KR101812319B1 - 아이리린 ｂ를 포함하는 혈전증 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 퉁퉁마디로부터 분리한 irilin B (5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물, 식품 또는 사료용 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다. 퉁퉁마디로부터 분리 정제한 이소플라본계 화합물인 irilin B 는 내인성 및 외인성 경로의 혈액 응고활성과 혈소판 응집을 강력히 저해하는 항혈전 활성이 우수하므로 천연물 유래의 혈액순환개선제 및 심뇌혈관계 관련질환 치료제로 사용할 수 있다. 또한, irilin B 는 알파 글루코시다제 및 안지오텐신전환효소에 대한 강력한 저해활성을 동시에 나타냄으로써 알파글루코시다제 저해활성과 관련된 당뇨, 고지혈증 및 비만억제제등의 의약품용도로 개발될 수 있고, 안지오텐진전환효소의 저해활성과 관련된 고혈압 예방 및 치료를 위한 의약품, 기능성 식품 또는 사료용 용도로 개발될 수 있다. Irilin B는 피부갈변화 효소인 타이로시나제에 대한 저해활성도 나타내므로, 미백용 기능성 화장품의 용도로도 개발될 수 있다.

Description

아이리린 Ｂ를 포함하는 혈전증 예방 및 치료용 조성물{A composition comprising irilin B for prevention or treatment of thrombosis}

본 발명은 아이리린 Ｂ를 포함하는 혈전증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

혈액응고반응에는 외인성 경로(extrinsic pathway)와 내인성(intrinsic pathway)라는 두 가지 경로가 있으며 최종적으로 피브린의 생산으로 종결된다. 혈액의 응고는 혈관이나 혈액이 손상 받으면 프로트롬빈 활성제(prothrombin activator)라고 불리는 복합물질이 형성되고, 프로트롬빈 활성제는 프로트롬빈을 트롬빈(thrombin)으로 변하도록 촉매작용을 한다. 트롬빈(Thrombin)은 피브리노겐(fibrinogen)을 섬유소사(fibrin thread)로 변화시켜 혈소판이나 혈액세포 및 혈장을 둘러싸 혈액덩어리 즉 혈전(blood clot, 血栓)을 형성한다. 한편, 혈관이 파괴되면 내피하 조직이 노출되는데 이 내피하 조직에 제 XII인자가 접촉함으로써 내인성 경로의 응고반응이 일어난다. 반면에 외인성 경로에서는 혈관이 파괴되면 혈액이 흘러나올 뿐 아니라, 혈관 밖에서 혈관 안으로 응고를 촉진시키는 물질인 조직인자(tissue factor)가 유입되고, 이 조직인자는 제 VII인자와 복합체를 형성하여 제 X인자를 활성화시켜 피브린을 형성하게 된다. 즉 응고반응이 시작되는 계기가 혈관 외에 있는 것인지, 혈관 내에 있는 것인지에 따라 외인성, 내인성 경로로 분류된다. 혈액응고 검사법에서는 에이피타임(aPTT, activated partial thromboplastin time)이 불리는 내인성 경로의 혈액응고 시간과 프로트롬빈타임(PT, prothrombin time)으로 명명되는 외인성 경로의 혈액응고 시간을 측정한다. 두 방법 모두 각 경로에 작용하는 조직인자들, 칼슘 등이 함유된 시약을 피검 혈장에 첨가하여 응고활성을 평가하게 된다.

한편, 혈소판은 혈관이 손상되어 피부나 점막 등에 출혈이 생겼을 경우 가장 먼저 활성화되는 혈액응고 촉진인자로서 핵을 가지고 있지 않고 수명은 10일 정도이며 지라에서 파괴된다. 혈소판이 손상된 혈관벽에 붙어 공기와 맞닿게 되면 트롬보키나아제라는 효소의 작용으로 혈장단백질 중 하나인 프로트롬빈을 트롬빈으로 바꾸고, 트롬빈이 다시 피브리노겐을 피브린으로 변화시켜 피브린이 혈액을 응고시키는 복잡한 과정을 거쳐 혈액이 응고된다.

혈액이 응고되어서 생긴 덩어리인 혈전(血栓)은 온몸을 돌아다니면서 언제, 어떤 문제를 유발할지 모르는 '혈관 속 시한폭탄'이다. 혈전이 일으키는 질병은 수 없이 많다. 혈전이 뇌·심장 혈관을 막아 생명을 앗아가거나 치명적인 후유증을 남기는 뇌졸중, 뇌경색·심근경색, 심부전 등의 질환과 하체의 정맥이 막혀 다리가 붓고 통증이 생기는 심부정맥혈전증, 혈전이 폐 혈관을 막아 호흡곤란을 유발하는 폐색전증 등이 있다.

심혈관계질환은 심장질환과 혈관질환을 포함하는 매우 광범한 질환으로서 심근경색, 고혈압, 심부전, 부정맥, 심근경색 및 동맥경화 진행에 의한 허혈성 심장질환 등이 주요 심장질환이며 혈관질환은 뇌졸중과 말초혈관질환 등을 말한다. 세계 보건기구 (WHO)의 통계에 따르면, 현대 과학과 의학의 눈부신 발전에도 불구하고 지난 30년간 꾸준히 발병율과 유병율이 증가한 질환으로 보고되었으며, 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 심장순환기 계통 질환에 의한 사망률이 전체 사망률의 30% 내외로 매우 높은 비율을 차지하는 치명적인 질환의 일종이다.

항혈소판제와 항응고제는 심장과 뇌혈관 질환을 비롯한 각종 질환에서 합병증을 예방하고 질환의 재발을 막기 위해 반드시 복용해야 하는 필수적인 약물이다. 대표적인 항혈소판 제제인 아스피린(aspirin)은 1980년대 심혈관질환의 예방에 대해 FDA의 사용 승인을 받은 이후 임상에서 가장 흔히 처방되고 있는 약제이지만, 약물에 대한 저항성이 많게는 45%까지 보고되었으며, 단독으로 사용했을 때 심혈관질환의 발생률을 낮추는 데는 한계가 있다. 현재까지 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 와파린, 쿠마린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라, 출혈성 부작용과 위장 장해 및 과민 반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다. 기존 약물들의 단점이나 부작용들을 개선시킨 새로운 제제들(clopidogrel, Cangrelor)이 등장하고는 있지만, 정맥주사해야 하는 단점이 있어, 완벽한 약물은 없으며 여전히 부작용의 발생이 문제가 되고 있다. 따라서, 이와 같은 심혈관계 질환의 예방 및 치료를 위하여 혈액순환 개선 효과를 가진 새로운 항혈전 제제의 개발을 위한 연구의 일환으로, 특히 부작용이 없는 식품소재로부터 항응고 활성 혹은 혈소판 응집저해 활성을 나타내는 새로운 물질의 탐색 및 개발의 필요성이 대두되고 있다.

대한당뇨병학회에서 국민건강영양조사 자료를 바탕으로 분석한 당뇨병관련 역학자료분석 및 최근 질병관리본부의 발표에 의하면 우리나라 당뇨병 유병률은 지속적으로 증가 추세에 있고 이에 따른 각종 만성질환 및 합병증의 증가로 국민건강이 상당히 위협받을 것으로 예측하고 있다. 분석결과에 따르면, 최근 5년간(2010-2014) 우리나라 당뇨병 유병률은 증가하는 경향을 보였고 특히 남자에서의 증가 양상이 뚜렷하게 나타남을 알 수 있다. 2014년 기준으로 30세 이상 성인의 11.9%(약 320만 명)가 당뇨병 환자로 파악되었는데 이는 30세 이상 성인 8명 중 1명이 당뇨병 환자에 해당하는 것이다. 남녀의 비율로 보면 남자는 전체 중 13.6%, 여자는 10.3%로 남자가 좀 더 많고, 연령대에 따른 당뇨병 환자 비율을 보면 60대 이상이 52.8%로 가장 많았고, 다음으로 50대가 12.6%, 30-40세의 젊은 나이에서는 9.8%에 이르는 것으로 나타나고 있다. 더 큰 문제는 향후 당뇨병으로 진행할 가능성이 매우 높은 당뇨병 전 단계 (pre-diabetes) 상태의 고위험군에 속하는 공복혈당장애 인구가 30세 이상 성인의 24.6%(약 660만 명)에 이른다는 것이다.

당뇨병 예방효과가 알려진 당뇨병 약제로는 인슐린감수성 개선제(rosiglitazone, pioglitaz one)와 포도당흡수억제제인 알파 글루코시다제 억제제(Acarbose, Vogl ibose) 등이 있다. 특히 탄수화물을 주식으로 삼는 아시아국가에 해당하는 중국과 일본에서 시행된 알파 글루코시다제 억제제를 이용한 당뇨병 예방 연구에서는 각각 88%와 40.5% 정도로, 서양인들을 대상으로 한 연구에서 나타난 36%의 효과보다 높은 예방효과를 보여주어, 같은 계열의 약제도 식생활패턴이나 인종에 따라 다른 결과를 나타냄을 알 수 있었다. 알파글루코시다제는 동물 소장 내에서 이당류들을 마지막으로 가수분해하고 포도당을 유리시켜 소장점막으로 흡수시키는 역할을 하므로 이 효소의 활성 저해는 식사 후 탄수화물의 흡수를 억제하여 과도한 혈당증가를 방지할 수 있으므로 당뇨병 환자 특히 인슐린 저항성이 과다하게 나타나는 인슐린 비의존형 당뇨병 (Non-insulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM) 환자들의 식후 급격한 혈당상승을 억제하는 것이 당뇨병 치료를 위하여 매우 중요하다.

고혈압은 뇌졸중, 심근경색, 울혈성 심부전, 신장병 및 말초혈관질환과 같은 심뇌혈관질환의 주요 위험요인이다. 우리나라에서 고혈압이 뇌혈관질환 발생에 기여하는 정도는 35%, 허혈성 심장질환에 기여하는 정도는 21%로 알려져 있다. 이는 인구집단 전체가 정상혈압을 유지할 수 있다면 뇌혈관질환과 허혈성 심장질환을 각각 35%와 21% 예방할 수 있다는 뜻이 된다. 혈압이 높은 사람은 지속적으로 혈압이 상승하는 경향이 있으며 혈압상승은 심뇌혈관질환의 위험을 가중시키므로 고혈압 진단을 받은 사람들은 항고혈압제 복용과 생활습관의 개선이 필요하다.

고혈압의 치료를 위해 현재 많은 항고혈압제가 개발되어 사용되고 있으며 작용기전과 작용점에 따라 이뇨제, 교감신경계 작용약물(α,2-아드레날린성 길항제, β-아드레날린성 길항제), 혈관확장제, 칼슘 채널 길항제(calcium channel blockers), 안지오텐신 전환 효소(ACE, angiotensin converting enzyme) 저해제 등으로 분류된다. 안지오텐신 전환효소(Angiotensin-I converting enzyme: ACE)는 데카펩타이드 (decapeptide)인 안지오텐신 Ⅰ로부터 다이펩타이드(dipeptide, His-Leu)를 절단함으로서 혈관 수축 작용을 갖는 안지오텐신 Ⅱ로 전환시키는 역할을 한다. 안지오텐신 전환효소에 의해 생성된 안지오텐신 Ⅱ의 증가는 강한 혈압 상승작용과 항이뇨 호르몬인 알도스테론의 분비를 촉진하고 물과 나트륨의 배설을 억제하여 순환 혈액량을 증가시킴으로써 고혈압을 일으키게 한다. 또한, 안지오텐신 전환효소는 혈관 이완작용을 하는 브레디키닌(bradykinin)을 분해하여 불활성화 시킴으로써 결과적으로 혈압상승을 유발하는 역할을 한다. 따라서 안지오텐신 전환효소의 활성을 억제함으로써 혈관 수축을 막아 혈압 강하 효과를 나타낼 수 있으므로, ACE 저해활성을 나타내는 화합물은 고혈압 치료제 또는 예방물질로 개발할 수 있음을 의미한다. 자주 처방되는 항고혈압성 ACE억제제로는 캡토프릴(Captopril), 페린도르프릴(Perindorpril), 에날라프릴(Enalapril), 리시노프릴(Lisinopril) 및 라미프릴(Ramipril) 등이 있으나 모두 화학합성제이므로 식품소재로부터 부작용이 없는 항고혈압성 ACE 저해활성 소재의 개발이 필요성 대두된다.

사람의 피부색은 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께, 및 카로티노이드, 빌리루빈 등 인체 내외의 색소 함유 유무와 같은 여러 요인들에 의해 결정된다. 특히, 멜라노사이트에서 타이로시나제(tyrosinase) 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소가 가장 중요한 요인이다. 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인이 영향을 미친다. 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능을 하지만 멜라닌이 과잉생산됨으로써 색소침착 및 피부노화를 촉진하고 피부암 유발에도 주요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 타이로시나제 저해활성이 있는 성분들인 알부틴 (arbutin), 코지산(kojic acid), 하이드로퀴논(hydroquinone)은 미백화장품 용도로 사용하여 왔으나, 이들은 불충분한 미백 효과, 피부에 대한 안전성 문제, 및 화장료에 배합시 제형 내에서의 안정성 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있어 식품소재나 천연물로부터 안전성과 안정성이 입증된 미백 소재의 개발이 필요하다.

퉁퉁마디는 나트륨 외에도 마그네슘, 칼륨, 철 등의 미네랄과 풍부한 아미노산을 다량 함유하여 우리나라에서는 채소, 약초, 발효식품 등으로 이용하였고, 유럽에서는 샐러드, 식초의 재료 등으로 이용하고 있다. 퉁퉁마디는 오랫동안 민간약으로 시력저하, 소화불량, 위장병, 간염, 신장병 등에 사용되어 왔고, 항산화, 항당뇨, 항암, 항고혈압, 항고지혈증, 피부미백 활성 등에 대한 연구만 이루어졌을 뿐 아직까지 그 생리활성 유효성분에 대한 연구가 많이 이루어지지 않았다.

현재까지 퉁퉁마디로부터 단리되어 구조가 규명된 주요 생리활성 물질들로는 이소람네틴 3-오-베타-디-글루코피라노사이드(isorhamnetin 3-O-β-D-glucopyranoside), 쿼시틴 3-오-베타-디-글루코피라노사이드(quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside), 3-카페오일-4-디하이드로카페오일퀴닉에시드; 퉁퉁마딕 에시드) (3-caffeoyl-4-dihydrocaffeoyl quinic acid;tungtungmadic acid) 등이 있다. 이 중 이소람네틴 3-오-베타-디-글루코피라노사이드는 항산화 및 항당뇨 효과가 있다고 보고되었고, 쿼시틴 3-오르소-베타-디-글루코피라노사이드도 항산화 효과가 있다고 보고된 바 있으며, 3-카페오일-4-디하이드로카페오일퀴닉에시드(퉁퉁마딕 에시드)는 항암 및 항염증효과에 관한 보고가 있다.

본 발명자들은 퉁퉁마디 추출물에서 강력한 항응고활성 및 항혈소판 활성을 나타내는 이소플라본계 화합물인 irilin B 화합물을 분리하게 되었으며, 이에 irilin B 화합물을 혈전증을 치료하는 유효물질로 제안한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 부작용이 없는 식품소재로부터 혈액순환 개선 효과를 가진 새로운 항혈전 제제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 퉁퉁마디(Salicornia europaea) 추출물에서 강력한 항응고활성 및 항혈소판 활성이 나타내는 이소플라본계 화합물인 아이리린 B (irilin B) 화합물을 분리하게 되었으며, 이 화합물이 알파글루코시다제, 안지오텐신전환 효소 및 타이로시나제에 대한 저해활성을 동시에 나타냄을 확인하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 혈전증 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 혈전증 예방 및 개선용 식품 또는 사료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 당뇨병, 고지혈증 또는 비만 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 고혈압 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 당뇨병, 고지혈증, 비만 또는 고혈압 예방 및 개선용 식품 또는 사료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 미백 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 irilin B (5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물의 분리방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 irilin B (5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈전증 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명자들은 부작용이 없는 식품소재로부터 혈액순환 개선 효과를 가진 새로운 항혈전 제제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 퉁퉁마디(Salicornia europaea) 추출물에서 강력한 항응고활성 및 항혈소판 활성이 나타내는 이소플라본계 화합물인 아이리린 B (irilin B) 화합물을 분리하게 되었으며, 이 화합물이 알파글루코시다제, 안지오텐신전환 효소 및 타이로시나제에 대한 저해활성을 동시에 나타냄을 확인하였다.

본 발명자들은 퉁퉁마디를 동결건조한 후 파쇄하여 분말화한 다음 냉수를 이용하여 탈염하고, 상기 탈염된 분말을 열수추출한 후, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 유기용매 분획을 한 뒤, 컬럼크로마토그래피와 박층크로마토그래피를 실시하였다. 이를 프렙용 HPLC로 항응고활성이 우수한 성분을 단리한 후 구조분석을 실시한 결과, 메톡실화된 이소플라본계열의 화합물인 irilin B임을 확인하였고, 이 화합물의 항혈소판 활성을 확인하였다.

퉁퉁마디에서 항혈전활성 유효성분에 관한 보고는 없었으며, 본 발명자들이 대한민국 특허출원 제 10-2015-0127594호에서 퉁퉁마디 추출물의 항혈전활성을 최초로 명시한 바 있다. 본 발명에서는 이러한 퉁퉁마디 추출물에서 강력한 항응고활성 및 항혈소판 활성이 나타내는 이소플라본계 화합물인 irilin B 화합물을 분리하여, 이 화합물의 항혈소판 활성 및 알파글루코시다제, 안지오텐신전환 효소 및 타이로시나제에 대한 저해활성을 확인하였다.

아이리린 B (irilin B) 화합물은 플라보노이드의 한 종류인 이소플라본계열의 화합물이나, 이소플라본으로 널리 알려져 있는 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein), 글리시테닌(glycitenin)과는 달리 플라보노이드 환구조 내에 메톡실화되어 있는 것이 특징으로, 1991년 구리염화물(cupric chloride)로 처리한 붓꽃류(Iris pseudacorus)의 잎에서 스트레스 대사체물질(stress metabolie)로 처음으로 보고되었다 (Isoflavonoids produced by Iris pseudacorus leaves treated with cupric chloride. 1991. Phytochemistry. 30(1): 157-163). Irilin B는 현재까지 붓꽃과류(Iris spp)를 제외한 다른 식물에서는 분리 보고된 예는 없다. 붓꽃과류에서 분리된 Irilin B 화합물의 밝혀진 생리활성으로는 항산화활성, 에스트로제닉활성 및 항진균활성이 아주 제한된 문헌에만 명시되어 있다(Four new flavones and a new isoflavone from Iris bungei. J. Nat. Prod. 2001. 64: 857-860, Crystal and molecular structure of the isoflavones irilin B and betavulgarin. 2005. 41(4): 396-399, Flavonoids from Iris songarica and their antioxidant and estrogenic activity. Planta Medica. 2008. 74: 1492-1495)

본 발명에서 용어 "혈전증"은 혈전에 의해 발생되는 질환으로서, 상기 혈전이랑 혈관 속에서 피가 굳어진 덩어리를 의미한다. 상기 혈전증은 동맥 혈전증과 정맥 혈전증을 포함한다. 상기 동맥 혈전증은 예컨대, 뇌혈관계 질환인 동맥경화, 뇌졸중, 뇌경색; 심혈관계 질환인 심부전, 심근경색; 급성 말초 동맥 폐쇄증 및 폐 혈전증 등을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 정맥 혈전증은 뇌정맥혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지정맥혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 중심 망막정맥 폐쇄증 등을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "유효성분으로 포함하는"이란 하기의 irilin B 의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함된 irilin B 은 천연식물재료인 퉁퉁마디로부터 분리한 화합물로서 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 퉁퉁마디 추출물로부터 분리하여 동정된 상기 화학식 1로 표시되는 5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본 (irilin B)은 건강한 성인남녀로부터 분리된 혈장을 이용하여 설계된 혈액응고 활성 측정법을 통하여 내인성 및 외인성 경로의 혈액 응고 과정을 억제하는 즉 항응고활성이 있음을 확인하였다. 또한 항혈전 활성 평가의 일환으로 혈소판 응집 저해활성을 측정한 결과 인간 적혈구의 용혈현상 없이 강력한 항혈소판 활성을 나타냄을 확인하였다. 이와 같은 실험 데이터는 본 발명의 조성물이 혈전증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 종래 혈전억제제의 대체제로 이용될 수 있음을 보여주는 것이다.

한편, 본 발명인 퉁퉁마디로부터 분리한 irilin B는 임상으로 처방되는 항혈전용 아스피린보다 항응고활성과 항혈소판활성이 탁월한 뿐만 아니라 적혈구 용혈현상을 나타내지 않았다. 따라서 본 발명에 의한 irilin B를 함유하는 조성물은 혈전증 치료제와 혈관 내 생성되는 혈전으로 인하여 발병하는 심·뇌혈관계 질환들을 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 기능성식품으로 사용될 수 있다. 아스피린의 경우 위장장해 및 장출혈 등의 부작용이 있는 것으로 알려져 있으나, 퉁퉁마디는 오랫동안 식용 및 민간약으로 사용되어 왔던 것이므로 이로부터 추출된 본 발명의 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없을 것으로 예상할 수 있다. 또한 동일한 목적으로 동물의약품 및 기능성 사료로도 개발이 가능하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 irilin B(5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물을 포함하는 혈전증 예방 및 개선용 식품 또는 사료용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 혈전증 예방 및 개선용 식품 조성물은 상술한 본 발명의 혈전증 예방 및 치료용 약제학적 조성물과 동일한 유효성분인 irilin B를 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물인 경우에는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등의 형태로 제조될 수 있다. 예컨대 캔디류의 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강보조 식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 irilin B 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 irilin B 화합물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 irilin B(5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병, 고지혈증 또는 비만 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 당뇨병, 고지혈증 또는 비만 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 혈전증 예방 및 치료용 약제학적 조성물과 동일한 유효성분인 irilin B를 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 irilin B는 소장점막에 분포하고 있는 탄수화물 소화효소들인 알파글루코시다제 (α-glucosidase)를 저해하여 기질인 파라니트로페닐 알파글루코사이드(p-니트로페닐-α-글루코피라노사이드)이 효소반응으로 분해되어 생성되는 과산화수소를 파라니트로페놀과 반응하여 생성되는 색소물질을 비색 정량함으로써 알파-글루코시다제 저해활성이 있음을 확인하였다.

본 발명의 실시예에서 irilin B는 임상으로 처방되는 항당뇨성 약물로서 알파-글루코시다제 저해제로 알려져 있는 아카보스(acarbose)보다 우수한 알파글루코시다제 제해활성을 나타내었다. 따라서 irilin B를 함유하는 조성물은 당뇨병을 치료하는 용도외에도 소장점막에서의 단당류 의 흡수를 억제함으로써 식후 과도한 혈당상승을 억제하므로, 이와 관련되 비만과 고지혈증 예방및 치료에도 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 동일한 목적으로 동물의약품 및 기능성 사료로도 개발이 가능하다. 당뇨 치료제로 처방되는 아카보스는 복부팽만과 설사 등의 부작용을 수반하는 것으로 알려져 있지만 퉁퉁마디는 식품공전에 등재되어 있는 식품재료이므로 irilin B를 함유하는 퉁퉁마디 추출물은 독성이나 부작용이 없이 사용할 수 있을 것으로 예상된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 irilin B(5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물을 유효성분으로 포함하는 고혈압 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 고혈압 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 혈전증 예방 및 치료용 약제학적 조성물과 동일한 유효성분인 irilin B를 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

Iirilin B는 래빗 렁 아세톤 파우더(rabbit lung acetone power)로부터 분리한 안지오텐신전환효소(angiotensin converting enzyme)를 저해하여 기질로 사용한 트리펩타드인 히퓨릴 히스티딜 류신(Hippuryl-Histidyl-Leucine, HHL)과 반응하여 생성되는 산물을 에틸아세테이트로 추출하여 자외선 흡광도(UV absorbance)를 정량함으로써 안지오텐신전환효소에 대한 저해활성을 확인하였다.

본 발명의 실시예에서 irilin B는 안지오텐신 전환효소에 대하여 강력한 저해활성을 가지는 유기합성 고혈압 치료제인 캡토프릴(captopril)보다는 다소 약하나 플라보노이드 중 안지오텐신전환효소에 대하여 저해활성을 나타내는 플라보노이드 화합물 중 가장 강한 활성을 나타내는 것으로 알려진 루테올린(luteolin)보다는 우수한 저해활성을 나타내어 부작용과 독성이 있는 화학의약품을 대체할 천연물 항고혈압 치료제로 개발될 수 있다. 또한 동일한 목적으로 동물의약품 및 기능성 사료로도 개발이 가능하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 irilin B(5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물을 포함하는 당뇨병, 고지혈증, 비만 또는 고혈압 예방 및 개선용 식품 또는 사료용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 당뇨병, 고지혈증, 비만 또는 고혈압 예방 및 개선용 식품 조성물은 상술한 본 발명의 혈전증 예방 및 치료용 약제학적 조성물과 동일한 유효성분인 irilin B를 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 irilin B(5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물을 유효성분으로 포함하는 미백 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 미백 화장료 조성물은 상술한 본 발명의 혈전증 예방 및 치료용 약제학적 조성물과 동일한 유효성분인 irilin B를 이용하는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명에서 irilin B는 인간의 피부조직인 멜라노사이트 세포에서 분리한 갈변화효소인 타이로시나제(tyrosinase)를 억제하여 기질로 사용한 L-DOPA를 산화시켜 생성되는 멜라닌 색소의 양을 비색 정량함으로써 irilin B의 타이로시나제 저해활성을 확인하였다. 이로써, 본 발명의 irilin B를 함유하는 조성물은 미백기능의 화장품 용도로도 개발 될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이 인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로 카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산에스테르 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에서 유효성분인 화학식 1로 표시되는 화합물의 양은 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 상기 미백 효능을 달성하는 데 충분한 양으로 포함된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 irilin B (5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물의 분리방법을 제공한다:

(a) 퉁퉁마디 또는 퉁퉁마디 탈염물을 극성 용매로 추출하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)의 추출물로부터 고분자성 화합물을 제거한 후, 비극성 유기용매를 첨가하여 분획물을 수득하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)의 비극성 유기용매 분획물을 정제하는 단계.

이하, 본 발명의 Irilin B (5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물의 분리방법에 대하여 상세히 설명한다.

단계 (a): 퉁퉁마디의 추출단계

우선, 단계 (a)에서는 상기 퉁퉁마디 또는 퉁퉁마디 탈염물에 극성 용매를 처리하여 추출물을 수득한다.

퉁퉁마디를 수세한 후 동결건조 또는 열풍건조 또는 음건하여 파쇄하고, 수득된 건조분말을 3-9°C의 냉수를 이용하여 탈염시킴으로써 퉁퉁마디 탈염물(예컨대, 탈염분말)을 수득할 수 있다.

본 발명의 분리방법에서 사용되는 극성 용매는, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 극성 용매는 물 또는 알코올이다. 본 발명의 특정 구현에에 따르면, 퉁퉁마디 탈염분말을 100°C의 물로 3-4시간 열수추출한다.

단계 (b): 비극성 유기용매 분획물 수득단계

이어, 상기 단계 (a)의 추출물로부터 고분자성 화합물을 제거한 후, 비극성 유기용매를 첨가하여 분획물을 수득한다.

상기 단계 (a)의 추출물에 극성 용매인 알코올을 가하여 고분자성 화합물을 제거할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)의 추출물에 에탄올을 가하여 교반하고 저온(예??대, 4℃)에서 하룻밤 정치하고, 이때 생성된 고분자성 침전물을 원심분리 및 여과로 제거한다. 여기서 고분자 화합물이라 함은 추출물에 함유되어 있는 다당류, 단백다당류, 및 단백질을 의미한다.

본 발명의 분리방법에서 사용되는 비극성 용매는, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 아세톤, 아세토나이트릴, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 디클비로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비극성 용매는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 부탄올이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 단계 (b)에서는 비극성 유기용매로서 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 이용하여 분배 분획물을 수득한다.

단계 (c): 정제단계

마지막으로, 상기 단계 (b)의 비극성 유기용매 분획물을 정제한다.

정제단계 (c)에서는 공지된 다양한 정제방법을 이용할 수 있으며, 예컨대 컬럼크로마토그래피 및 박층크로마토그래피를 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 추출물을 증류수 또는 알코올(예컨대, 메탄올)에 용해하여 컬럼 크로마토그래피 정제를 실시한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 컬럼 크로마토그래피는 소수성 흡착제로 충진한 디아이언 HP-20 컬럼, 극성실리카겔 컬럼, 저분자용 세파덱스 LH-20 겔여과컬럼을 이용한 3단계 컬럼 크로마토그래피로 실시할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)의 컬럼 정제 활성획분을 알코올(예컨대, 메탄올)에 용해시킨 후 순상 박층크로마토그래피 정제를 실시한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 분리방법은 상기 단계 (c) 이후에 단계 (c)의 정제획분을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 순수분리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)의 정제분획물을 역상 소수성컬럼을 이용한 고속액체크로마토그래피를 이용하여 순수분리한다.

본 발명자들은 상기방법에 의하여 순수분리한 화합물의 분자구조를 동정한 결과 메톡실화된 이소플라본 계열 화합물인 5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본 (화학식 1)임을 확인하였고, 이는 1991년 붓꽃과류에서 스트레스 대사체 물질로 처음으로 분리되어 irilin B로 명명되었다.

[화학식 1]

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 퉁퉁마디로부터의 irilin B 분리방법은 다음과 같다: 퉁퉁마디를 수세한 후 동결건조 또는 열풍건조 또는 음건하여 파쇄하여 수득된 건조분말을 3-9°C의 냉수를 이용하여 탈염하는 단계: 상기 탈염물을 100°C의 물로 3-4시간 열수추출하는 단계: 상기 추출물을 에탄올을 이용하여 고분자성 화합물을 제거하고 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적으로 분배분획하는 단계: 상기추출물을 증류수 또는 메탄올에 용해하여 소수성 흡착제로 충진한 디아이언 HP-20 컬럼, 극성실리카겔 컬럼, 저분자용 세파덱스 LH-20 겔여과컬럼을 이용한 3단계 컬럼 크로마토그래피 정제단계: 상기 컬럼 정제 활성획분을 메탄올에 용해한 후 순상 박층크로마토그래피에 의한 정제단계: 상기 정제분획물을 역상 소수성컬럼을 이용한 고속액체크로마토그래피를 이용하여 순수분리하는 단계.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 퉁퉁마디로부터 분리한 irilin B (5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.

(b) 퉁퉁마디로부터 분리 정제한 이소플라본계 화합물인 irilin B 는 내인성 및 외인성 경로의 혈액 응고활성과 혈소판 응집을 강력히 저해하는 항혈전 활성이 우수하므로 천연물 유래의 혈액순환개선제 및 심뇌혈관계 관련질환 치료제로 사용할 수 있다.

(c) 또한, irilin B 는 알파 글루코시다제 및 안지오텐신전환효소에 대한 강력한 저해활성을 동시에 나타냄으로써 알파글루코시다제 저해활성과 관련된 당뇨, 고지혈증 및 비만억제제등의 의약품용도로 개발될 수 있고, 안지오텐진전환효소의 저해활성과 관련된 고혈압 예방 및 치료를 위한 의약품 및 기능성 식품 용도로 개발될 수 있다.

(d) irilin B는 피부갈변화 효소인 타이로시나제에 대한 저해활성도 나타내므로, 미백용 기능성 화장품의 용도로도 개발될 수 있다.

도 1은 퉁퉁마디 정제 분획물의 HPLC 프로파일을 나타낸다. (A) SED-L-14의 HPLC 크로마토그램; (B) 순수 분리 정제 화합물 A의 HPLC 크로마토그램과 자외선 흡수 파장 스펙트럼.
도 2a 및 2b는 화합물 A의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸 것이다. (2a) 네거티브모드로 스캔; (2b) 포지티브 모드로 스캔.
도 3a-3c는 화합물 A의 핵자기공명 분석결과를 나타낸 것이다. (3a) ¹ H-NMR 스펙트럼; (3b) ¹³C-NMR 스펙트럼; (3c) ¹H-¹H COSY 및 ¹H-¹³C HMBC 이차원핵자기공명 분석을 통한 irilin B의 구조결정.
도 4는 퉁퉁마디 열수추출물, 유기용매 분획물, 및 컬럼크로마토그래피 정제획분들의 프로트롬빈 타임(PT)의 항응고활성을 측정한 것이다. 농도는 각각 각각 1.25, 2.5 및 5 mg/ml 농도로 비교 실험하였다. SED: 퉁퉁마디 탈염물의 열수추출물, SED-EA: 퉁퉁마디 탈염물의 에틸아세테이트 분획물, SED-EA-H2: SED-EA의 HP20 컬럼 크로마토그래피 분획물, SED-EA-H2-S3: SED-EA-H2의 실리카젤 컬럼 크로마토그래피 분획물, SED-L13 + L14: SED-EA-H2-S3의 LH-20 컬럼 크로마토그래피 분획물.
도 5는 퉁퉁마디 열수추출물, 유기용매 분획물, 및 컬럼크로마토 그래피 정제획분들의 에이피타임(aPTT)의 항응고 활성을 측정한 것이다. 농도는 각각 각각 1.25, 2.5 및 5 mg/ml 농도로 비교 실험하였다. SED: 퉁퉁마디 탈염물의 열수추출물, SED-EA: 퉁퉁마디 탈염물의 에틸아세테이트 분획물, SED-EA-H2: SED-EA의 HP20 컬럼 크로마토그래피 분획물, SED-EA-H2-S3: SED-EA-H2의 실리카젤 컬럼 크로마토그래피 분획물, SED-L13 + L14: SED-EA-H2-S3의 LH-20 컬럼 크로마토그래피 분획물.
도 6은 irilin B 화합물의 알파글루코시다제 저해활성을 당뇨치료약으로 상용화되어 있는 대표적인 알파글루코시다제 저해제인 acarbose와 비교 측정한 것이다. ** IC₅₀: 본 실험 조건에서 알파글루코시다제 활성을 50% 저해하는데 소요되는 농도 (이 값이 적을수록 활성이 큼을 의미함).
도 7은 irilin B 화합물의 안지오텐신 전환효소 저해활성을 고혈압치료약으로 상용화되어 있는 대표적인 ACE 저해제인 캡토프릴(captopril)과 플라보노이드성 ACE 저해제로 루테올린(luteolin)과 비교 측정한 것이다. ** IC₅₀: 본 실험 조건에서 안지오텐신 전환효소 활성을 50% 저해하는데 소요되는 농도 (이 값이 적을수록 활성이 큼을 의미함)
도 8은 irilin B와 알부틴 화합물의 멜라닌 생성 억제 효과를 비교 측정한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 퉁퉁마디로부터 항응고활성 순수화합물의 분리 정제

1-1 : 퉁퉁마디의 열수추출

본 발명에 사용되는 퉁퉁마디는 2015년 7월경 대한민국 전남 신안군에서 수확된 퉁퉁마디(Salicornia europaea)에서 뿌리를 제거하고, 세척한 후 동결건조하였다. 동결건조된 건초(1 kg)를 분말화한 시료에 중량대비 40 배의 저온수(3℃)를 가하여 1시간 동안 교반한 후, 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 상기 수득한 침전물에 부피 대비 20 배의 증류수를 가하고 초고속 진공농축수 추출기(COSMOS660, ㈜경서 E & P, 한국)로 100± 5℃에서 3시간 동안 열수 추출하고, 방냉한 후, 여과하여 생성된 추출잔사에 대하여 동일한 방법으로 열수추출을 반복하였다. 상기 과정에서 얻어진 추출액을 모아 원심분리(4℃, 10000 rpm, 30분) 및 감압 필터여과하고 수득된 여과액을 45℃에서 감압농축하여 2 L의 농축액을 얻었다.

1-2 : 열수추출물의 유기용매 분획

상기 1-1 단계에서의 추출물 2 L에 3 L의 에탄올(99%)을 가하여 교반하고 4℃에서 하룻밤 정치하여 생긴 고분자 침전물을 원심분리(4℃, 10000rpm, 30분) 및 감압필터 여과로 제거하고, 여과액을 감압건조하여 에탄올을 완전 제거한 액을 증류수 2 L에 재용해 시켰다. 다음으로 5 L 부피의 분액깔대기에 2 L의 n-헥산을 혼합하여 헥산층과 수층으로 2회 분획하였다. 상기 수층에 2 L의 클로로포름을 첨가하여 클로로포름층과 수층으로 2회 분획하고, 수층에 다시 에틸아세테이트를 첨가하고 에틸아세테이트층과 수층으로 2회 분획하고, 최종적으로 수층에 n-부탄올을 2 L 가하여 부탄올층과 수층으로 2회 분획하였다. 상기에서 얻어진 각 용매추출액을 감압건조하여 각 유기용매를 제거한 뒤 동결건조하여 헥산 분획물(2.3 g), 클로로포름 분획물(1.1 g), 에틸아세테이트 분획물(5.8 g), 부탄올 분획물(12.6 g) 및 물 분획물(28.5 g)을 수득하였다.

1-3: 컬럼크로마토그래피 정제

상기 1-2 에서 제조된 유기용매 분획물 중 내인성 및 외인성 경로의 항응고활성, 즉 프로트롬빈타임과 에이피타임을 가장 오래 연장시켜 항응고활성이 가장 우수한 에틸아세테이트 분획물(SED-EA) (5.8 g)을 100 ml의 증류수(pH 5)에 용해시켜 흡착성 디아이온 HP-20 레진이 충진된 첫 번째 컬럼 (4 × 40 ㎝) 상단부위에 흡착시킨 후 증류수, 50% 메탄올, 30% 아세톤 및 70% 아세톤으로 순차적으로 용출시켜 4개의 분획물들을 획득하였다. 그 중 항응고활성이 가장 우수한 50% 메탄올 용출획분 (SED-EA-H2, 1.8 g)을 극성 실리카겔이 충진된 두 번째 컬럼 (3.3 × 40 ㎝)에서 메탄올과 에틸아세테이트를 1:1로 혼합한 이동상 용매를 이용하여 유속 0.5 ml/분의 속도로 용출시켜 300 ml씩 5개의 분획물을 획득하였다. 그리고 그 중 항응고활성이 가장 우수한 획분(SED-EA-H2-S3, 452㎎)을 감압건조 후 3 ml의 메탄올에 용해하고, 저분자용 겔여과 세파덱스 (Sephadex) LH-20이 충진된 세 번째 컬럼 (2.5 × 33 cm)에 도입한 다음 100% 메탄올(유속 0.2 ml/분)을 이동상 용매로 사용하여 흘려보내면서 40 ml씩 총 15개의 분획물(SED-L-1 ~ SED-L-15)을 수득하였다. 최종적으로 상기 15 개의 분획물 중 프로트롬빈타임과 에이피타임을 오래 연장시켜 항응고활성이 가장 높은 획분 SED-L-13 및 SED-L-14 획분을 감압농축, 동결건조하여 각각 89 mg 및 42 mg 을 수득하였다.

1-4 : 박층크로마토그래피 정제

상기 1-3에서 얻어진 활성획분(131 mg)을 소량의 메탄올에 용해시켜 극성 실리카젤이 도포된 박층크로마토그래피 플래이트 (20 X 20 cm, 0.25 μm)에 점적한 후, n-부탄올 : 메탄올 : 물 = 4 : 2 : 1로 구성된 이동상 용매를 이용하여 전개하고, 이동상 용매를 완전히 제거한 후 UV 254 nm에서 분리된 밴드를 확인하였으며, Rf 0.65 위치의 활성띠 부분을 긁어 취하였다. 수득한 실리카젤 활성띠 부분의 성분은 메탄올로 용출하여 감압건조 후 정제된 항응고활성 획분 57 mg을 획득하였다.

1-5 : 고속액체크로마토그래피에 의한 순수분리

상기 1-4 에서 얻어진 박층크로마토그래피 정제 획분 57 mg을 1 ml의 HPLC용 메탄올에 용해한 후 0.22 μm 필터로 여과한 다음 고속액체크로마토그라피를 이용하여 항응고활성이 강한 단일물질을 분리하였다. 분석용 HPLC는 졸박스 이클립스 C18 분석 컬럼 (Zorbax Eclips, 5 μm, 4.5 × 250 mm, Agilent)이 장착된 모델(1260 Infinity, Agilent, USA)을 사용하였고, 고속분취 액체크로마토그라피는 일본 YMC사의 프렙용 컬럼(Triart C18, 20 mm × 150 mm, 5 μm, YMC, Japan)이 장착한 모델(Multiple Preparative HPLC(LC-forte/R, YMC, Japan)을 사용하였다. 이동상 용매 조건은 메탄올과 3차 증류수를 이용한 그래디언트 조건에서 1-3 ml/분의 유속으로 흐르게 하여 분석하였으며, Agilent, 1200 DAD 검출기(detector) 또는 YMC UV-3400 UV 검출기를 사용하였으며, 두 파장영역 (260 및 330 nm)의 흡수도를 이용하여 화합물들을 순수분획한 결과 머무름시간 18.1분에서 항응고활성이 강한 화합물 A(15.4 mg)을 수득할 수 있었다. 도 1은 퉁퉁마디 정제 분획물인 SED-L-14 및 화합물 A의 분석용 HPLC 크로마토그램과 화합물 A의 자외선 흡수 파장 스펙트럼을 나타낸 것이다.

실시예 2. 퉁퉁마디 추출물로부터 분리된 화합물 A(compound A)의 구조분석

2-1. 실시예 1-5 에서 분리된 화합물 A의 자외선 최대 흡수대 및 시약 첨가에 따른 흡수변이(adsorption shift)는 각 시료를 메탄올에 1 mg/ml의 농도로 용해시킨 후 자외선 분광기(Genesys 10S UV-VIS spectrophotometer, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 190-500 nm 영역 내에서 측정하였다. 이때, 시약첨가에 따른 자외선 흡수대의 변화를 관찰하기 위하여 AlCl₃, NaOH 및 NaOAC 등을 사용하였다

2-2. 화합물 A의 분자량 결정을 위하여 1 mg 의 화합물 A를 전자포말이온화 (ESI) 질량분석기 (LC-ESI mass spectrometer, AGILENT 1100, USA Micromass Quattro II)로 포지티브 및 네거티브 스캔을 실시하고, 하이 레조루션(High resolution) MS를 측정하였다 (도 2a 및 2b).

2-3. 핵자기공명(NMR)분석은 화합물 A(3 ㎎)을 완전 건조하여 DMSOd6 (0.5 ml)에 용해한 후 5 mm NMR 튜브에 주입하고 제올 모델 기종 (JNM-ECA 600, Jeol, Japan)으로 분석 하였으며, ¹H-NMR(도 3a)은 600MHz로, ¹³C-NMR(도 3b)은 150 MHz로 각각 측정하였다. 그리고, ¹H-¹H COSY, HMQC, HMBC spectrum 측정을 통하여 화합물 A내 수소와 탄소의 위치를 결정하였다(도 3c).

상기와 같이 측정한 결과, 화합물 A는 아이리닌 B(irilin B, 5,7,2’-트리하이트록시-6-메톡시이소플라본)로 동정되었고 물리· 화학적 성질은 다음과 같다.

(1) 분자식 : C₁₆H₁₂O₆

(2) 분자량 : 300, ESI-MS: m/z 299.1 [M-H]⁺, m/z 301.1 [M+H]⁺ (도 2)

(3) 녹는점 : 183℃

(4) 성상 : 미색분말 (pale yellow powder)

(5) 용해성 : 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 클로로포름에 용해되고 물에 불용성

(6) TLC 발색 : FeCl₃(양성), 브로모크레졸그린 (음성), UV light(양성, 황녹색), 아니린디페닐라민(음성), 앤티모니(음성), 드라겐돌프(음성)

(7) 자외선 최대 흡수파장 영역 (메탄올, λmax, nm) : 214, 263, 289sh, and 338sh, (+NaOAc) : 271, 340, (+AlCl₃) : 215, 271, 317, 368 : (+NaOAc + H₃BO₃) 214, 263, 289sh, and 338sh

(7) ¹H 및 ¹³C-NMR :

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 3.87(1H, d, 3-H), 6.47(1H, d, 8-H), 8.07(1H, d, 2-H), 6.90(1H, d, 3’-H), 7.23(1H, m, 4’-H), 6.89(1H, d, 5’-H), 7.23(1H, s, 4’-H) (도 3a)

¹³C-NMR (150 MHz,DMSO-d6) δppm : 157.0(2-C), 122.0(3-C), 182.6(4-C), 156.8(5-C), 133.0(6-C), 159.0(7-C), 95.2(8-C), 155.0(9-C), 106.4(10-C), 119.3(1’-C), 155.9(2′-C), 117.1(3’-C), 130.9(4’-C), 120.7(5’-C), 132.7(6’-C), 60.7(OCH₃) (도 3b).

(8) 화학구조식

실시예 3: 퉁퉁마디 추출 및 정제 분획물들의 항응고 활성 확인

항혈전 활성 평가의 일환으로 혈액응고 저해활성을 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며(Sohn et al., 2004. Kor. J. Pharmacogn 35. 52-61;Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928), 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임을 측정하였다. 혈장은 건강한 성인 남녀의 혈액을 칼슘시트레이트가 도포된 시험관에 담아 원심분리(4℃, 3000 rpm, 20 min)한 후, 상등액인 혈장을 분리하였으며, 크라이오튜브에 소분하여 80℃에 보관하면서 사용하였다.

3-1: 프로트롬빈 타임(prothrombin time)

표준혈장(MD Pacific Co., China) 30 μl와 다양한 농도(1.25, 2.5 및 5.0 mg/ml)의 시료액 5 μl를 Genius Semi-auto Coagulometer CA 51-52 (Shenzhen, China) 의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 40 μl의 PT reagent(Diagon, Hungary)를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 4회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 양성대조군로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1초의 응고시간을 나타내었고, 프로트롬빈 저해활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고 시간으로 나눈값(Ts/Tc)으로 나타내었다.

3-2: 에이피타임 (activated Partial Thromboplastin Time)

혈장 30 μl와 다양한 농도(1.25, 2.5 및 5.0 mg/ml)의 시료 추출액 5 μl를 Genius Semi-auto Coagulometer CA 51-52 (Shenzhen, China)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 20 μl의 aPTT reagent(Diagon, Hungary)를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 처리하였다. 이후 20 μl CaCl₂(35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 58.0 초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 4회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고인자 저해활성은 시료 첨가시의 aPTT시간을 용매 대조구의 aPTT시간으로 나눈 값(Ts/Tc)으로 나타내었다.

상기 실시예 1로부터 항혈전성 irilin B 화합물의 정제 과정에서 수득된 퉁퉁마디 열수추출물, 유기용매 분획물, 및 컬럼크로마토 그래피 정제획분들의 항응고 활성, 즉 프로트롬빈 타임과 에이피타임을 아스피린을 대조군으로 하여 비교측정하였으며, 각 시료의 농도는 각각 1.25, 2.5 및 5 mg/ml 농도로 3회 이상 반복 실험한 평균값으로 도 4 및 도 5에 나타내었다.

퉁퉁마디 추출물 및 정제분획물들의 항응고활성은 활성 경로 중 혈관 벽의 손상으로 외부 조직인자가 유입되어 혈액응고가 개시되는 외인성 경로의 혈액응고를 나타내는 프로트롬빈 타임을 시료대신 DMSO를 가한 대조군과 함께 측정하였다. 시료를 가하지 않은 혈장 단독의 프로트롬빈타임은 11.1 초로 측정되었으며, DMSO를 용매로 사용한 대조군의 프로트롬빈타임은 17.4초 였다. 도 4에서 나타낸 바와 같이, 양성대조군으로 사용한 아스피린은 1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml 및 5 mg/ml 농도에서 대조군의 프로트롬빈타임을 각각 1.33, 3.88 및 11.5 배 연장시켜 우수한 항응고 활성을 나타내었다. 퉁퉁마디 탈염물의 열수추출물(SED)은 2.5 mg/ml 및 5 mg/ml농도에서 각각 1.29배 및 2.54 배 타임을 연장시켰으며, SED를 유기용매 분획하여 얻어진 분획물 중 항응고 활성이 가장 높았던 에틸아세테이트 획분(SED-EA)은 2.5 mg/ml 및 5 mg/ml농도에서 각각 2.52배 및 4.23 배 연장시켰다. 에틸아세테이트 획분(SED-EA)을 디아이언 HP-20 컬럼으로 정제하여 얻은 분획물 중 가장 활성이 우수하였던 SED-EA-H2는 5 mg/ml에서 프로트롬빈 타임을 대조군 대비 6.88 배 증가시킴으로써, 열수추출물(SED) 대비 약 2.7 배의 정제 효율을 나타내었다. SED-EA-H2의 실리카젤 컬럼 크로마토그래피를 통하여 획득된 SED-EA-H2-S3은 1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml 및 5 mg/ml농도에서 대조군 대비 각각 2.54, 5.51 및 11.5배 연장시켜 아스피린보다 우수한 활성을 나타냈으며, SED-EA-H2-S3 분획물로부터 겔여과 컬럼인 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피 정제를 통하여 수득된 활성 정제 획분(SED-L-13 + 14)의 프로트롬빈 타임은 1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml 및 5 mg/ml 농도에서 대조군 대비 3.68, 11.5 및 11.5배 연장시켰으며, 특히 2.5 mg/ml의 농도에서는 아스피린 보다 약 3 배 강한 강력한 항응고활성을 나타내었다. 이러한 결과로부터 컬럼 정제 마지막 획분인 LH 20 컬럼 크라마토그래피에서 수득된 활성획분(SED-L-13 + 14)으로부터 분리한 항응고성 활성 본체인 단일화합물 뿐만 아니라, 정제과정 중에 수득되는활성획분들도 아스피린 대비 우수한 프로트롬빈타임의 항응고활성을 나타내므로 위장장해 및 장출혈 등의인 부작용을 나타내는 기존의 항혈전제이 아스피린 등을 대체할 수 있을 것으로 판단되며, 상업적인 항혈전제로서의 개발이 가능하리라 판단된다.

도 5는 혈액응고 경로에서 내인성경로를 통하여 일어나는 혈액응고 과정을 측정하는 에이피 타임(activated Partial Prothrombin time, aPPT)을 시료들과 양성대조군인 아스피린과 비교 측정한 것이다. DMSO를 가하지 않은 혈장의 에이피타임은 23.8초이었으며, DMSO를 가한 용매대조군의 에이피타임은 46.8초로 측정되었다. 아스피린은 1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml 및 5 mg/ml 농도에서 시료대신 DMSO를 가하여 측정한 대조군의 에이피타임을 각각 1.31, 2.05 및 4.27 배 연장시켜 내인성경로의 응고를 효과적으로 저해함을 알 수 있다. 퉁퉁마디 탈염물의 열수추출물(SED)은 2.5 mg/ml 및 5 mg/ml농도에서 각각 1.88배 및 2.51 배 에이피타임을 연장시켰으며, SED를 유기용매 분회하여 얻어진 분획물 중 항응고 활성이 가장 높았던 에틸아세테이트 획분(SED-EA)은 2.5 mg/ml 및 5 mg/ml 농도에서 각각 2.33 및 3.1 배 연장시켰다. 에틸아세테이트 획분(SED-EA)의 디아이언 HP-20 컬럼 정제 분획물 중 가장 활성이 우수하였던 SED-EA-H2는 1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml 및 5 mg/ml 농도에서 에이피타임을 대조군 대비 각각 1.99, 2.87. 3.85 배 증가시킴으로써 활성물질의 정제를 통하여 아스피린보다 우수한 내인성경로의 항응고활성을 나타내는 획분을 얻을 수 있었다. SED-EA-H2의 실리카젤 컬럼 크로마토그래피를 통하여 획득된 SED-EA-H2-S3은 1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml 및 5 mg/ml 농도에서 대조군 대비 각각 3.64, 4.27 및 4.27 배 연장시켜 아스피린보다 우수한 활성을 나타냈으며, 특히 SED-EA-H2-S3 분획물로부터 겔여과 컬럼인 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피 정제를 통하여 수득된 활성 정제 획분(SED-L-13 + 14)의 에이피타임은 실험한 모든 농도(1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml 및 5 mg/ml)에서 본 실험에서 사용된 항응고측정기의 최대값인 200초 이상의 항응고활성을 나타내어 대조군 대비 모두 4.27 배 연장시켜, 아스피린 보다 강력한 항응고활성을 나타내었다. 따라서, 퉁퉁마디 추출물에 존재하는 항응고성 활성물질은 외인성 경로 및 내인성 경로의 양 경로 혈액응고를 모두 강력히 억제하는 것으로 보여지므로 안전하고 부작용 없는 천연 식품 재료 유래의 항혈전제제로서 개발이 가능하리다 본다.

실시예 4: 본 발명의 irilin B 화합물의 항응고 및 항혈소판 활성 평가

본 발명에서 퉁퉁마디 추출물로부터 순수분리된 irilin B 화합물의 항혈전 활성 효능을 평가하기 위하여, 상기 실시예 3과 같이 외인성 및 내인성 경로의 프로트롬빈 타임과 에이피타임을 측정하였다(표 1). 한편, 혈소판은 다양한 혈구세포와 함께 혈관을 순환하는 원반형의 작은세포로서 핵이 없는 대신 혈관손상보호 및 혈소판 응집과 관련된 다양한 물질을 고농도로 포함하는 사이토플라즈믹 그래뉼(cytoplasmic granule)을 가지고 있으며, 혈관내벽의 손상이 나타나는 경우 응집인자들을 분비하고 내피세포의 손상으로 노출된 collagen 등과 결합하여 1차 지혈 플러그(primary hemostatic plug)를 형성하여 혈전생성을 개시한는 중요한 세포이다. 따라서 혈소판 응집저해는 항응고활성과 더불어 혈전생성을 방지하는 매우 중요한 과정이다. 따라서 irilin B의 혈소판 응집저해 활성(platelet aggregation inhibition activity)을 측정하였다(표 2). 실험은 인간의 농축혈소판을 사용하였으며, 이를 washing buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM 글루코스, 1 mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM 글루코스, 0.49 mM MgCl₂, 0.25% 젤라틴, pH 7.4)에 재현탁한 후, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재현탁하였으며, 이때 혈소판 수는 4 x 10⁹/ml이 되도록 조정하였다. 이후 1 ml 현탁액에 2.5 μl 콜라겐을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer (Genius Semi-auto Coagulometer CA 51-52, Shenzhen, China)를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.

퉁퉁마디로부터 분리한 irilin B 화합물의 항응고 활성평가

-	mg/mL	아스피린	Irilin B	이소람네틴
PT (Ts/Tc)	1	1.03	3.15	1.01
PT (Ts/Tc)	1.50	1.16	4.24	1.28
PT (Ts/Tc)	2.50	>11.8	>11.8	>11.7
PT (Ts/Tc)	5.00	>11.8	>11.8	>11.7
-	mg/mL	아스피린	Irilin B	이소람네틴
aPTT (Ts/Tc)	1	1.09	2.62	1.17
aPTT (Ts/Tc)	1.50	1.56	>3.56	1.86
aPTT (Ts/Tc)	2.50	2.10	>3.56	2.35
aPTT (Ts/Tc)	5.00	>3.56	>3.56	>3.56

- Ts: 시료를 처리한 시험군에서의 혈액응고 시간(초)

- Tc: 용매로 DMSO를 사용한 대조군의 혈액응고 시간(초)

- PT에서의 Tc(sec): 17.0초, aPTT에서의 Tc(sec): 56.1초

상기 표 1은 퉁퉁마디에서 단리한 irilin B와 임상으로 사용되는 항혈전제인 아스피린과 미나리 등에서 강력한 항혈전제로 보고된 플라보놀 화합물인 이소람네틴(isorhamnetin)을 비교 대상으로 항응고활성(PT, aPTT)을 실시예 3-1과 3-2의 방법으로 동일조건에서 비교 측정한 것이다(Anticoagulant activities of persicarin and isorhamnetin. Vascul. Pharmacol. 58(4): 272-279).

본 발명의 irilin B는 외인성 경로인 프로트롬빈 타임과 내인성 경로인 에이피타임을 실험한 모든 농도 (1, 1.5, 2.5 및 5.0 mg/ml)에서 아스피린 및 이소람네틴과 비교시 우수한 항응고활성을 나타냄을 확인하였다. 특히 임상용 항혈전제로 처방되고 있는 아스피린은 1.5 mg/ml의 농도에서 프로트롬빈타임과 에이피타임을 용매 대조군 대비 각각 1.16 및 1.56 배 연장시켰으나 irilin B는 동일농도에서 각각 4.24배 및 3.56 배 이상 연장시켰다. 이는 irilin B의 항응고활성이 PT에서는 아스피린보다 약 3.65 배, aPTT에서는 약 2.3배 이상 강함을 의미하며, 강력한 항혈전성 플라보놀로 알려진 이소람네틴 보다도 각각 2.2배 및 1.9 배 강하였다.

또한 irilin B 화합물의 혈소판 응집저해 활성을 나타내는 아래 표 2의 결과를 보면, 임상에서 사용되는 항혈소판제인 아스피린은 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml 농도에서 대조군인 DMSO의 응집능 100% 대비 혈소판응집능이 각각 17.01, 36.63 및 52.87%로 농도 의존적으로 저해함을 알 수 있었다. 실시예 1과 같이 퉁퉁마디로부터 순수정제한 irilin B의 경우, 아스피린 보다 월등히 높은 혈소판 응집저해 활성을 나타내었다. 즉, 아스피린보다 낮은 농도인 0.25, 0.125, 0.0125 및 0.005 mg/ml 농도로 각각 실험하였을 때 혈소판 응집능은 대조군인 DMSO의 응집능 100% 대비 각각 12.64, 16.48, 24.75, 48.89%로 측정되었다. 이를 혈소판 응집저해 활성의 IC₅₀ 값으로 비교하였을 때 아스피린은 110.4 μg/ml 이었고, irilin B는 5.21 μg/ml로서 irilin B는 아스피린보다 약 21 배 높은 강력한 혈소판 저해활성을 나타내었다. 이는 irilin B 화합물이 내인성 및 외인성 경로의 혈액응고 과정을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 혈소판 응집 저해를 통하여 강력한 항혈전 활성을 나타내므로 혈관 내 혈전으로 인하여 발생되는 심뇌혈관 관련 질환(심장병, 심근경색, 허혈, 뇌졸중, 뇌경색 등)들의 치료를 위한 의약품과 이 들 질환을 예방하는 기능성 혈행개선제로서의 개발이 가능함을 시사한다.

퉁퉁마디로부터 분리한 irilin B 화합물의 혈소판 응집저해 활성평가

시료 (Sample)		응집강도 (Amplitude, ohm)	응집기울기 (Slope)	하강면적 (Area under)	*혈소판 응집능 (Platelet aggregation activity, %)	**IC50 (μg/ml)
DMSO 대조군		21	3	130.5	100.0	-
아스피린 (mg/ml)	0.5	4	0	22.21	17.01	110.4
아스피린 (mg/ml)	0.25	9	1	47.83	36.63	110.4
아스피린 (mg/ml)	0.125	13	2	69.07	52.87	110.4
Irilin B (mg/ml)	0.25	2	0	16.55	12.64	5.21
Irilin B (mg/ml)	0.125	3	0	21.59	16.48	5.21
Irilin B (mg/ml)	0.0125	5	1	32.36	24.75	5.21
Irilin B (mg/ml)	0.0050	12	2	63.82	48.89	5.21

* 혈소판 응집능((Platelet aggregation activity, %) : 시료첨가구의 혈소판응집 하강면적/DMSO 첨가구의 혈소판응집 하강면적

** IC₅₀: 본 실험 조건에서 50% 혈소판 응집저해에 소요되는 농도 (이 값이 적을수록 혈소판 응집 저해활성이 강함을 의미)

실시예 5: Irilin B 화합물의 알파글루코시다제 저해활성 평가

포유류 소장 점막의 brush border에 분포하고 있는 탄수화물 소화효소들인 말타아제(maltase), 수크라아제(sucrase) 및 글루코아밀라아제(glucoamylase)들이 알파-글루코시다제(α-Glucosidase)이며, 이 효소의 과도한 활성을 저해함으로써 이당류, 다당류가 단당류로 분해되는 과정을 억제하여 식후 과도한 혈당상승을 지연시키는 효과를 나타낸다. 따라서, 이 효소의 활성 저해는 항당뇨 효능을 측정하는 도구로 사용된다. α-글루코시다아제 억제제는 소장 내에서 탄수화물의 소화를 지연시켜, 식후의 혈당 수치의 증가를 약화시키고, 고혈당으로 인한 인슐린 분비를 지연시키는데 효과적이다. 따라서 실시예 1에서 순수분리한 irilin B 화합물의 알파글루코시다제에 대한 저해활성을 확인하고자 Ove의 방법(Ove, N.; Cowell, G.M.; Tranum-Jenser, J. Hansen, O.; Welinder, K.G. J. Biol. Chem. 261:12306-12309, 1986)을 일부 수정하여 실험하였다. 효소반응은 96-웰 마이크로플레이트에 다양한 농도(0.25, 0.5 및 1.0 mg/ml)로 조제된 20 μl 시료액, 20 μl의 α-글루코시다제(Sigma Co., UDA)(2 Uint/ml) 및 180 μl의 100 mM 인산염 완충액(phosphate buffer, pH 7)을 37℃에서 10분간 preincubation 후 30 μl의 20 mM p-니트로페닐-α-D-글루코피라노스 기질용액을 가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 알파글루코시다제 억제 활성은 96-반응액 (180 μl)에 글루코스옥시다제 (glucose oxidase reagent)를 가하여 생성되는 과산화수소를 오르토디아니시딘 (o-dianisidine)과 반응시켜 생성되는 색소물질을 540 nm에서 비색정량하고 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 계산하였다. 양성대조군으로서 아르카보스(Arcabose) (Sigma Co., USA) 0-100 μg/ml을 사용하였다.

- α-글루코시다제 활성의 억제(%) = (1-As/Ac) × 100 (%)

- Ac: 540 nm에서의 대조군 흡광도

- As: 540 nm에서의 샘플 흡광도

도 6에 도시된 바와 같이, 실시예 1에서 순수분리된 정제된 irilin B와 당뇨치료제로 상용화되어 있는 아카보스(Sigma Co., USA)의 알파글루코시다제 저해활성을 동일농도인 25. 50, 100 μg/ml의 동일농도에서 비교 측정한 결과 아카보스는 각각 25.0, 36.1 및 51.2%의 저해활성을 나타냈으며, irilin B는 45.0, 60.3 및 77.2%로 아카보스보다 우수한 알파글루코시다제 저해활성을 나타냄을 확인하였다. 두 화합물의 IC₅₀값을 각각 계산한 결과, 아카보스는 98.5 μg/ml, irilin B는 46.3 μg/ml이었다. 이는 irilin B가 아카보스 보다 약 2.1 배의 강한 활성을 의미한다. 따라서 irilin B는 천연물 유래의 강력한 알파글루코시다제 저해제로서 당뇨 치료를 위한 의약품 외에 고혈당으로 촉발되는 비만과 고지혈증 치료제로도 개발이 가능할 것으로 보인다.

실시예 6: 본 발명의 irilin B 화합물의 안지오텐신 전환효소 저해활성 평가

안지오텐신 전환효소에 의해 생성된 안지오텐신 Ⅱ의 증가는 강한 혈압 상승작용과 항이뇨호르몬인 알도스테론의 분비를 촉진하고 물과 나트륨의 배설을 억제하여 순환 혈액양을 증가시킴으로써 고혈압을 일으키게 한다. 따라서 irilin B화합물의 안지오텐신 전환효소에 대한 저해활성을 확인하고자 Cushman과 Cheung의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 ACE(안지오텐신 변환효소, Angiotensin I Converting Enzyme) 저해활성을 측정하였다. 시료 50 μl에 Rabbit lung aceone powder(Sigma Col) 1 g을 10 ml의 0.3 M NaCl를 함유하는 0.1 M 붕산염 소디움 버퍼(sodium borate buffer) 용액에 용해한 ACE 상등액 25 μl(2.5 unit)와 0.3 M NaCl를 함유하는 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3) 50 μl, 다양한 농도(0.25, 0.5 및 1.0 mg/ml)의 시료 용액 25 μl을 혼합하여 37℃ 온도 하에서 10분간 프리인큐베이션(preincubation)시켰다. 여기에 기질로서 Hip-His-Leu 용액 50 μl를 가한 후, 다시 37℃ 온도 하에서 30분간 반응시킨 후, 1 N 염산(HCl) 100 μl을 가하여 반응을 정지시켰다. 여기에 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 1 ml를 가하여 1분간 볼텍싱(vortexing)한 다음, 3,000 g로 15분간 원심분리 후, 분리된 에틸아세테이트 상층액(추출물) 0.8 ml를 취하였다. 이 상층액을 후드 내에서 가온시켜며 완전히 휘발시킨 뒤, 동일조건의 붕산염 소디움 버퍼(sodium borate buffer) 1 ml를 가하여 용해시켜 228 nm에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해활성을 계산하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 양성대조군으로서 캡토프릴(Captopril)(Sigma Co., USA) 0-1 μg/ml과 비교 화합물로 플라보노이드 화합물 중 ACE 저해활성이 가장 높은 것으로 보고되어 있는 [Inhibition of angiotensin-converting enzyme activity by flavonoids: Structure-activity relationship studies. PLOS ONE,. 2012: 7(11), e494493] 루테올린(luteolin, Sigma Co., USA)의 활성을 동일조건에서 비교 측정하였다. 도 7의 결과에서 나타나듯이 irilin B 화합물은 농도 의존적으로 강력한 ACE저해활성을 나타내어 12.5 μg/ml의 농도에서도 60%에 가까운 저해활성을 보였으며, ACE활성을 50% 저해하는데 필요한 irilin B 농도인 IC₅₀값은 10.9 μg/ml로 계산되었다. 이는 플라보노이드성 ACE 저해제로 알려져 있은 루테올린(26.7 μg/ml) 보다 약 2.4 배 강한 ACE 저해활성을 의미한다. Irilin B는 화학의약품인 캡토프릴보다는 다소 약하나, 부작용이 없는 천연물 유래의 항고혈압 치료제로서의 개발 가능성은 크다고 하겠다.

실시예 7: 본 발명의 irilin B 화합물의 타이로시네이즈 저해활성 평가

붓꽃에서 분리된 irilin B의 미백 화장품 용도로서의 가능성을 확인하여 보고자 피부 멜라닌색소의 생성을 유발시키는 갈변화 효소인 타이로시네이즈(Tyrosinase)에 대한 저해활성을 측정하였다. 상기 실시예 1에서 순수분리한 irilin B의 멜라닌 생합성 저해에 관여하는지 알아보기 위해 인간 피부 유래의 효소(Sigma Co, USA)인 타이로시네이즈를 이용하였으며 반니 등의 방법(A. Vanni, Annali di Chimica, 80, p35, 1990)을 일부 변형하여 실험하였다. 100 mM 포타슘 포스페이트 완충액(pH 6.8) 180 μl, 5 mM L-DOPA 수용액 30 μl 및 1,250 U/ml 농도의 휴면 티로시나제 40μl를 혼합한 후 다양한 농도의 시료용액을 각각 20 μl 가하여 37℃에서 30분간 효소반응을 진행시켰고, 반응용액의 흡광도를 490 nm에서 측정하여 하기 수학식 1로 티로시나제의 활성 억제율을 구하였다. 양성대조군으로는 알부틴(시그마 사)을 사용하였다.

타이로시나제 저해활성 (%) = [(A-B)/A]× 100

A : 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 490 nm에서 흡광도

B : 시료를 첨가한 반응용액의 490 nm에서 흡광도

퉁퉁마디로부터 분리한 irilin B 화합물의 타이로시나제 저해활성평가

시료	농도 (μg/ml)	타이로시나제 저해활성(%)
Irilin B	25	16.2
Irilin B	50	27.1
Irilin B	100	46.3
Irilin B	200	68.6
알부틴	50	15.3
알부틴	100	21.7
알부틴	250	42.9
알부틴	500	65.4

상기 표 3은 irilin B 화합물의 타이로시나제 저해활성을 비교 평가한 것으로, irilin B는 25, 50, 100 및 200 μg/ml의 농도에서 각각 16.2, 27.1, 46.3 및 68.6%의 타이로시나제 억제활성을 보여 양성대조군으로 비교한 알부틴 보다 동일농도에서 현저히 멜라닌 생성을 억제하여, 100 μg/ml의 농도에서 알부틴보다 약 2.13 배 우수한 미백활성을 나타내었다(도 8 참조). 알부틴은 티로시나제에 대한 억제 능력이 검증되어 화장품 등에 사용되고 있으나, 알부틴 자체가 하이드로퀴논에 당이 붙어있는 상태로 화장료로 적용시 피부 효소에 의해 당이 분리된 후 하이드로퀴논에 의한 피부자극이 우려되기도 하며, 낮은 저해활성, 사용중의 변색, 물질 자체의 불안정성 등의 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 알부틴보다 우수한 미백효과를 나타내는 이소플라본 계의 irilin B는 당이 결합되어 있지 않은 아글리콘화합물이므로 알부틴이나 코지산을 대체할 수 있는 새로운 미백성분으로서 기능성 화장품 용도로 개발이 가능하다고 보겠다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예 일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 Irilin B (5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈전증 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제 1 항 있어서, 상기 혈전증은 동맥 혈전증 또는 정맥 혈전증인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
3. 제 2 항 있어서, 상기 동맥 혈전증은 동맥경화, 뇌졸중, 뇌경색, 심부전 또는 심근경색인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
4. 하기 화학식 1로 표시되는 Irilin B (5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물을 포함하는 혈전증 예방 및 개선용 식품 또는 사료용 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
5. 삭제
6. 하기 화학식 1로 표시되는 Irilin B (5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물을 유효성분으로 포함하는 고혈압 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
7. 삭제
8. 하기 화학식 1로 표시되는 Irilin B (5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물을 유효성분으로 포함하는 미백 화장료 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
9. 다음 단계를 포함하는 Irilin B (5,7,2’-트리하이드록시-6-메톡시이소플라본) 화합물의 분리방법:
   (a) 퉁퉁마디(Salicornia spp.)를 극성 용매로 추출하는 단계;
   (b) 상기 단계 (a)의 추출물로부터 고분자성 화합물을 제거한 후, 비극성 유기용매를 첨가하여 분획물을 수득하는 단계; 및
   (c) 상기 단계 (b)의 비극성 유기용매 분획물을 정제하는 단계.
   
10. 제 9 항 있어서, 상기 단계 (b)는 비극성 유기용매로서 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 이용하여 분배 분획물을 수득하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
    
11. 제 9 항 있어서, 상기 분리방법은 상기 단계 (c) 이후에 단계 (c)의 정제획분을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 순수분리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.

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