JP2013530181A

JP2013530181A - 有色豆抽出物を含有する組成物

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Publication number: JP2013530181A
Application number: JP2013515271A
Authority: JP
Inventors: ジンクヮンキム，; チェウクキム，; ヨンスジョン，; ジュンウォンユン，; キュンミンリム，; ヨンヒョプジュ，; ヨンホパク，; ヒョンジョンシン，
Original assignee: Amorepacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2013-07-25
Also published as: WO2011159134A3; WO2011159134A2; CN102970998B; CN102970998A; JP2016065087A; KR20110138001A; US20130089631A1; JP6284920B2

Abstract

本発明は、有色豆等から抽出した有色豆抽出物の分画物を有効成分として含有する抗血栓効能組成物に関する。本発明による抗血栓組成物は、血栓形成が原因として作用する心臓血管疾患、脳血管疾患、動脈硬化症、高血圧、糖尿等の循環器系疾患の治療に非常に有用に利用され得る。

Description

本発明は、有色豆抽出物の分画物を有効成分として含有する抗血栓組成物に関するものである。

現代社会においては、食生活様式の変化や内的及び外的ストレスの増加により、中高年層においていわゆる成人病と言われる循環器系疾患の発病増加が大きな問題となっている。２００８年度の韓国統計庁の資料によると、動脈硬化症、脳出血、脳卒中、脳梗塞等の脳血管疾患と心臓疾患が、癌を除いた死亡原因の１位、２位を争っているという実情である。これら疾患の主要原因は、血栓（ｔｈｒｏｍｂｕｓ）であり、血栓症（ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）は、過剰の血小板凝集反応によって起こる病理現象である。血管が損傷した際、血小板は、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、ＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）等といった各種作用物質（ａｇｏｎｉｓｔｓ）の刺激によって活性化されて、粘着反応（ａｄｈｅｓｉｏｎ）、放出反応（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）及び凝集反応（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を引き起こす。この過程は、止血（ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）だけでなく、血栓症等を含む循環器系疾患の発病に重要な部分を占めている。

循環器系疾患の一例として冠状動脈疾患を挙げることができるが、これは、全世界的にもっともよくある死亡原因の一つとして知られている。特に、急性冠動脈症候群（ａｃｕｔｅｃｏｒｏｎａｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、死亡の直接的な原因となる冠動脈疾患である。急性冠動脈症候群は、不安定狭心症（Ｕｎｓｔａｂｌｅａｎｇｉｎａ）、非ＳＴ上昇型心筋梗塞（Ｎｏｎ‐ＳＴ‐ｓｅｇｍｅｎｔｅｌｅｖａｔｉｏｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ；ＮＳＴＥ；ＮｏｎＱ‐ｗａｖｅＭＩ）、ＳＴ上昇型心筋梗塞（ＳＴ‐ｅｌｅｖａｔｉｏｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ；ＳＴＥＭＩ；Ｑ‐ｗａｖｅＭＩ）等に分類することができ、前者の２つは治療、予後が類似するために、まとめてＮＳＴＥＡＣＳ（Ｎｏｎ‐ＳＴ‐ｅｌｅｖａｔｉｏｎＡｃｕｔｅＣｏｒｏｎａｒｙＳｙｎｄｒｏｍｅ）と呼ばれたりもする。慢性安定狭心症（ＣｈｒｏｎｉｃＳｔａｂｌｅＡｎｇｉｎａ）は、粥状硬化により冠状動脈有効直径が減少して虚血が誘発されるが、急性冠動脈症候群は、その機序が異なる。急性冠動脈症候群は、粥状硬化班の破裂或いはびらんにより誘発された冠状動脈内急性血栓（ＩｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙＡｃｕｔｅＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）によって血流が急速に減少或いは遮断されて起こる。

より具体的に説明すると、急性冠動脈症候群における血管内血栓形成過程は、外傷により血管の損傷が来た後に止血（ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）が起こる過程と同じである。すなわち、脆弱性動脈硬化班（Ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃｐｌａｑｕｅ）に破裂或いはびらんが発生すると、内皮細胞下の結合組織が血液に露出される。血液中の血小板がこれに付着し（Ｐｌａｔｅｌｅｔａｄｈｅｓｉｏｎ）、機械的、生化学的刺激により血小板が活性化されて、ＴｘＡ２（ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅＡ２）、ＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、エピネフリン（ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）等が分泌される（Ｐｌａｔｅｌｅｔａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）。これらの物質は、血小板表面の糖タンパク質受容体（ＧＰ IIｂ／IIIａｒｅｃｅｐｔｏｒ）を活性化させ、活性化されたＧＰ IIｂ／IIIａ受容体は、フィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）を媒介に血小板を互いに絡み付かせる（Ｐｌａｔｅｌｅｔａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）。血小板は、数多くの経路を通じて活性化されるが、最終的に、ＧＰ IIｂ／IIIａ受容器を介してフィブリノーゲンを媒介に凝集されるので、この過程が血小板凝集の最終共通経路（ｆｉｎａｌｃｏｍｍｏｎｐａｔｈｗａｙ）となる。一次的に生成された血栓は、血小板が豊富な、いわゆる「白色血栓（ｗｈｉｔｅｔｈｒｏｍｂｕｓ）」であり、止血過程の１次止血（ｐｒｉｍａｒｙｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）に該当する。

このときに生じたＰＲＴ（ｐｌａｔｅｌｅｔｒｉｃｈｔｈｒｏｍｂｕｓ）は、粥状硬化斑の損傷部位の血管壁に生成され、冠状動脈を完全に閉塞させないのが普通である（Ｍｕｒａｌｔｈｒｏｍｂｕｓ）。これは、臨床的にＮＴＳＥＡＣＳに該当する。ＰＲＴ（Ｐｌａｔｅｌｅｔｒｉｃｈｔｈｒｏｍｂｕｓ）上に、２次的に血液凝固過程（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）が活性化され、連鎖反応によってトロンビン（ｆａｃｔｏｒ IIａ）が生成される。トロンビンは、フィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）をフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）に活性化させ、活性化されたフィブリンが網状に絡まるようになりながら（ｆｉｂｒｉｎｍｅｓｈｗｏｒｋ）、赤血球等の血液細胞が含まれた血栓が形成される。形成された血栓は、いわゆる「赤色血栓（ｒｅｄｔｈｒｏｍｂｕｓ）」であり、止血過程の２次止血（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）に該当する。局所的な血栓／血栓溶解バランス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ／ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓｂａｌａｎｃｅ）が血栓生成の方向に持続すると、血管が完全に閉塞して（ＯｃｃｌｕｓｉｖｅＴｈｒｏｍｂｕｓ）、臨床的にＳＴＥＭＩとして発現される。

抗血栓薬物は、１次止血に関与する血小板を抑制する抗血小板製剤（Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔａｇｅｎｔ）と、２次止血の血液凝固（Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）を抑制する抗凝固剤（Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ）とに分類することができる。抗血小板製剤としては、ＴｘＡ２の生成を抑制するアスピリン（ａｓｐｉｒｉｎ）、ＡＤＰ受容体遮断剤（ＡＤＰｒｅｃｅｐｔｏｒｂｌｏｃｋｅｒ）であるクロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）とチクロピジン（ｔｉｃｌｏｐｉｄｉｎｅ）、ＧＰ IIｂ／IIIａ受容体遮断剤（ＧＰ IIｂ／IIIａｒｅｃｅｐｔｏｒｂｌｏｃｋｅｒ）であるアブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）等がある。また、テオフィリン（ｔｈｅｏｐｙｌｌｉｎｅ）、モルシドミン（ｍｏｌｓｉｄｏｍｉｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）、ニトログリセリン（ｎｉｔｒｏｇｌｙｃｅｒｉｎｅ）等は、ｃＡＭＰとｃＧＭＰの生成を促進してＣａ^２＋の動員を抑制するものと知られている。抗凝固剤としては、抗トロンビンIII（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ III）を活性化させてトロンビンを分解するヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）、ＤＴＩ（ｄｉｒｅｃｔｔｈｒｏｍｂｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であるヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）、ビタミンＫ拮抗剤であるワルファリン（ｗａｒｆａｒｉｎ）等がある。

しかし、前記言及した薬物は、人体に止血過剰抑制、不妊、消化器障害等のいくつかの副作用を惹起するという問題点がある。したがって、抗血栓薬物の副作用を画期的に減らしながらも安全な製剤の開発が必要である。

特開平１−２９１７６１号公報韓国公開特許第１０−２００１−００７４００８号公報

HAE-SOOK et al., "Isoflavone Contents, Antioxidant and Fibrinolytic Activities of Some Commercial Cooking-with Rice Soybeans", Korean J. Food Sci. Technol. Vol.34, No.3, pp.498-504, 2002. DAE-YOUNG KWON et al., "A Study of Traditional Korean Soybeans for Development of Value Added Products", research report, 2001.

本発明の一側面は、抗血栓効能がある組成物を提供しようとするものである。

本発明の他の一側面は、抗血栓効能がある薬学組成物又は健康食品組成物を提供しようとするものである。

本発明の一側面は、水、Ｃ_１‐Ｃ_５アルコール又はその混合物を利用して抽出した有色豆抽出物の分画物を有効成分として含有する組成物を提供する。

本発明の一側面例による組成物は、優れた抗血栓効能が認められ、副作用のない天然物質を使用し、薬学及び健康食品分野等において多様に活用可能である。

フィールド豆の２０％エタノール抽出物をＨＰ‐２０レジンで分画した５０％エタノール分画物の、濃度による血小板凝集抑制効能を示したグラフである。

従来の豆に関する研究は、豆から薬理活性を示す有効成分を分離、精製する方向で進められ、豆自体の医薬的用途のための研究は不足していた。そして、その抽出方法においても、天然物から通常的に利用する抽出法である、高濃度の有機溶媒を利用した抽出方法を使用していた。

豆抽出物は、明らかにされている成分の他に、いくつかの未知の成分を含んでおり、これらのうち一部の成分は、人体に有用な薬理効果を示したりもする。また、その有用な成分は、通常の高濃度有機溶媒を利用した抽出方法によっては、抽出することができない。本発明者らは、天然物及び生薬抽出において一般的に使用される抽出法に対する認識から抜け出して、水又は低濃度の有機溶媒を抽出溶媒として使用して豆から抽出物を獲得し、この獲得した豆抽出物に対してレジンを利用して分画化を進めることで得た分画物が、強力な抗血栓効能を示すことを明らかにした。

本発明の一側面による組成物は、水、有機溶媒又は水と有機溶媒との混合物を利用して抽出した豆抽出物の分画物を含有することを特徴とする。本発明の他の一側面による組成物は、水、Ｃ_１‐Ｃ_５アルコール又はその混合物を利用して抽出した有色豆抽出物の分画物を含有する抗血栓組成物であってよい。

本発明の一側面において、前記有機溶媒は、特に制限されるものではなく、Ｃ_１‐Ｃ_５の低級アルコールであってよい。前記Ｃ_１‐Ｃ_５の低級アルコールは、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ‐プロピルアルコール、ｎ‐ブタノール及びイソブタノールよりなる群から選択されるいずれか一つ又は二つ以上の混合溶媒であってよく、具体的には、エタノールであってよい。本発明の他の一側面において、前記Ｃ_１‐Ｃ_５アルコールの濃度は、１〜７０％（ｖ／ｖ）、具体的には１〜４０％（ｖ／ｖ）であり、より具体的には５〜２５％（ｖ／ｖ）、さらに具体的には７〜２０％（ｖ／ｖ）である。たとえば、前記溶媒は、５〜２５％（ｖ／ｖ）濃度のエタノール、より具体的には、１０％又は２０％（ｖ／ｖ）濃度のエタノールであってよい。

本発明による組成物は、水又は低濃度の低級アルコールを利用して豆を抽出することになる。本発明者らは、多様な研究及び反復的な実験を通じて、水を含む複数の種類の有機溶媒の中から低級アルコール、たとえばエタノール、特に低濃度エタノールを利用して抽出した有色豆抽出物が、血液循環を改善させ、肥満及び糖尿の予防及び治療に効果的であり、高脂血症の予防及び治療に優れた効果を有するという点を確認し、本発明を完成した。

本発明の一側面において、前記有色豆抽出物の分画物は、水又は低級アルコール抽出物に対するレジン分離分画物であり、具体的には、ＨＰ‐２０レジン分画物であってよい。前記レジンは、たとえば、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ）とベンゼン（ｂｅｎｚｅｎｅ）の重合体を含む合成吸着剤カラムであり、具体的には、ＨＰ‐２０レジン（ｒｅｓｉｎ）である。本発明者らは、代表的な例として、低濃度エタノールを利用して抽出した有色豆抽出物に対する多様な分画を抽出する実験を行った。実験の結果、前記抽出物に対してＨＰ‐２０レジン分画を施して得た分画物が抗血栓効能に優れていることが確認され、特に、水分画に比べてＨＰ‐２０レジン５０％エタノール分画物のほうがその効能に優れていることが示された。

本発明の一側面において、前記有色豆抽出物の分画物は、有色豆の水又は低級アルコール抽出物に対するレジン分離分画物であり、具体的には、低濃度エタノールを利用して抽出した抽出物をＨＰ‐２０レジンを利用して分画化した分画物であってよい。

本明細書において「有色豆（ｃｏｌｏｒｅｄｓｏｙｂｅａｎ）」は、豆粒の皮の色が濃い色を帯びた豆を総称する意味であり、黒色だけでなく、赤色、黄色、青色等の色をする場合も包括する。前記有色豆は、例えば、霜太 (black bean、 Glycine max)、鼠目太 (Seomoktae、Rhynchosia Nolubilis)、青豆 (blue bean Glycine max MERR)、黄豆 (yellow bean、 Glycine max MERR)、フィールド豆 (field bean、 Phaseolus vulgaris L.)、インゲン豆 (kidney bean、Phaseolus vulgaris)、うずら豆 (pinto bean、Phaseolus vulgaris L.)、赤小豆 (small red bean、Vigna angularis)、黒小豆 (small black bean、Phaseolus angularis W.F.WIGHT.)、豆もやし原料豆(sprouting bean、Glycine max (L.) Merr.)、大豆 (soybean、Glycine max)及び黒大豆(Black soybean、Glycine max(L.) Merr.)、緑豆(Vigna radiate)、及び栗豆(Glycine max(L.) Merr.)などよりなる群から選択されるいずれか一つ又は二つ以上であってよいが、これらに限定されるものではない。本発明の一側面において、有色豆は、フィールド豆であってよい。有色豆の名称は、地域や分類、方言などの影響により多様に呼ばれ得る。また、本明細書において「有色豆抽出物」とは、多様な抽出過程を通じて有色豆から抽出された物質を総称し、たとえば、水又は有機溶媒等を利用して抽出された物質を含む。本明細書において「分画物」とは、任意の物質に対する多様な分画物を総称し、例えば、抽出物に対する分画物を含む。より具体的には、前記有色豆抽出物に対するＨＰ‐２０レジン分離分画物を含む。

本発明に係る有色豆抽出物の分画物を含有する組成物は、血小板凝集を抑制して血栓の生成を阻害する効能があり、また、血管の収縮を抑制して血管弛緩を誘導する効能がある。したがって、こうした効能を通じて、血液循環の改善に効果的であり、肥満、糖尿及び高脂血症等の治療又は予防に効果的に使用することができる。

本発明の一側面は、前記組成物を有効成分として含む薬学組成物を提供する。本発明の他の一側面において、前記薬学組成物は、血管疾患の予防、軽減又は治療用組成物であってよい。本発明に係る組成物を含む薬学組成物は、血栓生成防止、血管収縮抑制及び／又はコレステロール抑制効能が認められる。具体的に、前記薬学組成物は、抗血栓効能に起因する血液循環改善用薬学組成物であってよく、肥満、糖尿及び高脂血症等を含む血管疾患の軽減又は治療用薬学組成物であってよい。前記血管疾患は、たとえば、肥満、糖尿、脳卒中、脳出血、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、高血圧、貧血、偏頭痛又は高脂血症等を含む。

本発明に係る組成物を医薬品に適用する場合には、前記組成物を有効成分として使用される無機又は有機の担体を加えて、固体、半固体又は液体の形態で経口投与剤或いは非経口投与剤に製剤化してよい。

前記経口投与のための剤材としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、軟質及び硬質カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、乳濁剤、シロップ剤、ペレット剤等を挙げることができる。また、前記非経口投与のための剤材としては、注射剤、点滴剤、軟膏、ローション、スプレー、懸濁剤、乳剤、坐剤等を挙げることができる。常法に従って実施すれば、本発明の有効成分を容易に製剤化することができ、また、界面活性剤、賦形剤、着色料、香辛料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤又はその他常用される補助剤を適当に使用してよい。

本発明に係る前記薬学組成物は、経口、非経口、直腸、局所、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下等に投与されてよい。

また、前記有効成分の投与量は、治療を受ける対象の年齢、性別、体重、治療する特定の疾患又は病理状態や疾患又は病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断に応じて異なるであろう。こうした因子に基づいた投与量の決定は、当業者の水準内にある。一般的な投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜２０００ｍｇ／ｋｇ／日、より具体的には０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜１５００ｍｇ／ｋｇ／日であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明の一側面は、本発明に係る組成物を有効成分として含む食品添加剤、機能性食品又は健康食品組成物を提供する。本発明の他の一側面において、本発明に係る組成物を含む食品添加剤、機能性食品又は健康食品組成物は、血液循環改善用組成物であってよく、肥満、糖尿及び高脂血症を含む血管疾患の予防又は緩和用組成物等であってよい。前記血管疾患は、たとえば、肥満、糖尿、脳卒中、脳出血、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、高血圧、貧血、偏頭痛又は高脂血症等を含む。

本発明に係る組成物を含む食品添加剤又は機能性食品の例としては、発酵乳、チーズ、ヨーグルト、ジュース、生菌製剤又は健康補助食品等を挙げることができ、その他、多様な類型を含む。

本発明の一側面において、前記組成物は、本発明が目的とする主効果を損なわない範囲内で、主効果に相乗効果を与え得る他の成分を含有してよい。たとえば、物性改善のために、香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤、保湿剤、増粘剤、無機塩類、乳化剤及び合成高分子物質等の添加剤をさらに含んでよい。その他にも、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖及び海藻エキス等の補助成分をさらに含んでもよい。前記成分は、剤形又は使用目的に応じて、当業者が困難なく適宜選定して配合してよく、その添加量は、本発明の目的及び効果を損なわない範囲内で選択してよい。たとえば、前記成分の添加量は、組成物全体の重量を基準として、０．０１〜５重量％、より具体的には０．０１〜３重量％の範囲であってよい。

本発明に係る組成物の剤形は、溶液、乳化物、粘性型混合物、タブレット、粉末等の多様な形態であってよく、これらは、単純飲用、注射投与、スプレー方式又はスクイーズ方式等の多様な方法で投与されてよい。

以下、本発明の実施例及び実験例を通じて本発明をさらに詳述するが、下記実施例及び実験例は、本発明の効果を例示的に確認するためのものであり、本発明の範囲がこれらにのみ限定されるものではない。

［実施例１］フィールド豆１０％エタノール抽出物のＨＰ‐２０レジン（ｒｅｓｉｎ）を利用した分離
乾燥したフィールド豆１ｋｇを、１０％のエタノール溶液５Ｌに浸漬して、６０℃の温度で３時間還流抽出した後、常温で一定時間放置した。抽出液をろ過して減圧濃縮し、凍結乾燥して１０％エタノール抽出物試料を製造した。

疎水性レジンであるＤＩＡＩＯＮＨＰ‐２０（ＳＵＰＥＬＣＯ）を利用して、下記のように１０％エタノールフィールド豆抽出物に対するレジン分離分画を得た。

ＨＰ‐２０レジンを利用した分離のために、カラムに、３０ｃｍの長さとなるようにＨＰ‐２０レジンを充填した後、１Ｌのエタノールを５００ｍｌずつ利用して２回、１Ｌの５０％エタノールを５００ｍｌずつ利用して２回、１Ｌの蒸留水を５００ｍｌずつ利用して２回、それぞれ洗浄した。６ｇの１０％エタノールフィールド豆抽出物を水に溶かした後、ＨＰ‐２０レジン充填カラムに加え、７５ｍｌの蒸留水、７５０ｍｌの５０％エタノール、５００ｍｌのエタノールを順次入れながら、流れ出てきた溶媒を２５０ｍｌ三角フラスコに受けた後、それぞれを減圧濃縮し、凍結乾燥して分画試料を製造した。

［実施例２］フィールド豆２０％エタノール抽出物のＨＰ‐２０レジン（ｒｅｓｉｎ）を利用した分離
乾燥したフィールド豆１ｋｇを２０％のエタノール溶液５Ｌに浸漬して、６０℃の温度で３時間還流抽出した後、常温で一定時間放置した。抽出液をろ過して減圧濃縮し、凍結乾燥して２０％エタノール抽出物試料を製造した。

疎水性レジンであるＤＩＡＩＯＮＨＰ‐２０（ＳＵＰＥＬＣＯ）を利用して、下記のように２０％エタノールフィールド豆抽出物に対するレジン分離分画を得た。

ＨＰ‐２０レジンを利用した分離のために、カラムに、３０ｃｍの長さとなるようにＨＰ‐２０レジンを充填した後、１Ｌのエタノールを５００ｍｌずつ利用して２回、１Ｌの５０％エタノールを５００ｍｌずつ利用して２回、１Ｌの蒸留水を５００ｍｌずつ利用して２回、それぞれ洗浄した。６ｇの２０％エタノールフィールド豆抽出物を水に溶かした後、ＨＰ‐２０レジン充填カラムに加え、７５０ｍｌの蒸留水、７５０ｍｌの５０％エタノール、５００ｍｌのエタノールを順次入れながら、流れ出てきた溶媒を２５０ｍｌ三角フラスコに受けた後、それぞれを減圧濃縮して凍結乾燥して分画試料を製造した。

［実施例３］フィールド豆３０％エタノール抽出物のＨＰ‐２０レジン（ｒｅｓｉｎ）を利用した分離
乾燥したフィールド豆１ｋｇを、３０％のエタノール溶液５Ｌに浸漬して、６０℃の温度で３時間還流抽出した後、常温で一定時間放置した。抽出液をろ過して減圧濃縮し、凍結乾燥して３０％エタノール抽出物試料を製造した。

疎水性レジンであるＤＩＡＩＯＮＨＰ‐２０（ＳＵＰＥＬＣＯ）を利用して、下記のように３０％エタノールフィールド豆抽出物に対するレジン分離分画を得た。

ＨＰ‐２０レジンを利用した分離のために、カラムに、３０ｃｍの長さとなるようにＨＰ‐２０レジンを充填した後、１Ｌのエタノールを５００ｍｌずつ利用して２回、１Ｌの５０％エタノールを５００ｍｌずつ利用して２回、１Ｌの蒸留水を５００ｍｌずつ利用して２回、それぞれ洗浄した。６ｇの３０％エタノールフィールド豆抽出物を水に溶かした後、ＨＰ‐２０レジン充填カラムに加え、７５０ｍｌの蒸留水、７５０ｍｌの５０％エタノール、５００ｍｌのエタノールを順次入れながら、流れ出てきた溶媒を２５０ｍｌ三角フラスコに受けた後、それぞれを減圧濃縮し、凍結乾燥して分画試料を製造した。

［実施例４］フィールド豆４０％エタノール抽出物のＨＰ‐２０レジン（ｒｅｓｉｎ）を利用した分離
乾燥したフィールド豆１ｋｇを、４０％のエタノール溶液５Ｌに浸漬して、６０℃の温度で３時間還流抽出した後、常温で一定時間放置した。抽出液をろ過して減圧濃縮し、凍結乾燥して４０％エタノール抽出物試料を製造した。

疎水性レジンであるＤＩＡＩＯＮＨＰ‐２０（ＳＵＰＥＬＣＯ）を利用して、下記のように４０％エタノールフィールド豆抽出物に対するレジン分離分画を得た。

ＨＰ‐２０レジンを利用した分離のために、カラムに、３０ｃｍの長さとなるようにＨＰ‐２０レジンを充填した後、１Ｌのエタノールを利用して５００ｍｌずつ２回、１Ｌの５０％エタノールを用いて５００ｍｌずつ２回、１Ｌの蒸留水を利用して５００ｍｌずつ２回、それぞれ洗浄した。６ｇの４０％エタノールフィールド豆抽出物を水に溶かした後、ＨＰ‐２０レジン充填カラムに加え、７５０ｍｌの蒸留水、７５０ｍｌの５０％エタノール、５００ｍｌのエタノールを順次入れながら、流れ出てきた溶媒を２５０ｍｌ三角フラスコに受けた後、それぞれを減圧濃縮し、凍結乾燥して分画試料を製造した。

［実施例５］フィールド豆７０％エタノール抽出物のＨＰ‐２０レジン（ｒｅｓｉｎ）を利用した分離
乾燥したフィールド豆１ｋｇを、７０％のエタノール溶液５Ｌに浸漬して、６０℃の温度で３時間還流抽出した後、常温で一定時間放置した。抽出液をろ過して減圧濃縮し、凍結乾燥して７０％エタノール抽出物試料を製造した。

疎水性レジンであるＤＩＡＩＯＮＨＰ‐２０（ＳＵＰＥＬＣＯ）を利用して、下記のように７０％エタノールフィールド豆抽出物に対するレジン分離分画を得た。

ＨＰ‐２０レジンを利用した分離のために、カラムに、３０ｃｍの長さとなるようにＨＰ‐２０レジンを充填した後、１Ｌのエタノールを５００ｍｌずつ使用して２回、１Ｌの５０％エタノールを５００ｍｌずつ使用して２回、１Ｌの蒸留水を５００ｍｌずつ使用して２回、それぞれ洗浄した。６ｇの７０％エタノールフィールド豆抽出物を水に溶かした後、ＨＰ‐２０レジン充填カラムに加え、７５０ｍｌの蒸留水、７５０ｍｌの５０％エタノール、５００ｍｌのエタノールを順次入れながら、流れ出てきた溶媒を２５０ｍｌ三角フラスコに受けた後、それぞれを減圧濃縮し、凍結乾燥して分画試料を製造した。

［実施例６］フィールド豆水抽出物のＨＰ‐２０レジン（ｒｅｓｉｎ）を利用した分離
乾燥したフィールド豆１ｋｇを、蒸留水５Ｌに浸漬して、６０℃の温度で３時間還流抽出した後、常温で一定時間放置した。抽出液をろ過して減圧濃縮した後、凍結乾燥して水抽出物試料を製造した。

疎水性レジンであるＤＩＡＩＯＮＨＰ‐２０（ＳＵＰＥＬＣＯ）を利用して、下記のようにフィールド豆水抽出物に対するレジン分離分画を得た。

ＨＰ‐２０レジンを利用した分離のために、カラムに、３０ｃｍの長さとなるようにＨＰ‐２０レジンを充填した後、１Ｌのエタノールを５００ｍｌずつ利用して２回、１Ｌの５０％エタノールを５００ｍｌずつ利用して２回、１Ｌの蒸留水を５００ｍｌずつ利用して２回、それぞれ洗浄した。水を利用して抽出したフィールド豆抽出物６ｇを水に溶かした後、ＨＰ‐２０レジン充填カラムに加え、７５ｍｌの蒸留水、７５０ｍｌの５０％エタノール、５００ｍｌのエタノールを順次入れながら、流れ出てきた溶媒を２５０ｍｌ三角フラスコに受けた後、それぞれを減圧濃縮し、凍結乾燥して分画試料を製造した。

［実施例７］霜太抽出物のＨＰ‐２０レジン（ｒｅｓｉｎ）を利用した分離
乾燥した霜太１ｋｇを２０％のエタノール溶液５Ｌに浸漬して、６０℃の温度で３時間還流抽出した後、常温で一定時間放置した。抽出液をろ過して減圧濃縮し、凍結乾燥して２０％エタノール抽出物試料を製造した。

疎水性レジンであるＤＩＡＩＯＮＨＰ‐２０（ＳＵＰＥＬＣＯ）を利用して、下記のように２０％エタノール霜太抽出物に対するレジン分離分画を得た。

ＨＰ‐２０レジンを利用した分離のために、カラムに、３０ｃｍの長さとなるようにＨＰ‐２０レジンを充填した後、１Ｌのエタノールを５００ｍｌずつ利用して２回、１Ｌの５０％エタノールを５００ｍｌずつ利用して２回、１Ｌの蒸留水を５００ｍｌずつ利用して２回、それぞれ洗浄した。６ｇの２０％エタノール霜太抽出物を水に溶かした後、ＨＰ‐２０レジン充填カラムに加え、７５０ｍｌの蒸留水、７５０ｍｌの５０％エタノール、５００ｍｌのエタノールを順次入れながら、流れ出てきた溶媒を２５０ｍｌ三角フラスコに受けた後、それぞれを減圧濃縮して凍結乾燥して分画試料を製造した。

［実施例８］大豆抽出物のＨＰ‐２０レジン（ｒｅｓｉｎ）を利用した分離
乾燥した大豆１ｋｇを、２０％のエタノール溶液５Ｌに浸漬して、６０℃の温度で３時間還流抽出した後、常温で一定時間放置した。抽出液をろ過して減圧濃縮し、凍結乾燥して２０％エタノール抽出物試料を製造した。

疎水性レジンであるＤＩＡＩＯＮＨＰ‐２０（ＳＵＰＥＬＣＯ）を利用して、下記のように２０％エタノール大豆抽出物に対するレジン分離分画を得た。

ＨＰ‐２０レジンを利用した分離のために、カラムに、３０ｃｍの長さとなるようにＨＰ‐２０レジンを充填した後、１Ｌのエタノールを５００ｍｌずつ利用して２回、１Ｌの５０％エタノールを５００ｍｌずつ利用して２回、１Ｌの蒸留水を５００ｍｌずつ利用して２回、それぞれ洗浄した。６ｇの２０％エタノール大豆抽出物を水に溶かした後、ＨＰ‐２０レジン充填カラムに加え、７５０ｍｌの蒸留水、７５０ｍｌの５０％エタノール、５００ｍｌのエタノールを順次入れながら、流れ出てきた溶媒を２５０ｍｌ三角フラスコに受けた後、それぞれを減圧濃縮し、凍結乾燥して分画試料を製造した。

［実施例９］鼠目太抽出物のＨＰ‐２０レジン（ｒｅｓｉｎ）を利用した分離
乾燥した鼠目太１ｋｇを、２０％のエタノール溶液５Ｌに浸漬して、６０℃の温度で３時間還流抽出した後、常温で一定時間放置した。抽出液をろ過して減圧濃縮し、凍結乾燥して２０％エタノール抽出物試料を製造した。

疎水性レジンであるＤＩＡＩＯＮＨＰ‐２０（ＳＵＰＥＬＣＯ）を利用して、下記のように２０％エタノール鼠目太抽出物に対するレジン分離分画を得た。

ＨＰ‐２０レジンを利用した分離のために、カラムに、３０ｃｍの長さとなるようにＨＰ‐２０レジンを充填した後、１Ｌのエタノールを利用して５００ｍｌずつ２回、１Ｌの５０％エタノールを用いて５００ｍｌずつ２回、１Ｌの蒸留水を利用して５００ｍｌずつ２回、それぞれ洗浄した。６ｇの２０％エタノール鼠目太抽出物を水に溶かした後、ＨＰ‐２０レジン充填カラムに加え、７５０ｍｌの蒸留水、７５０ｍｌの５０％エタノール、５００ｍｌのエタノールを順次入れながら、流れ出てきた溶媒を２５０ｍｌ三角フラスコに受けた後、それぞれを減圧濃縮し、凍結乾燥して分画試料を製造した。

［実験例１］コラーゲンによって誘導されたヒト血小板凝集抑制の観察
エタノール含量による抽出物の活性の差を比較するために、水またはエタノール含量を変えて抽出したフィールド豆を利用して、下記実験を実施した。

ヒトの血小板濃縮血漿（ＰｌａｔｅｌｅｔＲｉｃｈＰｌａｓｍａ，ＰＲＰ）を分離するために、３．２％クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）を抗凝固剤として使用し、２週間以上薬物を服用していない健康な男性の静脈から血液を採取した。採血された血液１５０ｇを１５分間遠心分離した後、上層液（ＰＲＰ）を得、残渣を再び遠心分離して血小板欠乏血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔｐｏｏｒｐｌａｓｍａ，ＰＰＰ）を分離した。分離したＰＲＰの血小板数は細胞カウンターを使用して数え、ＰＲＰをＰＰＰで希釈して１ｍｌあたり３×１０^８個の血小板が含まれるように希釈した後、実験に使用した。

血小板の凝集活性は、血小板凝集計（ｌｕｍｉ‐ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ，Ｃｈｒｏｎｏ‐ＬｏｇＣｏ．，ＵＳＡ）を利用して、吸光度変化として測定した。２分間、３７℃となるように熱混合器（ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）で先培養したＰＲＰに、フィールド豆抽出物を２００μｇ／ｍｌ濃度となるように加え、７分間培養した。培養されたＰＲＰ５００μｌを、シリコンがコーティングされた血小板凝集計用キュベットに入れ、３分間培養した。その次に、血小板凝集誘発試料であるコラーゲンを、最大凝集を引き起こす最小濃度である１〜３μｇ／ｍｌ加え、その後６分間、反応を観察した。観察した結果、コラーゲンのみ処理した対照群の血小板凝集抑制率を０％としたときの比較値を、表１（血小板凝集抑制率（％））に示した。

表１を参照すると、水と、１０％、２０％エタノール抽出物が、他の抽出物に比べて血小板凝集抑制効能に優れるものと示された。前記各エタノール抽出物をＨＰ‐２０レジンを利用して分画化を行なった際のその活性の変化を調べるために、実施例１ないし５に記載されたのと同様にＨＰ‐２０レジンで分画化を行なった。

［実験例２］エタノール含量別抽出物のＨＰ‐２０レジンを利用した分画に対する血小板凝集抑制活性
実施例１ないし５に開示された方法により、ＨＰ‐２０レジンで分画して得たフィールド豆の水分画物と５０％エタノール分画物を処理して、実験例１と同一の方法により実験を行った。実験の結果は、下記表２（血小板凝集抑制率（％））に示した。

表１と表２を参照すると、比較的弱い効果を示していた３０％、４０％、７０％抽出物に対しても、これらをＨＰ‐２０レジンで分画化して５０％エタノール分画物とすると、その血小板凝集抑制活性が増加した。フィールド豆の２０％エタノール抽出物をＨＰ‐２０レジンで分画した５０％エタノール分画物の濃度による血小板凝集抑制効能を示した図１からも分かるように、５０％エタノール分画物は、濃度に比例して血小板凝集抑制効能が高まる。

このことから、ＨＰ‐２０レジンを利用した分画化方法が血小板凝集抑制効能を５０％エタノール分画に集中させることが確認された。

［実験例３］豆の種類によるＨＰ‐２０レジン分画別の血小板凝集抑制活性
各種の豆に対して血小板凝集抑制効能を評価するために、最も優れた効能を示した２０％エタノール抽出物に対して、各種の豆を利用して実施例７ないし９に開示された方法により、ＨＰ‐２０レジンを利用した分画化を行なった。

実験例１と同一の条件で各豆のＨＰ‐２０レジン分画による水分画と５０％エタノール分画に対して２００μｇ／ｍｌを処理して実験を行った。実験の結果は、下記表３（血小板凝集抑制率（％））に示した。

表３を参照すると、フィールド豆のみならず、すべての豆において、２０％エタノール抽出物に比べて、ＨＰ‐２０レジンを利用した５０％エタノール分画で血小板凝集抑制効能に顕著に優れるものと示された。これは、実験例２と同様にＨＰ‐２０レジンを利用した溶媒分画が活性を増加させる主要方法であることが分かり、比較的よい活性を示していたフィールド豆や霜太だけでなく、相対的に低い活性を示していた大豆の場合にも、血小板凝集抑制活性を増加させる方法であるのが確実である。

［実験例４］血小板凝集刺激源別の活性抑制特異性の観察
活性がもっとも優れていた各豆の２０％エタノール抽出物のＨＰ‐２０レジン５０％エタノール分画において、血小板凝集刺激源によって特異的な活性抑制効能を見せるのかについて調べるための実験を実施した。

血管が損傷すると、その部位の内皮細胞層が破壊されるとともに、血液内に露出されるコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、血小板から分泌するＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）は血小板の凝集を刺激する原因となるものと知られている。これを土台に、ＨＰ‐２０レジン５０％エタノール分画が、ＡＤＰ、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）による活性抑制特異性を有するのかについての評価を実施した。評価は、前記実験例１と同一の方法によって実施し、ただし実験例１のコラーゲンに代えてＡＤＰ、トロンビン刺激を加えたという点のみが異なっている。その結果は、表４（血小板凝集抑制率（％））に示した。

表４から分かるとおり、ＨＰ‐２０レジン５０％エタノール分画は、コラーゲンにより誘導された血小板凝集だけでなく、ＡＤＰ、トロンビン等、他の刺激剤により誘導された血小板凝集に対しても抑制効能を示した。

［実験例５］豆の種類によるＨＰ‐２０レジン５０％エタノール分画に対する血小板凝集後の活性化物質分泌抑制効能の観察
各豆のＨＰ‐２０レジン５０％エタノール分画が、血小板凝集時に生成されるトロンボキサンの生成を抑制させる効能を調べるために、実験例１において使用したＰＲＰに試料を４００μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１０分間培養した後、コラーゲン５μｇ／ｍｌを加え、６分間反応させた。ＥＤＴＡ２ｍＭ、インドメタシン（Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）５０μＭを加えて反応を終結させ、２０００ｘｇで２０分間遠心分離し、上清液のみを取って、生成されたトロンボキサンを酵素免疫法を使用して定量した。その結果は、表５（トロンボキサン生成抑制率（％））に示した。

表５から見られるとおり、ＨＰ‐２０レジン５０％エタノール分画は、血小板凝集後に生成されるトロンボキサンの生成を抑制するものと観察された。

［実験例６］ＳＤラット（ｒａｔ）から分離した血小板凝集抑制効能の観察
前記において効能を観察していたフィールド豆のＨＰ‐２０レジン５０％エタノール分画に対し、ラット（ｒａｔ）から分離した血小板の凝集抑制効能があるのかについて調べるために、前記実験例１と同一の方法により、刺激源であるコラーゲンとＡＤＰの濃度をそれぞれ１５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ濃度で実験を行った。試料の処理濃度は２００μｇ／ｍｌであり、その結果は、表６（血小板凝集抑制率（％））に示した。

表６から分かるとおり、フィールド豆のＨＰ‐２０レジン５０％エタノール分画は、ヒトだけでなく、ラットに対しても高い血小板凝集抑制効能を示した。

Claims

水、Ｃ_１‐Ｃ_５アルコール又はその混合物を利用して抽出した、有色豆抽出物のレジン分画物を含有する抗血栓組成物。
Ｃ_１‐Ｃ_５アルコールの濃度は１％ないし４０％（ｖ／ｖ）である、請求項１に記載の抗血栓組成物。
Ｃ_１‐Ｃ_５アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ‐プロピルアルコール、ｎ‐ブタノール及びイソブタノールよりなる群から選択されるいずれか一つ又は二つ以上を含む、請求項１に記載の抗血栓組成物。
有色豆は、霜太、鼠目太、青豆、黄豆、フィールド豆、インゲン豆、うずら豆、赤小豆、黒小豆、豆もやし原料豆、大豆及び黒大豆よりなる群から選択されるいずれか一つ又は二つ以上である、請求項１に記載の抗血栓組成物。
レジン分画物は、有色豆抽出物をポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ）とベンゼン（ｂｅｎｚｅｎｅ）の重合体を含む合成吸着剤カラムを使用して分画化した分画物である、請求項１に記載の抗血栓組成物。
Ｃ_１‐Ｃ_５アルコールは、５％ないし２５％（ｖ／ｖ）濃度のエタノールである、請求項１に記載の抗血栓組成物。
有色豆抽出物のレジン分画物は、エタノールを利用して抽出した有色豆抽出物に対するポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｌｅｎｅ）とベンゼン（ｂｅｎｚｅｎｅ）の重合体を含む合成吸着剤カラム分画物である、請求項１に記載の抗血栓組成物。
請求項１ないし７のいずれかに記載の抗血栓組成物を有効成分として含有する、血管疾患の軽減又は治療用薬学組成物。
前記血管疾患は、肥満、糖尿、脳卒中、脳出血、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、高血圧、貧血、偏頭痛又は高脂血症である、請求項８に記載の血管疾患の軽減又は治療用薬学組成物。
請求項１ないし７のいずれかに記載の抗血栓組成物を有効成分として含有する、血管疾患の予防又は緩和用健康食品組成物。
前記血管疾患は、肥満、糖尿、脳卒中、脳出血、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、高血圧、貧血、偏頭痛又は高脂血症である、請求項１０に記載の血管疾患の予防又は緩和用健康食品組成物。