KR20120117128A - 반지련 추출물을 함유하는 모발 성장 촉진 또는 탈모 방지용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 반지련 추출물을 함유하는 모발 성장 촉진 또는 탈모 방지용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물에 함유되는 유효성분인 반지련 추출물은 섬유아세포 및 진피유두세포의 증식을 촉진시키고 모발 성장 관련 유전자들의 발현을 증가시킴으로써 모발 성장 촉진 및 탈모 방지에 우수한 효과를 나타낸다. 또한 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

Description

반지련 추출물을 함유하는 모발 성장 촉진 또는 탈모 방지용 조성물 {Compositions for promoting hair growth or preventing hair loss comprising Portulaca grandiflora Hooker extracts}

본 발명은 반지련 추출물을 함유하는 모발 성장 촉진 또는 탈모 방지용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 피부에 대한 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있으며 섬유아세포 및 진피유두세포의 증식을 촉진시키고 모발 성장 관련 유전자들의 발현을 증가시킴으로써 모발 성장 촉진 및 탈모 방지 효과가 우수한 반지련 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.

모발은 피부 부속 기관의 하나로 생태학적으로 상피에서 유래하며, 태생 2개월째부터 형성된다. 모발의 종류는 그 굵기에 따라 가는 모발의 세모(Vellus hair)와 굵고 딱딱한 경모(terminal hair)로 분류된다. 모발의 성장은 주기적이며 일시적으로 탈모되지 않는다. 각 모낭은 활동과 정지의 간헐적인 단계를 거친다. 성장기(growing phase), 즉 생장기(anagen) 동안 모구의 세포는 활발히 분화하여 성장 모발을 형성한다. 인간의 두발은 85%가 3?6년의 성장기 두발이고, 5%가 두발의 퇴화가 시작되어 2?3주간 진행되는 퇴행기며, 나머지 10%가 두발의 성장이 멈추는 3?4개월간의 휴지기로 하루 평균 50?100여개 정도가 빠진다 (이진산(1998). 백발?탈모증 동의보감, 건강생활연구회 편, 도서출판 인화). 탈모의 원인으로는 유전, 영양장애, 내분비장애, 조직 장애, 모낭충, 두부의 압박, 비듬, 자가 면역, 국소감염 등을 들 수 있다 (김민정(2005). 모발과 두피, 예림, 110-111). 탈모는 모발형성에 밀접한 모낭에서의 호르몬, 단백질 등의 대사 작용의 이상과 현대사회로 들어서면서 여성들의 사회활동 증가로 인한 스트레스 증가 및 서구화된 식습관에서 오는 영양의 불균형 등 탈모에 직?간접적으로 영향을 미칠 수 있는 많은 사회 문화적인 요인들의 변화에서 기인하는 것으로 생각되고 있다 (J. Kor. Soc. Cosm. Vol. 13, No. 3(2007) p.1366-1375).

주변에서 흔히 볼 수 있는 탈모증은 크게 두 종류로 분류될 수 있는데, 첫 번째는 남성형 탈모증(male pattern baldness), 장년형 탈모증(alopecia seniles) 또는 남성호르몬성 탈모증(androgenic alopecia)으로 불리우는 것으로 중년 남성에서 흔히 볼 수 있으며 전두부와 두정부에서 시작되는 탈모증이 있고, 둘째로는 원형 탈모증(alopecia areata)으로 불리우는 것으로 주로 후두부에서 시작되어 원형 내지는 타원형의 비교적 경계가 명확한 탈모를 보이며 청소년기에 발생할 수 있는 탈모증이 있다. 탈모증은 남성에만 있는 질병이 아니고 여성에서도 발생할 수 있으며, 특히 여성의 경우에는 두정부에서 시작되는 경우가 많고, 원형 탈모증 역시 존재하는데 남성에 비하여 발생 빈도가 낮을 뿐이다 (M. Inaba 등, Androgenetic Alopecia, Springer-Berlag, Tokyo, Japan, 1996).

현재 탈모예방 및 치료는 의학적 접근법과 한의학적 접근법으로 나누어 볼 수 있다. 의학적 접근법으로는 약물요법, 수술적 방법, 영양요법, 식이요법 등이 있다. 현재 모발성장을 촉진하는 약물로는 미국 Food and Drug Administration (FDA)에서 공인 받은 Minoxidil (MXD)과 Finasteride가 있으며 치료를 중단하면 원래대로 돌아가고 오랫동안 사용하면 피부염 등의 부작용이 보고되고 있다 (Kaufman K.D.(1996). Elsevier Science, 363－365).

반지련(Portulaca grandiflora Hooker)은 쇠비름과(Portulacaceae)의 식물로서 남아메리카가 원산이며, 일반적으로 채송화라 불린다. 줄기는 붉은 빛을 띠고 가지가 많이 갈라져서 퍼지며 높이는 20 cm 내외이고 잎은 육질로서 어긋나고 가늘고 긴 원기둥 모양이고 잎겨드랑이에 흰색 털이 있다. 성분으로 전초에 알칼로이드(Alkaloid), 플라보노이드(Flavonoid)류 등이 함유되어 있으며 주성분으로는 포츌랄(Portulal), 베타닌(Betanin), 베타시아닌(Betacyanin), 베타니딘(Betanidin) 등이 알려져 있다. 특히 포츌랄(Portulal)은 식물의 성장을 촉진시키는 작용을 한다고 알려져 있다. 반지련은 청열작용이 있으므로 인후염 및 뜨거운 물이나 불에 데었을 때 소염효과를 얻고, 타박상과 피부가 헐어 생긴 발진에도 사용되었으며, 주로 외용약으로 사용하였다 (중약대사전, 중약대사전편찬위원회, 도서출판 정담, 1997).

반지련이 각종 종양세포에 대해 항 돌연변이 효과와 항암(anti-tumorigenic)활성이 있는 것으로 알려져 간종대와 간암 등의 치료에 활용되고 있다 (Wong By Lau BH, Teel RW, cancer Lett. 1992;62(2): 123-31).

반지련에 대한 선행 발명의 예를 보면, 항산화 항염효과 (공개특허10-2007-0065951), 항암 및 암 전이 억제 효과 (공개특허 특2003-0023243), 피부노화방지 조성물 (공개특허 특2003-0061847) 등의 선행 연구가 이루어져 있으나 모발의 성장이나 조성물에 대한 선행 연구는 이루어지지 않았다.

본 발명자들은 반지련 추출물이 세포증식 및 항산화, 모발 관련 유전자 발현을 증가시키는 효과가 우수하여 모발 증식 촉진 및 탈모 예방 효과를 발휘하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 세포 증식 효과, 항산화 효과 및 모발 성장 관련 유전자 발현을 증가시킴으로써 모발 성장 촉진 또는 탈모 방지 효과를 갖는 반지련 추출물을 함유하는 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 반지련 추출물을 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진 또는 탈모 방지용 조성물을 제공한다.

상기 반지련은 쇠비름과(Portulacaceae)의 식물로서, 본 발명에서는 반지련 추출물이 섬유아세포 및 진피유두세포의 증식을 촉진시키고 모발 성장 관련 유전자들의 발현을 증가시킴으로써 모발 성장 촉진 및 탈모 방지 효과를 가짐을 처음으로 밝혀내었다.

본 발명의 조성물에서, 상기 반지련 추출물은 반지련을 당업계에 공지된 통상적인 식물 추출방법, 예컨대, 열수추출, 유기용매 추출, 냉침추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 방법을 사용하여 추출할 수 있다, 상기 유기용매 추출은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출할 수 있으며, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 함수 에탄올, 가장 바람직하게는 환류조건 하에 함수 에탄올로 추출할 수 있다.

상기 통상적인 식물 추출방법을 이용한 구체적인 반지련 추출물의 제조방법의 예로는, 반지련 건조물 또는 그 분쇄물을 상기 추출용매에 투입하고 필요에 따라 교반하면서 5-40℃에서 1-15일간 침적시키거나 40-100℃에서 4-20시간 동안 가열하여 추출할 수 있다. 추출에 사용되는 용매의 양은 추출 원료의 통상 5 내지 20 배량(중량비)을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 실시예에서, 다양한 용매를 이용한 추출물들의 섬유아세포 및 진피유두세포의 증식 효과를 확인하였으며, 이 중 대표적으로 가장 높은 효과를 나타낸 추출물(함수 에탄올 추출물)을 이용하여 모발 보호, 모발 성장 촉진 및 탈모 방지 효과 등의 임상실험도 진행하여 그 효과를 확인하였다 (실험예 9 참조).

본 발명의 조성물에서, 상기 반지련 추출물은 모발 성장 관련 유전자인 인슐린양 성장인자(Insulin-like Growth Factor), 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor), 각질형성세포 성장인자(Keratinocyte Growth Factor) 및 혈관내피세포 성장인자인(Vascular Endothelial Growth Factor)의 발현을 증가시킴으로써 모발 성장 촉진 및 탈모 방지 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에서, 반지련 추출물은 상기 모발 성장 관련 유전자들의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었으며 (표 12 참조), 이를 통해 모발 성장 촉진 및 탈모 방지 효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단하였으며, 그 결과를 임상실험을 통해 최종 확인함으로써, 반지련 추출물이 모발 성장 촉진 또는 탈모 방지용 조성물로 사용될 수 있음을 입증하였다 (표 18 참조).

본 발명의 조성물에서, 상기 반지련 추출물은 천연 식물의 추출물로서 이미 생약제로 많이 사용되고 있고 본 발명의 피부 자극성 시험결과(시험예 9)에서 피부 자극이 거의 없음을 확인함에 따라, 조성물 중 그 함량은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 90 중량%로 함유될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 10 중량%로 함유되는 것이 적당하다.

본 발명의 반지련 추출물을 포함하는 조성물은 모발 성장 촉진 및 탈모 방지 효과를 위한 화장료 조성물 및 피부외용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 이용되는 경우에는, 유효 성분으로서의 반지련 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스 등을 포함할 수 있다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 반지련 추출물은 상기 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001 - 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 - 3 중량%로 배합될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 페이스트, 크림, 겔, 파우더, 스프레이 용액, 유탁액, 현탁액, 로션, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 상세하게는, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 또는 바디클린저의 제형으로도 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물이 피부외용 약학적 조성물로 이용되는 경우에는, 유효 성분으로서의 반지련 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 피부외용 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있고, 바람직하게는 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 액상, 크림상, 페이스트상, 고체상 등의 두피에 적용시킬 수 있는 모든 제형으로 제조가 가능하며, 통상의 첨가제를 가하여 모발성장촉진을 위한 샴푸, 헤어컨디셔너, 헤어로션, 액상의 양모제 타입 등의 조성물로 제조될 수 있으며 이들 제형의 에어졸 타입도 포함한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 반지련 추출물은 섬유아세포 및 진피유두세포의 증식을 촉진시키고 모발 성장 관련 유전자들의 발현을 증가시킴으로써 모발 성장 촉진 및 탈모 방지에 우수한 효과를 나타낸다. 그리고 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 추출물 제조

음건 후 세절한 반지련 1 kg을 95%(중량%) 에탄올 20 L에 넣고 상온에서 5일간 교반 추출한 후 250메쉬 여과포로 여과하고, 4℃에서 7일간 방치하여 숙성시킨 후 와트만 여과지(N0.5)로 여과하여 활성탄 처리 후 감압 농축하여 추출물 48.2 g을 얻었다.

실시예 2~11.

하기 표 1의 용매를 사용하고 실시예 1과 동일한 방법으로 추출하여 그 결과를 하기 표 1에 기술하였다.

	용 매	추출물 (g)
실시예 2.	정제수	47.9
실시예 3.	무수 메탄올	46.3
실시예 4.	무수 에탄올	46.6
실시예 5.	함수 에탄올 (30 중량%)	43.2
실시예 6.	함수 에탄올 (70 중량%)	45.1
실시예 7.	부틸렌글리콜	44.6
실시예 8.	프로필렌글리콜	42.0
실시예 9.	글리세린	44.8
실시예 10.	함수 부틸렌글리콜 (30 중량%)	44.2
실시예 11.	함수 프로필렌글리콜 (30 중량%)	41.2

실시예 12.

음건 후 세절한 반지련 1 kg을 95%(중량%) 에탄올 20 L에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 환류조건하에서 80℃에서 4시간 가열하여 추출한다. 250 메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각한 후 5~15℃에서 7일간 방치한다. 와트만 여과지(N0.5)로 여과하여 활성탄 처리 후 감압 농축하여 추출물 47.2 g을 얻었다.

실시예 13~17.

하기 표 2에 기술한 용매를 사용하고 실시예 12와 동일한 방법으로 추출하여 그 결과를 하기 표 2에 기술하였다.

	용 매	추출물 (g)
실시예 13.	정제수	44.3
실시예 14.	무수 메탄올	42.1
실시예 15.	무수 에탄올	42.8
실시예 16.	함수 에탄올 (30 중량%)	46.2
실시예 17.	함수 에탄올 (70 중량%)	49.3

실험예 1. 세포 증식에 관한 실험 (사람 섬유아세포)

모발 성장은 케라티노사이트, 멜라노사이트, 섬유아세포의 분화와 증식에 의해 조절되며 (Hirobe T, Histol Histopathol 1995;10:223-237), Minoxidil 또한 다양한 피부 세포 및 hair follicle cell의 증식을 촉진하므로 (Messenger AG, Rundegren J. Br J Dermatol 2004;150:186-194) 섬유아세포의 증식은 모발 성장에 중요한 인자로 여겨진다.

MTT assay는 살아있는 세포의 수를 측정함으로서 세포 증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로 살아있는 세포는 미토콘드리아 내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT(3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)가 숙신산탈수소효소(succinate dehydrogenase 또는 mitochondrial dehydrogenase라고도 불림)에 의해 수불용성인 파란색의 formazan 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이다. 생성된 formazan 유도체는 용해제(보통 dimethylsulfoxide 사용)를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정한다.

좀 더 자세히 설명하면, 사람 섬유아세포(ATCC, American Type Culture Collection, Cat. No. CRL-2076)를 5×10⁴ cells/㎖의 농도로 하여 24 well plate에 접종하였다. 배지는 소혈청 10%를 함유한 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium; GIBCO, USA)을 사용하였다. 접종 후 24시간 후 소혈청 0%를 함유한 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium; GIBCO, USA)을 교체하고, 시험 시료(실시예 1~17)를 50 μg/ml의 농도로 10 μl 첨가한 후 3일 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 제거하고 다시 5% PBS (phosphate buffered saline) 200 μl씩을 가하여 세척하고 25 μg/ml의 MTT 용액을 well당 1.0 ml씩 가한 후 4시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 well당 1.0 ml씩 가한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존률은 하기의 실험식 1을 이용하여 계산하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 여기서 섬유아세포의 증식에 효과가 있는 것으로 알려진 Minoxidil은 양성대조군으로 사용되었다.

[실험식 1]

시 료	세포 생존율(%)
control	100
Minoxidil 500 μM	134
실시예 1	99
실시예 2	101
실시예 3	108
실시예 4	102
실시예 5	121
실시예 6	105
실시예 7	111
실시예 8	98
실시예 9	100
실시예 10	108
실시예 11	112
실시예 12	102
실시예 13	113
실시예 14	105
실시예 15	105
실시예 16	129
실시예 17	130

사람 섬유아세포를 이용한 세포 증식 실험을 측정한 결과, 실시예 5, 실시예 16, 실시예 17에서 20% 이상의 세포 증식 효과가 나타남을 확인하였다. 이는 섬유아세포의 증식에 효과가 있는 것으로 알려진 Minoxidil과 비교하여 유사한 수준으로 세포 증식효과를 나타내는 것이다. 양성대조군으로서 Minoxidil은 500 μM (104.46 μg/ml)이 사용되었는데, 이 농도에서 34% 세포 증식 효과를 보였기 때문에, 반지련추출물을 50 μg/ml 처리 시 20%의 증식은 의미 있는 수치라 판단하였다.

실험예 2. 세포 증식에 관한 실험 ( 진피유두세포 )

진피유두세포는 hair dermal papilla의 주요 성분 중 하나이며, 진피유두세포에 의해 생성, 분비된 성장인자들(basic fibroblast growth factor (bFGF), endothelin-1 (ET-1), stem cell factor (SCF) 등)은 hair matrix cell의 성장과 분화를 촉진한다 (Paus R, Foitzik K. Differentiation 2004;72:489-511; Fujie T, et al., J Dermatol Sci 2001; 25:206-212; Botchkarev VA, et al., J Investig Dermatol Symp Proc 2003;8:46-55). 일반적으로, 새로운 hair follicle의 유도와 모발 성장의 유지에 있어서 필수적인 역할을 할 것으로 생각되고 있다 (Jahoda CA, et al., Nature 1984;311:560-562; Kamp H, et al., Exp Dermatol 2003;12:662-672; Krugluger W, et al., Exp Dermatol 2005;14:580-585.). 따라서, 진피유두세포의 활성과 증식은 새로운 모발 성장 촉진물질의 개발에 있어서 중요 요인이라 할 수 있다.

진피유두세포(Dermal papilla cell)를 5×10⁴ cells/ml의 농도로 하여 24 well plate에 접종하였다. 배지는 소혈청 10%를 함유한 DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)을 사용하였다. 접종 후 24시간 후 소혈청 0%를 함유한 DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)을 교체하고, 시험 시료(실시예 1~17)를 50 μg/ml의 농도로 10 μl 첨가한 후 3일 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 제거하고 다시 5% PBS (phosphate buffered saline) 200 μl씩을 가하여 세척하고 25 μg/ml의 MTT 용액을 well당 1.0 ml씩 가한 후 4시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 well당 1.0 ml씩 가한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존률은 상기의 실험식 1과 같이 계산하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 여기서 진피유두세포의 증식에 효과가 있는 것으로 알려진 Minoxidil은 양성대조군으로 사용되었다.

시 료	세포 생존율(%)
control	100
Minoxidil 500 μM	134
실시예 1	118
실시예 2	107
실시예 3	111
실시예 4	100
실시예 5	101
실시예 6	123
실시예 7	88
실시예 8	99
실시예 9	98
실시예 10	110
실시예 11	101
실시예 12	128
실시예 13	112
실시예 14	103
실시예 15	101
실시예 16	101
실시예 17	132

진피유두세포를 이용한 세포 증식 실험을 측정한 결과, 실시예 6, 실시예 12, 실시예 17에서 20% 이상의 세포 증식 효과가 나타남을 확인하였다. 이는 진피유두세포의 증식에 효과가 있는 것으로 알려진 Minoxidil과 비교하여 유사한 수준으로 세포 증식효과를 나타내는 것이다. 양성대조군으로서 Minoxidil은 500 μM (104.46 μg/ml)이 사용되었는데, 이 농도에서 35% 세포 증식 효과를 보였기 때문에, 반지련추출물을 50 μg/ml 처리 시 20%의 증식은 의미 있는 수치라 판단하였다.

실험예 3. 추출물의 농도에 따른 세포 증식에 관한 실험 (사람 섬유아세포)

실험예 1과 동일한 방법으로 실시예 17의 사람섬유아세포에 대한 증식효과를 농도별로 측정한 결과, 하기의 표 5에서와 같이 10 μg/ml 농도 처리 시부터 세포 증식 효과를 보였다.

실시예	세포 생존율(%)
control	100.00
실시예 17 1 μg/ml	102.26
실시예 17 10 μg/ml	128.04
실시예 17 100 μg/ml	133.21
Minoxidil 500 μM	130.76

상기 표 5의 결과는 사람 섬유아세포에 대한 증식효과에서 반지련 추출물의 최적 농도가 10 ~ 100 μg/ml임을 보여주는 것이다.

실험예 4. 추출물의 농도에 따른 세포 증식에 관한 실험 ( 진피유두세포 )

실험예 2와 동일한 방법으로 실시예 17의 진피유두세포에 대한 증식효과를 농도별로 측정한 결과, 하기 표 6에서와 같이, 100 μg/ml 농도 처리 시부터 세포 증식 효과를 보였다.

실시예	세포 생존율(%)
control	100.00
실시예 17 1 μg/ml	102.98
실시예 17 10 μg/ml	117.52
실시예 17 100 μg/ml	136.34
Minoxidil 500 μg/ml	139.74

상기 표 6의 결과는 진피유두세포에 대한 증식효과에서 반지련 추출물의 최적 농도가 100 μg/ml임을 보여주는 것이다.

실험예 5. 반지련 추출물에 의한 모발 관련 유전자 발현 증가 측정

인슐린양 성장인자인 IGF-I (Insulin-like Growth Factor), 간세포 성장인자인 HGF (Hepatocyte Growth Factor), 각질형성세포 인자인 KGF (Keratinocyte Growth Factor), 및 혈관내피세포 성장인자인 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) 유전자 발현 효과를 보기 위해, RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)을 실시하였다. 진피유두세포(Dermal papilla)를 100 mm 세포 배양 접시에 80% 밀도로 접종한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 소혈청 10%를 함유한 DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)을 사용하였다. 실시예 17을 농도별로 첨가하여 18시간 배양하고, 세포에 트리졸 (Trizol, invitrogen, 미국) 1 ㎖을 첨가하여 프로메가社의 RNA 분리법에 따라 분리하였다. 자외선 검출기를 이용하여 260 nm에서 RNA를 정량한 후, RT-PCR을 실시하였다. RT-PCR은 RT-PCR Kit (All-in-one RT-PCR Kit, SuperBio, Korea)를 사용하였고, 프라이머와 반응 조건은 하기의 표 7, 8, 9, 10과 같고, kit의 방법에 의해 실험을 수행하였다.

IGF-1 프라이머

센스	5'-TCAACAAGCCCACAGGGTAT-3'
안티센스	5'-ACTCGTGCAGAGCAAAGGAT-3'
반응 조건	50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분간 40 cycle로 중합 반응

HGF 프라이머

센스	5'-CGAGGCCATGGTGCTATACT-3'
안티센스	5'-ACACCAGGGTGATTCAGACC-3'
반응 조건	50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소 불활성화, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분간 40 cycle로 중합 반응

KGF 프라이머

센스	5'-GACATGGATCCTGCCAACTT-3'
안티센스	5'-AATTCCAACTGCCACTGTCC-3'
반응 조건	50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분간 35 cycle로 중합 반응

VEGF 프라이머

센스	5'-TCTTCAAGCCATCCTGTGTG-3'
안티센스	5'-GCGAGTCTGTGTTTTTGCAG-3'
반응 조건	50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분간 40 cycle로 중합 반응

β-actin 프라이머

센스	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3'
안티센스	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3'
반응 조건	50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃ 1분, 62℃ 1분, 72℃ 1분간 25 cycle로 중합 반응

상기와 같이, IGF-I, HGF, KGF 및 VEGF 발현 효과를 측정한 결과는 actin 유전자에 대해 보정을 하여 나타내었고, 하기 표 12에서 나타나는 바와 같이 실시예 17의 모발 관련 유전자 발현 증가 효과가 우수함을 알 수 있었다.

mRNA 발현량 (%, 액틴에 대해 보정한 값)	농도
	Control (%)	1 μg/ml	10 μg/ml	100 μg/ml
IGF-I	100	156	210	269
HGF	100	100	134	159
KGF	100	192	260	365
VEGF	100	101	115	122

실험예 6. 모발 보호용 항산화능

본 발명에 따른 실시예 17의 모발 보호 효과에 대한 주요한 메커니즘의 하나로 항산화능의 정도를 조사하였다. 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH, Sigma D9132-1G, USA)는 에탄올 내에서 자유라디칼을 발생하는데, 상기 실시예 17에서 제조된 반지련 추출물과 일정 비율로 혼합하여 생성된 자유라디칼의 양이 어느 정도 감소하는지를 확인하였다. 에탄올 0.2 ml에 에탄올을 용매로 제조된 0.1 mM DPPH 용액 0.5 ml 및 본 발명에 따른 실시예 17을 0.3 ml을 최종농도가 1~100 μg/ml가 되도록 첨가하였다. 그 다음, 상기 용액을 10초 동안 강하게 vortexing 하고, 냉암소에서 30분간 보관한 다음, ELISA를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 발명에 따른 추출물의 항산화능의 정도는 70% 에탄올을 사용한 대조군(무처리군)의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 나타내었다. 그 결과를 표 13에 나타내었다.

3회 반복 시험의 결과, 대조군과 비교하여 농도가 증가할수록 높은 항산화 효과를 보여주었다. 따라서 이러한 결과는 본 발명에 따른 반지련 추출물을 포함하는 조성물의 경우, 세포 독성이 적으면서 유의적인 항산화능으로 모발 보호 및 탈모 예방 효과를 가질 수 있음을 나타낸 것이다.

농도	Inhibition effect (%)
Control	0 %
실시예 17 1 μg/ml	1.1 %
실시예 17 5 μg/ml	12.34 %
실시예 17 10 μg/ml	26.89 %
실시예 17 50 μg/ml	52.16 %
실시예 17 100 μg/ml	75.52 %

실험예 7. 반지련 추출물의 모발 생장 촉진 효과 시험

본 발명에 따른 탈모 방지 및 모발 생장 촉진용 반지련 추출물의 효과를 알아보기 위하여, C57BL/6N 마우스를 이용하여 본 조성물의 모발 생장 촉진 효과를 확인하였다. C57BL/6N 마우스가 두 번째 catagen (퇴행기) 시기로 진입하는 생후 49~51일째에 왁스를 이용하여 등의 털을 완전히 제거하고, 상기 실시예 17의 반지련 추출물의 농축 고형분을 1%가 되게 물에 희석하여 15일간 하루 2회씩 100 ㎕씩 발라주어 모발 생장 효과를 확인하였다. 대조군으로는 모발 생장 촉진 효과가 없는 것을 사용하였으며, 결과는 시간 경과에 따른 모발의 길이(단위(mm))를 측정하여 모발 생장 촉진 정도를 비교하였다. 실험결과는 아래 표 14와 같으며, 모발 생장효과가 있음을 알 수 있었다.

	5일 (거의 차이 없음)	10일 (약간 차이 보임)	15일 (확연하게 차이가 보임)
대조군	0.09±0.001	0.96±0.52	2.14±0.67
실시예 17	0.09±0.001	1.01±0.45	3.56±0.96

실험예 8. 피부 자극성 시험

상기 실시예 17의 반지련 추출물의 농축 고형분을 1%가 되게 물과 희석하여 토끼의 피부에 대한 자극 정도를 측정하였고, 이를 위하여 상기 조성물의 적용 24시간 전에 토끼의 제모(除毛)를 실시하여 정상피부와 상처피부의 처치구획 및 대조구획으로 구분하였다. 도포방법은 토끼 1 마리당 도포부위에 1회 도포하였다. 무처치 대조 구획에는 멸균생리식염수를 같은 양으로 도포하고 가제를 덮었다. 그리고 시료의 증발을 막기 위해 침투성과 반응성이 없는 고형재질의 박지로 덮고, 테이프를 사용하여 고정한 후 24시간, 72시간, 120시간 동안 적용시켰다. 이후 적용시간 종료 후에는 생리식염수를 이용해 도포부위를 가볍게 세정해주었다. 그리고 시료물질 투여 후 일주일간 매일 외관, 사료 및 음료 소비상태와 임상 증상 등에 대하여 관찰하였다.

피부 반응의 평가는 의약품 등의 '독성시험기준'을 이용하여 판단하였다. 또한 피부에 대한 자극의 정도를 일반적으로 많이 이용되는 Draize의 P.I.I. (Primary Irritation Index)의 산출방법으로 평가하였고, 그 결과는 하기 표 15에 나타내었다.

시료명	P.I.I 결과치
	24시간	72시간	120시간
대조군	0.1 무자극	0.1 무자극	0.1 무자극
실시예 17	0.3 저자극	0.1 무자극	0.1 무자극
P.I.I (무자극) 0 ←←→→ 5 (강한자극)

상기 표 15에서 보는 바와 같이, 24시간 적용시 P.I.I.가 0.3으로 저자극을 나타내며 72시간 적용시 0.1로 무자극을 나타내어, 본 발명의 조성물이 피부 자극이 적음을 알 수 있다.

실험예 9. 임상 효과 실험 평가

사람을 대상으로 하는 임상시험에서 그 효과를 확인하고자 탈모증이 있는 대상자를 선정하여 시험하였다. 임상시험에서는 반지련 추출물을 함유한 제형(실시제형예)과 유효성분을 함유하지 않는 제형(비교제형예)을 이용하여 탈모방지 및 모발성장 촉진에 관한 임상 효과를 측정하였다 (하기 표 16 참조).

피험자는 20~50세까지의 성인 남녀 중 탈모증이 있는 사람 또는 일일 평균 탈모수가 100개 이상인 사람 20명씩을 대상으로 실시하였으며, 사용 방법은 탈모 부위에 1일 2~3회 수적(약 2 ml)을 도포하는 것으로 하고 효과 확인의 정도에 따라 최소 1개월에서 최대 5개월까지 사용하였다. 효과의 판정은 세발 시 일일 평균 탈모량, 육안 판정 소견 및 자각 증상 개선 정도를 다음의 평가 척도에 따라 5단계로 평가하고, 종합적으로 전반적인 개선도를 상기 평가 척도의 평균으로 하였다 (하기 표 17 참조). 최종 판정은 종합적인 전반 개선도 3.0점 이상을 유효하다고 하였으며 그 결과는 다음의 표 18에 나타내었다.

상기 실시예 17의 반지련 추출물을 함유한 화장료 중 헤어 로션의 제형예를 표 16에 나타내었다. 이때 비교예는 반지련 추출물을 함유하지 않은 경우이다.

성분	실시 제형예 (중량)	비교제형예
세토스테아릴알코올	2.0	2.0
염화스테아릴트리에틸암모늄	2.0	2.0
히드록시에틸셀룰로오즈	0.5	0.5
피톡톤올아민	0.1	0.1
실시예 17	10	-
향료, 색소	0.5	0.5
정제수	잔액	잔액
계	100	100

단계구분	세발시 탈모량	자각 증상	육안 판정
5 4 3 2 1	현저한 감소 중등도 감소 경도 감소 불변 악화(증가)	현저한 개선 중등도 개선 경도 개선 불변 악화	현저한 개선 중등도 개선 경도 개선 불변 악화

단계구분	세발시 탈모량	자각 증상	육안 판정	종합 개선도
실시제형	3.2	4.6	4.5	4.1
비교제형	2.5	2.4	2.3	2.4

상기 표 18에 나타난 바와 같이, 비교제형에서는 약간의 개선 효과를 나타내기는 하였으나 그 유효성을 기대하기는 어려웠으며, 본 발명에 따른 실시예 17의 반지련 추출물을 함유한 조성물 제형에서는 중등도 개선 효과를 나타내었다. 탈모방지 및 모발 성장 촉진 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다. 또한 임상시험에서의 사용기간 중 대상자 전원에게서 어떠한 부작용도 발견되지 않아 인체에도 안전한 조성물임을 알 수 있었다.

Claims (7)

1. 반지련 추출물을 유효성분으로 함유하는 모발 성장 촉진 또는 탈모 방지용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 반지련 추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 반지련 추출물은 모발 성장 관련 유전자인 인슐린양 성장인자(Insulin-like Growth Factor), 간세포 성장인자(Hepatocyte Growth Factor), 각질형성세포 성장인자(Keratinocyte Growth Factor) 및 혈관내피세포 성장인자인(Vascular Endothelial Growth Factor)의 발현을 증가시킴으로써 모발 성장 촉진 및 탈모 방지 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 반지련 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 크림, 로션, 스킨, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트 및 미용액으로 구성된 군에서 선택된 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 피부외용 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.