KR20130072661A - 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 - Google Patents
와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 분획물은 세포독성이 없고 염증반응과 관련하여 산화질소 생성을 억제하는 효과가 있으며 LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 세포주에서 iNOS, COX-2 및 IL-1β 염증 단백질의 발현을 현저하게 저해시켜 우수한 염증 반응 억제 활성을 가지고 있어, 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 항염증 조성물은 각종 염증 질환의 치료 및 예방에 유용한 치료제 및 염증을 개선할 수 있는 기능성 식품의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스타민, 세로토닌, 브래디키닌, 프로스타글라딘, 류코트리엔과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다. 그러나 지속적인 염증반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다.
대식세포는 선천면역뿐만 아니라 획득면역 등 다양한 숙주반응에 관여하여 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 염증반응 시에는 NO(Nitric Oxide)와 사이토카인을 생산하여 감염초기에 생체방어에 중요한 역할을 한다. 내독소로 잘 알려진 LPS(lipopolysaccharide)는 그람 음성균의 세포외막에 존재하며, RAW 264.7과 같은 마크로파지(macrophage) 또는 단핵구(monocyte)에서 TNF-α, 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1β(IL-1β)와 같은 염증성 사이토카인들을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파아제A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산이 프로스타글라딘으로 바뀌는 과정 및 NO형성 과정으로 이어지게 된다. 체내 염증과정에서는 과량의 NO 및 프로스타글라딘E2(PGE2) 등의 염증인자가 iNOS 및 COX-2에 의해 형성된다. 이 중 NO는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관확장 등의 다양한 생리 기능을 가지고 있다. 일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 염증상태에서 iNOS에 의해 과잉 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다. PGE2 는 염증반응, 면역반응, 그리고 혈관형성(angiogenesis)을 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.
이러한 기전의 작용으로 현재까지 항염증 약물의 사용으로 인해 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용되기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭게 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다고 할 수 있다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련 지어 최근에는 민간에서 사용되는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 상기와 같은 부작용에 대한 우려가 없으면서도 염증 작용의 효과적인 억제 효능을 가진 식물소재를 도출하기 위해 다양한 식물을 대상으로 하여 연구를 수행하였다.
본 발명과 관련된 선행문헌으로서는, 한국공개특허 제2011-0130546호에 꽈리 추출물을 이용하여 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품을 생산할 수 있다는 내용이 개시되어 있고 한국등록특허 제1050020호에는 흑골두 추출물을 유효성분으로 한 염증성 질환에 대한 약학 조성물로 사용할 수 있다는 내용이 개시되어 있다.
그러나 아직까지 염증 억제 효과가 우수하고 동시에 체내에도 안전하여 안심하고 사용할 수 있는 천연 유래의 항염증 치료제는 개발되지 않고 있는데, 따라서 염증 치료를 위한 새로운 천연물 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 와송 추출물, 보다 구체적으로 와송의 디클로로메탄 분획물이 우수한 항염증 활성을 갖는다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 염증 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 함염증 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 함염증 효과를 위한 건강기능성식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 와송(Orostachys japonicus)의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 디클로로메탄 분획물은 와송 분말에 에탄올을 첨가하여 수득한 에탄올 추출물에 디클로로메탄을 첨가하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 와송의 디클로로메탄 분획물은 상기 조성물에 10~115ug/ml의 양으로 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 NO(Nitric Oxide) 생성을 억제할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 iNOS, COX-2 및 IL-1β의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 대식세포에서 LPS에 의한 염증 신호전달 초기에 JNK, p38의 인산화를 감소시킴으로써 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하는 활성이 있을 수 있다.
나아가 본 발명은 와송 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증 억제용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 분획물은 세포독성이 없고 염증반응과 관련하여 산화질소 생성을 억제하는 효과가 있으며 LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 세포주에서 iNOS, COX-2 및 IL-1β 염증 단백질의 발현을 현저하게 저해시켜 우수한 염증 반응 억제 활성을 가지고 있어, 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 항염증 조성물은 각종 염증 질환의 치료 및 예방에 유용한 치료제 및 염증을 개선할 수 있는 기능성 식품의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 분획물의 농도처리에 따른 세포증식 억제효과를 MTS assay를 이용하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 분획물의 농도처리에 따른NO(Nitric oxide) 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 분획물의 농도처리에 따른 iNOS, COX-2 및 IL-1β의 발현 억제 효과를 웨스턴 블럿 기법으로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 분획물의 농도처리에 따른 iNOS, COX-2 및 IL-1β의 강도 발현정도를 정량화한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 분획물이 가지는 NF-kB 억제인자인 IκB와 NF-kB의 헤테로다이머(heterodimer) 중 하나인 p65 단백질의 인산화 정도를 웨스턴 블럿 기법으로 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 분획물의 농도처리에 따른이 JNK의 활성에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 기법으로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 분획물의 농도처리에 따른 p38의 활성에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 기법으로 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 분획물이 NF-κB의 활성화를 조절하는 MAPK 발현 억제 활성을 보여주는 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 분획물의 농도처리에 따른NO(Nitric oxide) 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 분획물의 농도처리에 따른 iNOS, COX-2 및 IL-1β의 발현 억제 효과를 웨스턴 블럿 기법으로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 분획물의 농도처리에 따른 iNOS, COX-2 및 IL-1β의 강도 발현정도를 정량화한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 분획물이 가지는 NF-kB 억제인자인 IκB와 NF-kB의 헤테로다이머(heterodimer) 중 하나인 p65 단백질의 인산화 정도를 웨스턴 블럿 기법으로 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 분획물의 농도처리에 따른이 JNK의 활성에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 기법으로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 와송 디클로로메탄 분획물의 농도처리에 따른 p38의 활성에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 기법으로 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 분획물이 NF-κB의 활성화를 조절하는 MAPK 발현 억제 활성을 보여주는 결과이다.
본 발명은 와송(Orostachys japonicas)의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
와송(Orostachys japonicas)은 돌나물과의 다년생 초본 식물로서, 오랫동안 간염, 폐렴, 지혈, 습진, 화상, 부종의 치료를 위한 치료제로 사용해 왔으며, 약리 작용으로는 혈관 수축작용, 호흡 흥분 작용, 장관의 긴장도 증강 작용, 혈압강화, 이뇨 작용 및 해열 작용이 있다고 알려져 있다.
한편 본 발명자들은 이러한 와송을 이용한 염증질환 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 와송의 디클로로메탄 분획물이 염증반응과 관련하여 NO 생성을 억제하고, LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 세포주에서 iNOS, COX-2 및 IL-1β 염증 단백질의 발현을 확연히 저해시킨다는 사실을 확인함으로써, 와송의 디클로로메탄 분획물을 염증 치료제로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
이러한 사실을 입증하기 위해 본 발명자들은 본 발명의 일실시예를 통해 다음과 같은 실험을 수행하였는데, 즉, 와송의 디클로로메탄 분획물을 농도별로 LPS로 염증 반응을 유발시킨 대식세포주를 대상으로 산화질소 억제 효과를 분석한 결과, 와송의 디클로로메탄 분획물이 처리 농도에 비례하여 산화질소의 생성을 억제하는 활성이 있다는 사실을 알 수 있었다(도 2 참조).
또한, 다른 일실시예에 의하면, 염증 유발 시 발현이 증가되는 것으로 알려진 염증인자인 iNOS, COX-2 및 IL-1β의 단백질 발현에 와송의 디클로로메탄 분획물이 미치는 영향을 분석한 결과, 와송의 디클로로메탄 분획물 농도에 비례하여 iNOS, COX-2 및 IL-1β 염증 단백질 발현은 현저하게 감소되는 것으로 나타났다 (도 3 및 도 4 참조).
뿐만 아니라 본 발명자들은 이러한 와송의 디클로로메탄 분획물이 가지는 항염증 활성을 분자적인 기작에서 확인하기 위해 염증반응을 유도하는 유전자의 발현을 촉진시키는 것으로 알려진 NF-kB(nuclear factor kappa B)의 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 염증유발 인자인 LPS에 의해 유도된 NF-kB의 서브유닛인 p65와 IkB의 인산화를 와송의 디클로로메탄 분획물 처리에 의해 억제한다는 사실을 알 수 있었다(도 5 참조).
참고로, NF-kB가 활성화될 경우, 이의 서브유닛인 p65는 핵 내로 이동하여 유전자의 전사를 활성화시키고, 세포질에서 IkB는 인산화 되는데, 본 발명에서는 이러한 인자들의 인산화 정도를 통해 와송의 디클로로메탄 분획물의 항염증 활성을 조사한 것이다.
즉, 상기 결과를 통하여 본 발명자들은 와송의 디클로로메탄 분획물이 결과적으로 NF-kB의 인산화를 억제하여 불활성화 시킴으로서 염증 인자들의 전사를 억제하는 기작을 통해 항염증 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.
나아가 와송의 디클로로메탄 분획물이 LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 MAPKs 인산화에 미치는 영향을 조사하였는데, 그 결과, JNK와 p38의 활성은 15분에서 30분까지만 지속되다가 60분부터 저해되는 것으로 나타났다(도 6및 도 7 참조).
이러한 결과를 바탕으로 본 발명자들은 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 분획물이 여러 염증유발 인자들의 발현 및 활성을 억제하는 기작을 통해 염증으로 유발되는 질환들을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 와송(Orostachys japonicus)의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 와송(Orostachys japonicus)의 디클로로메탄 분획물은 용매로서 디클로로메탄을 사용하여 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 추출 및 정제될 수 있는데, 본 발명에 따른 와송 유래 디클로로메탄 분획물은 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
바람직하게 본 발명의 항염 활성을 가지는 와송 추출물은 유기용매로서 디클로로메탄을 사용하는 추출방법을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 와송의 디클로로메탄 분획물은 용매추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 공정을 수행할 수 있고, 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제하는 과정을 수행할 수 있다.
따라서 본 발명에 있어서 와송의 디클로로메탄 분획물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획물 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 분획물을 제조하는 방법을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
본 발명의 와송 유래 디클로로메탄 분획물은 (a) 건조된 와송(Orostachys japonicus) 분말을 에탄올을 이용하여 추출하는 단계; (b) 에탄올 추출물을 헥산과 물이 혼합된 혼합용매를 가하여 헥산 분획물과 물 분획물로 분획하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계를 통해 수득한 물 분획물에 디클로로메탄과 물이 혼합된 혼합용매를 가하여 디클로로메탄 분획물과 물 분획물로 분획하는 단계를 통하여 제조될 수 있다.
이러한 각종 유기용매를 이용하여 추출물을 분획화하는 과정은 추출물(또는 분획물)이 가지고 있는 약리효과를 최대로 나타내는 분획물(fraction)을 찾아내게 하는 바, 필요 없는 물질을 분획화 과정을 통해 제거하여, 특정 효과를 나타내는 활성물질만이 최대로 농축된 추출물 상태를 만들 수 있게 한다. 이러한 분획화 과정을 통해 천연식물의 추출물은 약학적 조성물 및 건강기능식품의 소재로서의 활용도를 높일 수 있게 된다.
한편, 본 발명에서 상기 염증 질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 위염, 대장염, 관절염, 신장염 및 간염을 포함할 수 있다.
따라서 본 발명은 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 본 발명의 조성물은 염증질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 와송의 디클로로메탄 분획물을 10~200ug/ml로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항염증 조성물은 약학적으로 유효한 양의 와송의 디클로로메탄 분획물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 염증질환을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 분획물의 약학적으로 유효한 양은 0.5~100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5~5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 염증질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 항염증 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 항염증 조성물은 염증질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 염증질환의 예방 및 치료용 약제를 제공할 수 있다.
뿐만 아니라 본 발명에 따른 항염 활성을 가지는 와송의 디클로로메탄 분획물은 세포에 대해 독성을 유발시키지 않는 특징이 있고(도 1 참조), 또한 천연물인 와송을 사용함을 특징으로 하고 있어, 체내의 독성 및 부작용 염려 없이 안심하고 사용할 수 있다.
따라서 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 상기 조성물은 염증질환의 예방 및 개선을 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 상기 본 발명의 조성물은 염증질환 증상의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물로도 사용할 수 있다.
그러므로 본 발명의 조성물은 염증질환 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본원에서 상기 식품이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본원발명에 따른 항염증 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본원발명에서 상기 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명에 따른 상기 염증질환의 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 항염증 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공할 수 있으며, 상기 식품의 형태는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
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참조예
1>
하기 본 발명의 실시예에서 사용한 세포배양 조건, 시약 및 통계처리 방법은 다음에 기재된 바와 같이 수행하였다.
세포배양 및 시약
쥐의 대식세포주(mouse monocyte/macrophage)인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받았으며, 10% FBS, 1% 5,000unit/㎖ 페니실린-5,000㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였고, 2일 간격으로 배지를 교체해 주었으며,일주일에 1~2회 계대 배양 하였다.
DMEM 배양액, 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)은 하이클론 테크놀로지사 (Logan, UT)에서 구입하였으며 LPS, Griess reagent 등은 시그마 케미칼사(Sigma Chemical Co., MO, U.S.A), iNOS/COX-2/NF-κB/ERK/JNK/p38 rabbit polyclonal IgG 항체 등은 셀시그날링 테크놀로지사(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)에서 구입하였다.
통계처리
본 발명의 실시예에서 수행한 실험들의 분석결과는 평균± 표준오차(S.E)로 표시하였고, 유의성은 SPSS/PC+ 패키지(pachage)의 원-웨이 아노바(one-way ANOVA)를 이용하여 듀칸의 멀티플 테스트(Duncan's multiple test)로 분석하였다.
<
실시예
1>
와송의
용매
분획물
제조
밀양 거북이 와송을 식품용 및 의약용으로 사용하기 위하여 추출 용매는 약전 에탄올을 사용하였다. 자연 건조시킨 와송을 40메쉬(40mesh)이하로 잘게 분쇄하고 분말화 시킨 후, 95% 에탄올에 24시간 동안 침지하는 과정을 3회 반복하여 추출하였다. 그 여액을 증류 농축장치(rotary evaporator)를 이용해 40℃에서 농축하여 에탄올 추출물을 제조하였고, 이후 상기 농축 에탄올 추출물을 계통분획법에 따라 용매분획을 실시하였다.
먼저 상기 추출된 와송 에탄올 추출물에 물과 헥산이 1:1의 비율로 혼합된 혼합용매를 처리하여 헥산 분획과 물 분획으로 분리하였으며, 이렇게 얻어진 물 분획에 디클로로메탄과 물이 1:1의 비율로 혼합된 혼합용매를 처리하여 디클로로메탄 분획과 물 분획으로 다시 분리하였으며, 이렇게 얻어진 물 분획에 에틸아세테이트와 물이 1:1의 비율로 혼합된 혼합용매를 처리하여 에틸아세테이트 분획과 물 분획으로 분리하였다. 이후 분획이 완료된 각 와송의 용매 추출 분획물들은 rotary evaporator를 이용하여 건조시킨 후 하기 실험에 사용하였다.
<
실시예
2>
본 발명에 따른
와송
디클로로메탄
분획물의
MTS
법에 의한 세포독성 검사
상기 실시예 1에서 수득한 용매 분획물들 중 와송의 디클로로메탄 분획물을 대상으로 처리농도에 따른 RAW 264.7 세포에 대한 증식 억제 효과를 MTS[3-(4,5-dimethlylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt] 분석을 이용하여 조사하였다. 세포를 96-웰 플레이트에서 24시간 배양한 후, 와송의 디클로로메탄 분획물을 각각 다른 농도(0, 25, 50, 75, 100, 150ug/ml)로 세포에 처리한 다음, 20㎕ Cell Titer 96 에이퀴어스 원 솔루션(Aqueous One Solution)용액을 처리하고 490㎚파장을 이용해 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 와송의 디클로로메탄 분획물을 대식세포에 농도별로 처리한 결과, 모든 농도에서 90%이상의 생존율을 보이는 것으로 나타남에 따라 세포독성이 거의 없는 것을 알 수 있었고, 이러한 결과를 토대로 하기 실험에서는 와송의 디클로로메탄 분획물을 0~100ug/ml의 농도범위에서 실험하였다(도 1 참조).
<
실시예
3>
와송의
디클로로메탄
분획물에
대한 산화질소(
NO
) 억제 효과 분석
상기 실시예 1에서 얻은 와송 디클로로메탄 분획물에 대해 산화질소 억제 효과를 측정하기 위하여, 쥐 대식세포 세포주인 RAW 264.7 세포를 대상으로 상기 분획물 처리에 따른 산화질소의 생성량을 측정하였다.
산화질소(Nitric oxide, NO)의 생성 평가는 RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 세포수를 5×105 cells/mL로 조절한 후, 24-웰 플레이트에 부착하고, 와송 디클로로메탄 분획물을 농도별로 처리하고 1시간 후에 리포폴리사카라이드(LPS)(1μg/mL)를 처리하여 16시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 그리스(Griess) 시약[1%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2의 형태로 측정하였다.
세포배양 상등액 100μL와 그리스 시약 100μL를 혼합하여 96-웰 플레이트 에서 10분 동안 반응시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 아질산나트륨(NaNO2)을 기준으로 비교하였다.
그 결과, LPS 단독 처리에 의해 증가된 산화질소의 생성양 와송 디클로로메탄 분획물의 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났고, 감소 정도는 분획물 처리 농도에 비례하는 것으로 나타났으며, 특히 100ug/ml의 농도에서는 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비슷하게 나타나 매우 우수한 산화질소 생성 억제 활성이 있는 것으로 나타났다(도 2 참조).
<
실시예
4>
와송
디클로메탄
분획물의
iNOS
,
COX
-2 및
IL
-1β 단백질 발현에 미치는 영향 분석
와송 디클로로메탄 분획물이 iNOS, COX-2 및 IL-1β의 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블럿(Western blot)을 이용하여 확인하였는데, 실험에 사용된 세포들을 상기 실시예 3에서 사용한 세포들을 대상으로 하였다.
세포로부터 단백질을 분리하는 과정으로 세포 배양판(cell culture plate)으로부터 배양액을 제거하고, 얼음으로 차갑게 만든 PBS로 2회 세척하였다. 플레이트를 얼음 위에 올려놓은 채 세포 용출 버퍼(cell lysis buffer)(pH 7.4)를 넣어주고
세포 스크래퍼(scraper)로 긁어주어 세포를 수집하였다. 이를 얼음 상태에서 1시간 방치한 후 4℃, 13,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액 만을 모아 새 튜브로 옮겼다. 단백질 정량은 BCA 단백질 어세이 방법으로 측정하였다.
BCA법으로 측정한 동일한 양의 단백질 샘플을 2배의 로딩 버퍼와 혼합한 후, 10% criterion Tris-HCl precast gel에 로딩(loading)하여 전기영동하고 semi-dry transfer system을 이용하여 PVDF(polyvinylidene fluoride membrane)로 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼(Transfer)가 완료된 PVDF 막을 5% 탈지분유(non-fat dry milk)를 함유한 PBST로 비특이적 단백질을 차단하기 위하여 한 시간 정도 반응시킨 후 1차 항체로 4℃에서 밤새도록 반응시키고 2차 항체로 반응시킨 뒤 ECL kit를 이용하여 필름에 현상한다.
그 결과, LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 대식 세포주에서 iNOS, COX-2 및 IL-1β의 염증 단백질은 그 발현이 현저하게 증가되는 것으로 나타났으나, 본 발명의 와송 디클로로메탄 분획물을 처리한 군들의 경우 상기 단백질들의 발현이 감소되는 것으로 나타났고, 상기 분획물의 처리 농도에 비례하여 iNOS, COX-2 및 IL-1β 염증 단백질 발현이 확연하게 감소되었음을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 4 참조).
<
실시예
5>
본 발명에 따른
와송
디클로로메탄
분획물의
NF
κB 활성에 미치는 영향 분석
본 발명의 와송 디클로로메탄 분획물이 LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 NFκB의 서브유닛인 p65와 IκB-α의 인산화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 기법을 수행하였다. 웨스턴 블럿을 상기 실시예 4에서 기술된 방법을 사용하였으며 단지 항체로서 p65와 IκB-α에 대한 항체를 사용하였다.
그 결과, LPS 단독 처리군에서 p65와 IκB-α는 인산화되는 것으로 나타났으나 와송의 디클로로메탄 분획물을 처리한 군의 경우 처리 농도에 비례하여 LPS에 의하여 유도된 p65와 IκB-α의 인산화가 농도 의존적으로 저해되는 것을 알 수 있었다(도 5 참조).
<
실시예
6>
본 발명에 따른
와송
디클로로메탄
분획물이
MAPKs
의 활성에 미치는 영향
본 발명의 와송의 디클로로메탄 분획물이 LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 MAPKs 인산화에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 기법으로 확인하였다.
그 결과, LPS 단독 처리군에서 JNK와 p38의 인산화의 발현이 뚜렷하게 나타났으나, 와송의 디클로로메탄 분획물 농도에 비례하여 LPS에 의하여 유도된 인산화가 농도 의존적으로 저해되었음을 확인할 수 있었고 JNK와 p38의 활성은 15분에서 30분까지 지속되다가 60분부터 저해되었다(도 6 및 도 7 참조).
더 나아가 본 발명의 발명자들은 본 발명의 와송의 디클로로메탄 분획물이 염증유발 단백질로 알려진 iNOS와 COX-2 발현 억제와 MAPK 신호전달 경로 차단의 관련성이 있는지 여부를 알아보기 위하여 특정 MAPK inhibotor를 이용하여 확인하였다.
그 결과 와송의 디클로로메탄 분획물과 각각의 인히비터(inhibitor)를 처리한 경우 NO의 생성을 일으키는 iNOS의 발현은 완전히 억제되었으며 SP600125와 SB203580의 처리에서 와송의 디클로로메탄 분획물을 매개로한 COX-2의 억제가 약간 회복되는 결과를 확인할 수 있었다(도 8 참조).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (7)
- 와송(Orostachys japonicas)의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 디클로로메탄 분획물은 와송 분말에 에탄올을 첨가하여 수득한 에탄올 추출물에 디클로메탄을 첨가하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물. - 제1항에 있어서,
와송의 디클로로메탄 분획물은 상기 조성물에 10~200ug/ml의 양으로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 추출물은 산화질소(NO) 생성 억제활성이 있는 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 추출물은 대식세포에서 iNOS, COX-2 및 IL-1β의 발현을 억제하는 활성이 있는 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 추출물은 대식세포에서 LPS에 의한 염증 신호전달 초기에 JNK, p38의 인산화를 감소시킴으로써 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하는 활성이 있는 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 염증의 개선 및 예방용 건강기능성 식품.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110140191A KR20130072661A (ko) | 2011-12-22 | 2011-12-22 | 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110140191A KR20130072661A (ko) | 2011-12-22 | 2011-12-22 | 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130072661A true KR20130072661A (ko) | 2013-07-02 |
Family
ID=48987293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020110140191A KR20130072661A (ko) | 2011-12-22 | 2011-12-22 | 와송의 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20130072661A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190006303A (ko) | 2017-07-10 | 2019-01-18 | 정문석 | 누룩으로 발효시킨 복합생약추출물을 포함하는 여드름 치료용 화장료 조성물 |
-
2011
- 2011-12-22 KR KR1020110140191A patent/KR20130072661A/ko not_active Application Discontinuation
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| KR20190006303A (ko) | 2017-07-10 | 2019-01-18 | 정문석 | 누룩으로 발효시킨 복합생약추출물을 포함하는 여드름 치료용 화장료 조성물 |
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