KR102099076B1

KR102099076B1 - 디에콜을 포함하는 혈전증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102099076B1
Application number: KR1020180028556A
Authority: KR
Inventors: 이만휘; 박년호; 권태형
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-03-12
Filing date: 2018-03-12
Publication date: 2020-04-09
Also published as: KR20190107375A

Abstract

본 발명은 디에콜(dieckol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 디에콜 화합물은 아데노신 이인산(ADP)에 의한 혈소판 응집능 및 혈전 형성을 효과적으로 억제하므로 혈전 및 혈소판 응집으로 인한 다양한 혈전성 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

Description

디에콜을 포함하는 혈전증 예방 또는 치료용 조성물{Pharmaceutical composition comprising dieckol for prevention or treatment of thrombosis}

본 발명은 디에콜을 포함하는 혈전증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

혈소판(血小板, Platelet, Thrombocyte)은 피가 나오지 못하도록 섬유소를 묶어서 그물 같은 응혈을 만들어서 혈액 응고에 중요한 역할을 하는 고형 성분의 하나이다. 골수 안에 있는 거핵 세포의 세포질이 찢어져 혈액 속에 나온 것이며, 1개의 거핵세포가 약 400~8000개 정도 생성하며, 핵은 없고, 크기는 0.5-2.5μm 정도이며 혈액 1L당 약 150~370×10⁹개 정도 가지고 있다. 이 수량이 모두 혈액이 존재하는 것은 아니고, 전체의 1/3 정도는 비장에 체류하고 있으며, 나머지만 혈액을 순환하고 있으며, 평균 수명은 약 7~11일 정도이고, 일반 성인은 하루에 혈소판을 체중 1kg 당 약 20억 개를 생성한다. 혈관 손상 후 지혈을 유지하는데 중요한 역할을 한다.

그러나 병리학적으로 과다 활성화 및 혈소판 응집은 전 세계적으로 사망의 주요 원인인 죽상 동맥 경화증, 혈전증, 심장 마비 및 심혈관 질환을 유발하며, 치료 분야에서 지난 수십 년 동안 주요 개선이 이루어지고 있으나, 치료보다는 예방에 초점을 맞추는 새로운 치료 방법이 필요하다.

혈소판의 약리학 적 억제가 혈전증을 감소시키는 데 효과적이며 혈소판 관련 심혈관 질환을 치료하고 예방할 수 있는 많은 항 혈소판 제제가 사용 가능하다는 사실이 밝혀져 있으며, 현재 사용 가능한 약물은 혈전증에 대해 매우 효과적이지만 심각한 부작용과 일부 출혈 및 효능 부족과 같은 합병증으로 인해 사용이 제한적이다. 따라서 보다 안전하고 효과적인 항 혈소판 전략의 개발이 요구된다.

현재 심혈관 질환(Cardiovascular diseases, CVD)은 선진국에서 이환율(mortality)과 사망률의 주요 원인이다. 여러 가지 위험 요소가 있지만 주요 원인이되는 혈소판은 CVD에서 중심 역할을 하며 혈소판 응집은 뇌졸중 및 심장 마비로 이어질 수 있는 혈관의 협착을 유발하는 죽상 경화성 플라크의 발달 및 진행에 핵심적인 요소이다. 활성 혈소판은 혈전증 및 아테롬(atheroma) 생성의 중요한 중개자 역할을 한다.

또한, 혈관 내 혈전증은 다양한 심혈관 질환(CVD)을 유발하는 요인이다. 다른 측면에서, 혈소판 기능의 약리학적 억제는 혈전증 발생을 크게 감소시켰으며, 심혈관 질환 치료에 임상적으로 승인된 많은 약물을 사용하고 있으나, 이러한 항혈소판 약물은 심각한 합병증을 가지며 일부 환자에서는 효과가 없으므로 CVD의 치료 및 예방에 효과적이고 안전한 방법을 개발해야 할 필요가 있다.

(0001) 대한민국 등록특허 KR 10-1812319

이에 본 발명자들은 혈전증 예방 또는 치료할 수 있는 화합물을 연구하던 중에 해조류 대황에서 분리한 디에콜이 혈소판의 활성 및 혈전 형성을 억제하는 것을 확인하였으므로 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 디에콜 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 디에콜 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디에콜(dieckol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 디에콜 화합물은 혈소판 활성 억제 및 혈전 형성을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈전증은 혈전성 정맥염, 동맥색전증, 관상동맥혈전증, 뇌동맥혈전증, 말초혈관혈전증, 심부정맥혈전증, 동맥혈전증, 정맥혈전증, 만성동맥폐색증, 폐경색 및 뇌색전증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 디에콜 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 디에콜 화합물은 아데노신 이인산(ADP)에 의한 혈소판 응집능 및 혈전 형성을 효과적으로 억제하므로 혈전 및 혈소판 응집으로 인한 다양한 혈전성 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

도 1은 해조류 대황 추출물(EBE)에서 분리한 5개의 화합물에 대한 HPLC 분석한 결과이다: E-1: 6,6’-bieckol(13분), E-2: 6,8’-bieckol(13분), E-3: 8,8’-bieckol(13분), (D) E-4: dieckol(15.8분), (E) E-5: phlorofucofuroeckol-A 13(18.6분).
도 2는 해조류 대황 추출물(EBE)에서 분리한 5개의 화합물의 구조식이다.
도 3은 해조류 대황 추출물(EBE)에서 분리한 5개의 화합물로 ADP에 의한 혈소판 응집능의 억제를 확인한 그래프이다:
(A) E-1: 6,6’-bieckol, (B) E-2: 6,8’-bieckol, (c) E-3: 8,8’-bieckol, (D) E-4: dieckol, (E) E-5: phlorofucofuroeckol-A.
도 4는 디에콜 화합물이 ADP에 의한 혈소판 응집능의 억제를 확인한 그래프이다:
(A) 세척한 혈소판을 1 mM CaCl₂ 존재하에 디에콜 화합물 또는 부형제(vehicle)로 2분간 전처리하고, 디에콜 화합물의 농도(0, 1.25, 2.5, 5.0, 10.0 μM) 처리하고 ADP로 5분간 자극한 다음 혈소판 응집 억제능 확인함.
도 5는 디에콜 화합물의 ADP 자극에 대한 칼슘이온의 상승에 억제를 확인한 그래프이다: 세척된 혈소판에 칼슘 형광단 (5 μM, Fura-2/AM)을 1시간 동안 로딩하였고, 결과는 최소 4회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타냄, *** 대조군에 비해 p <0.001.
도 6은 디에콜 화합물의 ATP 방출 효과를 나타낸 그래프이다: 결과는 최소 4 회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타냄, *** 대조군에 비해 p <0.001.
도 7은 디에콜 화합물이 ADP으로 자극된 혈소판에서 인테그린 α_IIbβ₃에 결합하는 피브리노겐 억제 효과를 나타낸 그래프이다:
(A) (a) 부형제(vehicle), (b) ADP 10μM 처리, (c) 디에콜 화합물 2.5μM + ADP 10μM, (d) 디에콜 화합물 5.0μM + ADP 10μM, (e) 디에콜 화합물 10.0μM + ADP 10μM로,
(B) 디에콜 화합물의 농도(0, 2.5, 5.0, 10.0 μM)에 따른 인테그린 α_IIbβ₃에 결합하는 피브리노겐의 억제 효과, ** 대조군에 비해 p <0.01 및 *** p <0.001.
도 8은 디에콜 화합물의 농도(0, 2.5, 5.0, 10.0 μM)에 따라 MAPK(ERK, JNK 및 p38), MAPKK 신호 전달 단백질의 인산화 억제능을 확인한 사진이다.
도 9는 디에콜 화합물의 농도(0, 2.5, 5.0, 10.0 μM)에 따라 PI3K/Akt 경로 활성화의 인산화 억제능을 확인한 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 발명자들은 혈전증의 예방 또는 치료할 수 있는 화합물을 연구하던 중에 해조류 대황(Eisenia bicyclis)에서 분리한 디에콜(dieckol)이 아데노신 이인산(ADP)에 의한 혈소판 응집 및 혈전 형성을 억제하는데 효과가 우수한 것을 확인하였으며, 해조류 대황 추출물보다 혈소판 응집 및 혈전 형성을 억제하는데 효과 뛰어난 것을 확인하였으므로 본 발명의 디에콜을 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디에콜(dieckol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 발명의 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 디에콜 화합물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이사용 될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 그 투여 용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 디에콜 화합물의 양을 기준으로 1일 0.5 내지 5000 mg/kg으로, 바람직하게는 50 내지 500 mg/kg으로, 더욱 바람직하게는 50 mg/kg으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디에콜(dieckol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

[화학식 1]

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본 발명의 건강기능식품은 디에콜 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 디에콜 화합물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강기능음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염,알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 2 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 재료 및 방법

<1-1> 화학 물질 및 시약

ADP는 Chrono-log (Haverown, PA, USA)에서 입수하였다. Fura-2/AM은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Fibrinogen Alexa Fluor 488 접합체는 Molecular Probes (미국 오레곤, Eugene)에서 구입하고 ATP 분석 키트는 Biomedical Research Service Center (Buffalo, NY, USA)에서 구입하였다. Syn, Fyn, Lyn, Syk, phospholipase Cγ2 (PLCγ2), phospho-p44/42 (phospho-ERK), p44/42(ERK), MEK, phospho-MEK, 스트레스-활성화 단백질 키나아제 (SAPK)/c- JNK, phospho-SAPK/JNK, phospho-PI3K, PI3K, phospho-Akt 및 Akt는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 획득하였다. 정제수(Ultrapure water)는 J. T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 입수하였다.

<1-2> 실험 동물

수컷 Sprague-Dawley(SD) 랫트 (240∼260 g)를 Orient Co. (Seoul, Korea)에서 구입하여 일주일 동안 사육장에서 12/12 h light/dark cycle, 온도 23 ± 2℃ 및 습도 50 ± 10%에서 키웠다. 모든 동물 관련 연구는 IACUC 가이드라인에 따라 수행되었으며 프로토콜은 경북대학교의 동물실험윤리위원회의 승인을 받았다.

<1-3> 혈소판 준비

심장을 통해 래트로부터 혈액을 채취하고 항응고제인 anticoagulant acid citrate dextrose(ACD) 용액이 담긴 튜브로 옮겼다. 혈액을 170 × g에서 7분 동안 원심 분리하여 혈소판이 많은 혈장(PRP)을 얻었다. PRP를 350 x g에서 7분간 원심 분리하여 세척된 혈소판을 분리하였다. Tyrode의 완충액(137 mM NaCl, 12 mM NaHCO₃, 5.5 mM 포도당, 2 mM KCl, 1 mM MgCl₂ 및 NaHPO₄, pH 7.4)을 사용하여 혈소판 농도를 3 x 10⁸ cell/mL로 조정하고 혈소판 응집 분석에 사용하였다. 모든 준비 절차는 실온 (23 ± 2℃)에서 수행하였다.

<1-4> 혈소판 응집 분석

혈소판 응집은 이전 기술(Endale, M., et al., Br J Pharmacol, 2012. 167(1): p. 109-27.)과 같이 표준 기술, 광전송 집계 측정법 (Chrono-log, Havertown, PA, USA)을 사용하여 수행되었다. 간단히 말해, 세척된 혈소판을 1 mM 염화칼슘 (CaCl₂)의 존재하에 디에콜 화합물 또는 부형제(vehicle) 중 다양한 농도로 37℃에서 2분간 예비 배양한 후, 작용제인 아데노신 이인산(ADP)을 혈소판 혼합물을 연속적으로 교반하면서 5분 동안 추가로 배양하였다.

<1-5> 세포 내 칼슘 이온 측정

[Ca² ⁺]_i 농도는 Fura-2/AM을 사용하여 이전에 기술한 바와 같이 평가하였다. PRP를 5 μM Fura-2/AM과 함께 37℃에서 60분 동안 배양하였다. Fura-2가 충혈된 혈소판 (3 x 10⁸/mL)을 1 mM CaCl₂ 존재하에 37℃에서 2분간 디에콜 화합물로 미리 배양한 다음 5분 동안 ADP로 자극하였다.

Fluorescence는 분광 형광 측정기 (F-2500, Hitachi, Japan)를 사용하여 기록하였고 [Ca² ⁺]_i는 Schaeffer and Blaustein의 방법을 사용하여 다음 식을 사용하여 계산하였다: [Ca² ⁺] _iin cytosol = 224nM × (F-F _min)/(Fmax-F). 여기에서 224nM은 Fura-2-Ca²⁺ 복합체의 해리 상수이고, F _min과 Fmax는 각각 매우 낮은 Ca² ⁺ 농도에서의 형광 강도 수준을 나타내었다.

<1-6> ATP 방출 분석

세척된 혈소판을 1 mM CaCl₂ 존재하에 디에콜 화합물과 함께 37℃에서 2분간 예비 배양하고 ADP로 자극시켰다. 5분 후 응집 반응을 종결시키고 혈소판 혼합물을 원심분리하였다. 획득된 상층액은 ATP 분석 키트 (Biomedical Research Service Center)를 사용하여 luminometer (GloMax 20/20, Promega, Madison, WI, USA)로 ATP 분비를 측정하는데 사용하였다.

<1-7> 유세포 분석(Flow cytometry )

인테그린 α_IIbβ₃에 결합하는 피브리노겐은 유동 세포 계측법을 사용하여 정량화되었다. 세척된 혈소판을 디에콜 화합물과 함께 0.1 mM CaCl₂의 존재하에 2분 동안 예비 배양 한 다음 5분 동안 ADP으로 자극시켰다. 자극된 혈소판을 실온 (23 ± 2℃)에서 5분 동안 fibrinogen Alexa Flour 488 접합체 (20 μg/mL)로 처리하고 4℃에서 30분 동안 0.5 % 파라 포름 알데히드로 고정시켰다. 배양 후, 혈소판을 인산 완충 식염수 (PBS)로 3회 세척하고 400 μL PBS에 현탁시켰다. Fluorescence는 FACS Calibre cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 기록하고 CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

<1-8> 면역 블롯

면역 브롯(Immunoblot) 분석은 이전에 기술 된대로 수행되었다 (Jeong et al., 2016). 10% SDS-PAGE를 사용하여 혈소판 용해물에서 총 세포 단백질 (35 μg)을 분리하고 transfer buffer (25 mM Tris, pH 8.5, 0.2 M glycine 및 20% methanol)에서 polyvinylidene difluoride (PVDF) 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 5% 탈지분유로 차단하고 1차 및 2차 항체로 탐침하고 항체 결합을 강화된 화학 발광(iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea)을 사용하여 시각화하였다.

<1-9> 통계 분석

데이터는 일방 분산 분석 (ANOVA)에 의해 분석되었고 Dunnett’s post hoc test를 통해 관찰된 차이 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA))의 통계적 유의성을 측정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 나타내었다. 0.05 이하의 p 값은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

<1-10> 활성 화합물의 추출 및 분리

대황 건조 분말(약 1.3 kg)을 메탄올로 추출한 후, 클로로포름과 에틸아세테이트로 분배 추출하였다. 에틸아세테이트층을 감압 농축한 후, 클로로포름-메탄올(50:1→1:1 v/v, stepwise) 용매를 이용하여 silica gel flash column chromatography를 수행하였다. 용출 분획 중 활성을 나타낸 클로로포름-메탄올(2:1) 분획을 감압 농축하여 물과 메탄올의 용매를 이용하여 ODS column chromatography를 실시하였으며, 그 결과 두 개의 활성분획 Fr. I과 Fr. II를 얻었다. 활성분획 Fr. I을 농축한 후 메탄올을 이용하여 Sephadex LH-20 column chromatography를 실시한 결과, 세 개의 활성 화합물 E-1, E-2, E-3을 정제하였다.

또한, 활성분획 Fr. II도 상기와 동일한 방법으로 메탄올을 이용하여 Sephadex LH-20 column chromatography를 실시하였으며, 그 결과 두 개의 활성화합물 E-4와 E-5를 분리, 정제하였다(도 1). 분리된 각 화합물의 HPLC profile (column: ODS 4.6

× 150 mm; solvent: 10→90% aqueous methanol (0-2분: 10% aqueous methanol, 2분-23분: 10 → 100% methanol; flow rate: 1 ml/min; UV 296 nm)을 도 2에 나타내었다.

< 실시예 2> 실험결과

<2-1> 디에콜 화합물의 혈소판 응집 및 세포 내 칼슘 동원 분석 결과

해조류 대황에서 분리한 5개의 화합물의 아데노신 이인산(ADP)의 자극에 의해 유발된 혈소판 응집 억제 정도를 확인한 결과, 디에콜(dieckol)이 혈소판 응집을 억제하는데 효과가 가장 뛰어난 것을 확인하였다(도 3).

혈소판 응집의 유의하고 용량 의존적인 억제는 부형제(vehicle) 대조군과 비교하여 디에콜 화합물로 전처리 된 혈소판에서 관찰되었으며, 디에콜 화합물은 혈소판 응집과 혈전 형성을 억제하였다(도 4).

디에콜 화합물 또는 부형제(vehicle)로 전처리 한 혈소판에서 칼슘 동원을 평가 한 결과, 디에콜 화합물이 칼슘 동원을 억제하여 혈소판 응집을 억제하였으며, 디에콜 화합물의 처리 용량에 따라 세포 내 칼슘 이동이 억제되는 것을 확인하였다(도 5).

<2-2> 디에콜 화합물의 과립 분비 억제 분석 결과

혈소판은 자극시 혈소판 응집을 향상시키는 많은 인자를 분비하는 상이한 종류의 과립을 보유한다. 조밀한 과립에서 나오는 ATP 분비는 혈소판 응집을 일으키는 중요한 분비물 중 하나이다.

혈소판 응집이 종결된 후, ATP 측정기(luminometer)를 사용하여 디에콜 화합물의 용량에 따라 처리한 아데노신 이인산(ADP)-자극 혈소판에서 ATP의 농도를 평가하였다.

그 결과, 디에콜 화합물은 작용물질로 자극된 혈소판에서 ATP 방출을 처리 농도에 의존적으로 억제하였다(도 6).

<2-3> 디에콜 화합물의 내부-외부 시그널 조절 분석 결과

입체 구조 변화는 피브리노겐 결합(fibrinogen binding)에 반응하여 인테그린(integrin) α_IIbβ₃의 구조에서 일어나며, 이는 신호 전달을 증가시키고 혈소판 응집에 관여하므로, 디에콜 화합물의 용량에 따라 아데노신 이인산(ADP)-자극 혈소판에 대한 피브리노겐의 결합을 유동세포 계측법을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 디에콜 화합물은 피브리노겐과 인테그린 α_IIbβ₃ 상호 작용을 조절하고, 디에콜 화합물의 처리 용량에 따라 피브리노겐과의 결합 친화성을 억제하였다(도 7).

<2-4> 디에콜 화합물의 혈소판 응집 억제 분석 결과

MAP 인산화효소(Mitogen activated protein kinase, MAPK)는 ERK, JNK, p38^MAPK를 포함하고 있으며, APK가 혈소판에서 발현되고 상이한 작용제에 의해 활성화된다는 것이 알려져 있다. 아데노신 이인산(ADP)-자극된 혈소판 활성화에 대해, 디에콜 화합물의 처리에 따른 MAPK 경로의 조절을 분석하였다.

그 결과, 아데노신 이인산(ADP)-자극된 혈소판에서 MAPK 분자의 활성화를 디에콜 화합물이 유의하게 감소시켰다(도 8).

또한, PI3K/Akt 경로는 혈소판 과립 분비와 응집에 중요한 역할을 하므로 디에콜 화합물의 작용제로 유도된 혈소판에 미치는 영향을 조사하기 위하여 세척된 혈소판을 디에콜 화합물로 전처리하고 아데노신 이인산(ADP)-자극된 혈소판에 처리하여 반응이 종결된 후, 혈소판으로부터 단백질을 추출하고 면역 블롯 분석에 의해 각 단백질의 인산화를 분석하였다.

그 결과, 디에콜 화합물의 처리함에 따라 PI3K/Akt 경로 활성화의 인산화를 억제하였으므로 디에콜 화합물이 혈소판 응집을 억제하는 것을 확인하였다(도 9).

Claims

인비트로(in vitro) 상에서,
하기 화학식 1로 표시되는 디에콜(dieckol) 화합물을 처리하여 혈소판 응집을 억제하는 방법
[화학식 1]

.
제1항에 있어서,
상기 혈소판 응집을 억제하는 방법은 혈소판에서의 칼슘 동원(Ca²⁺ mobilization)을 억제하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 혈소판 응집을 억제하는 방법은 혈소판에서의 ATP 방출을 억제하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 혈소판 응집을 억제하는 방법은 혈소판에서의 피브리노겐과 인테그린 α_IIbβ₃의 결합 친화성을 억제하여, 혈소판 응집을 억제하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 혈소판 응집을 억제하는 방법은 혈소판에서의 MAP 인산화효소(Mitogen activated protein kinase; MAPK)의 활성화를 억제하여, 혈소판 응집을 억제하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 혈소판 응집을 억제하는 방법은 혈소판에서의 PI3K/Akt 경로 활성화의 인산화를 억제하여, 혈소판 응집을 억제하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 디에콜(dieckol) 화합물의 농도는 5 내지 10 (μM)인 것을 특징으로 하는, 방법.