KR102464897B1 - 전립선 비대증 예방, 개선 또는 치료용 생약 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유효성분으로 당귀 및 녹용의 혼합 추출물 또는 당귀, 녹용 및 감초의 혼합 추출물을 포함하는 전립선 비대의 예방, 개선 또는 치료용 혼합 생약 조성물에 관한 것으로, 전립선비대 상피세포인 BPH-1 세포의 증식을 효과적으로 억제하고 DHT level 및 5-알파 환원효소의 작용을 감소시킴으로써 궁극적으로 비대화 된 전립선 크기를 감소시켜 전립선 비대증의 예방, 개선 또는 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 당귀 및 녹용의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방, 개선 또는 치료용 생약 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 당귀 및 녹용을 혼합함으로써 각각의 추출물이 단독으로 존재하는 경우보다 전립선비대 세포의 증식을 효과적으로 억제하고, 세포고사억제 인자인 Bcl-2를 감소시켜 전립선세포의 항상성이 효과적으로 유지될 수 있도록 하며, 5-알파 환원효소2의 유의적 감소, DHT의 유의적 감소를 통하여 전립선 세포의 과다한 성장을 억제하여 전립선비대의 진행을 효과적으로 완화하는 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 당귀 및 녹용에 1종의 생약인 감초를 추가하는 경우 이러한 효과는 더욱 현저하게 나타날 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 생약 조성물은 천연물이므로 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있어, 의약품 또는 식품으로 사용될 수 있다.
배뇨장애 관련 질환 중 대표적인 질환이 양성 전립선 비대증(BPH)이다. 전립선비대증은 배뇨의 속도를 감소시키는 질환으로 40대 이후에 주로 발생하며 나이의 증가에 따라 비례하는 질환이다. 이 중 65세 이후의 남성에서 50% 이상이 증상이 동반된 전립선비대증을 가지고 있다. 전립선비대증에 의한 하부 요로증상의 발생은 삶의 질을 떨어뜨린다. 특히 잦은 야간 배뇨는 숙면을 취하기 어렵게 하며, 긴장을 초래하기도 하고, 운동을 제한시키며, 행복감을 심각하게 감소시킨다. 또한 방광 출구 폐색이 오래 지속되면 배뇨근의 수축력이 부적절해져 잔뇨량 증가, 요폐 등이 발생하고 이의 결과로 요로감염, 방광결석, 신부전 등의 합병증이 발생된다.
전립선 비대증의 원인인 분명하지 않으나 노화에 따른 성호르몬의 변화로 인한 전립선내 간질세포와 상피세포의 증식이 주된 특징이다. 혈중 테스토스테론의 농도는 노화에 따라 감소하나, 세포 내 5-알파 환원효소 억제제의 활성은 오히려 증가되어 테스토스테론에서 디히드로테스토스테론(DHT)으로 전환이 증가한다. DHT는 테스토스테론보다 강력하게 전립선에 작용하여 epidermal growth factor(EGF)와 fibroblastic growth factor(FGF) 등의 성장인자를 통해 전립선 세포의 증식을 유도한다.
전립선비대증의 치료방법은 내과적 치료와 수술적 치료 크게 2가지로 나눌 수 있다. 내과적 치료의 경우 경증 또는 중등도의 증상을 보이거나 수술적 치료가 불가능할 경우에 시행하는데 알파 아드레날린 수용체 차단제와 5-알파 환원효소 억제제가 대표적이다. 전립선 비대증의 증상 개선을 위해서는 이러한 약물을 지속적으로 복용해야 하는데, 이러한 합성 약물들은 교감신경억제로 인한 혈압강하, 현훈감, 빈맥 등의 부작용 및 다양한 성기능 장애가 보고되고 있다. 따라서, 이러한 합성 약물들을 대체할만한 안전하면서 효능이 과학적으로 입증된 천연물 유래의 약물의 필요성이 요구된다.
당귀(Angelica gigas)는 한국 및 중국 등지에서 서식하는 다년생 식물로, 꽃이 피기 전 당귀의 뿌리를 건조시켜서 약재로 사용해 왔으며, 그 성분으로 피라노쿠마린(pyranocoumarin) 화합물인 데커신(decursin), 푸라노쿠마린(furanocoumarin) 화합물인 노다케닌(nodakenin), 이소임페라토린(isoimperatorin), 마르메신(marmesin), 및 잔토아놀 (xanthoarnol) 등이 보고되어 있다. 이 중 데커신의 경우는 기억력 개선효과, 염증 억제, 전립선암 세포주에서 세포자연사 유도와 같은 효과가 보고되어 있으며(Kim et al. 2016), 특히 당귀의 에탄올추출물에 데커신이 존재하며 남성 불임(male infertility)에 대한 보호 효과(Bae et al. 2016), 염증 억제효과(Shin et al. 2010) 등이 있는 것으로 알려져 있다. 대한민국 등록특허 제10-1072175호에는 당귀의 유효성분인 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 혼합물이 배뇨장애 및 부종에 효과가 있다고 개시하고 있으나, 당귀 추출물에 대한 효과는 실질적으로 개시되어 있지 않다. 특히, 상기 대한민국 등록특허 제10-1072175호에서는 당귀와 상승 효과를 나타낼 수 있는 조합 가능한 천연물에 대해서는 전혀 언급되어 있지 않다.
이에, 본 발명자들은 부작용이 많은 합성 약물들을 대체할만한 안전하면서 효능이 과학적으로 입증된 천연물 유래의 의약품 또는 식품을 개발하기 위하여 연구한 결과, 당귀에 전립선과 관련된 효과가 전혀 알려져 있지 않던 녹용을 혼합한 결과 당귀 단독보다 현저히 우수한 전립선비대 상피세포인 BPH-1 세포의 증식억제 효과와 전립선비대 동물 모델에서 DHT의 감소 효과, 5-알파 환원효소의 감소 효과 및 전립선 크기의 감소 효과를 달성할 수 있음을 확인하였고, 나아가, 당귀 및 녹용의 혼합 추출물에 감초를 추가할 경우 당귀 및 녹용의 2종 혼합 추출물보다도 더 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 전립선비대 동물 모델을 통하여 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 전립선 비대의 예방, 개선 또는 치료용 혼합 생약 조성물을 제공하는 것을 해결과제로 하며, 유효성분으로 당귀 및 녹용의 혼합 추출물 또는 당귀, 녹용 및 감초의 혼합 추출물을 포함하는 전립선 비대의 예방, 개선 또는 치료용 혼합 생약 조성물을 제공하는 것을 구체적인 해결과제로 한다.
나아가, 본 발명은 2종 또는 3종 생약의 추출물이 약리학적으로 가장 우수한 상승 효과를 나타낼 수 있는 비율로 혼합된 혼합 추출물을 제공하는 것을 특별한 해결과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 하기와 같은 수단을 개시한다.
일 양태에서, 당귀 및 녹용의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개시한다.
본 발명에서의 녹용(Cervus elaphus)은 자라기 시작한지 2개월 된 사슴의 뿔을 약용으로 사용하는 것을 의미한다. 녹용은 일반적으로 수분을 5 내지 7%, 조단백질을 55 내지 62%, 조지방을 1 내지 2% 및 조회분을 27 내지 35% 함유하고 있으며, 무기물 조성으로는 칼슘, 인, 칼륨, 나트륨, 마그네슘, 철, 망간, 아연 등을 포함하고, 아미노산 조성에 있어서는 시스틴, 메티오닌 및 아스파르트산을 함유하는 것으로 알려져 있다.
상기 '당귀 및 녹용의 혼합 추출물'은 (i) 당귀와 녹용을 각각 추출하여 얻어진 당귀 추출물과 녹용 추출물을 혼합하는 방식, 및 (ii) 당귀와 녹용의 혼합물을 추출하는 방식으로 얻어지는 추출물을 모두 의미한다.
상기 당귀 및 녹용의 혼합 추출물 내의 당귀 및 녹용의 배합 중량비(w/w)는 1 내지 3 : 1, 바람직하게는 3 : 1인 것이 좋다.
다른 양태에서, 본 발명은 유효성분으로 당귀 및 녹용의 혼합 추출물에 감초 추출물을 추가로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개시한다.
본 발명에서의 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer)는 콩(Leguminosae)과에 속하는 다년생 초본으로 단맛 성분인 글리시리진을 함유하여 감미료로 사용되고 있으며, 여러 가지 질병에 대한 치료효과와 항균 작용 및 우수한 항산화능이 알려져 있다. 중독의 해독제로 이동되거나 진해거담제, 완화제 등으로 사용되며, 근육이나 조직의 급격한 긴장에 의한 통증 완화, 체중 증가, 백혈구 증가, 이뇨 작용, 항염 작용 등이 알려져 있다.
상기 '당귀, 녹용 및 감초의 혼합 추출물'은 (i) 당귀, 녹용 및 감초를 각각 추출하여 얻어진 당귀 추출물, 녹용 추출물 및 감초 추출물을 혼합하는 방식, 및 (ii) 당귀, 녹용 및 감초의 혼합물을 추출하는 방식으로 얻어지는 추출물을 모두 의미한다.
상기 당귀, 녹용 및 감초의 혼합 추출물 내의 당귀, 녹용 및 감초의 배합 중량비(w/w)는 1 내지 3 : 1 : 1, 바람직하게는 3 : 1 : 1인 것이 좋다.
상기 “배합 중량비(w/w)”는 단일 생약 추출물의 중량비 또는 추출 전 혼합물 내 단일 생약들의 중량비를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 혼합 추출물이 당귀, 녹용 및 감초 각각의 단일 생약의 추출물을 각각 제조한 후 2종 또는 3종 생약의 추출물을 혼합하는 방식으로 제조되는 경우, 당귀, 녹용 및 감초 각각의 단일 생약을 용매로 추출한 후 여과, 농축한 건조물의 중량비를 나타낸다. 또한, 당귀, 녹용 및 감초의 혼합물을 추출하는 단일 추출공정을 통해 제조되는 경우, 상기 혼합물에 포함된 당귀, 녹용 및 감초 각각의 단일 생약들의 중량비를 나타낸다.
여기서, 생약들의 혼합비가 상기 범위를 벗어나면 약리학적 효과를 나타낼 수 있는 성분의 추출 효율이 떨어져 기대하는 악리학적 효과가 감소되는 문제가 발생한다.
본 발명에 이용되는 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매를 이용하여 얻을 수 있다. 추출용매로는 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c) 아세트산, 또는 상기 극성 용매들의 혼합물을 포함한다. 비극성 용매로는 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 부틸아세테이트, 플루오로알칸, 헥산, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 상기 비극성 용매들의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물 또는 에탄올을 용매로 사용하여 수득한 것이다.
상기 에탄올은 순수 에탄올 용액뿐만 아니라 에탄올 수용액을 포함하는 것으로, 10 내지 70%(v/v), 바람직하게는 20 내지 60%(v/v), 보다 바람직하게는 약 25 내지 55%(v/v)의 에탄올 수용액일 수 있다. 바람직하게는, 50%(v/v) 에탄올 수용액이 이용될 수 있다.
본 발명의 추출물은 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 당귀, 녹용 및 감초의 2종 또는 3종 혼합 추출물은 상술한 용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제 과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것을 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 다른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 2종 또는 3종 혼합 추출물에 포함된다. 또한, 본 발명의 2종 또는 3종 혼합 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 당귀 및 녹용의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 개시한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 당귀, 녹용 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 개시한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 2종 생약의 혼합 추출물 제조단계는 건조 당귀를 상기 용매에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 물, 또는 10 내지 70%(v/v), 바람직하게는 20 내지 60%(v/v), 보다 바람직하게는 약 25 내지 55%(v/v)의 에탄올 수용액으로 추출하여 당귀 추출물을 얻는 단계;
건조 녹용을 상기 용매에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 물, 또는 10 내지 70%(v/v), 바람직하게는 20 내지 60%(v/v), 보다 바람직하게는 약 25 내지 55%(v/v)의 에탄올 수용액으로 추출하여 녹용 추출물을 얻는 단계; 및 상기 얻어진 당귀 추출물 및 녹용 추출물을 배합 중량비(w/w)로 1 내지 3 : 1, 바람직하게는 3 : 1로 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 3종 생약의 혼합 추출물 제조단계는 상기 2종 혼합 추출물 제조단계에서 상기 녹용 추출물을 얻는 단계 이후에 건조 감초를 상기 용매에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 물, 또는 10 내지 70%(v/v), 바람직하게는 20 내지 60%(v/v), 보다 바람직하게는 약 25 내지 55%(v/v)의 에탄올 수용액으로 추출하여 감초 추출물을 얻는 단계를 추가로 포함하며, 추출단계에서 얻어진 당귀 추출물, 녹용 추출물 및 감초 추출물을 배합 중량비(w/w) 기준으로 1 내지 3 : 1 : 1의 비율, 바람직하게는 3 : 1 : 1로 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 2종 생약의 혼합 추출물 제조단계는 건조 당귀 및 건조 녹용을 배합 중량비(w/w)로 1 내지 3 : 1, 바람직하게는 3 : 1로 혼합하는 단계; 및
상기 혼합 생약을 상기 용매에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 물, 또는 10 내지 70%(v/v), 바람직하게는 20 내지 60%(v/v), 보다 바람직하게는 약 25 내지 55%(v/v)의 에탄올 수용액으로 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 3종 생약의 혼합 추출물 제조단계는 상기 2종 생약 혼합 단계에 건조 감초를 추가할 수 있다.
보다 자세하게는, 생약(당귀, 녹용 및 감초 각각 또는 당귀와 녹용 혼합물 또는 당귀와 녹용과 감초 혼합물)에 상기 용매를 가하고 3 내지 10 시간 환류 추출하는데, 여기서 용매의 사용량은 생약 원료 중량의 5 내지 20배가 적당하며, 온도는 70 내지 100℃인 것이 좋다. 추출 후 여과하여 여과액을 모으고, 다시 잔사에 다시 약 5 내지 20배 중량의 용매를 가하여 3 내지 10시간 재추출하고 여과하여 이전의 여액과 혼합함으로써 추출 효율을 높일 수 있다. 이와 같이 2차에 걸친 추출 및 각각의 추출 후 얻어진 여과액을 혼합함으로써 추출 효율을 높일 수 있으나, 본 발명의 추출물이 추출 회수에 한정되는 것은 아니다.
상기 생약 추출물 제조시 사용되는 용매의 양이 너무 적으면 교반이 어렵게 되고 추출물의 용해도가 낮아져 추출효율이 떨어지게 되고, 지나치게 많은 경우는 다음의 정제단계에서 사용되는 저급 알코올의 사용량이 많아져 경제적이지 못하여 취급상 문제가 발생할 수 있으므로, 용매의 사용량은 상기 범위로 하는 것이 좋다.
본 발명의 바람직한 예에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택할 수 있는데, 이는 생약 추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 내지 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌고, 3차 이상의 다단계 추출은 경제성이 없는 것으로 판단된다.
상기와 같이 1, 2차에 걸쳐 용매로 추출하여 얻은 추출액은 최종 여과단계를 거친 후 40 내지 70 ℃로 감압 농축하여 추출물 총량의 1/2 내지 1/10 중량으로 농축시킨 후 분무건조시킴으로써 분말상태의 생약 추출물로서 제조될 수 있다.
본 발명에 사용된 추출 방법은 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예컨대, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 초고압 추출 또는 환류 냉각 추출법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물 내의 유효성분으로서의 혼합 추출물의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 10 내지 100 중량%, 바람직하게는 50 내지 70 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예컨대, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여)할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 첨가제(예를 들어, 담체, 부형제, 결합제, 활택제 등)를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 mg/kg 범위 내이다. 또한 인체 내 투여량은 동물실험을 근거로 환산할 수 있다(Shin et al., J Korean Oriental Medicine 31(3):1-7, 2010).
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food), 식품 첨가제(food additives) 등의 형태를 포함한다. 이때 본 발명의 식품 조성물은 전립선 비대증 예방 또는 개선 작용을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다.
상기 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물 유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 상기 2종 또는 3종 혼합 추출물 또는 분획물을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 2종 또는 3종 혼합 추출물 또는 분획물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 상기 2종 또는 3종 혼합 추출물 또는 분획물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 상기 2종 또는 3종 혼합 추출물 또는 분획물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 2종 또는 3종 혼합 추출물 또는 분획물과 전립선 비대증 예방 또는 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 전립선 비대증 예방 또는 개선용 조성물이 건강음료 조성물로 이용되는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에 따른 혼합 생약 조성물은 전립선 비대증의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낸다. 보다 특별하게는, 전립선비대 상피세포인 BPH-1 세포의 증식을 효과적으로 억제하고 DHT level 및 5-알파 환원효소의 작용을 감소시킴으로써 궁극적으로 비대화 된 전립선 크기를 감소시켜 전립선 비대증의 예방 또는 치료제 또는 개선제로서 유용하게 활용될 수 있다. 특히, 현재 처방되고 있는 합성 약물과 달리 지속적으로 복용하더라도 혈압강하, 현훈감, 빈맥 등의 부작용이 발생하지 않아 환자의 복약 순응도를 개선할 수 있는 특별한 효과가 있다.
도 1은 당귀의 열수추출물(A)과 50% 에탄올 추출물(B)의 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 녹용의 열수추출물(A)과 50% 에탄올 추출물(B)의 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 감초의 50% 에탄올 추출물의 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 당귀(A), 녹용(B) 및 감초(C)의 50% 에탄올 추출물의 BPH-1 세포에서 Bcl-2 및 Bax 발현량 측정 결과이다.
도 5는 당귀 및 녹용의 열수 추출물의 혼합물(A)과 50% 에탄올 추출물의 혼합물(B)의 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 당귀 및 녹용의 50% 에탄올 추출물의 혼합 비율 1 : 1(A), 3 : 1(B), 1 : 3(C)에 따른 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 당귀 및 녹용의 50% 에탄올 추출물의 혼합 비율 3 : 1에 따른 BPH-1 세포에서 Bcl-2 및 Bax 발현량 측정 결과이다.
도 8은 혼합 추출물 투여 후 혈액 및 전립선조직에서 DHT 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 혼합 추출물 투여 후 혈액에서 테스토스테론 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 혼합 추출물 투여 후 전립선비대 유발 모델의 전립선 조직에서의 5- 알파 환원효소 1, 2 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 혼합 추출물 투여 후 혈액에서 PSA의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 혼합 추출물 투여 후 전립선조직의 병리학적 변화를 촬영한 사진이다.
도 13은 혼합 추출물 투여 후 전립선조직에서 bax, bcl-2 등의 세포고사인자의 mRNA 변화를 측정한 그래프이다.
도 14는 혼합 추출물 투여 후 전립선 조직에서 bax 및 bcl-2 발현량을 측정한 결과이다.
도 2는 녹용의 열수추출물(A)과 50% 에탄올 추출물(B)의 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 감초의 50% 에탄올 추출물의 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 당귀(A), 녹용(B) 및 감초(C)의 50% 에탄올 추출물의 BPH-1 세포에서 Bcl-2 및 Bax 발현량 측정 결과이다.
도 5는 당귀 및 녹용의 열수 추출물의 혼합물(A)과 50% 에탄올 추출물의 혼합물(B)의 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 당귀 및 녹용의 50% 에탄올 추출물의 혼합 비율 1 : 1(A), 3 : 1(B), 1 : 3(C)에 따른 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 당귀 및 녹용의 50% 에탄올 추출물의 혼합 비율 3 : 1에 따른 BPH-1 세포에서 Bcl-2 및 Bax 발현량 측정 결과이다.
도 8은 혼합 추출물 투여 후 혈액 및 전립선조직에서 DHT 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 혼합 추출물 투여 후 혈액에서 테스토스테론 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 혼합 추출물 투여 후 전립선비대 유발 모델의 전립선 조직에서의 5- 알파 환원효소 1, 2 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 혼합 추출물 투여 후 혈액에서 PSA의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 혼합 추출물 투여 후 전립선조직의 병리학적 변화를 촬영한 사진이다.
도 13은 혼합 추출물 투여 후 전립선조직에서 bax, bcl-2 등의 세포고사인자의 mRNA 변화를 측정한 그래프이다.
도 14는 혼합 추출물 투여 후 전립선 조직에서 bax 및 bcl-2 발현량을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1. 당귀 추출물의 제조
참고예 1-1. 열수 추출물의 제조
당귀(Angelica gigas) 1kg에 물 10L를 가하여 98℃에서 8시간 추출하고 상온냉각시킨 후 25마이크로필터로 여과하였다. 이렇게 얻어진 추출액은 50℃에서 감압농축하여 추출액 총량의 약 1/3중량의 농축물을 얻었고 분무건조하여 당귀 열수추출물을 제조하였다.
참고예 1-2. 에탄올 추출물의 제조
상기 참고예 1-1의 물을 50% 에탄올로 하고 85℃에서 추출하는 것을 제외하고, 상기 참고예 1-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하였다.
참고예 2. 혼합 추출물 후보(녹용, 감초)의 제조
참고예 2-1. 열수 추출물의 제조
상기 참고예 1-1의 당귀를 녹용으로 하는 것을 제외하고, 상기 참고예 1-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하였다.
참고예 2-2. 에탄올 추출물의 제조
상기 참고예 1-2의 당귀를 녹용 또는 감초로 하는 것을 제외하고, 상기 참고예 1-2와 동일한 방법으로 추출물을 제조하였다.
[
In vitro
실험 방법 및 조건]
A. 세포 배양
- 인간 전립선 비대증 세포주(Human benign prostatic hyperplasia cell line)인 BPH-1을 사용하였으며, 소태아혈청(fetal bovine serum) 10%, 1% penicillin/streptomycin를 함유한 RPMI 1640에서 배양하였다. 배양조건은 37 ℃5% CO2, 95% humidity atmosphere로 조성하였다.
B. BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과 측정 방법
- BPH-1 세포를 96 well plate에 8500 cells/well로 시딩(seeding)하고, 세포가 착상한 후 시료를 넣고 48시간 동안 배양한 다음, 5 mg/mL의 MTT 시약(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States)을 가하였다. 2시간 후 배지를 걷어내고 PBS로 1회 세척한 다음 100 μL의 DMSO를 넣어 형성된 포르마잔(Formazan)을 녹인 후 570 nm에서 측정하였다.
- 세포 생존능(Cell viability)는 대조군(control)을 100%로 하여 상대값을 계산하여 나타내었다.
C. BPH-1 세포에서 면역 블로팅(Immunoblotting)
- BPH-1 세포를 대상으로 Bax 및 Bcl-2의 발현을 검토하기 위하여 면역 블로팅을 시행하였다. 전립선 조직을 균질화하고 3000 rpm에서 6분간 원심분리하여 상등액을 수거하고 Bradford 법으로 단백질을 정량하였다. 각 군간 50 μg 단백질(protein)을 기준으로 SDS gel에 전기영동하고, 웨스턴 블랏(Western blot)을 시행하였다. 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 transfer 한 후 5% 스킴 밀크(skim milk)로 4℃에서 16시간 동안 블로킹(blocking)을 시행하였으며, 각각의 항체(antibody)로 진행하고 X-ray film에 현상하였다.
- 상기 항체는 다음과 같다; Bcl-2(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, United States)와 Bax(Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, United States) 모두 1:1000으로 희석하여 사용하였다.
실험예 1.
단일 생약 추출물의
BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과
참고예 1 및 2에서 제조된 당귀, 녹용 및 감초의 열수추출물과 50% 에탄올 추출물을 상기 [In vitro 실험 방법 및 조건]의 B에 기재된 것처럼 진행하여 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과를 계산하였으며, 그 결과를 도 1 내지 3에 나타내었다.
도 1의 결과를 보면, 당귀의 열수추출물 및 50% 에탄올 추출물 모두 유의적인 세포 생존능 감소를 보였으며(P<0.05), 특히 당귀 50% 에탄올추출물의 경우 농도의존적으로 감소하여 0.5 mg/mL에서는 약 30%, 1 mg/mL의 농도에서는 약 70%의 세포 생존능의 감소를 보였다.
당귀와 혼합할 생약 후보인 녹용에 대한 도 2의 결과를 보면, 녹용의 열수추출물 및 50% 에탄올 추출물 모두 유의적인 세포 생존능 감소를 보였다.(P<0.05)
또 다른 생약 후보인 감초에 대한 도 3의 결과를 보면, 감초의 50% 에탄올추출물의경우도 0.5 mg/mL 농도 이상에서는 약 30%의 세포 생존능 감소를 보였다.
실험예 2.
단일 생약 추출물의
BPH-1 세포에서
Bcl-2 및 Bax 발현량 측정
실험예 1을 통해 3가지 생약의 50% 에탄올 추출물이 세포 생존능이 더 효과적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 전립선비대의 억제 효과를 추가로 확인하기 위해 상기 [In vitro 실험 방법 및 조건]의 C에 기재된 것처럼 진행하여 BPH-1 세포에서 세포고사와 관련된 Bcl-2 및 Bax 발현량을 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
세포고사 현상은 전립선의 항상성을 유지하는데 필수적인 과정이며, 비후된 전립선 상피조직에서 정상조직 보다 덜 일어나게 된다. DHT는 전립선 내의 세포고사를 저지하는 요인이며, 세포고사를 억제하는 bcl-2가 전립선 상피에서 증가하여 전립선 성장을 유발한다. 도 4의 결과를 보면, 녹용 50% 에탄올 추출물(A)의 경우 농도가 증가함에 따라 bax가 증가하고 bcl-2가 감소하였으며, 당귀 50% 에탄올 추출물(C)의 경우 Bax가 감소하는 것으로 보이나 bax/bcl-2의 비율로 볼 때는 bax가 유지되었다.
상기 in vitro 실험 결과를 종합하여, BPH-1 세포에서 세포증식을 억제하는 동시에 항상성 유지에도 필수적인 세포고사와 관련된 bcl-2를 감소시키는 효과를 나타낸 녹용을 당귀와 혼합할 생약으로 선정하였다.
실시예 1. 당귀 및 녹용의 추출물의 혼합물의 제조
실시예 1-1. 열수 추출물의 제조
참고예 1-1에서 제조된 당귀 열수추출물과 참고예 2-1에서 제조된 녹용 열수추출물을 배합 중량비(w/w) 1 : 1로 혼합하여 당귀 및 녹용의 열수 추출물의 혼합물을 제조하였다.
실시예 1-2. 50% 에탄올 추출물의 제조
참고예 1-2에서 제조된 당귀 50% 에탄올추출물과 참고예 2-2에서 제조된 녹용 50%에탄올 추출물을 배합 중량비(w/w) 1 : 1의 비율로 혼합하여 당귀 및 녹용의 50% 에탄올 추출물의 혼합물을 제조하였다.
실험예 3.
당귀 및 녹용의
혼합 추출물의
BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과
실시예 1에서 제조된 당귀 및 녹용의 열수추출물의 혼합물과 50% 에탄올 추출물의혼합물을 상기 [In vitro 실험 방법 및 조건]의 B에 기재된 것처럼 진행하여 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과를 계산하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 결과를 보면, 당귀 및 녹용 열수 추출물을 혼합한 경우 대조군에 비해 유의적으로 낮아지기는 하였으나, 50% 에탄올 추출물을 혼합한 경우에 비해서는 세포 생존능이 여전히 높은 상태였다. 50% 에탄올 추출물을 혼합한 경우에는 0.2 mg/mL 이상에서는 40-50%의 세포 생존능의 감소를 보이는 것으로 나타났다.
실시예 2. 당귀 및 녹용의 다양한 혼합 비율 추출물의 제조
상기 실험예 3의 결과에서 당귀 및 녹용의 50% 에탄올 추출물을 혼합한 경우에 세포 생존능이 유의적으로 감소함을 확인하고, 최적의 혼합 비율을 찾기 위해 참고예 1-2에서 제조된 당귀 50% 에탄올 추출물과 참고예 2-2에서 제조된 녹용 50% 에탄올 추출물을 배합 중량비(w/w) 3 : 1, 1 : 3의 비율로 혼합하여 추출물의 혼합물을 제조하였다.
실험예 4.
혼합 비율별 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과
실시예 1-2에서 제조된 1 : 1 비율의 혼합 추출물(A), 실시예 2에서 제조된 3 : 1(B) 및 1 : 3(C) 비율의 혼합 추출물을 상기 [In vitro 실험 방법 및 조건]의 B에 기재된 것처럼 진행하여 BPH-1 세포에서 세포증식억제 효과를 계산하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6의 결과를 보면, 당귀 대 녹용이 1 : 3인 경우에는 세포 생존능이 감소하는 경향은 있었으나 그 범위가 30%로 내로 크지 않았지만, 당귀 대 녹용이 1 : 1인 경우와 3 : 1인 경우는 모두 세포 생존능이 크게 감소하는 것으로 나타났다. 특히, 3 : 1인 경우는 0.5 mg/mL의 농도에서 50%에 가까운 감소 효과를 보였는데, 녹용 단독의 에탄올 추출물의 경우 세포 생존능 감소 효과가 거의 나타나지 않았음을 고려하면 이는 당귀에 녹용을 조합함으로써 예상치 못한 시너지 효과가 발생하였음을 의미한다.
실험예 5. 당귀 및 녹용의 추출물을 3 : 1 비율로 혼합한 추출물의 BPH-1 세포에서
Bcl-2 및 Bax 발현량 측정
상기 실험예 4에서 우수한 효과를 나타낸 당귀 및 녹용의 추출물을 3 : 1 비율로 혼합한 추출물을 상기 [In vitro 실험 방법 및 조건]의 C에 기재된 것처럼 진행하여 BPH-1 세포에서 세포고사와 관련된 Bcl-2 및 Bax 발현량을 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7의 결과를 보면, bax가 증가하며 bcl-2는 대조군에 비해 감소하는 것으로 나타났다.
실시예 3. 당귀 및 녹용의 혼합 50% 에탄올 추출물의 제조
In vivo 테스트에 앞서, 건조 당귀 및 건조 녹용을 3 : 1 배합 중량비(당귀 750g, 녹용 250g)로 혼합하고 이에 50% 에탄올 10L를 가하여 85℃에서 8시간 추출하고 상온냉각시킨 후 25마이크로필터로 여과하였다. 이렇게 얻어진 추출액은 50℃에서 감압농축하여 추출액 총량의 약 1/3중량의 농축물을 얻었고 분무건조하여 2종 생약 혼합 50% 에탄올 추출물을 제조하였다
실시예 4. 당귀, 녹용 및 감초의 혼합 50% 에탄올 추출물의 제조
In vivo 테스트에 앞서, 실험예 1의 도 3에서 0.5 mg/mL 농도 이상에서는 약 30%의 세포 생존능 감소를 보인 감초를 추가하여 3종 생약 혼합 50% 에탄올 추출물을 제조하였다. 구체적으로, 당귀, 녹용, 감초를 3 : 1 : 1 배합 중량비(당귀 600g, 녹용 200g, 감초 200g)로 혼합하고 이에 50% 에탄올 10L를 가하여 85℃에서 8시간 추출하고 상온냉각시킨 후 25마이크로필터로 여과하였다. 이렇게 얻어진 추출액은 50℃에서 감압농축하여 추출액 총량의 약 1/3중량의 농축물을 얻었고 분무건조하여 3종 생약 혼합 50% 에탄올 추출물을 제조하였다.
[
In vivo
연구방법]
I. 실험동물의 관리 및 전립선비대의 유도
- 7주령의 웅성 Sprague Dawley 래트를 분양받아(Samtako Inc., Osan, Korea) 사용하였으며, 정상대조군인 대조군(Control)을 제외한 나머지 실험군은 1주일의 적응기를 거친 후에 전립선비대모델 구축을 위해 거세(castration)을 실시하였다.
- 실험동물의 사육환경은 온도 23 ± 2 ℃상대습도 55 ± 5%, 명암교대는 약 12시간으로 하였으며 사료와 물은 자유로이 섭취하게 하였다.
- 실험동물은 사육상자 당 2마리씩 수용하였으며 무게측정과 베딩교환은 3일에 한번씩 실시하여 관리하였다. 실험동물은 일주일의 안정화기간을 거쳐서 실험에 사용되었다.
- 일주간의 안정화 기간 후 고유의 테스토스테론(intrinsic testosterone)의 영향을 배제하기 위하여 거세를 시행하였다. 간단히 설명하자면, 배면이 수술자를 향하게 눕여 고정하고 음낭 끝 부위의 피부를 절개하여 좌우 고환 및 부고환을 잘라낸 후 절개면을 봉합하여 수술을 실시하였다. 본 거세술은 식약처의 수컷 성선비대반응시험법을 참고하여 시행하였다.
- 수술을 시행하고 10일 동안 안정화를 시켜 수술부위의 상처를 아물게 하였다. 이후 수술된 래트(castrated rat)에 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate, TP)를 투여하여 실험을 개시하였다.
- 개시 시점의 래트의 몸무게는 250-300 g 범위에 있었으며, 수술하지 않은 대조군을 포함하여 10마리를 한 군으로 총 7그룹으로 시료 경구투여에 맞도록 군을 나누었다. 실험동물은 사육상자 당 2마리 이하로 수용되었으며, 다른 군끼리 한 사육상자에 있지 않도록 배려하여 배치하였다.
- 각 그룹 중 대조군을 제외하고 나머지 실험동물은 전립선비대 유도를 위하여 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate, TP)를 3 mg/kg body weight/day로 주입(injection) 하였다. 실험의 오차를 최소화 하기 위하여 3일마다 측정된 실험동물의 무게를 기준으로 총 주입 부피(injection volume)은 100 ㎕가 되도록 콘 오일(corn oil)에 녹여 사용하였다.
- 대조군은 TP없이 corn oil만을 100 ㎕씩 주입하였다. 물과 사료는 자유섭취 하도록 하였으며 시료는 농도별로 군을 나누고 매일 경구투여하고 8주 동안 시행하였다.
II. 동물실험 디자인
- 실험에 사용된 혼합 추출물은 총 2가지로 샘플 A의 경우 실시예 3에서 제조된 당귀 및 녹용의 3 : 1 혼합 50% 에탄올 추출물이며, 샘플 B의 경우 실시예 4에서 제조된 당귀, 녹용 및 감초의 3 : 1 : 1 혼합 50% 에탄올 추출물이다. 이와 같은 2가지 혼합 추출물을 경구 투여 하였으며 양성대조군으로는 쏘팔메토를 100 mg/kg bw/day로 경구투여하였다.
- 상기와 같이 수술된 실험동물을 대상으로 8주간 TP를 투여하는 동시에 A와 B 2종의 혼합 추출물을 50 및 200 mg/kg BW/day의 농도별로 경구투여하여 진행한 동물실험의 각 군은 다음의 표 1과 같다(n=10): (A) Control; 콘 오일을 주입하고 생리식염수급여, (B) BPH group; TP(3 mg/kg body weight/day) 주입하고 생리식염수 급여, (C) A Low; TP(3 mg/kg body weight/day) 주입 및 샘플 A을 50 mg/kg body weight/day로 경구투여, (D) A High; TP(3 mg/kg body weight/day) 주입 및 샘플 A을 200 mg/kg body weight/day로 경구투여, (E) B Low; TP(3 mg/kg body weight/day) 주입 및 샘플 B를 50 mg/kg body weight/day로 경구투여, F) B High; TP(3 mg/kg body weight/day) 주입 및 샘플 B를 200 mg/kg body weight/day로 경구투여 G) Saw Palmetto; TP(3 mg/kg body weight/day) 주입 및 쏘팔메토 100 mg/kg body weight/day로 경구투여 한 그룹으로 나누었다.
- 대조군을 제외하고는 모두 BPH가 유도되었으며, 식이와 음수는 8주간 자유공급하였다. 실험기간 동안 식이 섭취량과 체중은 3일마다 일정한 시간에 측정하였다.
- 동물실험은 수원대학교 동물실험윤리 위원회의 승인을 받아 관리지침에 따라 수행하였다(USW-IACUC-2019-003).
| 군 | TP 주입 | experiment |
| 대조군 | 콘 오일 | 일반 래트 |
| BPH | TP(3 mg/kg BW/day) | 수술된 래트 |
| A Low | TP(3 mg/kg BW/day) | 수술된 래트에 샘플 A을 50 mg/kg BW/day로 경구투여 |
| A High | TP(3 mg/kg BW/day) | 수술된 래트에 샘플 A을 200 mg/kg BW/day로 경구투여 |
| B Low | TP(3 mg/kg BW/day) | 수술된 래트에 샘플 B를 50 mg/kg BW/day로 경구투여 |
| B High | TP(3 mg/kg BW/day) | 수술된 래트에 샘플 B를 200 mg/kg BW/day로 경구투여 |
| 쏘팔메토 | TP(3 mg/kg BW/day) | 수술된 래트에 쏘팔메토 100 mg/kg BW/day로 경구투여 |
- 실험기간 동안 실험동물의 체중 증가량은 주 2회씩 일정 시간 전에 측정하여 기록하였으며, 실험동물의 무게는 거세를 시행한 후 10일 간 회복기를 거쳐 측정된 몸무게를 최초 몸무게로 하였다.
- 실험동물의 식이 역시 매주 2회 급여와 잔여량을 측정하여 기록하고 식이효율(Food efficiency ratio, FER)을 산출하는 것에 사용하였다.
- 8주 동안 전립선비대유도 및 시료 경구투여를 시행하고 희생 전날 오버나잇 절식을 실시하고 희생 전 마지막 무게를 측정하였다.
- 실험동물의 무게는 실험개시 시점과 마지막 무게차이를 전체 증체량(Weight gain)으로 계산하였으며, 그 결과는 다음의 표 2와 같다.
증체량(Weight gain, g)= 최종 몸무게(Final body weight, g)- 최초 몸무게(Initial body weight, g)
| 군 | 최초 몸무게 | 최종 몸무게 | 증체량 | 음식 섭취량 | FER |
| 대조군 | 374.61±7.57 | 536.07±16.49 | 161.46±12.19 | 1316.49±13.57 | 0.12±0.01 |
| BPH | 322.66±8.34 | 442.58±10.38 | 119.92±8.18 | 1211.48±9.48 | 0.10±0.01 |
| A Low | 344.26±5.36 | 452.68±7.94 | 108.42±5.54 | 1237.03±18.51 | 0.09±0.00 |
| A High | 358.00±7.30 | 468.07±12.63 | 110.07±5.74 | 1267.04±9.88 | 0.09±0.00 |
| B Low | 332.97±4.88 | 442.93±9.99 | 109.95±6.74 | 1251.54±11.67 | 0.09±0.00 |
| B High | 357.69±6.35 | 465.48±13.59 | 107.79±10.97 | 1273.32±15.80 | 0.08±0.01 |
| 쏘팔메토 | 345.46±7.78 | 472.03±14.44 | 126.57±9.14 | 1261.15±17.74 | 0.10±0.01 |
- 대조군과 전립선비대 유발군인 BPH군은 유의적 차이가 있는 것으로 나타났으나, BPH군과 나머지 군과의 유의적 차이는 나타나지 않았다. 체중변화와 전립선비대는 에스트로겐-테스토스테론 비율 변화에 따라 비만도가 증가하면 영향이 있다고 생각되기는 하나 항상 유의적인 결과로 보고되고 있지는 않다.
- 테스토테론으로 전립선비대를 유도한 랫 모델에서 거세를 시행하지 않은 정상대조군과 비교하여 BPH군의 체중은 유의적 차이가 없거나 유의적으로 낮은 것으로 보고된 경우가 많으며, 쏘팔메토를 처리한 양성대조군의 경우는 BPH군과 유의적 차이가 없는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서 나타난 실험동물의 체중 차이는 다른 전립선비대 유도 동물실험과의 결과와 유사한 결과이다.
III. serum ALT 및 AST 측정
- 실험동물의 혈액을 수집하여 원심분리한 후 혈청(serum) 부분을 수집하여 분석에 사용하였다. 혈청에서의 아스파르테이트아미노전달효소(aspartate aminotransferase, AST)와 알라닌아미노전달효소(alanine aminotransferase, ALT)의 분석은 아산제약(Asan, Seoul, Korea)의 kit를 이용하여 측정하였으며, 표준곡선에 따라 Karmen 단위로 표기하여 비교하였다.
- 실험동물을 희생하고 수집된 간을 실험동물의 체중 100 g 당으로 계산한 간 지수(liver index)는 다음의 표 3과 같다.
| 군 | Liver (mg/100g of BW) |
AST | ALT |
| 대조군 | 3.23±0.08 | 97.50±7.78 | 53.50±6.78 |
| BPH | 3.26±0.08 | 112.40±9.25 | 53.50±4.68 |
| A Low | 3.41±0.08 | 116.22±9.92 | 64.33±6.12 |
| A High | 3.50±0.08 | 103.56±16.23 | 54.33±10.69 |
| B Low | 3.37±0.09 | 102.20±7.08 | 57.00±5.12 |
| B High | 3.12±0.11 | 112.60±12.64 | 44.70±6.51 |
| 쏘팔메토 | 3.26±0.06 | 124.10±10.56 | 59.10±5.80 |
- 각 군의 간 지수를 비교한 결과, 모든 군은 BPH군과 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다. 희생 시 수집된 혈액에서 분리한 혈청으로부터 ALT 및 AST를 측정한 결과 대조군과 BPH군은 각 ALT 및 AST 모두에서 유의적 차이가 없는 것으로 나타났으며, 샘플 A의 저농도 및 고농도, 샘플 B의 저농도 및 고농도 모두에서 유의적 차이가 나타나지 않았다. AST 및 ALT는 안전성지표로 이 두 지표의 혈중 수치는 볼 때, 각 샘플군에서 독성이 나타나지 않았다는 것을 의미한다.
IV. 혈중 지질측정 (TC, TG, LDL, HDL)
- 실험동물을 희생시켜 혈액을 채취한 후 원심분리 한 혈청(serum)을 이용하여 아산제약 enzyme assay kit(Asan, Seoul, Korea)를 사용하여 총 콜레스테롤(TC), 트리글리세리드 (TG), HDL(High density lipoprotein cholesterol)을 측정하였고, 주어진 아래 계산식에 의해 LDL(Low density lipoprotein cholesterol)의 농도를 산출하였다.
- 실험동물 희생 시 수집되어 분리된 혈청으로부터 TG, TC, HDL 이 측정하였으며, 각 값을 이용하여 LDL 콜레스테롤 값을 계산한 결과는 다음의 표 4와 같다.
| 군 | TG (mg/dl) |
총 콜레스테롤 (mg/dl) |
HDL (mg/dl) |
LDL (mg/dl) |
| 대조군 | 323.70±15.85 | 116.70±2.79 | 47.50±3.06 | 13.90±3.94 |
| BPH | 263.30±27.06 | 98.40±6.27 | 35.80±5.63 | 20.86±3.63 |
| A Low | 215.70±18.68 | 90.70±3.09 | 30.20±1.69 | 20.76±2.96 |
| A High | 218.20±19.09 | 94.90±3.44 | 30.40±2.10 | 23.56±3.84 |
| B Low | 228.10±13.35 | 100.70±2.67 | 31.40±1.21 | 23.68±2.61 |
| B High | 217.50±18.14 | 88.70±2.72 | 23.70±2.47 | 21.50±4.36 |
| 쏘팔메토 | 173.40±14.71 | 94.30±4.33 | 23.50±1.96 | 36.21±4.41 |
- BPH군과 대조군은 TG와 TC, LDL에서 유의적인 차이를 보이고 있지 않으나 HDL에서 대조군이 유의적으로 높은 것으로 나타났다. 샘플 A 및 샘플 B 모두 BPH 군과 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다.
- 본 연구결과에서는 전립선비대유발모델과 대조군에서 지질 프로파일의 주목할 만한 유의적 차이는 없는 것으로 나타났으며, 각 샘플의 영향도 없는 것으로 확인되었다.
실험예 6. 전립선유발동물모델에서 전립선 무게 측정 결과
- 실험 개시 8주 경과 후, 실험동물은 CO2 gas를 이용하여 희생시킨 후 복부를 절개하여 심장채혈을 실시하였다. 수집된 혈액은 실온에 30분간 정치한 후, 3,000rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하였으며, 간과 전립선은 적출하여 PBS에 1회 세척한 후 물기를 가볍게 제거하여 무게를 측정하고 기록하였다.
- 적출된 전립선은 분석을 위하여 용도별로 처리한 후 -80℃에 보관되었다. 전립선의 무게는 실험동물의 100 g body weight에 대한 mg으로 계산하여 표기하였다. 그 결과는 다음의 표 5와 같다.
| 군 | 전립선 무게 (g) | 전립선 비율* (mg/100g of BW) |
| 대조군 | 0.64±0.03 | 0.12±0.01 |
| BPH | 0.98±0.07 | 0.24±0.02 |
| A Low | 0.97±0.05 | 0.22±0.01 |
| A High | 0.92±0.05 | 0.20±0.01 |
| B Low | 0.86±0.04 | 0.20±0.01 |
| B High | 0.88±0.66 | 0.19±0.01 |
| 쏘팔메토 | 0.99±0.05 | 0.22±0.01 |
* 전립선 비율(prostate ratio) : 전립선 무게(mg) / 몸 무게(mg) * 100(g)
- 전립선건강의 기능성을 시험하기 위한 바이오마커의 선정 중에서 전립선의 크기는 성장인자에 관련된 중요한 지표이며 동물실험과 인체적용실험에서만 측정가능한 마커이다. 동물실험에서 전립선의 크기는 실험종료 시점의 전립선의 무게를 측정하며, 인체적용시험의 경우는 환자의 초음파를 이용하여 크기를 측정한다.
- 대조군에 비하여 전립선비대를 유발한 모든 군이 유의적인 증가를 보였다. 전립선비율(Prostate ratio)를 보면 대조군에 비하여 BPH군은 두 배 증가하였으며, 샘플 급여군에서는 B High 군에서 전립선비대군인 BPH군과 비교하여 약 21%의 유의적 감소를 보였다.
실험예 7. 혈액 및 전립선조직에서 DHT의 측정 결과
- 혈청(serum)에서의 DHT는 ELASA assay kit(BioVendor, Brno, Czech Republic)로 측정되었다. 구체적으로, 혈장 50㎕을 goat-anti-rabbit antibody가 미리 코팅된 96well microplate에 HRP-conjugated DHT와 DHT-specific antibody와 함께 1시간동안 실온에서 쉐이킹 인큐베이션(shaking incubation)을 실시하였다.
- 인큐베이션 후 기질 용액을 첨가하고 15분 후 황산용액으로 반응을 멈춘 후 450 nm에서 10분이내에 시료별 차이를 측정하였으며, 그 결과는 도 8. A에 나타내었다. 측정값의 계산은 DHT 기준액으로 그린 표준 그래프를 이용하였으며 단위는 pg/mL로 표기하였다.
- 전립선조직에서의 DHT 측정을 위하여 조직무게 4배의 pH 7.4의 PBS를 넣고 균질화한 후 4 ℃5000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상등액을 취하여 혈액에서와 동일한 방법으로 DHT를 측정하였으며, 그 결과는 도 8. B에 나타내었다.
도 8. A의 결과를 보면, 대조군에 비하여 BPH군의 DHT 레벨이 297.03 pg/mL에서 1716.57 pg/mL로 5배 이상 유의적 증가를 보였으며, 샘플 A, B 급여군은 DHT 레벨이 감소하는 경향을 보였다. 이 중 B high군은 1266.06 pg/mL로 30% 이상의 유의적 감소를 보였다.
또한, 도 8. B의 결과를 보면, 대조군에 비하여 BPH군이 118.99 pg/mL에서 685.18 pg/mL로 증가하였으며, B high군에서 469.75 pg/mL로 32% 유의적 감소를 보였다.
이와 같은 혈액 및 전립선조직에서의 DHT 감소는 5-알파 환원효소 활성의 억제를 의미하며, 그 결과 전립선 세포의 증식을 억제하여 전립선 크기가 억제될 수 있음을 의미한다.
실험예 8.
혈액에서 테스토스테론의 측정
혈중 테스토스테론의 측정은 DHT와 동일하게 혈청(serum)에서 테스토스테론 ELASA assay kit(Arbor Assays, Michigan, United States)를 통하여 측정되었으며, 그 결과는 도 9에 나타내었다. 측정값은 테스토스테론 스탠다드로 측정된 그래프를 이용하여 계산하였다. 단위는 pg/mL로 표기하였다.
도 9의 결과를 보면, T 레벨의 경우 혈청 T값의 경향은 DHT 레벨과 유사하였으며 BPH군과 비교하여 15% 감소, 조직에서 T 레벨의 경우도 B high군에서 5% 유의적으로 낮게 나타났다. 이에 반해, 쏘팔메토군의 경우 DHT 및 T 레벨이 BPH군과 비교하여 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다.
실험예 9. 5-알파 환원효소(alpha reductase) 1, 2 측정
수집된 전립선조직을 균질화하여 5-알파 환원효소 1, 2를 측정하였으며, 그 결과는 도 10에 나타내었다. 측정은 5- 알파 환원효소 2 ELASA kit(Cusabio, Wuhan, Hubei, China)를 이용하여 시행하였다. 구체적으로, 전립선조직 100mg을 1 X PBS 1mL에 균질화 한 후, -20℃에 냉동하여 오버나잇(overnight) 하였고, 2번의 동결융해(freeze-thaw) 사이클을 거쳐 세포막(cell membranes)이 파괴된 파쇄액(homogenate)를 얻어낸 후 5000 xg에서 5분간 원심분리한 상등액을 이용하여 분석하였다. 5-알파 환원효소 2는 실험동물의 혈청(serum)을 분리하여 사용하였다.
도 10의 결과를 보면, 5-환원효소 1의 경우 대조군에 비하여 BPH군에서 200배 이상의 증가를 보이는데 반해, 샘플 A 및 B 투여군에서 모두 감소하는 경향을 보였다. 또한, 5-알파 환원효소2의 경우 대조군에 비하여 BPH군에서 약 7배 증가하였는데 반해, B High군에서 119.58pg/mL로 204.85 pg/mL의 BPH군에 비해 42% 유의적 감소를 보였다. 이것은 본 출원의 혼합 추출물이 5-알파 환원효소2를 유의적으로 억제함을 의미하고, 이러한 효소 억제 효과는 앞선 실험예 7에서 확인한 DHT의 감소와 연계될 수 있다.
실험예 10. 혈액에서 전립선 특이항원(Prostate Specific Antigen, PSA)의 측정
분리된 실험동물의 혈청에서 PSA를 측정하였으며, 그 결과는 도 11에 나타내었다. 측정은 PSA ELISA kit(Cusabio)를 이용하여 시행하였다. 실험을 위하여 분리된 혈청은 200배 희석하여 사용하였으며, assay를 시행한 후 450 nm에서 측정한 값으로 표준곡선을 중심으로 계산하여 그래프를 작성하였다.
도 11의 결과를 보면, 본 출원의 혼합 추출물은 BPH군에 비해 모두 PSA 수치의 감소를 보였다.
실험예 11. 전립선조직의 병리학적 변화 비교
전립선조직을 10% 포르말린용액에 침지 후, 4 μm 두께의 파라핀 섹션을 제작하고, 탈랍(Dewaxing)과 탈수과정 후, 일반적인 조직병리학적 검사를 위하여 조직을 haematoxylin and eosin (H&E)으로 염색하고 분석하여 x200배로 촬영하여 비교하고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12의 결과를 보면, 전립선비대 유발군인 도 12. B는 전립선조직의 상피세포가 비후되고 내강이 좁아진 것을 볼 수 있다. 이에 반해, 본 출원의 혼합 추출물을 투여한 A Low(C), A High(D), B Low(E), B High(F)군 모두에서 상피세포의 내강이 BPH군과 비교하여 넓은 것을 확인할 수 있었다. 이는 전립선비대의 전형적인 패턴이 완화될 수 있음을 의미한다.
실험예 12. 전립
선 조직에서 bax, bcl-2 등의 세포고사인자의 비교
각 군 실험동물의 전립선조직에서 mRNA 를 추출하여 DNA를 합성하고 real time PCR로 Bax 및 Bcl-2의 mRNA 변화를 검토하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다. 분석에 사용된 각 primer의 서열은 표 6과 같다. 이와 같은 프라이머를 이용하여 95°C에서 10s, 55 °C에서 10s, 72°C 10s로 45 cycle 반복하고 95°C 5s, 65°C 60s의 Melting 1cycle로 진행하였다 (Roche Lightcycler 96 Real-time Pcr System, Roche, Basel, Switzerland).
[표 6]
도 13의 결과를 보면, Bax는 대조군과 비교할 때 BPH군에서 유의적으로 감소하였으며, bcl-2의 경우는 BPH군에서 유의적 증가를 보였다. 샘플 A와 B급여군에서 모두 bax는 증가하고 bcl-2는 감소하는 경향을 보였고 특히 B High군에서 Bax는 BPH군에 비해서 약 3배의 유의적 증가를 보였다. 그에 비해 bcl-2는 유의적 감소를 보이지 않았으나, bax/bcl-2 ratio로 볼 때 BPH군보다 유의적으로 높은 것을 확인하였다.
실험예 13. 전립선 조직에서
Bcl-2 및 Bax 발현량 측정
전립선 조직을 대상으로 면역블로팅(immunoblotting)을 시행하여, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 전립선조직을 균질화하고 3000 rpm에서 6분간 원심분리하여 상등액을 수거하고 Bradford 법으로 단백질을 정량하였으며, 다른 조건은 in vitro 세포에서와 동일하게 시행하였다.
도 14의 결과를 보면, bcl-2와 bax의 단백질 발현을 확인한 결과이다. Bcl-2가 높게 발현되어 있고 bax의 발현이 대조군에 비해 낮은 BPH군과 비교할 때, B high 군의 경우 Bax의 발현이 상승하였고 bcl-2가 감소한 것을 볼 수 있다. 이와 같은 경향은 A High에서도 확인되었다.
본 발명에 따른 혼합 생약 조성물은 전립선 비대증의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타내므로, 기능성 식품, 영양 보조제, 건강식품 및 의약품으로 이용 가능하다.
Claims (12)
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- 당귀, 녹용 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 혼합 추출물 내의 당귀, 녹용 및 감초의 배합 중량비(w/w)는 1 내지 3 : 1 : 1인 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물
- 제 4항에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 에탄올 추출물인 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 에탄올은 50% 에탄올 수용액인 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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- 당귀, 녹용 및 감초의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 혼합 추출물 내의 당귀, 녹용 및 감초의 배합 중량비(w/w)는 1 내지 3 : 1 : 1인 전립선 비대증의 개선용 식품 조성물
- 제 10항에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 에탄올 추출물인 전립선 비대증의 개선용 식품 조성물.
- 제 11항에 있어서, 상기 에탄올은 50% 에탄올 수용액인 전립선 비대증의 개선용 식품 조성물
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