KR20140137655A - 오공 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 전이로 인한 폐의 침투성 염증의 예방 또는 개선을 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오공 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 췌장 조직 및 샘꽈리세포에서의 급성 췌장염 발병을 저해하는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다. 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 췌장 조직에서의 염증, 부종, 액포화 및 괴사의 정도, 췌장 조직에서의 혈청 아밀라제 및 리파제의 활성, 췌장 조직에서의 전염증성 사이토카인 및 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현, 췌장 조직에서의 MPO 침윤을 저해시키는 효능, 췌장 중량/체중의 비율(P.W/B.W)을 감소시키는 효능을 보유하고 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 샘꽈리세포에서의 전염증성 사이토카인 및 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현, 샘꽈리세포에서의 MAPKs 통로의 활성, 샘꽈리세포에서의 HMGB1 단백질의 발현을 저해시키는 효능, 샘꽈리세포에서의 세포독성이 없으며, 추가적으로 폐 조직의 부종 및 염증 정도, 폐 조직의 MPO 침윤을 저해시키는 효능을 보유하고 있다.

Description

오공 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물{A PHARMACEUTICAL COMPRISING SCOLOPENDRA SUBSPINIPES FOR TREATING OR PREVENTING ACUTE PANCREATITIS}

본 발명은 오공 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 췌장 조직 및 샘꽈리세포에서급성 췌장염 발병을 저해하는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다. 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 췌장 조직에서의 염증, 부종, 액포화 및 괴사의 정도, 췌장 조직에서의 혈청 아밀라제 및 리파제의 활성, 췌장 조직에서의 전염증성 사이토카인 및 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현, 췌장 조직에서의 MPO 침윤을 저해시키는 효능, 췌장 중량/체중의 비율(P.W/B.W)을 감소시키는 효능을 보유하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 샘꽈리세포에서의 전염증성 사이토카인 및 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현, 샘꽈리세포에서의 MAPKs 통로의 활성, 샘꽈리세포에서의 HMGB1 단백질의 발현을 저해시키는 효능, 샘꽈리세포에서의 세포독성이 없으며, 추가적으로 폐 조직의 부종 및 염증 정도, 폐 조직의 MPO 침윤을 저해시키는 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 조성물의 농도는 마우스 기준으로 복강 내에 1회 투여시 0.05 mg/kg~1 g/kg인 것을 기술적 특징으로 보유하고 있다.

급성 췌장염(Acute pancreatitis)은 단백분해효소 전구물이 췌장 내에서 조기 활성화됨으로써 일어나는 자가소화의 과정을 통해, 췌장에 부종 또는 종창 등을 동반하는 염증성 질환으로서, 많은 경우에 담관 질환, 알콜의 과잉 섭취 또는 고지혈증 등으로 인하여 유발되는 것으로 알려져 있다.

급성 췌장염에 대하여 지금까지 밝혀진 기전을 개략적으로 살펴보면, 어떠한 트리거링 이벤트(triggering event)가 췌장 내에 있는 소화 전구효소들(digestive proenzymes)을 활성 상태로 변환시키고, 결국 막 파괴, 부종(edema), 장 출혈(intestinal hemorrhage) 및 괴사(necrosis)에 이르게 한다.

또한 이 과정에서 염증 반응이 수반되는데, 투과성 백혈구들은 결국 국부적인 췌장 손상은 물론 전신 징후에까지 이르게 한다. 염증 반응 과정에서는, 인터루킨-1β(interleukin-1β, IL-1β), 인터루킨-6(IL-6) 및 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)와 같은 염증반응 촉진 사이토카인(cytokines), 즉 전염증성 사이토카인이 주요한 역할을 하게 된다. 전염증성 사이토카인은 염증 반응의 매개체이며, 선상 세포의 괴사를 유발하고 국부적인 췌장 손상을 심화시킨다.

급성 췌장염이 발병하면, 환자의 약 25%가 위중한 상태에 이르며, 그 중 30~50%가 사망에 이르게 된다. 그러나 급성 췌장염에 대한 병리-생리학적 소견이 모두 밝혀지지 않았으므로 유효적절한 치료법이 매우 부족한 실정이다. 따라서, 급성 췌장염의 기전을 최대한 밝혀냄과 동시에 그에 따른 치료법 및 치료물질의 개발이 시급하다 하겠다.

한편, HMGB1(고이동성 1군 단백질)은 핵 인자 및 분비 단백질로, 암포테린(amphoterin) 또는 HMG1이라고도 한다. 세포핵 내에서 HMGB1은 DNA에 결합하고 특정 DNA 표적에서 단백질 조립을 촉진하는 구조 염색질-결합 인자로서 기능하며, 세포 외부에서 HMGB1은 RAGE(최종 당화 산물)에 대한 수용체에 높은 친화성으로 결합하는 강력한 염증 매개물질로 작용한다.

HMGB1 유전자는 염색체 13q12에 위치하며, 216개의 아미노산으로 구성된 HMGB1 단백질을 생산한다. HMGB1 단백질은 세 개의 도메인(domain)으로 구성되어 있는데 A box와 B box는 DNA에 결합하는 부위이고, 음전하를 가진 C 터미너스(terminus)가 있다. HMGB1은 인체 내에서 흉선, 림프절, 고환, 태아의 간 등에서 높은 농도로 존재하며, 간세포와 뇌세포를 제외하면 대부분의 세포에서는 주로 핵 내에 존재한다. HMGB1은 핵 내에서 뉴클레오솜(nucleosome)을 안정화시키고, 전사작용을 활성화시키며, 손상된 DNA를 복구하는데 중요한 역할을 담당한다.

본 출원인의 연구에서, HMGB1의 발현을 저해하면 HMGB1의 활동에 따른 TNF 또는 ILs와 같은 전염증성 사이토카인이 유발한 패혈증 또는 다기관 장기 부전 등의 침투성 염증 반응을 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 침투성 염증 반응은 급성 췌장염과도 관련이 있는 기전으로 알려져 있다.

본 출원인은, 위와 같이 급성 췌장염의 기전을 일부 밝혀내었으며, 동시에 급성 췌장염의 증상인 염증, 부종, 조직 손상, 소화 효소 과분비로 인한 자가소화 등에 오공이 미치는 효과를 규명한바, 오공을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염 치료용 조성물을 제공할 수 있다고 판단하여 본 발명을 안출하였다.

이하에서, 본 발명에 사용된 천연물인 오공에 관하여 설명하고자 한다.

오공(Scolopendra subspinipes mutilans)은 절족동물 다족류 중 오공과(Scolopendridae)에 속하는 왕지네의 머리에 있는 독을 제거하고 추출, 가공한 것이다. 오공은 항경련, 해열, 진통, 진정, 소염, 면역조절, 항균 등의 기능이 있으며, 심혈관 계통 질환에 효과가 있다고 알려져 있다.

오공의 성분은 지질 18.7%, 단백 63.4%, 아미노산 11.9%로 구성된다. 오공 아미노산의 성분을 살펴보면, 알라닌(alanine) 16.95%, 글리신(glycine) 15.41%, 글루타민(glutamine) 13.48%, 알리닌(alinine) 7.73%, 프롤린(proline) 6.72%, valie 5.85%, 루신(leucine) 5.73%, 트레오닌(threonine) 4.83%, 아스파르긴(aspargine) 3.91%, 이솔루신(isoleucine) 3.68%, 세린(serine) 3.22%, 라이신(lysine) 3.19%, 트립토판(trytophane) 2.34%, 페닐알라닌(phenylalanine) 2.07%, 메티오닌(methionine) 1.68%, 티로신(tyrosine) 1.64%, 히스티딘(histidine) 0.98%, 시스테인(cysteine) 0.59% 등이다.

오공의 아미노산 성분 중 글리신, 글루타민, 아스파라긴산(asparagusic acid), 글루탐산(glutamic acid), 타우린(taurine), g-아미노부틸산(g-aminobutyric acid) 등은 신경돌기의 분화를 촉진하며, MEK(MAPK/EPK kinase)에서 트레오닌과 타이로신(tyrosine) 인산화를 통해 Erk를 활성화시킨다.

본 발명과 관련된 선행 기술을 살펴보면, 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0067913호에는 황백 추출물을 유효성분으로 포함하는 급성 췌장염의 예방 또는 치료용 조성물에 관하여 기재되어 있다.

상기 선행 기술의 표적질환은 본 발명과 동일하나, 소재가 황백 추출물이라는 데에서 본 발명과 차이점이 있다.

본 발명의 목적은 오공 추출물을 유효성분으로 함유하여 췌장 조직 및 샘꽈리세포에서 급성 췌장염 발병을 저해하는 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적은 췌장 조직에서의 염증, 부종, 액포화 및 괴사의 정도, 췌장 조직에서의 혈청 아밀라제 및 리파제의 활성, 췌장 조직에서의 전염증성 사이토카인 및 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현, 췌장 조직에서의 MPO 침윤을 저해시키는 효능, 췌장 중량/체중의 비율(P.W/B.W)을 감소시키는 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적은 샘꽈리세포에서의 전염증성 사이토카인 및 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현, 샘꽈리세포에서의 MAPKs 통로의 활성, 샘꽈리세포에서의 HMGB1 단백질의 발현을 저해시키는 효능, 샘꽈리세포에서의 세포독성이 없으며, 추가적으로 폐 조직의 부종 및 염증 정도, 폐 조직의 MPO 침윤을 저해시키는 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적은 마우스 기준으로 복강 내에 1회 투여시 농도 0.05 mg/kg~1 g/kg인 오공 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오공 추출물을 유효성분으로 함유하여 췌장 조직 및 샘꽈리세포에서 급성 췌장염 발병을 저해하기 위한 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은 췌장 조직에서의 염증, 부종, 액포화 및 괴사의 정도, 췌장 조직에서의 혈청 아밀라제 및 리파제의 활성, 췌장 조직에서의 전염증성 사이토카인 및 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현, 췌장 조직에서의 MPO 침윤을 저해시키는 효능, 췌장 중량/체중의 비율(P.W/B.W)을 감소시키는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

또한, 본 발명은 샘꽈리세포에서의 전염증성 사이토카인 및 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현, 샘꽈리세포에서의 MAPKs 통로의 활성, 샘꽈리세포에서의 HMGB1 단백질의 발현을 저해시키는 효능, 샘꽈리세포에서의 세포독성이 없으며, 추가적으로 폐 조직의 부종 및 염증 정도, 폐 조직의 MPO 침윤을 저해시키는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은 마우스 기준으로 복강 내에 1회 투여시 농도 0.05 mg/kg~1 g/kg인, 오공 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명인 오공 추출물을 유효성분으로 포함하는 급성 췌장염의 예방 또는 치료를 위한 조성물은 급성 췌장염의 예방, 개선, 또는 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 사용한 건강기능식품은, 기능성 음료, 건강보조식품, 차, 과자류 등과 같이 다양한 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 사용하여 환, 과립, 음료, 타블렛, 캅셀 등의 제형을 제조할 수 있으며, 이 경우에 각 제형을 제조하기 위하여 첨가제가 추가될 수 있음은 물론이다.

본 발명이 약학적 조성물로 사용되기 위하여는 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드, 록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전부, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose)또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 복강내 주사의 경우에는 오공의 양이 1~20mg/kg이 되도록 한다. 또한 경구 투여의 경우에는 오공 양이 복강내 주사 양의 최소 10배 이상이 되도록 조절하여 투여하도록 한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한 본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 가축용 사료에 사용될 수 있으며, 각 경우에 가축 사료에서 허용되는 첨가제 또는 추가제를 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물은 췌장 조직 및 샘꽈리세포에서 급성 췌장염 발병을 저해하는 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물은 췌장 조직에서의 염증, 부종, 액포화 및 괴사의 정도, 췌장 조직에서의 혈청 아밀라제 및 리파제의 활성, 췌장 조직에서의 전염증성 사이토카인 및 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현, 췌장 조직에서의 MPO 침윤을 저해시키는 효능, 췌장 중량/체중의 비율(P.W/B.W)을 감소시키는 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물은 샘꽈리세포에서의 전염증성 사이토카인 및 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현, 샘꽈리세포에서의 MAPKs 통로의 활성, 샘꽈리세포에서의 HMGB1 단백질의 발현을 저해시키는 효능, 샘꽈리세포에서의 세포독성이 없으며, 추가적으로 폐 조직의 부종 및 염증 정도, 폐 조직의 MPO 침윤을 저해시키는 효능을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물은 마우스 기준으로 복강 내에 1회 투여시 농도 0.05 mg/kg~1 g/kg인 효능을 보유하고 있다.

도 1의 A는 오공 추출물 처리시 췌장 조직의 변화 양상을 200배율로 나타낸 사진이다.
도 1의 B는 오공 추출물 처리시 췌장 조직의 변화 양상을 400배율로 나타낸 사진이다.
도 2의 A는 오공 추출물 처리시 폐 조직의 변화 양상을 200배율로 관찰한 사진이다.
도 2의 B는 오공 추출물 처리시 폐 조직의 변화 양상을 400배율로 관찰한 사진이다.
도 3은 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 MPO 침윤의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.
도 4는 오공 추출물 처리시 혈청에서의 아밀라제 발현의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.
도 5는 오공 추출물 처리시 혈청에서의 리파제 발현의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.
도 6은 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 전염증성 사이토카인의 mRNA 발현의 변화 양상을 RT-PCR로 나타낸 그래프이다.
도 7은 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 전염증성 사이토카인 발현의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.
도 8은 오공 추출물 처리시 혈청에서의 전염증성 사이토카인 발현의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.
도 9는 오공 추출물 처리시 췌장 중량/체중의 비(P.W/B.W)의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.
도 10의 A는 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 HMGB1 발현의 변화 양상을 200배율로 관찰한 사진이다.
도 10의 B는 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 HMGB1 발현의 변화 양상을 400배율로 관찰한 사진이다.
도 10의 C는 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 HMGB1 발현의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.
도 11은 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 12는 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 전염증성 사이토카인 mRNA 발현의 변화 양상을 RT-PCR로 나타낸 그래프이다.
도 13은 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 전염증성 사이토카인 발현의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.
도 14는 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 MAPKs 통로 활성 변화 양상을 웨스턴 블롯으로 나타낸 사진이다.
도 15는 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 효과를 JNK 저해제인 SP, p38 저해제인 SB, NF-kB 저해제인 NAC와 비교한 결과를 웨스턴 블롯으로 나타낸 사진이다.
도 16은 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 HMGB1 발현의 변화 양상을 웨스턴 블롯으로 나타낸 사진이다.
도 17은 오공 추출물을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

제조예 1. 오공을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방 또는 치료를 위한 조성물

본 발명의 조성물은 급성 췌장염의 예방 및 치료를 위한 것으로서, 유효성분으로 오공(Scolopendra subspinipes mutilans)을 함유하도록 한다.

오공의 추출 방법에는 용매 추출법, 수증기 증류법, 이산화탄소 초임계 추출법, 수증기 증류법, 마이크로 웨이브 공정 추출법, 퍼콜레이션 추출법 등의 다양한 추출 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법 등 다양한 방법이 사용될 수 있다. 추출 시간 역시 달라질 수 있다.

또한, 2가지 이상의 추출 방법을 사용하여 2차 이상 추출할 수 있다.

추출 용매 역시 다양한 용매가 사용될 수 있다. 추출 가능한 용매에는 물, 에탄올, 메탄올, 지방유, 글리세린, 마유, 플로필렌글리콜, 에테르, 클로르포름, 석유에테르, 헥산, 벤젠, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 부탄올, 이소프로판올 등이 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 분배계수가 다른 2가지 이상의 용매를 동시에 사용하여 추출할 수도 있으며, 2가지 이상의 용매를 사용하여 2차 이상 추출할 수 있다.

설계 조건에 따라, 오공을 건조 후 분쇄하여 분말화한 후 추출할 수도 있다. 또한 오공을 바로 추출한 후 건조하여 분말화할 수도 있다. 농축 등의 과정이 추가될 수도 있다.

농축 방법에는 증발 농축, 건조 농축 등의 다양한 방법이 사용될 수 있으며, 건조 방법에는 양건조법, 음건조법, 동결건조법, 열풍건조법 등의 다양한 건조 방법이 사용될 수 있다.

또한 오공을 건조한 후 분쇄하여 용매에 용해시켜 용액으로 제조할 수 있다. 설계 조건에 따라, 오공 분말과 용매의 중량비는 임의로 조정될 수 있으며, 오공을 건조하는 방법 및 오공 분말을 용해할 용매 또한 임의로 조정될 수 있다. 용해 용매의 종류는 상기 추출 용매와 동일할 수 있다.

제조예 2. 오공 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방 또는 치료를 위한 조성물

설계 조건에 따라, 제조예 1을 이용하여 제조된 조성물을 기타 적절한 한약재들과 혼합하여 급성 췌장염의 예방 또는 치료를 위한 조성물을 제조할 수 있다.혼합 후 농축, 여과, 건조 등의 다양한 처리 공정이 실행될 수 있음은 물론이다.

제조예 3. 오공 추출물을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방 또는 치료 효능을 보유한 건강기능식품

제조예 1 또는 제조예 2를 이용하여 제조된 조성물에 식품학적으로 허용되는 첨가제를 첨가하여 건강기능 식품을 제조할 수 있다. 건강기능 식품의 제조시 추가 공정이 진행될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 이용한 건강기능식품은, 기능성 음료, 각종 식품류, 건강보조식품, 차, 과자류, 껌, 차, 비타민 복합제 등과 같이 다양한 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 급성 췌장염의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 조성물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며 건강 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율의 필수 성분으로서 오공을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리통 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 일긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 채소 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지는 않으나 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

제조예 4. 오공 추출물을 유효성분으로 포함하는 급성 췌장염의 예방 또는 치료 효능을 보유한 가축 사료

제조예 1 또는 제조예 2를 이용하여 제조된 조성물에 수의학적으로 허용되는 첨가제를 첨가하여 가축 사료를 제조할 수 있다. 가축 사료의 제조시 추가 공정이 실행될 수 있다.

실험예 1. 오공 추출물 처리시 췌장 조직의 조직학적 분석

실험예를 기재하기에 앞서, 이하 모든 실험예에 사용된 오공 추출물은 제조예 1 내지 제조예 2에 기재된 사항으로 제조한 것임을 밝혀둔다.

1. 실험 준비 및 전처리

1) 실험동물

모든 실험은 원광대학교 동물실험위원회에 의해 승인된 규정을 준수하여 수행되었다.

C57BL/6 6~8주령 마우스(mouse)의 암컷(몸무게 15~20g의 건강한 상태)을 (주)오리엔트바이오(성남, 경기도, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다.

마우스는 온도 23±2℃(mean±SD) 및 조명시간 12시간(오전 6시~오후 6시)의 환경 조절 사육 상자에서 7일간 사육되었으며, 이 적응기간 동안은 실험동물용 고형사료와 정수시스템을 이용한 물(tap water)을 자유 섭취하도록 하였다.

마우스는 인수시 및 적응기간 동안 일반증상의 이상이 관찰되지 않았으며, 급성 췌장염을 유도하기 전 18시간 동안 단식하였다.

2) 실험 시약

아비딘-퍼옥시다제(Avidin-peroxidase), 3'3'5'5'-TMB(tetramethylbenzidine, 테트라메틸벤지딘), 세루레인(Cerulein), 트리스(Tris)-HCl, NaCl, 트리톤(Triton) X-100, 및 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(hexadecyltrimethyl ammonium bromide)는 시그마(세인트 루이스, MO, 미국)에서 구입하였다. 안티 마우스(Anti mouse) IL-1β 및 TNF-α 항체와 재조합 IL-1β 및 TNF-α는 R & D 시스템스(미네아폴리스, MN, 미국)에서 구매하였다.

포스포스페시픽(phosphospecific) MAPK인 ERK 1/2(extracellular signal-regulated kinase), JNK(c-Jun NH2-terminal protein kinase) 및 p38 항체는 셀 시그널링 테크놀로지(비벌리, MA, 미국)에서 구매하였다. 모든 MAPK, Iκ-Bα(inhibitory kappa B alpha), β-액틴(actin) 항체는 산타 크루즈(CA, 미국)에서 구매하였다.

3) 급성 췌장염 유발

① 급성 췌장염을 유발시키기 위하여 세루레인 50 ug/kg을 1시간 단위로 6번 복강 주사하였다. 정상군은 세린(saline)만을 1시간 단위로 6번 주사하였다.

② 오공(Scolopendra subspinipes mutilans, SSM) 처리군에는 첫 번째 세루레인 주사 1시간 전에 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg을 피하 주사하였다. 정상군에는 아세트산을 피하 주사하였다.

③ 혈청 아밀라제, 리파제 및 사이토카인 레벨을 고려하여 혈액 샘플을 선정하였다.

④ 세루레인을 마지막으로 주사한 지 6시간 후에 마우스의 복강을 개복하여 혈액을 채취하고 췌장 및 폐를 적출하였다.

⑤ 적출된 췌장 및 폐는 포르말린으로 고정되어 -80 ℃에서 보관되었다.

여기에서, 세루레인으로 유도한 급성 췌장염 모델은 인간의 급성 췌장염에서 볼 수 있는 병리 조직학적 소견에 대한 재현성이 뛰어나고 경제적이어서, 급성 췌장염의 세포 병리 현상 및 소화효소의 자가 활성화 과정을 연구하는데 적합한 모델로 알려져 있다.

또한 세루레인을 1시간 간격으로 6번 투여하는 이유는, 세루레인이 콜레시스토키닌 아날로그(cholecystokinin analogue)로서 췌장의 수용체(receptor)를 통해 염증을 발생시키는 기전에 근거하고, 또한 세루레인의 반감기가 굉장히 짧기 때문이다.

또한 복강 내 주사를 통하여 약물을 주입하는 이유는, 경구 투여의 경우 위 및 소장에서 흡수된 약물이 문맥을 통하여 간으로 가서 일단 대사(First-Pass Metabolism)되므로 그만큼 약물작용이 약하게 되고 흡수가 일정치 않기 때문이다.

즉 간에서의 대사로 인한 생체이용률을 감안할 때, 경구투여는 보다 많은 용량을 사용하여야 하며, 작용 출현 시간이 늦어진다.

반면 복강 내 주사는 복막의 흡수 면적이 넓어 약물을 주사하면 흡수가 빠르고 작용이 빨리 나타난다. 또한 주사한 양이 모두 흡수되기 때문에 경구 투여 때보다 약리 작용의 정확성이 있고 주사된 약물은 내피 세포의 천공(pore)을 통해서 자유롭게 혈관 속으로 들어갈 수 있다. 즉 복강 내 주사는 반응 발현의 신속도와 용량의 정확성을 확보하기 위하여 선택되었다.

이하 모든 실험예에서, 실험 준비 및 전처리 과정은 본 실험예 1에 기재된 사항과 동일한 과정으로 실행됨을 밝혀둔다.

2. 실험 과정

급성 췌장염 발병시 췌장에는 부종 및 염증이 발생하므로 췌장의 부종 및 염증의 발생 정도가 급성 췌장염을 진단하는 지표가 될 수 있다.

조직학적 분석시, 조직 사이의 간격 증가의 여부를 척도로 하여 부종의 정도를 파악할 수 있고, 조직 사이의 염증성 세포들의 침윤으로 염증의 정도를 파악할 수 있다.

세루레인으로 급성 췌장염을 유발한 마우스에 오공 추출물을 처리한 후, 실험동물의 전체 췌장을 검사하되, 염증, 부종(edema), 괴사 및 액포화(vacuolization) 정도에 대해서는 반정량적인 분석을 수행하였다. 정상군은 세린만을 처리한 마우스로 설정하였다.

각 샘플에 대하여 최소 100필드(fields) 이상을 포함하는 단면을 분석하고, 샘꽈리세포(acinar cell) 괴사의 개수 및 액포화, 조직 내 부종, 염증의 존재에 기초하여 0~3(0: 정상, 3: 중증)의 범위에서 점수화하였다.

또한 상기 분석기준에는 샘꽈리세포의 형해(ghost), 팽윤(swelling) 및 구조적인 파괴의 정도도 포함되도록 하였다.

3. 실험 결과

하기의 [표 1]은 오공 추출물 처리시 췌장 조직의 조직학적 분석 결과를 나타낸 것이다.

	부종	염증	액포화	괴사
세린(Saline)	0.1±0.02	0.3±0.05	0.1±0.03	0.2±0.02
급성 췌장염	2.6±0.03	2.8±0.04	2.4±0.02	2.5±0.05
오공 0.1 g/kg + 급성 췌장염	2.3±0.05	2.0±0.02	1.6±0.04	1.8±0.01
오공 0.5 g/kg + 급성 췌장염	1.0±0.02	1.5±0.05	1.2±0.02	1.5±0.04
오공 1 g/kg + 급성 췌장염	0.6±0.01	1.0±0.03	0.7±0.05	0.9±0.03

도 1의 A는 오공 추출물 처리시 췌장 조직의 변화 양상을 200배율로 나타낸 사진이다.

도 1의 B는 오공 추출물 처리시 췌장 조직의 변화 양상을 400배율로 나타낸 사진이다.

[표 1] 및 도 1을 토대로 췌장 조직의 변화 양상을 분석한 결과, 세린만 처리한 정상군에서는 부종, 염증, 액포화, 괴사가 거의 나타나지 않았으나, 세루레인만 처리한 대조군에서는 부종, 염증, 액포화, 괴사가 확연히 진행되었다.

또한 오공 처리군에서는 오공의 처리 농도를 증가시킬 수록 부종, 염증, 액포화, 괴사의 진행이 저해되는 것을 관찰할 수 있었다.

즉, 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도 의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 2. 오공 추출물 처리시 폐 조직의 조직학적 분석

1. 실험 과정

급성 췌장염이 진행되면 폐와 같은 기타 장기에도 전이가 되어 호흡 부전과 같은 합병증을 야기한다. 따라서 폐 조직의 부종 및 염증의 발생 정도도 급성 췌장염을 진단하는 지표가 될 수 있다.

폐의 조직학적 분석은 실험예 1과 동일한 과정으로 실행되었다.

2. 실험 결과

결과는 세 번의 추가적인 실험에서 유사하게 도출되었다.

하기의 [표 2]는 오공 추출물 처리시의 폐의 조직학적 분석 결과를 나타낸 것이다.

	부종	염증
세린	0.2±0.05	0.3±0.03
급성 췌장염	2.7±0.02	2.8±0.05
오공 0.1 g/kg + 급성 췌장염	2.2±0.04	2.3±0.02
오공 0.5 g/kg + 급성 췌장염	1.6±0.03	1.5±0.04
오공 1 g/kg + 급성 췌장염	1.0±0.05	0.8±0.03

도 2의 A는 오공 추출물 처리시 폐 조직의 변화 양상을 200배율로 관찰한 사진이다.

도 2의 B는 오공 추출물 처리시 폐 조직의 변화 양상을 400배율로 관찰한 사진이다.

[표 2] 및 도 2를 토대로 폐 조직의 변화 양상을 분석한 결과, 세린만 처리한 정상군에서는 부종, 염증, 액포화, 괴사가 거의 나타나지 않았으나, 세루레인만 처리한 대조군에서는 부종, 염증, 액포화, 괴사가 확연히 진행되었다.

또한 오공 처리군에서는 오공의 처리 농도를 증가시킬 수록 부종, 염증, 액포화, 괴사의 진행이 저해되는 것을 관찰할 수 있었다.

즉, 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도 의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 3. 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 MPO 침윤 저해 효능

1. 실험 과정

호중구는 순환하는 백혈구의 50~70%를 차지하며 염증시에 제일 먼저 도착을 하는 혈구로서 기본 기능은 탐식 작용이다. 이러한 호중구의 침윤(neutrophil infiltration)은 염증의 지표로서 사용할 수 있으며 조직의 MPO 활성을 측정하여 검사할 수 있다.

또한, 호중구의 침윤은 샘꽈리세포의 괴사(necrosis)를 증가시키고 세포자멸사(apoptosis)를 감소시킴으로서 급성 췌장염의 악화에 영향을 미쳐 호중구를 감소시킨 후 급성 췌장염을 유발한 실험동물에서는 급성 췌장염의 중등도가 감소한다.

1) MPO 분석

췌장 조직의 MPO(myeloperoxidase, 미엘로퍼옥시다제) 활성도를 측정하여 췌장에서 호중구 침윤을 검사하였다.

① pH 7.4의 20 mmol/L 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)에 췌장 조직을 녹이고 균질화하여, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리한다.

② 10분간 원심분리된 췌장 조직을 0.5% HTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, 헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드)용액이 섞인 pH 6.0의 50 mmol/L 포스페이트 버퍼에 담가 15,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다.

③ 5분간 원심분리된 췌장 조직을 1.6 mmol/L 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine), pH 5.4의 80 mmol/L 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer), 그리고 0.3 mmol/L의 하이드로즌 퍼옥시다제(peroxidase)에 주입하여 재반응한다.

④ 췌장 조직이 담긴 테트라메틸벤지딘, 소듐 포스페이트 버퍼, 하이드로즌 퍼옥시다제의 혼합물을 110초간 37 ℃에서 인큐베이트(incubate)한다.

⑤ 췌장 조직이 담긴 테트라메틸벤지딘, 소듐 포스페이트 버퍼, 하이드로즌 퍼옥시다제의 혼합물에 2 mol/L의 황산을 처리하고, 리더(reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2) 통계 분석

정상군과 실험군의 차이를 ANOVA(two-way analysis of variance) 방법으로 검정하였다. P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다. 실험 결과는 Mean±SE로 표시하였다.

2. 실험 결과

결과는 세 번의 추가적인 실험에서 유사하게 도출되었다.

도 3은 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 MPO 침윤의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.

측정 결과, 세린만 처리한 정상군에서는 어떠한 변화도 없었으며, 세루레인만 처리한 대조군에서는 MPO 침윤이 증가하였다.

오공 처리군에서는 MPO 침윤이 점점 저해되었으며, 오공의 처리 용량을 0.1, 0.5, 1 g/kg로 증가시킬 수록 저해 효과는 증가하였다.

즉, 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 4. 오공 추출물 처리시 혈청 내 아밀라제 활성 저해 효능

1. 실험 과정

급성 췌장염이 발생하면 검사실 소견상으로 혈청 아밀라제(amylase) 혹은 리파제(lipase)가 정상치의 3배 이상 증가한다고 보고되어 있다. 이는 임상에서의 실제적인 초기 진단에 있어 아주 중요한 지표로서 두 가지 검사를 동시에 시행할 경우에 민감도와 특이도를 더욱 높일 수 있으므로 본 발명에서는 두 가지를 병행 측정하였다.

1) 혈청 내 아밀라제의 활성 측정

① 세루레인을 마지막으로 주사한 지 6시간 후에 마우스를 마취시켰다.

② 시린지(Syringe)를 이용하여 마우스의 심장에서 혈액을 채취했으며 혈액은 3,000rpm, 4 ℃에서 20분간 원심 분리하여 혈청만 분리하였다.

③ 아밀라제(amylase)를 분리된 혈청에서 정량하였다. 혈청 아밀라제의 측정은 바이오어세이 시스템(CA, 미국)으로 하였다.

2) 통계 분석

실험예 3과 동일한 과정으로 실행하였다.

2. 실험 결과

결과는 세 번의 추가적인 실험에서 유사하게 도출되었다.

도 4는 오공 추출물 처리시 혈청에서의 아밀라제 발현의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 세루레인만 처리한 대조군에서는 세린만 처리한 정상군과 비교하여 혈청 아밀라제의 발현이 약 2배 이상 증가하였다.

오공 처리군에서는 대조군과 비교하여, 혈청 아밀라제의 발현이 유의성 있게 감소하였다. 오공의 처리 용량을 0.1, 0.5, 1 g/kg로 증가시킬 수록 혈청 아밀라제 발현의 저해 효과 또한 증가하였다.

즉, 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 5. 오공 추출물 처리시 혈청 내 리파제 활성 저해 효능

1. 실험 과정

1) 혈청 내 리파제 활성 측정

① 세루레인을 마지막으로 주사한 지 6시간 후에 마우스를 마취시켰다.

② 시린지(syringe)를 이용하여 마우스의 심장에서 혈액을 채취했으며 혈액은 3,000rpm, 4 ℃에서 20분간 원심 분리하여 혈청만 분리하였다.

③ 리파제(lipase)를 분리된 혈청에서 정량하였다. 혈청 리파제의 측정은 바이오 어세이 시스템(CA 사, 미국)으로 하였다.

2) 통계 분석

실험예 3과 동일한 과정으로 실행하였다.

2. 실험 결과

결과는 세 번의 추가적인 실험에서 유사하게 도출되었다.

도 5는 오공 추출물 처리시 혈청에서의 리파제 발현의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.

측정 결과, 세루레인만 처리한 대조군은 세린만 처리한 정상군과 비교하여 혈청 리파제 발현이 약 3배 가량 증가하였다.

오공 처리군에서는 대조군과 비교하여, 혈청 리파제의 발현이 유의성 있게 감소하였다. 오공의 처리 용량을 0.1, 0.5, 1 g/kg로 증가시킬 수록 혈청 리파제 발현의 저해 효과 또한 증가하였다.

즉, 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 6. 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 TNF -α, IL -1β mRNA 의 발현 저해 효능

1. 실험 과정

급성 췌장염에서 염증 세포의 활성화 기전에는 TNF-α, IL-1β, IL-6가 대표적으로 관여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 전염증성 사이토카인(cytokine)들은 조직에서 염증을 매개하는데, 선상 세포의 괴사를 유발하고 국부적인 췌장 손상을 심화시킨다고 보고되어 있다.

1) 췌장 내 TNF-α, IL-1β의 mRNA 발현 측정

마우스 췌장 조직에서 mRNA의 전사는 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)으로 분석하였다. 그 과정은 다음과 같다.

① TriZol을 이용하여 췌장으로부터 총 RNA를 분리한 다음, 슈퍼스크립트(SuperScript) II RT (인비트로젠, 칼스버드, CA, 미국)를 이용하여 역전사 반응을 수행하였다.

② 라이트 사이클러(Light Cycler) 2.0 탐지 시스템(로슈 사, 스위스)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 택맨(TaqMan) 정량 RT-PCR을 수행하였다.

③ 각 샘플에 대하여, 관심있는 유전자의 발현을 분석하기 위하여 테스트 반응 및 역전사 효소가 없는 대조 반응을 세 번 반복하였다.

④ 대조 반응은 '하우스 키핑' HPRT(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼레이즈) mRNA로 정규화하였다. 임의의 발현 유닛은 관심 유전자의 발현량을 리보좀 단백질 HPRT mRNA 발현량으로 나누어 계산하였다.

다중 실시간 택맨 PCR을 위한 전방향, 역방향 및 프로브 프라이머는 다음과 같다.

TNF-α :

전방향 : 5′-TCT CTT CAA GGG ACA AGG CTG-3′

역방향 : 5′-ATA GCA AAT CGG CTG ACG GT-3′;

프로브 : 5′-CCC GAC TAC GTG CTC CTC ACC CA-3′

IL-1β :

전방향 : 5′-TTG ACG GAC CCC AAA AGA T-3′

역방향 : 5′-GAA GCT GGA TGC TCT CAT CTG-3′

유니버설 프로브, M15131.1-Roche Applied Science,

IL-6 :

전방향 : 5' -TTC ATT CTC TTT GCT CTT GAA TTA GA-3′

역방향 : 5' -GTC TGA CCT TTA GCT TCA AAT CCT-3′

유니버설 프로브, M20572.1-Roche Applied Science,

2) 통계 분석

실험예 3과 동일한 과정으로 실행하였다.

2. 실험 결과

결과는 세 번의 추가적인 실험에서 유사하게 도출되었다.

도 6은 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 전염증성 사이토카인의 mRNA 발현의 변화 양상을 RT-PCR로 나타낸 그래프이다.

측정 결과, 세루레인만 처리한 대조군은 세린만 처리한 정상군과 비교하여 TNF-α의 mRNA 발현이 약 17배, IL-1β의 mRNA 발현이 약 20배 가량 증가하였다.

오공 처리군의 TNF-α, IL-1β mRNA 발현은 대조군과 비교하여, 유의성 있게 감소하였다. 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg으로 용량을 증가시킬 수록 TNF-α, IL-1β mRNA 발현의 저해 효과 또한 증가하였다.

즉, 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 7. 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 TNF -α, IL -1β 발현 저해 효능

1. 실험 과정

1) ELISA 실행

ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, 엔자임-링크드 이뮤노솔번트 어세이)는 효소면역분석법의 총칭이며, 효소를 표식자로 한 항원항체반응을 이용하여 항원량 또는 항체량을 측정하는 방법이다. 급성 췌장염을 진단하는 방법으로 이용된다.

① pH 7.4의 PBS에 단클론 항체 IL-1β 및 TNF-α를 4 ℃에서 오버나이트(overnight) 인큐베이트한다.

② 96 웰 플레이트(well plate)에 인큐베이트된 안티-마우스(anti-mouse) IL-1β 및 TNF-α 단클론 항체를 100 uL씩 나눠담는다.

③ 100uL씩 나눈 안티-마우스 IL-1β 및 TNF-α 단클론 항체가 담긴 플레이트를 0.05% 트윈(Tween)-20이 들어간 PBS와 10% FBS가 들어간 PBS로 2시간 동안 씻는다.

④ 추가 세척한 단클론 항체 IL-1β 및 TNF-α를 RT에서 2시간 동안 인큐베이트하고, 플레이트를 씻어낸다.

⑤ 씻어낸 플레이트에 바이오티닐레이트(biotinylate)된 안티-마우스 IL-1β 및 TNF-α 항체를 주입하여 RT에서 1시간 인큐베이트한다.

⑥ 플레이트를 씻어내고, TMB 기질을 더하고 재세척하기 전에 아비딘-퍼옥시다제(Avidin-peroxidase)를 더하여 30분간 RT에서 인큐베이트한다.

⑦ 자동 마이크로플레이트(microplate) ELISA reader를 사용하여 450 nm에서 색의 변화를 측정한다. 표준 샘플은 재조합 IL-1β 및 TNF-α의 연속 희석을 이용함으로써 각 분석 플레이트에서 런 온(run on) 된다.

2) 통계 분석

실험예 3과 동일한 과정으로 실행하였다.

2. 실험 결과

결과는 세 번의 추가적인 실험에서 유사하게 도출되었다.

도 7은 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 TNF-α, IL-1β의 발현의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.

도 8은 오공 추출물 처리시 혈청에서의 TNF-α, IL-1β의 발현의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.

측정 결과, 세루레인만 처리한 대조군은 세린만 처리한 정상군과 비교하여 TNF-α의 약 4배, IL-1β의 발현이 약 5배 가량 증가하였다.

오공 처리군의 TNF-α, IL-1β 발현은 대조군과 비교하여, 유의성 있게 감소하였다. 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg으로 용량을 증가시킬 수록 TNF-α, IL-1β mRNA 발현의 저해 효과 또한 증가하였다.

즉, 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 8. 오공 추출물 처리시 췌장 중량/체중 비율 감소 효능

1. 실험 과정

급성 췌장염 발병시 췌장은 염증으로 인해 부종이 발생하여 췌장의 중량이 증가하는 한편, 체중은 감소하게 된다. 결과적으로 췌장 중량/체중의 비율(P.W/B.W)는 증가하게 되며, 췌장 중량과 체중의 비율은 급성 췌장염 발병 검진시 중요한 판단 지표가 된다.

1) 췌장 중량/체중 비율 측정

세루레인을 최초로 투여한 지 11시간 후에 췌장을 적출한 뒤, P.W/B.W(Pancreatic weight/Body weight, 췌장 중량/체중) 계산식을 통하여 체중에 대한 췌장의 중량 비율을 측정하였다.

2) 통계 분석

실험예 3과 동일한 과정으로 실행하였다.

2. 실험 결과

결과는 세 번의 추가적인 실험에서 유사하게 도출되었다.

도 9는 오공 추출물 처리시 췌장 중량/체중의 비(P.W/B.W)의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.

측정 결과, 세루레인만 처리한 대조군은 세린만 처리한 정상군과 비교하여, P.W/B.W가 약 2배 가량 증가하였다.

오공 처리군의 P.W/B.W는 대조군과 비교하여, 유의성 있게 감소하였다. 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg으로 용량을 증가시킬 수록 P.W/B.W의 감소 효과 또한 증가하였다.

즉, 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 9. 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 HMGB1 발현 저해 효능

1. 실험 과정

1) 조직학적 관찰 및 분석

① 췌장 조직을 적출하고 10% 포르말린 용액을 사용하여 고정시켰다.

② 일반적인 조직 표본 제작 방법으로 헤마톡시린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin) 염색을 시행하였다.

③ 카메라 부착 광학현미경(올림푸스 BX 51, 일본)으로 관찰한 후 사진을 촬영하였다.

2. 실험 결과

결과는 세 번의 추가적인 실험에서 유사하게 도출되었다.

도 10의 A는 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 HMGB1 발현의 변화 양상을 200배율로 관찰한 사진이다.

도 10의 B는 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 HMGB1 발현의 변화 양상을 400배율로 관찰한 사진이다.

도 10의 C는 오공 추출물 처리시 췌장 조직에서의 HMGB1 발현의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.

사진 및 그래프를 토대로 HMGB1의 발현을 관찰한 결과, 세린만 처리한 정상군은 췌장 조직 내 폐포 사이의 HMGB1의 발현이 거의 나타나지 않았으나, 세루레인 만 처리한 대조군에서는 HMGB1의 발현율이 높게 나타났다. 대조군은 정상군과 비교하여 HMGB1의 발현이 약 10배 가량 증가하였다.

오공 처리군의 HMGB1 발현은 대조군과 비교하여, 유의성 있게 감소하였다. 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg으로 용량을 증가시킬 수록 HMGB1 발현의 저해 효과 또한 증가하였다.

즉, 오공 0.1, 0.5, 1 g/kg 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 10. 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 세포 독성

1. 실험 과정

1) MTT 어세이 실행

① 세포 독성 측정은 자주색 포르마잔 결정 안에서 전환될 생존한 세포를 기반으로 하여 색으로 값을 수치화하는 칼라러메트릭(colorimetric) 테크닉 기법을 사용하는 MTT 어세이(assay)로 실행되었다. MTT 어세이에서는 MTT{tetrazolium compound 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide} 약물을 사용하였다.

② MTT 5 mg/mL를 크렙스 헨제레이트 버퍼(Kreb's-Henseleit buffer, 115 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 1.3 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 1 M CaCl2 및 1 M MgCl2)에 용해하고, 세린, 세루레인, 오공 0.05, 0.1, 0.5 mg/ml을 처리한 각 군에 MTT를 각각 50 μl씩 첨가하였다.

③ 30분간 37 ℃에서 배양한 후, 현탁액을 제거하고 포르마잔 결정을 200L 디메틸 설폭사이드에 용해하였다.

④ 각각의 부분 표본을 2벌의 96-웰 플레이트(well-plate)의 웰에서 배양한 후, 마이크로플레이트 ELISA 리더(microplate ELISA reader)를 사용하여 540 nm에서 분석하였다.

⑤ 분석 결과 독자 생존 가능한 세포의 비율을 %로 나타내었다.

2) 통계 분석

실험예 3과 동일한 과정으로 실행하였다.

2. 실험 결과

도 11은 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 세린만 처리한 정상군에서는 샘꽈리세포의 생존율이 100%였으나, 세루레인만 처리한 대조군에서는 60%까지 감소하였다.

오공 처리군에서는 샘꽈리세포의 생존율이 증가한 것을 볼 수 있다. 오공의 처리 농도를 증가시킬 수록 샘꽈리세포의 생존율 또한 증가하며, 특히 오공 0.5 mg/ml 처리군에서는 생존율이 80%를 넘어서는 것을 볼 수 있었다.

즉, 오공 0.05, 0.1, 0.5 g/kg 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 11. 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 TNF -α, IL -1β mRNA 발현 저해 효능

1. 실험 과정

실험예 6에 기재된 사항과 동일한 과정으로 실행되었다.

2. 실험 결과

결과는 세 번의 추가적인 실험에서 유사하게 도출되었다.

도 12는 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 전염증성 사이토카인 mRNA 발현의 변화 양상을 RT-PCR로 나타낸 그래프이다.

측정 결과, 세루레인만 처리한 대조군에서는 세린만 처리한 정상군과 비교하여, TNF-α mRNA의 발현은 약 4배 가량, IL-1β mRNA의 발현은 약 6배 가량 증가하였다.

오공 처리군의 TNF-α, IL-1β mRNA의 발현은 대조군과 비교하여, 유의성 있게 감소하였다. 오공 0.05, 0.1, 0.5 mg/kg으로 용량을 증가시킬 수록 TNF-α, IL-1β mRNA 발현의 저해 효과 또한 증가하였다.

즉, 오공 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 12. 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 TNF -α, IL -1β 발현 저해 효능

1. 실험 과정

실험예 7에 기재된 사항과 동일하게 실행되었다.

2. 실험 결과

결과는 세 번의 추가적인 실험에서 유사하게 도출되었다.

도 13은 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 전염증성 사이토카인 발현의 변화 양상을 나타낸 그래프이다.

측정 결과, 세루레인만 처리한 대조군에서는 세린만 처리한 정상군과 비교하여, TNF-α의 발현은 약 3배 가량, IL-1β의 발현은 약 7배 가량 증가하였다.

오공 처리군의 TNF-α, IL-1β의 발현은 대조군과 비교하여, 유의성 있게 감소하였다. 오공 0.05, 0.1, 0.5 mg/kg으로 용량을 증가시킬 수록 TNF-α, IL-1β 발현의 저해 효과 또한 증가하였다.

즉, 오공 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 13. 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 MAPKs 통로 활성 저해 효능

1. 실험 과정

MAPKs(mitogen-activated protein kinases) 통로는 선천 면역과 획득 면역에서 모두 중요한 조절 인자로 작용하고, 세포 안팎의 변화에 대해 폭넓게 반응하여, 다른 신호 전달 통로와 상호 작용하여 세포내 유전자 발현과 세포 기능 조절에 기여한다. 전염증성 사이토카인의 생성 조절에도 결정적인 역할을 한다. 대표적인 전염증성 사이토카인인 NF-kB를 저해하는 기능을 하는 Ik-Ba(inhibitory kappa-Ba)와도 연관이 있다.

포유류에는 ERK(extracellular signal-regulated kinase), JNK(c-jun NH2-terminal kinase), p38의 3가지 유형의 MAPKs 통로가 있다.

또한, 염증 반응이 끝난 후에는 세포가 사멸하는데, 세포가 사멸하는 방식에 따라 급성 췌장염의 중등도가 달라진다. 급성 췌장염의 중등도는 세포의 괴사 정도에 비례하고 세포자멸사의 정도에 반비례한다. 그러므로 급성 췌장염 발병시 세포의 괴사를 감소시키거나 세포자멸사를 증가시킨다면 급성 췌장염의 중등도를 감소시킬 수 있다.

ERK, JNK, p38은 세포자멸사를 유도하는 단백이기도 하며, 이들은 길항적이므로 세포자멸사가 잘 실행되지 않을 때에는 증가한다.

① 췌장 조직을 균질화한 후, 62.5 mM 트리스(Tris)-HCl, pH 6.8의 2% SDS(Sodium dodecyl sulfate, 소듐 도데실 설페이트), 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)로 만든 버퍼에 췌장 조직을 주입하여 끓였다.

② 세포 용해물 내의 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리하여 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다.

③ 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 후, 막은 RT에서 PBST(PBS-트윈-20) 내의 5% 스킴 밀크(skim milk)로 2시간 동안 차단하였으며, 인산화된 ERK 1/2, 인산화된 JNK, 인산화된 p38, Ik-Ba, 모든 ERK 1/2, 모든 JNK, 모든 p38, 혹은 β-액틴에 대한 항체를 오버나이트 인큐베이트하였다.

④ 인큐베이트된 항체를 3번 세척한 후, 각 블롯은 퍼옥시다제로 컨쥬게이트(conjugate)된 2차 항체로 1시간 동안 인큐베이트하였다. 화학발광적 발견 시스템을 증가시켜 발색된 항체-특이 단백질의 발현을 관찰하였다.

⑤ 샘꽈리세포에 JNK 저해제인 SP(SP600125) 50 μM, p38 저해제인 SB(SB239063) 20 μM, NF-kB 저해제인 NAC(N-acetyl cystein, 아세틸 시스테인) 10 mM 및 오공 0.5 mg/ml을 각각 1시간 동안 처리하였다.

2. 실험 결과

결과는 세 번의 추가적인 실험에서 유사하게 도출되었다.

도 14는 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 MAPKs 통로 활성 변화 양상을 웨스턴 블롯으로 나타낸 사진이다.

관찰 결과, 세루레인만 처리한 대조군에서는 MAPKs가 인산화되어 pJNK(인산화 JNK), pp38의 발현이 뚜렷이 나타났다. 세루레인만 처리한 대조군에서는 pJNK 밴드가 상대적으로 굵고 진하게 나타났다.

오공 처리군에서는 대조군과 비교하여, pJNK 밴드가 상대적으로 옅게 나타났으며, Ik-Ba 밴드가 상대적으로 굵고 진하게 나타난 것을 볼 수 있다.

즉, 오공 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

도 15는 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 효과를 JNK 저해제인 SP, p38 저해제인 SB, NF-kB 저해제인 NAC와 비교한 결과를 웨스턴 블롯으로 나타낸 사진이다.

관찰 결과, 세루레인만 처리한 대조군에서는 세린만 처리한 정상군과 비교하여 밴드가 굵고 진하게 나타났으며, 오공 처리군을 비롯한 SP, SB, NAC 처리군에서는 밴드가 옅게 나타났다. 오공이 기존의 전염증성 사이토카인 저해제와 동일한 수준의 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

즉, 오공 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 14. 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 HMGB1 발현 저해 효능

1. 실험 과정

실험예 11에 기재된 사항과 동일한 과정으로 실행되었다.

2. 실험 결과

도 16은 오공 추출물 처리시 샘꽈리세포에서의 HMGB1 발현의 변화 양상을 웨스턴 블롯으로 나타낸 사진이다.

관찰 결과, 세루레인만 처리한 대조군에서는 세린만 처리한 정상군과 비교하여 HMGB1 밴드가 상대적으로 굵고 진하게 나타났다.

오공 처리군에서는 대조군과 비교하여, HMGB1 밴드가 상대적으로 옅게 나타난 것을 볼 수 있다. 오공 0.05, 0.1, 0.5 mg/kg으로 용량을 증가시킬 수록 HMGB1 발현의 저해 효과 또한 증가하였다.

즉, 오공 처리군에서는 급성 췌장염 저해 효과를 관찰할 수 있었으며, 오공은 농도의존적으로 급성 췌장염을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 15. 오공 추출물의 HPLC 분석

1. 실험 과정

① 오공 추출물 분말 5mg을 메탄올 1mL에 용해한 후 0.45 μm 멤브레인 필터(membrane filter)에 걸렀다.

② HPLC 실험은 샘플 인젝터와 다이오드-어레이 UV/비스 디텍터(diode-array UV/Vis detector, DAD)가 부착된 HPLC 장비(SYKAM 시리즈)로 실행되었다. 20 μl의 오공 추출물 메탄올 혼합물을 HPLC 샘플 인젝터(sample injector)에 주입하였다.

③ 시세이도 캅셀 팍 C-18 컬럼(SHISEIDO CAPCELL PACK C-18 column)(4.6×250 mm; 5 ㎛)을 이용해서 실행한 모든 실험은 고정상(stationary phase)로 이용되었으며, 주입양(injection volume)은 각각 20 μl로 설정되었다.

④ 이동상은 40분 동안 10% 아세토니트릴에서 시작하여 40% 아세토니트릴로 넘어가는 기울기 프로그램을 적용한 물과 아세토니트릴(acetonitril)로 구성되었다.

⑤ 컬럼은 10% 아세토니트릴로 20분간 세척되었으며, 시스템은 20분간 개시 상태로 평형화되었다.

⑥ 유량(flow rate)은 0.7 ml/min이며, 검출 파장은 210 nm로 조정되었다.

⑦ 정량시 흡광도의 피크는 전체에서 1번째 91%, 2번째 4%, 3번째 0.5%, 4번째 4.5%였다.

2. 실험 결과

도 17은 오공 추출물을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

HPLC의 그래프에서 가로축은 시간을 나타내고 세로축은 UV 등으로 감지된 물질의 세기, 즉 양을 나타낸다. 동일한 조건(용출 버퍼의 농도나 속도, 컬럼 등)에서 같은 물질은 같은 시간대에서 피크(peak)가 나타난다. 피크를 이루는 부분은 감지되는 물질이 나오는 시간 및 양을 말하며, 피크가 없는 부분은 감지되는 물질이 없다는 것을 의미한다.

또한 피크가 좌우대칭일 수록, 피크의 끝(edge)이 날카로울 수록 HPLC의 여러 조건이 잘 맞아 분석이 잘 되었으며, 분석물의 성분 함량이 높다는 것을 의미한다.

오공 추출물의 HPLC 분석 그래프를 보면, 피크의 끝이 날카로우며, 좌우대칭에 가깝다. 따라서 오공 추출물의 성분 함량이 높다는 것을 알 수 있다.

Claims (6)

1. 오공 추출물을 유효성분으로 함유하는, 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 조성물은 췌장 조직 및 샘꽈리세포에서의 급성 췌장염 발병을 저해하는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는, 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
   
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 조성물은 췌장 조직에서의 염증, 부종, 액포화 및 괴사의 정도, 췌장 조직에서의 혈청 아밀라제 및 리파제의 활성, 췌장 조직에서의 전염증성 사이토카인 및 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현, 췌장 조직에서의 MPO 침윤을 저해시키는 효능, 췌장 중량/체중의 비율(P.W/B.W)을 감소시키는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는, 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
   
4. 청구항 2에 있어서,
   상기 조성물은 샘꽈리세포에서의 전염증성 사이토카인 및 전염증성 사이토카인 mRNA의 발현, 샘꽈리세포에서의 MAPKs 통로의 활성, 샘꽈리세포에서의 HMGB1 단백질의 발현을 저해시키는 효능, 샘꽈리세포에서의 세포독성이 없으며, 추가적으로 폐 조직의 부종 및 염증 정도, 폐 조직의 MPO 침윤을 저해시키는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는, 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
   
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 조성물의 농도는 마우스 기준으로 복강 내에 1회 투여시 0.05 mg/kg~1 g/kg인 것을 특징으로 하는, 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
   
6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 식품학적으로 허용 가능한 첨가제를 첨가한 건강기능식품.

Images