KR102362480B1 - 반지련 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성갱년기 증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 반지련 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성갱년기 증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 반지련 추출물은 세포 독성이 거의 없고, 손상된 성호르몬 분비 세포의 세포보호 활성이 있으며, 테스토스테론(Testosterone)의 함량을 증가시키고, 남성 호르몬 분비세포에서 17β-HSD의 발현을 증가시키는 효과가 있으며, 콜레스테롤 및 혈중 포도당을 감소시키고, 외측광근(vastus lateralis; VL)의 무게를 증가시키고, 내장지방 중 정소상체지방(epididyma fat; EF) 부위의 지방의 무게, 장간막(mescentric fat; MF) 부위의 지방의 무게 및 후복부(abdominal subcutaneous fat; ASF) 부위의 지방의 무게를 감소시키는 효과가 있으며, 강제수영 시험(FST)에서 부동자세 시간을 줄이고, 수영자세 및 등반자세 시간을 증가시키는 효과가 있을 뿐만 아니라, 정자수 및 정자의 활동성을 증가시키는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 남성갱년기 증후군의 예방, 개선 또는 치료용 건강기능식품 또는 의약품으로 사용할 수 있다.

Description

반지련 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성갱년기 증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, ameliorating or treating androgens syndrome comprising Scintilla Barbara extract as effective component}

본 발명은 반지련 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성갱년기 증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

갱년기는 주로 여성에 한정되어, 폐경에 의해 여성 호르몬이 급격하게 감소함으로써 나타나는 발작성 흥분, 안면홍조, 두통, 심계항진, 현기증, 이명, 불면 등의 혈관운동장애나 위장장애, 정신장애 등, 여러 가지 증상을 수반하는 시기로 인식되어 왔으나, 50대 이후의 남성에서도 갱년기 여성과 유사한 예민함, 우울감, 기억력 장애, 집중력 저하, 피로함, 불면, 안면 홍조, 근육량 및 골밀도 저하, 주기적 발한과 성적 활력의 저하 등과 같은 복합적 증상이 나타나 이 시기를 남성갱년기라 정의하였다.

국제 남성갱년기학회(International Society for the Study of the Aging Male; IS SAM) 및 국제남성 과학회(International Society of Andrology; ISA)가 공동으로 2004년 제4차 ISSAM congress에서 남성갱년기에 의한 복합적 증상을 후기발현남성성선기능저하증(Late-onset hypogonadism, LOH)으로 통일하여 LOH가 가장 광범위하게 사용되고 있다. 하지만, andropause, androgen deficiency for aging male(ADAM), partial androgen deficiency for aging male(PADAM), male climateric 등과 같은 다양한 이름으로 불리고 있다. 남성갱년기는 근육량 및 근력의 저하와 체질량 지수 감소, 체모 감소와 피부 변화, 지적 활동, 공간 지각 능력, 피곤, 성적 욕구의 감소와 발기, 특히 수면 중 발기 감소, 기분저하 및 불안정성을 동반하는 기분 변화, 골밀도 저하, 내장 지방의 증가 등과 같은 복합증후군을 나타낸다.

치료를 위해서는 폐경기 여성에 에스트로겐 대체 요법을 사용하는 것과 유사한 방식으로 남성 호르몬 대체 요법의 사용 가능성이 주장되고 있다. 한 연구에 따르면, 남성 갱년기 환자들을 테스토스테론 운데카노에이트를 사용하여 치료하는 경우, 상당한 개선 효과가 얻어지는 것으로 보고된 바 있다. 그러나 남성 호르몬의 투여는 간, 지질 상태, 심혈관 및 전립선 질환 등에 역효과를 미칠 수 있다는 위험성도 보고되어 있다.

따라서 최근에는 이러한 약물의 치료요법에 의한 문제점을 극복하기 위하여 천연 생약을 주성분으로 하는 남성갱년기 증후군 개선제의 개발이 시도되고 있다. 하지만, 아직까지는 생약재를 주성분으로 하는 종래기술은 남성갱년기 증후군의 단편적 증상인 성기능에 한정되는 경우가 많아, 성기능 개선과 더불어 근력 증가 등의 개선 효과 등 복합적 효과를 나타내는 제제에 관한 기술은 미흡한 실정이다.

한편, 반지련은 칫솔골무꽃(Scutellaria barbata)의 지상부로, 열을 내리는 작용이 있어서 화상일 때 소염효과가 있으며, 타박상으로 인해 피부가 헐은 곳에 쓰이는 약재이다. 전초로 줄기는 뭉쳐나며 비교적 가는 네모기둥 모양이고 길이 15~35cm이다. 바깥 면은 어두운 자주색~녹갈색이다. 잎은 마주나고 삼각형의 달걀모양 또는 피침형으로 길이 1.5~3cm, 너비 0.5~1cm이다. 윗면은 어두운 녹색이고 아랫면은 회록색이며 가장자리가 밋밋하거나 거치가 뚜렷하지 않고 짧은 잎자루가 있다. 꽃은 줄기 상부의 잎겨드랑이에 단생하고 꽃받침의 열편은 둔하거나 비교적 둥글고, 꽃대에 털이 성글게 덮여 있다. 꽃부리는 입술모양으로 황갈색~연한 남자색이며 길이는 약 1.2cm이고 털로 덮여 있다. 열매는 납작한 구형으로 연한 갈색이다. 뿌리는 매우 가늘다. 냄새가 약간 있고 맛은 약간 쓰다.

한국등록특허 제1865542호에 반지련 추출물을 포함하는 피지 과다분비 또는 지루성 습진의 억제 또는 개선용 조성물이 개시되어 있고, 일본공개특허 제2010-538093호에 자소과 패밀리의 반지련 에스트로겐성 추출물 및 그 사용이 개시되어 있으나, 본 발명의 반지련 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성갱년기 증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해서는 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 반지련 추출물을 유효성분으로 함유하는 남성갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하고, 본 발명의 반지련 추출물은 세포 독성이 거의 없고, 손상된 성호르몬 분비 세포의 세포보호 활성이 있으며, 테스토스테론(Testosterone)의 함량을 증가시키고, 남성 호르몬 분비세포에서 17β-HSD의 발현을 증가시키는 효과가 있으며, 콜레스테롤 및 혈중 포도당을 감소시키고, 외측광근(vastus lateralis; VL)의 무게를 증가시키고, 내장지방 중 정소상체지방(epididyma fat; EF) 부위의 지방의 무게, 장간막(mescentric fat; MF) 부위의 지방의 무게 및 후복부(abdominal subcutaneous fat; ASF) 부위의 지방의 무게를 감소시키는 효과가 있으며, 강제수영 시험(FST)에서 부동자세 시간을 줄이고, 수영자세 및 등반자세 시간을 증가시키는 효과가 있을 뿐만 아니라, 정자 수 및 정자의 활동성을 증가시키는 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 반지련 추출물을 유효성분으로 함유하는 남성갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 반지련 추출물을 유효성분으로 함유하는 남성갱년기 증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 반지련 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성갱년기 증후군의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 반지련 추출물은 세포 독성이 거의 없고, 손상된 성호르몬 분비 세포의 세포보호 활성이 있으며, 테스토스테론(Testosterone)의 함량을 증가시키고, 남성 호르몬 분비세포에서 17β-HSD의 발현을 증가시키는 효과가 있으며, 콜레스테롤 및 혈중 포도당을 감소시키고, 외측광근(vastus lateralis; VL)의 무게를 증가시키고, 내장지방 중 정소상체지방(epididyma fat; EF) 부위의 지방의 무게, 장간막(mescentric fat; MF) 부위의 지방의 무게 및 후복부(abdominal subcutaneous fat; ASF) 부위의 지방의 무게를 감소시키는 효과가 있으며, 강제수영 시험(FST)에서 부동자세 시간을 줄이고, 수영자세 및 등반자세 시간을 증가시키는 효과가 있을 뿐만 아니라, 정자 수 및 정자의 활동성을 증가시키는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 반지련 추출물의 세포 생존률을 확인한 결과이다. (A)는 Leydig 세포에서의 세포 생존률이고, (B)는 Sertoli 세포에서의 세포 생존률이다.
도 2는 본 발명의 반지련 추출물의 Leydig 세포에서의 세포 보호능을 확인한 결과이다. ###은 H₂O₂ 처리에 의해 세포 생존율이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.001이고, *은 H₂O₂ 처리군에 비해 본 발명의 반지련 추출물을 처리한 군의 세포 생존율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 3은 본 발명의 반지련 추출물의 처리에 따른 테스토스테론의 함량 변화를 확인한 결과이다. $은 반지련 추출물을 처리에 의해 통계적으로 유의미하게 테스토스테론의 함량이 증가하였다는 것으로, p<0.05이고, ###은 H₂O₂ 처리에 의해 테스토스테론의 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.001이며, *, **은 H₂O₂ 처리군에 비해 본 발명의 반지련 추출물을 처리한 군의 테스토스테론의 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이다.
도 4는 본 발명의 반지련 추출물을 처리한 Leydig 세포에서의 17β-HSD 발현량 변화를 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. ##은 과산화수소에 의해 손상된 Lydia 세포에서의 17β-HSD 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.01이고, *는 과산화수소에 의해 손상된 Lydia 세포에 본 발명의 반지련 추출물을 처리한 경우, 17β-HSD 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 5는 본 발명의 반지련 추출물을 처리한 Sertoli 세포에서의 안드로겐 수용체(androgen receptor) 발현량 변화를 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. ##은 과산화수소에 의해 손상된 Sertoli 세포에서의 안드로겐 수용체 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.01이고, **는 과산화수소에 의해 손상된 Sertoli 세포에 본 발명의 반지련 추출물을 처리한 경우, 안드로겐 수용체 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.01이다.
도 6은 본 발명의 반지련 추출물의 LNCaP 세포 생존률을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 반지련 추출물의 투여에 따른 테스토스테론(A), 콜레스테롤(B), 난포자극호르몬(C), 황체형성호르몬(D), 혈중 포도당(E), 17β-HSD 단백질(F)의 함량 변화를 확인한 결과이다. *, **, ***은 반지련 추출물을 처리하지 않은 대조군(-) 대비 반지련 추출물을 투여한 군에서 테스토스테론, 황체형성호르몬, 17β-HSD 단백질의 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였거나, 콜레스테롤 또는 혈중 포도당의 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이며, ***은 p<0.001이다.
도 8은 본 발명의 반지련 추출물의 투여에 따른 외측광근(vastus lateralis; VL)의 무게(A), 내장지방 중 정소상체지방(epididyma fat; EF) 부위의 지방의 무게(B), 장간막(mescentric fat; MF) 부위의 지방의 무게(C) 및 후복부(abdominal subcutaneous fat; ASF) 부위의 지방의 무게(D)의 변화량을 확인한 결과이다. *, **은 반지련 추출물을 처리하지 않은 대조군(-) 대비 반지련 추출물을 투여한 군에서 외측광근(vastus lateralis; VL)의 무게가 통계적으로 유의미하게 증가하였거나, 내장지방 중 정소상체지방(epididyma fat; EF) 부위의 지방의 무게, 장간막(mescentric fat; MF) 부위의 지방의 무게 및 후복부(abdominal subcutaneous fat; ASF) 부위의 지방의 무게가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이다.
도 9는 본 발명의 반지련 추출물의 투여에 따른 강제수영 시험(FST)에서 부동자세(immobility)(A), 수영자세(swimming)(B) 및 등반자세(climbing)(C)를 취한 시간을 확인한 결과이다. *, **, ***은 반지련 추출물을 처리하지 않은 대조군(-) 대비 반지련 추출물을 투여한 군에서 부동자세(immobility)를 취한 시간이 통계적으로 유의미하게 감소하였거나, 수영자세(swimming) 및 등반자세(climbing)를 취한 시간이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이며, ***은 p<0.001이다.
도 10은 본 발명의 반지련 추출물의 투여에 따른 부고환에서의 정자 수(A) 및 활동성(B) 분석 결과이다. *는 반지련 추출물을 처리하지 않은 대조군(-) 대비 반지련 추출물을 투여한 군에서의 정자 수 또는 정자의 활동성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것이다(p<0.05).

본 발명은 반지련 추출물을 유효성분으로 함유하는 남성갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

상기 남성갱년기 증후군은 테스토스테론 호르몬의 감소; 근력저하; 또는 정자 수 및 운동성의 감소;를 수반하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.

상기 반지련 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:

(1) 반지련에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

(2) 단계 (1)의 추출물을 여과하는 단계; 및

(3) 단계 (2)의 여과한 추출물을 농축하고 건조하여 추출물을 제조하는 단계.

상기 단계 (1)에서 추출용매는 물, C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 에탄올이지만 이에 한정하지 않는다.

상기 제조방법에 있어서, 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 건조된 반지련 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5~15배 첨가하는 것이고, 더욱더 바람직하게는 10배 첨가하는 것이다. 추출온도는 20~80℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 1~10시간인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 방법에 있어서, 단계 (3)의 농축은 진공 회전 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 동결건조이나 이에 한정하지 않는다.

상기 반지련 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 환, 정제(tablet), 캡슐(capsule), 산제, 분말, 과립, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나로 제조하거나, 식품의 성분으로 첨가하여 제조될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다.

본 발명의 반지련 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 일례로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 반지련 추출물을 유효성분으로 함유하는 남성갱년기 증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 반지련 추출물 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육 또는 피하주사 방식을 선택하는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하게 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 반지련 추출물의 제조

500g의 반지련을 50℃에서 7일 동안 열풍 건조한 후, 10배의 70%(v/v) 에탄올을 첨가하여 3시간씩 2회에 걸쳐 환류 냉각 추출 및 여과하였다. 이후 상기 반지련 추출액을 45℃에서 감압농축하여 에탄올을 제거한 후, -80℃에서 7일 동안 동결건조하여 반지련 추출물 143g을 수득하였다(수율: 28.6%).

실시예 2. 세포 생존율 및 보호능 분석

세포 생존율 분석을 위해 96웰 플레이트에 1×10⁴ cells/㎖의 세포를 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건으로 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 배양세포 표면을 PBS 용액으로 씻어주었다.

동일 양의 배지와 PBS에 녹인 시료 1, 5, 10, 50 및 100㎍/㎖을 각 웰에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5mg/㎖의 MTT를 20㎕씩 각 웰에 처리한 후 알루미늄 호일로 차광시킨 후 나머지 시간 동안 같은 조건에서 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후, 200㎕의 DMSO를 처리하였다. 이후 37℃에서 2시간 방치한 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 1에 개시한 바와 같이, Leydig 세포(A) 및 Sertoli 세포(B)에 반지련 추출물 처리하여도 세포 생존률이 유지되는 것을 확인하여 세포독성이 없는 것으로 판단하였다.

한편, 세포 보호능 측정은 과산화수소(hydrogen peroxide)로 산화적 스트레스를 준 후, 상기 세포 생존율과 동일한 방법으로 세포 보호 효과를 측정하였다. 도 2에 개시한 바와 같이, 과산화수소 처리에 의해 세포 생존률이 통계적으로 유의미하게 감소하였고, Leydig 세포에서 반지련 추출물을 처리에 의해 세포 생존률이 증가하여 세포 보호능이 있다는 것을 확인하였다.

실시예 3. 테스토스테론(Testosterone) 함량 분석

Leydig 세포 내, 테스토스테론 함량은 Leydig 세포 배양액으로 측정하였다. 배양이 끝난 후 배지는 R&D systems의 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) kit을 사용하여 테스토스테론의 함량을 측정하였다. 배지 100㎕를 goat anti-mouse IgG microtiter plate에 옮긴 후, 50㎕의 테스토스테론 항체를 첨가하여 1시간 배양하고 conjugate 50㎕를 첨가하여 1시간 동안 배양한 후 세척용액으로 세척하였다. 각각에 200㎕의 기질 용액을 첨가하여 1시간 동안 반응한 후 50㎕의 반응정지 용액(stop solution)을 넣어 반응을 중지시키고 분광광도계를 이용하여 450nm 흡광도를 측정하여 함량을 계산하였다.

그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이, 본 발명의 반지련 추출물은 테스토스테론의 함량을 증가시키는 효과가 있으며, 특히, 100㎍/㎖의 반지련 추출물을 처리한 경우는 통계적으로 유의미하게 테스토스테론의 함량을 증가시켰다.

실시예 4. Western blot을 이용하여 Leydig 세포에서 17β- HSD 의 발현량 변화 확인

Lysis buffer로 단백질을 추출한 후, 단백질은 브레드포드(Bradford) 방법을 이용하여 정량하였다. 정량한 단백질 50㎍을 10% Tris-glycine gel에 SDS-PAGE를 실시하였다. SDS-PAGE 후 gel를 nitrocellulose membrane에 120mA에서 1시간 동안 transfer를 실시한 후 membrane은 5% skim milk를 이용하여 1시간 실온에서 blocking하였다. 4℃에서 밤샘 배양하여 1차 항체와 반응시킨 후 T-PBS로 멤브레인을 세척하고, 2차 항체로 실온에서 2시간 반응하였다. 반응이 끝난 멤브레인을 ECL kit으로 반응 후 X-ray film(Agpa, Belgium)을 이용하여 현상하였다.

그 결과, 도 4 및 도 5에 개시한 바와 같이 과산화수소의 처리에 의해 17β-HSD 및 안드로겐 수용체의 발현량이 현저하게 감소하였고, 본 발명의 반지련 추출물을 처리한 군에서는 17β-HSD 및 안드로겐 수용체의 발현량이 회복된 것을 확인할 수 있다.

실시예 5. LNCaP 세포에서 세포 생존율 분석

테스토스테론의 합성 촉진으로 인한 호르몬 불균형으로 발생할 수 있는 전립선 세포의 증식을 확인하기 위하여, LNCaP 세포 생존율을 확인하였다.

96웰 플레이트에 1×10⁴ cells/㎖의 세포를 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건으로 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 배양세포 표면을 PBS 용액으로 씻어주었다. 동일 양의 배지와 PBS에 녹인 시료 1, 5, 10, 50, 100 및 200㎍/㎖을 각 웰에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5mg/ml MTT를 20㎕씩 각 웰에 처리한 후 알루미늄 호일로 차광시킨 후, 나머지 시간 동안 같은 조건에서 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후, 200㎕의 DMSO를 처리하였다. 이후 37℃에서 2시간 방치한 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 6에 개시한 바와 같이, LNCaP 세포에 반지련 추출물을 처리하여도 세포 생존률이 유지되는 것을 확인하여 호르몬 활성 촉진으로 발생할 수 있는 부작용인 전립선암 등의 발생을 유도하지 않는 것으로 판단하였다.

실험동물의 사육 및 투여

실시예 6~10에서 사용한 동물은 10주령의 C57BL/6J black 마우스(수컷, 20±2g)를 25주령까지 사육한 후, 군당 10마리씩 분류하였으며, 실험군은 100, 500, 1000mg/kg/day의 반지련 추출물을 5주 동안 경구투여하였다.

실시예 6. 혈청 내 호르몬 등 관련 지표 측정 및 단백질 분석

부검 시 마우스는 16.5% 우레탄을 복강 투여하여 마취한 후, 심장에서 혈액을 채취하여 실온에서 약 30분 동안 방치한 후, 3000rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 이후 상층액인 혈청을 깨끗한 튜브에 옮겨 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다.

남성갱년기 증상 관련 혈청 내 지표인 총 테스토스테론, 총 콜레스테롤, 난포자극호르몬(follicle-stimulating hormone; FSH) 및 황체형성호르몬(luteinizing hormone; LH)은 각각의 ELISA 키트를 사용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다. 포도당 측정은 혈당계를 이용하여 측정하였고, 17β-HSD 활성 변화는 특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 확인하였다.

그 결과 도 7에 개시한 바와 같이 본 발명의 반지련 추출물을 투여한 군에서 테스토스테론의 함량이 증가하였으며, 콜레스테롤의 수치는 감소하였고, 황체형성호르몬도 증가하였다. 또한, 혈중 포도당의 함량을 낮추는 효과가 있었으며, 17β-HSD의 단백질 함량도 증가하였다.

실시예 7. 근육 및 지방 분석

실험동물을 심장 채혈을 통해 희생 후, 피부를 벗겨낸 다리를 가위로 절제한 후, 대퇴근에서 큰 비중을 가진 외측광근(vastus lateralis; VL)을 분리하여 무게를 측정하였고, 내장지방 중 정소상체지방(epididyma fat; EF), 장간막(mescentric fat; MF), 후복부(abdominal subcutaneous fat; ASF) 부위의 지방의 무게를 측정하여 각각의 변화량을 확인하였다.

그 결과 도 8에 개시한 바와 같이, 본 발명의 반지련 추출물을 투여한 군에서 외측광근(vastus lateralis; VL)의 무게가 증가하였으며, 정소상체지방(epididyma fat; EF), 장간막(mescentric fat; MF), 후복부(abdominal subcutaneous fat; ASF) 부위의 지방의 무게가 감소한 것을 확인하였다.

실시예 8. 강제수영 시험(FST)

종래의 Detke 등에 의해 고안된 방법을 실험 환경에 맞게 수정하여 사용하였다. 직경 25cm, 높이 45cm의 투명한 유리 원통에 30cm의 높이로 수온 25℃의 물을 채운 후에 예비 실험으로 15분 동안 동물을 물에 빠뜨려 적응시키고, 24시간 후에 5분 안 본 실험을 실시하였다.

실험이 종료된 동물은 건조할 수 있도록 적외선 등 아래에 30분 동안 놓아 둔 후 원래의 케이지로 돌려놓았다. 5분 동안의 본 실험에서는 동물의 행동을 부동자세(immobility), 수영자세(swimming) 및 등반자세(climbing)로 구분하여 10초 마다 유지한 자세의 횟수를 체크하여 초 단위로 변환하였다.

그 결과 도 9에 개시한 바와 같이, 본 발명의 반지련 추출물을 투여한 군에서 부동자세를 취한 시간이 감소하였고, 수영자세 및 등반자세를 취한 시간이 증가하였다.

실시예 9. 부고환에서의 정자 수 및 활동성 분석

마우스를 희생하여 좌우의 부고환을 각각 적출하여 무게를 측정한 후, 0.5% BSA를 포함하는 M199 배지 1㎖에 넣고 1cc 인슐린 주사기를 이용하여 70회 찔러 부고환에서 정자가 자연스럽게 나오도록 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 이를 100㎕ 취하고, 여기에 배양액 0.5㎖을 가하여 2차 희석하였다. 2차 희석액 10㎕를 취하여 Dual Slide Sperm Analysis Chamber(Depth: 80㎛, Hamilton Thorne Biosciences, 미국)에 고루 퍼지도록 주입하여 광학 현미경을 통해 정자의 상태를 확인 후 CASA 시스템을 이용하여 정자의 운동성과 정자 수를 측정하였다.

그 결과 도 10에 개시한 바와 같이, 본 발명의 반지련 추출물을 투여한 군에서 정자수 및 정자 활동성이 증가하였다.

Claims (6)

1. 반지련(Scutellaria barbata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 근력저하; 또는 정자 수 및 운동성의 감소;를 수반하는 남성갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 반지련 추출물의 추출용매는 물, C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 남성갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 반지련 추출물은 음료, 환, 정제(tablet), 캡슐제(capsule) 및 산제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 남성갱년기 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
5. 반지련 추출물을 유효성분으로 함유하는 근력저하; 또는 정자 수 및 운동성의 감소;를 수반하는 남성갱년기 증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 반지련 추출물 이외에 추가로 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 것을 특징으로 하는 남성갱년기 증후군의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

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