDI社）で乾燥して烏梅抽出物を製造した（収率１６．２２５％）。

また、本発明の具体的な実施例で、血管性痴呆動物モデルを製作するために実験動物はウイスターラットで、慢性大脳血流低下は両側総頸動脈永久狭窄（Bilateral common carotid artery occlusion,2VO、以下「脳損傷（ＢＣＣＡｏ）」とする）で誘導した（Wakitaら,1994年）。前記製作された動物モデルの薬物経口投与において、本発明による烏梅抽出物経口投与濃度は、低濃度（１００ｍｇ／ｋｇ）、中農度（２００ｍｇ／ｋｇ）と高濃度（４００ｍｇ／ｋｇ）に定めて、釣藤散（Chotosan）（３００ｍｇ／ｋｇ）対照薬物投与群、模擬手術群と実験群の総６グループを適用して実験を設計した。

本発明の具体的な実施例で、本発明による烏梅抽出物の血管性痴呆動物モデルで行動検査を通じて効果を調べるために、血管性痴呆動物モデルに烏梅抽出物を３週間投与してトライアル訓練（水に入水して標識筒をさがし出す能力）を行なった。水中迷路でネズミの空間記憶試験を行なった結果、脳損傷群（ＢＣＣＡｏ）に比べて烏梅抽出物投与群は、海馬依存的学習の習得障害を示した（図１）。模擬手術群は脳損傷群に比べて水中空間記憶課題をよくこなした。実施例１の烏梅抽出物を処理した烏梅抽出物投与群の場合、実施例１の抽出物２００ｍｇ／ｋｇ投与群がほぼ対照群水準の良い行動を示した。統計検証の結果、集団間に差異があり（Ｆ（５，５３）＝８．２６、ｐ＝０．０００）訓練回数が増加するにしたがって隠されたプラットホームを探し出す速度が早くなった（Ｆ（３，１５９）＝９８．４８，ｐ＝０．０００）。集団間の差を知るための事後分析（post hoc）によると、ＢＣＣＡｏ集団と比べて、烏梅２００ｍｇ／ｋｇの投与を受けた動物は著しく空間記憶学習結果が良かった（ｐ＝０．０２７）。したがって、本発明による烏梅抽出物は空間記憶能力を効果的に正常化できるので、痴呆予防または治療に有用に使用することができる。二度の試験施行（probe trial）は結果でも、脳損傷群（ＢＣＣＡｏ）は模擬手術群に比べて著しくプラットホームの位置をよく憶えることができなかった（Ｆ（５，５３）＝７．０５、ｐ＝０．０００）（図２）。４日と８日訓練後に行なった試験施行で、脳損傷（ＢＣＣＡｏ）及び烏梅抽出物２００ｍｇ／ｋｇ投与群は、模擬手術群に比べてプラットホームの大きさの５倍程度の領域でのスイミングが著しく少なかった（ｐ＝０．０１４，first probe trial）。したがって、本発明による烏梅抽出物は記憶能力を増進させることを示す。

本発明の具体的な実施例で、神経生物学的指標検査（in vivo）を実施した。図４は、ウエスタンブロット結果で、図５は前記ウエスタンブロット結果を示すグラフで、本発明による烏梅抽出物の海馬損傷の正常化（ＥＲＫ(細胞外シグナル調節キナーゼ）リン酸化正常化、ＣｈＡＴ増加）効果を示すグラフである。図６はウエスタンブロット結果で、図７は前記ウエスタンブロット結果を示すグラフで、本発明による烏梅抽出物の海馬損傷の正常化（NF-kappa Bの水準が正常化）効果を示すグラフである。脳損傷群（ＢＣＣＡｏ）は、模擬手術群と比べてＥＲＫの水準に違いはないが、ＥＲＫリン酸化が相当に高かった。烏梅抽出物処理によって、ＥＲＫリン酸化程度が有意に減少した（ｐ＜０．０５）。脳損傷群の海馬のＣｈＡＴ（コリンアセチルトランスフェラーゼ、アセチルコリンの生成に用いられる酵素）は、模擬手術群に比べて減少し、減少したＣｈＡＴの水準は烏梅抽出物の投与によって正常化された。烏梅抽出物処理によって、ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂの水準が正常化された。

本発明の具体的な実施例で、組織学的指標検査(in vivo)を実施した。

海馬のマイクログリア細胞を探知するために、モノクローン抗体Ｉｂａ−１（ionized calcium-binding adaptor molecule）を使用した。このＩｂａ−１は、マイクログリア細胞とマイクロフェーズ（microphases）に発現する。図５は、烏梅抽出物処理による海馬内のマイクログリア細胞数の変化を示す。図８は組織免疫染色の結果で、図９は前記組織免疫染色結果を示すグラフである。脳損傷群（ＢＣＣＡｏ）は、模擬手術群と比べてマイクログリア細胞数が相当に高かった。烏梅抽出物２００ｍｇ／ｋｇ処理によってマイクログリア細胞の発現程度が有意に減少した（ｐ＜０．０５）。

本発明の具体的な実施例で、本発明による烏梅抽出物の毒性有無を調べるために、体重変化を実験期間の間測定した。脳損傷（ＢＣＣＡｏ）による体重が模擬手術群程増加しなかったが、全般的に烏梅抽出物の投与は体重変化に影響を与えなかった（図１０）。したがって、本発明による抽出物は毒性を示さなかったので痴呆予防または治療に有用に使用することができる。

したがって、本発明による烏梅抽出物は損傷した海馬を効果的に正常化することができ、毒性がないので痴呆予防または治療に有用に使用することができる。

前記予防または治療用組成物は、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して用いることができる。経口投与のための固形製剤では、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、丸薬などが含まれる。経口のための液状製剤では、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤では、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、滅菌された水溶液、液剤、非水溶液剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ、坐剤、エアゾールなどの外用剤及び滅菌注射製剤の形態に剤形化して用いることができ、好ましくはクリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはカタプラスマ剤の皮膚外用薬学的組成物を製造して使用することができるが、これに限定するものではない。非水溶性溶剤、懸濁剤ではプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基材では、ハードファット、マクロゴ−ル、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。

また、本発明による予防または治療用組成物は、一般的に用いられる担体、賦形剤、崩解剤、甘味料、滑沢剤、香味剤および希釈剤等を追加で含有することができる。前記担体、賦形剤及び希釈剤では、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を挙げることができる。前記崩解剤では、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスポビドン、クロスキャメロスナトリウム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、キトサン、グアガム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、マグネシウムアルミニウムシリケート、ポラクリリンカリウムなどがある。

また、本発明による予防または治療用組成物は、薬剤学的に許容可能な添加剤をさらに含有することができ、ここで、薬剤学的に許容可能な添加剤では、澱粉、ゼラチン化澱粉、非結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイダルシリコンジオキサイド、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアガム、前糊化澱粉、とうもろこし澱粉、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、澱粉グリコール酸ナトリウム、カルナウバ鉛、合成硅酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトール、タルクなどを用いることができる。本発明による薬剤学的に許容可能な添加剤は、前記薬学的組成物に対して０．１〜９０重量部含むことが好ましい。

本発明の予防または治療用組成物は、前記成分に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。本発明の組成物は、組成物総重量に対して前記烏梅抽出物を０．０００１ないし１０重量％で、０．００１ないし１重量％を含有することが好ましい。

また、本発明の予防または治療用組成物は、経口または非経口投与することができ、非経口投与時、皮膚外用または腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射注入方式を選択することが好ましい。

また、本発明は烏梅抽出物を有効成分として含有する痴呆予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。

前記烏梅抽出物は、痴呆予防または治療用組成物の有効成分である烏梅抽出物と同じ方法で製造することができる。

前記痴呆は、血管性痴呆またはアルツハイマー性痴呆であり得、好ましくは血管性痴呆であることが好ましいがそれに限定されない。

本発明の前記烏梅抽出物は、食品にそのまま添加するか他の食品または食品成分とともに用いることができ、一般的な方法によって適切に用いることができる。有効成分の混合量は、その使用目的（予防または改善用）によって相応しく定めることができる。一般的に、食品または飲料の製造時には、本発明の組成物を原料に対して０．２ないし２０重量％、好ましくは０．２４ないし１０重量％で添加する。しかし、健康及び衛生を目的とするかまたは健康調節を目的とする長期間摂取の場合には、前記の量は前記範囲であり得、安全性の面で何らの問題がないので、有効成分は前記範囲以上の量でも用いることができる。

本発明の健康機能食品は、様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。甘味料としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の健康食品１００重量部当たり０．０１〜０．０４重量部で、約０．０２〜０．０３重量部の範囲で選択することが好ましい。

前記健康機能食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例としては、ドリンク剤、肉類、ソーセージ、パン、ビスケット、餠、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常的な意味での健康食品をすべて含有する。

前記の外に本発明の健康機能食品は、様々な営養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有することができる。その他に本発明の健康機能食品は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立的にまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合は、あまり重要ではないが、本発明の健康食品１００重量部当り０．０１〜０．１重量部の範囲で選択することが一般的である。

また、本発明は、薬学的に有効な量の前記烏梅抽出物を痴呆にかかった個体に投与する工程を含む痴呆治療方法を提供する。

同時に、本発明は薬学的に有効な量の前記烏梅抽出物を個体に投与する工程を含む痴呆予防方法を提供する。

前記痴呆は、血管性痴呆またはアルツハイマー性痴呆であり得る。

前記個体は、人間を含むすべての動物が可能である。

前記烏梅抽出物は、追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。

前記投与は、経口投与、または皮下注射、静脈注射または筋肉内注射を通じた非経口投与が可能で、一般的な医薬品製剤の形態で用いることができる。

前記投与単位は、個別投与量の１、２、３または４倍を含有するかまたは１／２、１／３または１／４倍を含有することができる。個別投与量は、好ましくは有効薬物が１回に投与されるように含み、これは通常１日の投与量の全部、１／２、１／３または１／４倍に該当する。有効用量は０．０００１〜１０ｇ／ｋｇで、好ましくは０．０００１ｇ〜５ｇ／ｋｇであり、一日に１〜６回投与することができる。

本発明による烏梅抽出物は、血管性痴呆動物モデルで慢性血管性脳損傷によって誘導された海馬損傷の正常化（ＥＲＫリン酸化正常化、ＣｈＡＴ増加、ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ正常化）効果及び空間記憶能力改善効果が優れているので、血管性痴呆などのように血管性脳損傷に隋伴する疾患の予防または治療に有用に使用することができる。

施行回数(Sessions)にしたがって逃避に要した距離(Search Error)で示したグラフで、本発明による烏梅抽出物の空間記憶能力正常化効果を示すグラフである。 ＳＨＡＭ＋媒体；模擬手術群 ＢＣＣＡ０＋媒体；脳損傷群 ＢＣＣＡ０＋釣藤散３００；脳損傷群に釣藤散（Choto-san）３００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅１００；脳損傷群に烏梅（F.Mume）１００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅２００；脳損傷群に烏梅２００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅４００；脳損傷群に烏梅４００ｍｇ／ｋｇを処理した群 二回の試験施行(probe trial)で試験プラットホーム領域に留まった程度（％ Time in Target Counter)で示したグラフで、本発明による烏梅抽出物の空間記憶能力正常化効果を示すグラフである。 ＳＨＡＭ＋媒体；模擬手術群 ＢＣＣＡ０＋媒体；脳損傷群 ＢＣＣＡ０＋釣藤散３００；脳損傷群に釣藤散３００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅１００；脳損傷群に烏梅１００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅２００；脳損傷群に烏梅２００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅４００；脳損傷群に烏梅４００ｍｇ／ｋｇを処理した群 施行回数による平均水泳速度（ｍ／秒）を示したグラフで、脳損傷による運動障害がないことを示すグラフである。 ＳＨＡＭ＋媒体；模擬手術群 ＢＣＣＡ０＋媒体；脳損傷群 ＢＣＣＡ０＋釣藤散３００；脳損傷群に釣藤散３００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅１００；脳損傷群に烏梅１００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅２００；脳損傷群に烏梅２００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅４００；脳損傷群に烏梅４００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ウエスタンブロットの結果である。 前記ウエスタンブロットの結果を示したグラフで、本発明による烏梅抽出物の海馬損傷の正常化（ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）リン酸化正常化、ＣｈＡＴ増加効果）を示すグラフである。 ＳＨＡＭ＋媒体；模擬手術群 ＢＣＣＡ０＋媒体；脳損傷群 ＢＣＣＡ０＋釣藤散３００；脳損傷群に釣藤散３００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅１００；脳損傷群に烏梅１００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅２００；脳損傷群に烏梅２００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅４００；脳損傷群に烏梅４００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ウエスタンブロットの結果である。 前記ウエスタンブロットの結果を示すグラフで、本発明による烏梅抽出物の海馬損傷の正常化（NF-kappa Bの水準が正常化）効果を示すグラフである。 ＳＨＡＭ＋媒体；模擬手術群 ＢＣＣＡ０＋媒体；脳損傷群 ＢＣＣＡ０＋釣藤散３００；脳損傷群に釣藤散３００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅２００；脳損傷群に烏梅２００ｍｇ／ｋｇを処理した群 免疫組織染色の結果である。 前記免疫組織染色の結果を示すグラフで、本発明による烏梅抽出物の海馬損傷の正常化（ミクログリア発現抑制）効果を示すグラフである。 ＣＡ１；海馬のアンモン角(Cornus Ammonis)１ ＣＡ３；海馬のアンモン角(Cornus Ammonis)３ ＤＧ；海馬の歯状回(dentate gyrus) ＳＨＡＭ＋媒体；模擬手術群 ＢＣＣＡ０＋媒体；脳損傷群 ＢＣＣＡ０＋釣藤散３００；脳損傷群に釣藤散３００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅２００；脳損傷群に烏梅２００ｍｇ／ｋｇを処理した群 烏梅抽出物の処理による体重変化を示したグラフである。 ＳＨＡＭ＋媒体；模擬手術群 ＢＣＣＡ０＋媒体；脳損傷群 ＢＣＣＡ０＋釣藤散３００；脳損傷群に釣藤散３００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅１００；脳損傷群に烏梅１００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅２００；脳損傷群に烏梅２００ｍｇ／ｋｇを処理した群 ＢＣＣＡ０＋烏梅４００；脳損傷群に烏梅４００ｍｇ／ｋｇを処理した群

以下、本発明を実施例及び製造例によって詳しく説明する。

但し、下記の実施例及び製造例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例及び製造例に限定されるのではない。

烏梅抽出物の製造
本実験に使用した烏梅は、光明堂（蔚山所在）から購入して韓国漢方医学研究院漢方薬品質検査チームで外部形態を比較検査して確認した後、実験に使用した。乾燥した烏梅（２ｋｇ）を超音波熱併合抽出機（OM30-EP,SONIMEDI社）に入れて蒸留水８ｌを加えて９５℃で１２０分間抽出した。前記抽出液を湯薬乾燥器（EXDRYER,SONIMEDI社）に入れて−９５ｋＰａ以下、８０℃で４８時間乾燥して烏梅抽出物を製造した（収率１６．２２５％）。

血管性痴呆動物モデル製作及び薬物経口投与(in vivo)
＜２−１＞血管性痴呆動物モデル製作
本発明の烏梅抽出物の血管性痴呆進行抑制効果を調べるために、下記ののような実験を行なった。本実験に使用した実験動物は、１２週齢の３５０〜４００ｇのウイスターラット(Wister rat)を使用した。実験動物を入手後、外見を肉眼で検査した後、７日間の順化期間の間一般症状を観察して元気な動物を選抜して、体重範囲による無作為法によって群分けを行なった後に実験を行なった。順化及び実験期間の間の飼育環境は、温度２３±３℃、相対湿度５０±１０％、換気回数は時間当り１２〜１６回、照明は１２時間明暗周期（点灯７：００、消灯１９：００）、照度は１５０〜３００Ｌｘに調整して、試験の全期間にわたって一定した飼育環境条件を維持した。消毒した器具を用いて実験を実施した。水と固形飼料（PMI nutrition,米国）は、２４時間の間自由に摂取できるようにした。血管性痴呆動物モデルを製作するために、慢性大脳血流低下は両側総頸動脈永久狭窄（Bilateral common carotid artery occlusion,2VO,以下「脳損傷（ＢＣＣＡｏ）」と命名）で誘導した（Wakitaら,1994年）。簡単に要約すると、ラットを４％イソフルランで痲酔を誘導して、手術する間は１．５％イソフルランで痲酔を維持し頚中部を切開して迷走神経が損傷受けないように気を付けて両総頚動脈を露出させて、３番シルクで二度結紮させた。

＜２−２＞血管性痴呆動物モデルに薬物経口投与
薬物投与実験群は、ウイスターラット（Wistar rat）にＢＣＣＡｏ手術をした後２０日が経過した後、烏梅抽出物を経口投与した。総６群の集団を有して各群別に１６匹で実験した。予備実験の結果によると、約４０％のラットが視覚障害を有するので行動検査すなわち水中迷路検査１週間前にシャトルボックス(shuttle Box)を使用してブラインドグループ(Blind group)と非ブラインドグループ(non-Blind group)に分類した。ブラインドグループのラットは４２日の間経口投与し、記憶検査をした非ブラインドグループのラットは４２日の間経口投与した。

表１は、認知機能検証を示したものである。本発明による烏梅抽出物経口投与濃度は、低濃度（１００ｍｇ／ｋｇ）、中農度（２００ｍｇ／ｋｇ）と高濃度（４００ｍｇ／ｋｇ）に定め、釣藤散（３００ｍｇ／ｋｇ）対照薬物投与群、模擬手術群と実験群の総６グループを適用して実験を設計した。

血管性痴呆動物モデルで空間記憶遂行検査(in vivo)
本発明による烏梅抽出物の血管性痴呆動物モデルで行動検査を通じて効果を調べるために、下記のような実験を行なった。行動検査は水中迷路試験を通じて行なった。光が水に映らないように四方に仕切りを設置して円型水槽（直径１８３ｃｍ、高さ５８ｃｍ）に温度２６±２℃の水を標式筒の上２ｃｍ程度まで満たして色素を入れて底が映らなくする。また仕切りの特定位置に標式を付着してラットが標識筒を探していくための手がかりを提供する。水槽の特定の所に標識筒（直径１２ｃｍ、高さ３３．５ｃｍ）を位置させて、ラットを入水させて生き残るために永いで標識筒を捜していくように考案された。ラットが入水後標識筒を捜していくまでに必要となる時間、距離、速度を測定して記憶の指標にした。実施例１の烏梅抽出物を３週間投与して訓練試行（水に入水して標識筒を捜していく能力）を施行した。訓練後に測定するのではなく、訓練するのと同時にラットの動きを追跡して時間と距離などを測定するので、グループ別に日々短縮される時間と距離などを比較する。すなわち、時間と距離が早く、たくさん短縮されるほど、学習がよくできたことを推測することができる。訓練試行は、総８日間午前の時間を用いて（午前９時から）１日１回ずつ総８回施行した。実施例１の烏梅抽出物の長期間経口投与による空間記憶能力評価を実施したが、認知能力評価（空間記憶能力）は、一日に４回訓練をさせて総８日にわたって訓練し、試験施行を４日と８日の最後の施行後に実施した。また一週間後に手がかり訓練（cued training）を実施（一日に６回施行）した。

水中迷路でのラットの空間記憶遂行の結果、脳損傷群（ＢＣＣＡｏ）に比べて烏梅抽出物投与群は、海馬依存的学習の習得障害を示した（図１）。模擬手術群は、脳損傷群（ＢＣＣＡｏ）に比べて水中空間記憶課題をよくこなした。実施例１の烏梅抽出物を処理した烏梅抽出物投与群の場合、実施例１の抽出物２００ｍｇ／ｋｇ投与群がほぼ対照群水準の良い行動を見せることが示された。統計的検証の結果、集団間に差異があり（Ｆ（５，５３）＝８．２６，ｐ＝０．０００）訓練回数が増加するにつれて隠されたプラットホームを捜していく速度は早くなった（Ｆ（３，１５９）＝９８．４８、ｐ＝０．０００）。集団間の差を知るための事後分析によると、ＢＣＣＡｏ集団と比べて、烏梅２００ｍｇ／ｋｇの投与を受けた動物は、顕著に空間記憶学習を良くこなした（ｐ＝０．０２７）。したがって、本発明による烏梅抽出物は記憶空間能力を効果的に正常化することができるので痴呆予防または治療に有用に使用することができる。

二度の試験施行(probe trial)は、結果においても脳損傷群（ＢＣＣＡｏ）は模擬手術群に比べて著しくプラットホームの位置をよく憶えることができなかった（Ｆ（５，５３）＝７．０５，ｐ＝０．０００）（図２）。４日と８日の訓練後に行なった試験施行で、脳損傷（ＢＣＣＡｏ）及び烏梅抽出物２００ｍｇ／ｋｇ投与群は、模擬手術群に比べてプラットホームの大きさの５倍程度の領域での水泳を顕著に少なくした（ｐ＝０．０１４，first probe trial）。したがって、本発明による烏梅抽出物は記憶能力を増進させることを示す。

水中迷路訓練期間中の平均水泳速度は、集団間に差異を示さなかった（図３）。これはすべての集団において、運動障害がないことを示す。

表２は、手がかり訓練(cued training)の結果である。プラットホームの色を黒くして水面上にあるようにすることで、ラットがプラットホームを容易に見ることができる。この課題で障害がある個体は、運動能力または単純運動学習(striatum)習得障害を示したと言える。６回の手がかり訓練では、集団間に差があった。烏梅２００ｍｇ／ｋｇを投与した投与群は、ほとんど模擬手術群と類似の程度の遂行水準を示した。

血管性痴呆動物モデルで神経生物学的指標検査(in vivo)
実験を終了した後、脳海馬組織を急速冷凍した後、超低温冷蔵庫（−８０℃）に保管して使用した。急速冷凍保管されたネズミの脳組織を氷の上で溶かした後、冷たいタンパク質抽出緩衝液（1M Tris[pH7.5],0.5M EDTA,1M KCl,Glycerol 100%,100nM Dithiothreitol,proteinase inhibitor）を添加して８分間均質化した。組織を１時間の超遠心分離（14,000rpm,４℃，真空）させた後、試験管上層部の液体を収集した。ブラッドホード方法で各タンパク質量を分析した後に試料緩衝液でタンパク質を安定化させた。それぞれのタンパク質サンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを通じて１００Ｖで電気泳動させて得られたタンパク質バンドを１００Ｖ、４００ｍＡで移動装置を用いて、１時間ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜にタンパク質を移動させた。その後、ＴＢＳＴで１回洗浄して５％脱脂粉乳でブロッキング（１時間、常温）した。また、ＴＢＳＴで３回洗浄（１０分／回）し、それぞれＥＲＫ１次抗体（p44/42mapキナーゼ抗体（細胞内信号伝達、#9102））、ｐＥＲＫ １次抗体（phospho-p44/42 MAPK抗体（細胞内信号伝達、#9101S））、ＣｈＡＴ １次抗体（Chemicon、lot0512017589)、ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ｐ６５ １次抗体(Upstate Biotechnology)、ＩκＢα １次抗体、β−アクチン１次抗体(sigma)を５％脱脂粉乳に１：１０００に希釈して使用し、４℃で一晩中おいた。翌日、ＴＢＳＴで３回洗浄（１０分／回）した後、抗ウサギＩｇＧ ２次抗体(Amersham)を５％脱脂粉乳に１：５０００に希釈して１時間常温で処理した。最後に、ＴＢＳＴで３回洗浄（１０分／回）した後、ＥＣＬ溶液で反応させた後、フィルムに現像した。

図４は、烏梅抽出物処理によるＥＲＫリン酸化、ＣｈＡＴ、ＩκＢ（κＢのインヒビター）、ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells）の変化を示す。図４は、ウエスタンブロットの結果で、図５は前記ウエスタンブロットの結果を示すグラフで、本発明による烏梅抽出物の海馬損傷の正常化（ＥＲＫリン酸化正常化、ＣｈＡＴ増加）効果を示すグラフである。図６は、ウエスタンブロットの結果で、図７は前記ウエスタンブロットの結果を示すグラフで、本発明による烏梅抽出物の海馬損傷の正常化（ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂの水準が正常化）効果を示すグラフである。脳損傷群（ＢＣＣＡｏ）は、模擬手術群と比べてＥＲＫの水準に違いはないが、ＥＲＫリン酸化が相当に高かった。烏梅抽出物処理によってＥＲＫリン酸化程度が有意に減少した（ｐ＜０．０５）。脳損傷群（ＢＣＣＡｏ）の海馬のＣｈＡＴ（アセチルコリンの生成に用いられる酵素）は、模擬手術群に比べて減少し、減少したＣｈＡＴの水準は、烏梅抽出物の投与によって正常化された。烏梅抽出物処理によって、ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂの水準が正常化された。

したがって、本発明による烏梅抽出物は、損傷した海馬を効果的に正常化することができるので、痴呆予防または治療に有用に使用することができる。

血管性痴呆動物モデルで組織学的指標検査(in vivo)
組織学的指標検査に用いられたネズミは、ケタミンＨＣｌ（３０ｍｇ／ｋｇ）とザイラジン（２．５ｍｇ／ｋｇ）の混合剤で痲酔した後、０．０１ＭのＰＢＳが混じった４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）によって潅流した。脳は、４％のＰＦＡ（２日）で除去後に固定(postfix)して、３０％のスクロース（４８時間）を含有するＰＢＳで冷凍保存（cryoprotect；凍結から組織を保護）して、パウダードライアイスで氷らせて実験前まで−７０℃で保管した。潅流した脳組織は、ミクロトームで４０μｍの厚さに切開して４℃のＰＢＳで貯蔵した。海馬のミクログリア細胞を探知するためにモノクローン抗体Ｉｂａ−１(ionized calcium-binding adaptor molecule)を使用した。この Ｉｂａ−１は、ミクログリア細胞とミクロ相(microphases)に発現する。Ｉｂａ−１免疫反応性のために自由浮動セクションの耐性ペルオキシダーゼは、３％Ｈ_２Ｏ_２／１０％ＭｅＯＨであるＰＢＳで３０分のインキュベーションを通じて抑制した。その次に、組織は１０％血清を含んだ０．３％トリトン−Ｘ１００（ＰＢＳ−Ｔ−Ｓ）ＰＢＳで常温で１時間インキュベーションした。その後、組織は、約１２時間４℃３％ＰＢＳ−Ｔ−Ｓ溶液でＩｂａ−１抗体とともにインキュベーションした。それから組織は、馬抗マウス抗体（Vector；１：２００）とエクストラアビジンペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma Aldrich；１：１０００）でそれぞれ一時間インキュベーションした。最後にこの組織は、Ｖｅｃｔｏｒ ＳＧ基質キット（Sigma Aldrich）ペルオキシダーゼ用と反応し、合成樹脂でコーティングしたスライドに載せて一週間乾燥した。スライド上の乾燥した組織は、パーマウント試薬によってスライドカバーと合される。反応したミクログリアを統計分析を通じて数量化することで、一匹の動物当り６つの頭脳部分の中で海馬にミクログリアが含まれたことをＩｂａ−１抗体を通じて発見した。

図５は、烏梅抽出物処理による海馬内のミクログリア細胞数の変化を示す。図８は、組織免疫染色の結果で、図９は前記組織免疫染色の結果を示すグラフである。脳損傷群（ＢＣＣＡｏ）は、模擬手術群と比べてミクログリア細胞数が相当に高かった。烏梅抽出物２００ｍｇ／ｋｇ処理によってミクログリア細胞発現程度が有意に減少した（ｐ＜０．０５）。

したがって、本発明による烏梅抽出物は、損傷した海馬を効果的に正常化することができるので痴呆予防または治療に有用に使用することができる。

烏梅抽出物の毒性評価
本発明による烏梅抽出物の毒性有無を調べるために、体重変化を実験期間の間測定した。

図１０は、烏梅抽出物の処理による体重変化を示す。脳損傷による体重が模擬手術群程度増加しなかったが、全般的に烏梅抽出物の投与は体重変化に影響を与えなかった。したがって、本発明による抽出物は毒性を示さなかったので痴呆予防または治療に有用に使用することができる。

下記に本発明の組成物のための製造例を例示する。

＜製造例１＞薬学的製剤の製造
１．散剤の製造
烏梅（Fructus mume）超音波熱併合抽出物 ２ｇ
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。

２．錠剤の製造
烏梅超音波熱併合抽出物 １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。

３．カプセル剤の製造
烏梅超音波熱併合抽出物 １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。

４．丸薬の製造
烏梅超音波熱併合抽出物 １ｇ
乳糖 １．５ｇ
グリセリン １ｇ
キシリトール ０．５ｇ
前記の成分を混合した後、通常の方法によって１丸薬当り４ｇになるように製造した。

５．顆粒の製造
烏梅超音波熱併合抽出物 １５０ｍｇ
大豆抽出物 ５０ｍｇ
ブドウ糖 ２００ｍｇ
澱粉 ６００ｍｇ
前記の成分を混合した後、３０％エチルアルコール１００ｍｇを添加して摂氏６０℃で乾燥して顆粒を形成した後、包に充填した。

＜製造例２＞食品の製造
１．小麦粉食品の製造
本発明の烏梅の超音波熱併合抽出物０．５〜５．０重量部を小麦粉に添加して、この混合物を用いてパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して健康増進用食品を製造した。

２．スープ及び肉汁の製造
本発明の烏梅の超音波熱併合抽出物０．１〜５．０重量部をスープ及び肉汁に添加して健康増進用肉加工製品、麺類のスープ及び肉汁を製造した。

３．グランドビーフの製造
本発明の烏梅の超音波熱併合抽出物１０重量部をグランドビーフに添加して健康増進用グランドビーフを製造した。

４．乳製品の製造
本発明の烏梅の超音波熱併合抽出物５〜１０重量部を牛乳に添加して、前記牛乳を用いてバター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。

５．禅食の製造
玄米、麦、もち米、鳩麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを倍煎した後粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。

黒豆、黒ごま、えごまも公知の方法で蒸して乾燥させたものを倍煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。

本発明の烏梅の超音波熱併合抽出物を真空濃縮機で減圧濃縮して、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥粉末を後粉砕機で粒度６０メッシュに粉砕して乾燥粉末を得た。

前記で製造した穀物類、種実類及び烏梅の超音波熱併合抽出物の乾燥粉末を次の割合で配合して製造した。

穀物類（玄米３０重量部、鳩麦１５重量部、麦２０重量部）、
種実類（えごま７重量部、黒豆８重量部、黒ごま７重量部）、
烏梅の超音波熱併合抽出物（３重量部）、
霊芝（０．５重量部）、
地黄（０．５重量部）

＜製造例３＞飲料の製造
１．健康飲料の製造
液状果糖（０．５重量％）、オリゴ糖（２重量％）、砂糖（２重量％）、食塩（０．５重量％）、水（７５重量％）のような副材料と本発明の烏梅の超音波熱併合抽出物５ｇを均質に配合して瞬間殺菌後、それをガラス瓶、ペットボトルなど小包装容器に包装して健康飲料を製造した。

２．野菜ジュースの製造
本発明の烏梅の超音波熱併合抽出物５ｇをトマトまたはにんじんジュース１，０００ ｍｌに加えて、健康増進用野菜ジュースを製造した。

３．果物ジュースの製造
本発明の烏梅の超音波熱併合抽出物１ｇをりんごまたはぶどうジュース１，０００ｍｌ に加えて、健康増進用果物ジュースを製造した。前記抽出物の分画物１ｇをりんごまたはぶどうジュース１，０００ｍｌに加えて果物ジュースを製造した。

Claims (13)

1. 烏梅（Fructus mume）抽出物を有効成分として含有する痴呆(認知症)の予防または治療用薬学的組成物。
2. 前記抽出物が、水、アルコールまたはこれらの混合物を溶媒にして抽出されることを特徴とする、請求項１に記載の痴呆の予防または治療用薬学的組成物。
3. 前記アルコールが、Ｃ_１〜Ｃ_４の低級アルコールであることを特徴とする、請求項２に記載の痴呆の予防または治療用薬学的組成物。
4. 前記低級アルコールが、エチルアルコールまたはメタノールであることを特徴とする、請求項３に記載の痴呆の予防または治療用薬学的組成物。
5. 前記抽出物が、超音波熱併合抽出されることを特徴とする、請求項１に記載の痴呆の予防または治療用薬学的組成物。
6. 前記痴呆が、血管性痴呆またはアルツハイマー性痴呆であることを特徴とする、請求項１に記載の痴呆の予防または治療用薬学的組成物。
7. 烏梅抽出物を有効成分として含有する痴呆の予防または改善用健康機能食品。
8. 前記抽出物が、水、エチルアルコールまたはこれらの混合物を溶媒にして抽出されることを特徴とする、請求項７に記載の痴呆の予防または改善用健康機能食品。
9. 前記痴呆が、血管性痴呆またはアルツハイマー性痴呆であることを特徴とする、請求項７に記載の痴呆の予防または改善用健康機能食品。
10. 薬学的に有効な量の烏梅抽出物を痴呆にかかった個体に投与する工程を含む痴呆治療方法。
11. 薬学的に有効な量の烏梅抽出物を個体に投与する工程を含む痴呆予防方法。
12. 痴呆治療または予防のための医薬の製造のための烏梅抽出物の使用。
13. 痴呆の予防または改善のための健康機能食品の製造のための烏梅抽出物の使用。