JP2013509445A - 鋳型ナノ複合体 - Google Patents

鋳型ナノ複合体 Download PDF

Info

Publication number
JP2013509445A
JP2013509445A JP2012537179A JP2012537179A JP2013509445A JP 2013509445 A JP2013509445 A JP 2013509445A JP 2012537179 A JP2012537179 A JP 2012537179A JP 2012537179 A JP2012537179 A JP 2012537179A JP 2013509445 A JP2013509445 A JP 2013509445A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nanoparticles
polynucleotide
biomolecule
biomolecules
nanocomposite
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2012537179A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2013509445A5 (ja
JP5866119B2 (ja
Inventor
チャド エー． ミルキン，
デイビッド エー． ギルヨハン，
ウェストン エル． ダニエル，
ジョシュア アイ． カトラー，
キ チャン，
ダン チェン，
Original Assignee
ノースウェスタン ユニバーシティ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ノースウェスタン ユニバーシティ filed Critical ノースウェスタン ユニバーシティ
Publication of JP2013509445A publication Critical patent/JP2013509445A/ja
Publication of JP2013509445A5 publication Critical patent/JP2013509445A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5866119B2 publication Critical patent/JP5866119B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6933—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained by reactions only involving carbon to carbon, e.g. poly(meth)acrylate, polystyrene, polyvinylpyrrolidone or polyvinylalcohol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0089—Particulate, powder, adsorbate, bead, sphere
    • A61K49/0091—Microparticle, microcapsule, microbubble, microsphere, microbead, i.e. having a size or diameter higher or equal to 1 micrometer
    • A61K49/0093—Nanoparticle, nanocapsule, nanobubble, nanosphere, nanobead, i.e. having a size or diameter smaller than 1 micrometer, e.g. polymeric nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/12—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules
    • A61K51/1241—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins
    • A61K51/1244—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins microparticles or nanoparticles, e.g. polymeric nanoparticles
    • A61K51/1251—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins microparticles or nanoparticles, e.g. polymeric nanoparticles micro- or nanospheres, micro- or nanobeads, micro- or nanocapsules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/588—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with semiconductor nanocrystal label, e.g. quantum dots

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)

Abstract

本開示は、鋳型ナノ複合体を含む組成物およびそれらの使用方法に関する。本発明により、例えば、各ナノ複合体が、規定された構造を有し、単層中の複数の架橋生体分子、その上で構造が構築される鋳型を提供する表面を含み、前記表面は、前記構造が規定された後に任意で少なくとも部分的に除去される、複数のナノ複合体が提供される。本発明によってまた、第１の生体分子を表面と接触させることにより前記第１の生体分子を活性化する工程を含み、前記活性化により、前記第１の生体分子が第２の生体分子に架橋する、構造化ナノ複合体を架橋する方法もまた提供される。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２００９年１０月３０日に出願された米国特許仮出願第６１／２５６，６４０号、２０１０年８月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／３７４，５５０号および２０１０年９月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／３８６，８４６号（これらの開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の優先権の恩典を主張する。
政府の権利の声明
本発明は米国陸軍ＲＤＥＣＯＭにより認可番号Ｗ９１１ＮＦ−０９−１−００６９および国立衛生研究所（ＮＣＩ−ＣＣＮＥ）により与えられた認可番号Ｕ５４ＣＡ１１９３４１の下、政府支援によりなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
発明の分野
本開示は、鋳型ナノ複合体を含む組成物およびそれらの使用方法に関する。
遺伝子発現を制御する核酸は、可能性のある治療薬ならびに遺伝子機能分析のための重要なツールであると広く考えられている。核酸法の可能性は、細胞内に存在する相補的標的を認識し、結合することにより遺伝子経路を制御するそれらの能力にある。しかしながら、哺乳類細胞内への核酸の送達は、細胞が核酸取り込みに自然に抵抗するので、大きな課題のままである。さらに、それらは、細胞の内外の両方で異種核酸を分解し、破壊する様々な機序を有する。よって、外部トランスフェクション剤の助けなしに、無毒的に細胞膜に浸透し、プログラムされた核酸を送達するベクターの作製が、これらの技術を治療用途まで拡大するのに必要である。
多価無機ナノ材料が現在、インビボで可能性のある治療薬として認識されており、場合によっては、すでに、ＦＤＡにより診断ツールとしての使用が許可されている[非特許文献１;非特許文献２]。これらの粒子の表面は、様々な付着戦略を介して生体分子と結合させることができるので、これらはそれらの表面リガンドを選択することにより操作され、よく知られた生物システムおよび経路と相互作用することができる。例えば、金ナノ粒子を二本鎖ｓｉＲＮＡの高密度シェルで修飾することにより、哺乳類細胞においてＲＮＡｉ遺伝子サイレンシングに関与させることができる[非特許文献３]。これらの粒子は、トランスフェクション剤なしで高い細胞取り込み[非特許文献４]、急性毒性の欠如、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性[非特許文献５]および生体媒質中での高い安定性を示すので、ＲＮＡｉ遺伝子制御剤として特に有効である。増えている研究は、金ナノ粒子−ポリヌクレオチド複合体の、これらの様々な機能を実行する能力は、もっぱら粒子の表面上でのポリヌクレオチドの密集配列に由来することを示唆することに注意することが重要である[非特許文献６]。別の例では、生物模倣型合成高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）ナノ複合体が金ナノ粒子をリン脂質およびＡＰＯ１Ａ（生物関連タンパク質である）の高密度シェルで修飾することにより構築され得る[非特許文献７]。ＨＤＬはアテローム性動脈硬化およびその結果として起こる病気、例えば心疾患および脳卒中の発症を防ぐ動的血清分子である。生体ＨＤＬのように、この合成コンストラクトは、その疎水性リン脂質シェルにおいてコレステロールに結合することができる。重要なことには、これらの場合および多くの多の場合の両方において、それらのコア材料に関係なく、生物システムと相互作用する独特の能力を付与するのは、無機ナノ粒子の表面上の生物リガンドの高密度多価配列である。
生物−無機ナノ材料ハイブリッドは、望ましい特質、例えば診断および治療のために使用されるものを有するが、懸念がコア材料のインビボでのクリアランス／残留性および毒性に対して生じている。これらの懸念はナノ材料のインビボでの使用に対する限界として広く認識されているので、それらの無機ナノ粒子生物複合体対応物の性質を維持する調整可能な表面機能性を有するソフトナノ材料を作製するために普遍的アプローチが必要とされている。多くの合成戦略により、これらの問題に対処するために試みがなされてきており、ミセル構造が含まれる[非特許文献８;非特許文献９]。
中空ナノ複合体が近年、その独特の化学、物理、および生物特性のためにかなり関心を引いており、薬物／遺伝子送達[非特許文献１０;非特許文献１１;非特許文献１２]、イメージング[非特許文献１３;非特許文献１４]、および触媒作用[非特許文献１５]における広範囲にわたる用途を示唆する。したがって、これらの構造を合成するために、乳化重合[非特許文献１６;非特許文献１７;非特許文献１８]、レイヤーバイレイヤープロセス[非特許文献１９]、ミセルの架橋[非特許文献２０;非特許文献２１;非特許文献２２]、分子またはナノ粒子 自己集合[非特許文献２３;非特許文献２４]、および犠牲的鋳型技術[非特許文献２５]に基づいて様々な方法が開発されている。その中で、鋳型のサイズおよび形状を制御する能力を生成物に伝達するという点で、鋳型法が特に強力であり、そうでなければ、所望の均質性および形態を達成するのは困難である。典型的な鋳型合成では、犠牲コアが選択され、この上に、潜在的架橋部分を含む好ましい材料がコートされる。化学架橋によるコーティングの安定化後、鋳型を除去し、所望の中空ナノ粒子を残す。この追加の架橋工程は、組成的に簡単な分子、例えばポリ（アクリル酸）またはキトサンに対し容易に達成することができる[非特許文献２６;非特許文献２７]。しかしながら、感応性および／または生物学的な機能を持つ構造を含む系では、従来の架橋化学は、それらの活性の損失を防止するのに十分関与し得ない。
Rosi et al., Chem. Rev. 105 (4): 1547−1562 (2005) Taton et al., Science 289 (5485): 1757−1760 (2000) Giljohann et al., J. Am. Chem. Soc. 131 (6): 2072−2073 (2009) Rosi et al., Science 312 (5776): 1027−1030 (2006) Seferos et al., Nano Lett. 9(1): 308−11 (2009) Giljohann et al., Nano Lett. 7 (12): 3818−21 (2007) Thaxton et al., J. Am. Chem. Soc. 131 (4): 1384−5 (2009) Li et al., Nano Lett. 4 (6): 1055−1058 (2004) Liu et al., Chem−Eur J 16 (12): 3791−3797 (2010) Shu et al., Biomaterials 31: 6039 (2010) Kim et al., Angew. Chem. Int. Ed. 49: 4405 (2010) Kasuya et al., In Meth. Enzymol.; Nejat, D., Ed.; Academic Press: 2009; Vol. Volume 464, p 147 Sharma et al., Contrast Media Mol. Imaging 5: 59 (2010) Tan et al., J. Chem. Commun. 6240 (2009) Choi et al., Chem. Phys. 120: 18 (2010) Anton et al., J. Controlled Release 128: 185 (2008) Landfester et al., J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 48: 493 (2010) Li et al., J. Am. Chem. Soc. 132: 7823 (2010) Kondo et al., J. Am. Chem. Soc. 132: 8236 (2010) Turner et al., Nano Lett. 4: 683 (2004) Sugihara et al., Angew. Chem. Int. Ed. 49: 3500 (2010) Moughton et al., Soft Matter 5: 2361 (2009) Kim et al., Angew. Chem. Int. Ed. 46: 3471 (2007) Kim et al., J. Am. Chem. Soc. 132(28): 9908−19 (2010) Rｅ’thorｅ’ et al., Small 6: 488 (2010) Cheng et al., J. Am. Chem. Soc. 128: 6808 (2006) Hu et al., Biomacromolecules 8: 1069 (2007)
本開示は、鋳型ナノ複合体を含む組成物およびそれらの使用法を提供する。本明細書では、１つの表面を有する、または有しないナノ複合体を作製するための方法が開示される。１つの態様では、架橋することができる１つ以上の部分を有する生体分子が活性化され、これにより生体分子間の架橋反応が開始される。いくつかの態様では、活性化は自発的である。反応完了後、表面は任意で溶解され、得られた中空構造は、表面の形状を保持する。表面のない中空構造は、表面が無傷なままであるナノ複合体の特性を表す。
よって、本開示は、各ナノ複合体が規定された構造を有し、単層中の複数の架橋された生体分子、その上で構造が構築される鋳型を提供する表面を含み、表面は構造が規定された後に任意で少なくとも部分的に除去される、複数のナノ複合体を提供する。
様々な態様では、ナノ粒子は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、アルミニウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、銅ナノ粒子、コバルトナノ粒子、インジウムナノ粒子、およびニッケルナノ粒子からなる群より選択される。
一実施形態では、本開示は複数の生体分子中の各生体分子は同じであるナノ複合体を提供する。別の実施形態では、本開示は、複数の生体分子中の少なくとも２つの生体分子は異なるナノ複合体を提供する。
様々な実施形態では、生体分子は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、小分子、治療薬、コントラスト剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
さらなる実施形態では、複数のナノ複合体は単分散である。様々な態様では、単分散性は、複数のナノ複合体の直径において約２５％の変動があること、または単分散性は、複数のナノ複合体の直径において約１０％の変動があること、または単分散性は、複数のナノ複合体の直径において約１％の変動があることである。
いくつかの実施形態では、表面上の架橋生体分子の密度は、生体分子間の協同的挙動のために十分である。様々な態様では、表面上の架橋生体分子の密度が約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２であり、または表面上の架橋生体分子の密度が約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、複数のナノ複合体が提供される。
本開示のさらなる態様では、複数のナノ複合体が、さらに追加の作用物質を含む複数のナノ複合体が提供される。様々な態様では、追加の作用物質はポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、金属錯体、小分子、治療薬、コントラスト剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
１つの実施形態では、追加の作用物質は、複数の生体分子の少なくとも１つの生体分子と結合される。様々な態様では、追加の作用物質はハイブリダイゼーションにより複数の生体分子の少なくとも１つの生体分子と結合され、追加の態様では、追加の作用物質は複数の生体分子の少なくとも１つの生体分子と共有または非共有結合される。さらなる態様では、追加の分子は複数のナノ複合体の少なくとも１つの架橋生体分子中に捕捉される。
本開示はまた、様々な実施形態では、複数のナノ複合体における少なくとも１つのナノ複合体が、表面がない場合中空である、または複数のナノ複合体における大多数のナノ複合体が、表面がない場合中空である、または複数のナノ複合体における実質的に全てのナノ複合体が表面がない場合中空である、複数のナノ複合体を提供する。
１つの実施形態では、複数のナノ複合体の少なくとも１つにおいて、追加の作用物質が、そうでなければ中空であるナノ複合体に封入される、複数のナノ複合体が提供される。
１つの実施形態では、第１の生体分子を表面と接触させることにより第１の生体分子を活性化する工程を含み、活性化により、第１の生体分子は、第２の生体分子に架橋する、構造化ナノ複合体を架橋する方法もまた本開示により提供される。１つの態様では、表面は、その上で構造が構築される鋳型を提供し、一方、別の態様では、表面はナノ粒子である。様々な態様では、ナノ粒子は、球、ロッドおよび角柱からなる群より選択される。
本開示により提供される方法はまた、様々な態様では、ナノ粒子が金属である、さらなる態様では、ナノ粒子がコロイド金属であることを定める。よって、さらに別の態様では、ナノ粒子は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、アルミニウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、銅ナノ粒子、コバルトナノ粒子、インジウムナノ粒子、およびニッケルナノ粒子からなる群より選択される。
本開示はまた、本明細書で記載される方法のいずれかの様々な実施形態では、表面は、架橋後に少なくとも部分的に除去されることを定める。
いくつかの態様では、第１の生体分子および第２の生体分子は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、小分子、治療薬、コントラスト剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される方法が本開示によりさらに提供される。さらなる態様では、第１の生体分子および第２の生体分子は、少なくとも１つのアルキン部分を含み、または第１の生体分子および第２の生体分子はそれぞれ、約１０のアルキン部分を含む。
アルキン部分に関しては、本開示は、様々な態様では、アルキン部分は、表面と接触すると活性化されることを定める。１つの態様では、活性化により、アルキンは求核試薬の影響を受けやすくなり、様々な実施形態では、求核試薬は、水、アルコール、アミン、チオール、エステル、チオエステル、尿素、アミド、アルデヒド、カーボネート、カルバメート、分子内ヒドロキシル基、メチルエーテル基、ベンジルエーテル基、カルボン酸、ケトン、イミン、フェノール、２−ピロリドン、インドール、酢酸、β−ケトエステルおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
本開示の様々な実施形態では、活性化は、第１の生体分子の第２の生体分子への架橋を引き起こす。
いくつかの態様では、第１の生体分子はポリヌクレオチドであり、さらなる態様では、第２の生体分子はポリヌクレオチドである。さらに別の態様では、ポリヌクレオチドはＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドである。
本開示はまた、様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、約５〜約１００ヌクレオチド長、約５〜約９０ヌクレオチド長、約５〜約８０ヌクレオチド長、約５〜約７０ヌクレオチド長、約５〜約６０ヌクレオチド長、約５〜約５０ヌクレオチド長、約５〜約４５ヌクレオチド長、約５〜約４０ヌクレオチド長、約５〜約３５ヌクレオチド長、約５〜約３０ヌクレオチド長、約５〜約２５ヌクレオチド長、約５〜約２０ヌクレオチド長、約５〜約１５ヌクレオチド長、または約５〜約１０ヌクレオチド長であると定める。
別の実施形態では、追加の作用物質は第１の生体分子および第２の生体分子に、架橋工程中に添加され、一方、別の実施形態では、追加の作用物質はナノ複合体の形成後、表面の除去前にナノ複合体に添加される。さらなる実施形態では、追加の作用物質は、ナノ複合体の形成後、表面の除去後に、ナノ複合体に添加される。
別の態様では、表面を含む多価ナノ複合体を含み、ナノ複合体はさらに複数のポリヌクレオチドを含む組成物が提供され、ここで、複数のポリヌクレオチドの各々のスペーサ端は修飾され、複数のポリヌクレオチドを化学薬品と接触させると、複数のポリヌクレオチドは架橋し、表面は架橋後、任意で少なくとも部分的に除去される。組成物の様々な態様では、ナノ複合体はナノ粒子を含み、さらなる態様では、ナノ粒子は球、ロッドおよび角柱からなる群より選択される。
したがって、組成物のさらに別の態様では、ナノ粒子は金属である。１つの態様では、ナノ粒子はコロイド金属である。組成物の様々な実施形態では、ナノ粒子は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、アルミニウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、銅ナノ粒子、コバルトナノ粒子、インジウムナノ粒子、およびニッケルナノ粒子からなる群より選択される。
様々な実施形態では、修飾はアミン、アミド、アルコール、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、ジスルフィド、カルボン酸、フェノール、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドラゾン、アジドおよびアルキンからなる群より選択される。１つの態様では、修飾は、アミン修飾ヌクレオチドであり、さらなる態様ではアミン修飾ホスホラミダイトヌクレオチドはアミン修飾チミジンホスホラミダイト（ＴＮ）である。
さらなる実施形態では、化学薬品は、ジスクシンイミジルグルタラート、スベリン酸ジスクシンイミジル、ビス［スルホスクシンイミジル］スベラート、トリス−スクシンイミジルアミノトリアセテート、スクシンイミジル４−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン、スクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタレート塩酸塩、スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート、ジチオビス［スクシンイミジルプロピオネート］、３，３’−ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオネート］、酒石酸ジスクシンイミジル、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］、エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］、アジプイミド酸ジメチル・２ＨＣｌ、ピメルイミド酸ジメチル・２ＨＣｌ、スベルイミド酸ジメチル・２ＨＣｌ、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、β−［トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィノ］プロピオン酸、ビス−マレイミドエタン、１，４−ビスマレイミドブタン、ビスマレイミドヘキサン、トリス［２−マレイミドエチル］アミン、１，８−ビス−マレイミド−ジエチレングリコール、１，１１−ビス−マレイミド−トリエチレングリコール、１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン、ジチオビスマレイミドエタン、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン、１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン、ビス［ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド、Ｎ−（ａ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−ａ−［２−ピリジルジチオ］トルエン、４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート）、ヨード酢酸Ｎ−スクシンイミジル、スクシンイミジル３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート、スルホスクシンイミジル［４−アジドサリチルアミド］−ヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル−（パーフルオロアジドベンズアミド）エチル−１，３’−ジチオプロプリオネート、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）エチル−１，３’−プロプリオネート、スルホスクシンイミジル２−［７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセトアミド］エチル−１，３’ジチオプロピオネート、スクシンイミジル４，４’−アジペンタノエート、スクシンイミジル６−（４，４’−アジペンタンアミド）ヘキサノエート、スクシンイミジル２−（［４，４’−アジペンタンアミド］エチル）−１，３’−ジチオプロプリオネート、スルホスクシンイミジル４，４’−アジペンタノエート、スルホスクシンイミジル６−（４，４’−アジペンタンアミド）ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル２−（［４，４’−アジペンタンアミド］エチル）−１，３’−ジチオプロプリオネート、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド，トリフルオロ酢酸塩、［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド，トリフルオロ酢酸塩、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩酸塩、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネートおよびスクシンイミジル−［４−（ソラレン−８−イルオキシ）］−ブチラートからなる群より選択される。
別の態様では、複数のポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチド、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはそれらの組み合わせを含み、様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、約５〜約１００ヌクレオチド長、約５〜約９０ヌクレオチド長、約５〜約８０ヌクレオチド長、約５〜約７０ヌクレオチド長、約５〜約６０ヌクレオチド長、約５〜約５０ヌクレオチド長、約５〜約４５ヌクレオチド長、約５〜約４０ヌクレオチド長、約５〜約３５ヌクレオチド長、約５〜約３０ヌクレオチド長、約５〜約２５ヌクレオチド長、約５〜約２０ヌクレオチド長、約５〜約１５ヌクレオチド長、または約５〜約１０ヌクレオチド長である。
さらなる実施形態では、本開示はまた、本明細書で記載される方法を使用して、本開示のナノ複合体のいずれかを製造する方法を提供する。
本開示の別の態様では、標的分子を本明細書で記載されるナノ複合体組成物のいずれかと接触させることを含み、標的分子と組成物の接触で、検出可能な変化が得られる、標的分子を検出する方法が提供される。様々な態様では、検出はインビトロであり、または検出はインビボである。
本開示はまた、様々な態様では、標的ポリヌクレオチドを本明細書で記載されるナノ複合体組成物のいずれかと、遺伝子産物の発現を阻止するのに十分な条件下で接触させることを含む、標的ポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子産物の発現を阻止する方法を提供する。様々な態様では、遺伝子産物の発現はインビボで阻止され、または遺伝子産物の発現はインビトロで阻止される。さらなる態様では、遺伝子産物の発現は、少なくとも約５％阻止される。
本開示はさらに、様々な実施形態では、本明細書で記載される方法のいずれかにより製造される本開示の組成物を提供する。
アミン−修飾ＤＮＡのアルキン−ＮＨＳエステルによる修飾を示す図である。 Ａ）複数のクエン酸安定化、ＤＮＡ機能化、およびアルキン−ＤＮＡ機能化ＡｕＮＰの溶解、Ｂ）溶解プロセスの様々な段階でのアルキン−ＤＮＡ機能化ＡｕＮＰ、Ｃ）Ｂにおける対応する時間点のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す図である。 溶解プロセス中の金ナノ粒子の指示した溶液のＴＥＭ画像を示す図である。 Ａ）遊離鎖ＤＮＡの架橋構造およびＤＮＡ機能化ＡｕＮＰとのゲル電気泳動比較、Ｂ）ある範囲の密度を有するアルキン−ＤＮＡ−ＡｕＮＰから得られた架橋構造のゲル電気泳動分析を示す図である。 Ａ）ある範囲の異なるサイズの鋳型から形成させた中空ＤＮＡナノ複合体のゲル電気泳動、Ｂ）様々な数のアルキンユニットで修飾されたアルキン−ＤＮＡを用いて機能化されたＡｕＮＰから得られた架橋構造のゲル電気泳動を示す図である。 ＦｌおよびＣｙ３修飾中空ＤＮＡナノ複合体の２つの鎖系を示す。６０℃で、これらの粒子は脱ハイブリダイズされ、フルオレセインの緑色蛍光が観察された。室温では、粒子はハイブリダイズし、フルオレセインからＣｙ３までのＦＲＥＴがＣｙ３の橙色蛍光を生成した。その後、これらの粒子は巨視的凝集物を形成し、これらは溶液から沈殿する。 ２６０ｎｍでの、遊離鎖ＤＮＡに対する温度の関数としての吸光度を示す。５２０ｎｍでのこれらの鎖から形成されたＤＮＡ−ＡｕＮＰ凝集物および２６０ｎｍでの同じ鎖から形成された中空ＤＮＡナノ複合体凝集物。 Ａ）ＧＡＰＤＨに対し正規化させたｄｈａｒｍａｆｅｃｔ（遊離）、ｓｉＲＮＡ−ＡｕＮＰおよびｓｉＲＮＡ−中空ナノ粒子で処理した細胞に対するＥＧＦＲ ｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ定量、Ｂ）ｓｉＲＮＡ−中空ナノ粒子で処理した細胞中のＥＧＦＲおよびＧＡＰＤＨに対するウエスタンブロットを示す図である。 Ａ）ポリマーコート１３ｎｍ ＡｕＮＰの溶解プロセス、Ｂ）溶解中の様々な時間点でのＡｕＮＰの正規化ＵＶ−Ｖｉｓスペクトル、Ｃ）ａ）ポリマーコートＡｕＮＰ、ｂ−ｃ）部分的に形成されたナノ複合体およびｄ）完全に形成されたナノ複合体のＴＥＭ画像（０．５％酢酸ウラニルによるネガティブ染色）を示す。 Ａ．）動的光散乱により測定されたＡｕＮＰ、ポリマーコートＡｕＮＰおよびポリマーナノ複合体（ＰＮＳ）の数平均流体力学直径（１３、２０、３０および４０ｎｍ）、Ｂ．）ａ）２０ｎｍ ＰＮＳおよびｂ）４０ｎｍ ＰＮＳのＴＥＭ画像（０．５％酢酸ウラニルによるネガティブ染色）を示す。ｃ）なぜナノカプセルがＴＥＭにおいてドーナツ形状として現れるのかが示される。黒：酢酸ウラニル染色剤。青：表面上で崩壊したＰＮＳ。 Ａ．）１の１Ｈ−１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。 Ｂ．）４の１Ｈ−１３Ｃ ＮＭＲのスペクトルを示す。 Ｃ．）４の１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹのスペクトルを示す。 Ｄ．）１（点線）および４（実線）のＩＲスペクトルを示す。 Ａ）５に対するＨＳＱＣを示す。 Ｂ）反応後の５に対するＨＳＱＣを示す。 Ｃ）反応前後の５に対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを示す。 Ａ）ＡｕＮＰとのインキュベーション後のＤＮＡ−プロパルギルエーテル複合体６のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｂ）６のＡｕＮＰとのインキュベーション後の６のアガロースゲル（３％）電気泳動を示し、３−アーム架橋が単一のアセチレン基を用いて可能となる（図１２）という提案された架橋メカニズムの予測を確認する。 Ａ．）ストレプトアビジンおよびＨＲＰを含むプロテオナノ複合体の作成、Ｂ．）プロテオナノ複合体のＨＲＰ活性の表面に基づく発色分析を示す。 プロテオナノ複合体のＨＲＰ−触媒発色分析を示す図であり、ストレプトアビジンおよびＨＲＰのナノ複合体シェルへの組み込みの成功およびタンパク質機能の保持が示される。 アルキン部分およびリン脂質を含むポリマーおよびＡＰＯ１Ａタンパク質を使用することによる、中空ＨＤＬナノ粒子の形成のための可能性のある経路を示す。 ポリアルキン架橋のための可能性のある経路を示す。
複数のナノ複合体を含む組成物が、本明細書で提供され、ここで、各ナノ複合体が規定された構造を有し、単層中の複数の架橋された生体分子を含み、構造は表面により規定され、複数のナノ複合体は単分散され、表面の存在は、構造が規定された後には任意である。
開示されるナノ複合体は、例えば、Rosi et al.、Chem. Rev. 105(4): 1547−1562 (2005)、Taton et al.、Science 289(5485): 1757−1760 (2000)、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２３２５号および米国特許第６，３６１，９４４号に記載される機能化ナノ粒子の有効な代替物となり、というのは、それらはトランスフェクション剤なしで高い細胞取り込みを示し、急性毒性がなく、ヌクレアーゼ分解に対し抵抗性を示し、生体媒質において高い安定性を有するからである。これらの特性の組み合わせは重要である、というのは、生体分子−機能化ナノ粒子の著しく高い取り込みにもかかわらず、それらはこれまで試験した細胞型において毒性を示さず（下記表１を参照されたい）、この特性は、オフターゲット効果を減少させるために治療薬送達用途に対し重要であるからである。
このように、本開示は、ナノ複合体の生成に関する組成物および方法を提供する。１つの態様では、ナノ複合体は、互いに架橋され、表面に付着された生体分子を含む。いくつかの態様では、表面は溶解され、中空ナノ複合体が残る。よって本明細書で使用される生体分子および／または非生体分子を含むナノ複合体は、表面が保持されるナノ複合体または表面が本明細書で記載されるように溶解されたナノ複合体のいずれかを意味すると理解することができるであろう。表面が溶解されたナノ複合体は本明細書では、中空ナノ複合体または中空粒子と呼ばれる。
したがって、各ナノ複合体が規定された構造を有し、単層中に複数の架橋された生体分子を含む、複数のナノ複合体が提供される。各ナノ複合体の構造は、（ｉ）ナノ複合体の製造において使用された表面（ｉｉ）ナノ複合体を形成する生体分子の型、および（ｉｉｉ）表面上および／またはその周りでの個々の生体分子の架橋の程度および型により規定される。表面は、ナノ複合体の生成のために不可欠であり、表面はナノ複合体の構造の維持に不可欠ではない。よって、別の実施形態では、複数のナノ複合体は、それらの生成において使用される表面を含み、またはその複数が部分的な表面を含み、またはその複数は表面を含まない。
「表面」という用語は、その上またはその周りでナノ複合体が形成する構造を意味する。
本明細書では、「生体分子」はポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、小分子、治療薬、コントラスト剤およびそれらの組み合わせを含むと理解される。
本明細書および添付の特許請求の範囲では、単数形「１つの（a、an）」および「その（the）」は、文脈で明確に別記されない限り複数の言及を含むことに注意すべきである。
本明細書では、「約」という用語は、およそを意味すると理解されることにも注意すべきである。
「付着」、「結合」および「機能化」という用語は、本明細書では同じ意味で使用され、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、金属錯体、小分子、治療薬、コントラスト剤およびそれらの組み合わせの表面との関係を示すことにさらに注意すべきである。
本明細書では、「大部分」は集団（例えば、限定はされないが、生体分子の集団またはナノ複合体の集団）の５０％超を意味する。また、本明細書では、「実質的に全て」は、集団の９０％以上を意味する。
ナノ複合体
生体分子/非生体分子
提供されるナノ複合体の基本成分は、複数の生体分子である。しかしながら、別の実施形態では、１つ以上非生体分子が複数の生体分子中に含まれるナノ複合体が提供される。製造方法のために、得られたナノ複合体は、せいぜい、生体分子または生体分子および非生体分子の混合物の単層である。本明細書では、「単層」は生体分子および／または非生体分子の単一層のみがナノ複合体の表面で架橋されることを意味する。
本明細書では、生体分子としては、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、小分子、治療薬、コントラスト剤およびそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書では、非生体分子としては、希釈剤分子、金属錯体および当技術分野で知られている任意の非炭素含有分子が挙げられるが、それらに限定されない。
ナノ複合体の様々な態様では、生体分子はすべて同一であり、または、別の態様では、少なくとも２つの生体分子は異なる。同様に、非生体分子が含まれる場合、１つの態様では非生体分子はすべて同一であり、別の態様では少なくとも２つの非生体分子は異なる。生体分子が全て同一であり、非生体分子が全て同一である場合の組み合わせは、少なくとも２つの生体分子が全て同一である非生体分子と組み合わされる、生体分子は全て同一であり、少なくとも２つの非生体分子は異なる、少なくとも２つの異なる生体分子が少なくとも２つの異なる非生体分子と組み合わされる混合物と共に、企図される。
本明細書では、生体分子および／または非生体分子は、ナノ複合体構造に不可欠な構造生体分子および／または構造非生体分子、あるいはナノ複合体構造に不可欠ではない非構造生体分子および／または非構造非生体分子のいずれかであると理解されるであろう。生体分子および／または非生体分子が非構造性であるいくつかの態様では、生体分子および／または非生体分子は架橋部分を含まない。この開示では、非構造生体分子および非構造非生体分子は追加の作用物質と呼ばれる。
構造
ナノ複合体の「構造」は、様々な態様では、（ｉ）ナノ複合体の製造において使用された表面（ｉｉ）ナノ複合体を形成する生体分子の型、および／または（ｉｉｉ）表面上および／またはその周りでの個々の生体分子間の架橋の程度および型により規定されることが理解される。
提供されるナノ複合体のあらゆる態様では、生体分子は、非生体分子と共に、または非生体分子なしで、架橋される。非生体分子と共に、または非生体分子なしでの生体分子間の架橋は、架橋することができる各生体分子のある部分で実施される。ナノ複合体が生体分子および非生体分子の両方を構造成分として含む場合、生体分子および非生体分子は、いくつかの態様では共に結合される。生体分子および／または非生体分子が複数の架橋部分を含む場合、ナノ複合体の形成においてある程度の分子内架橋が生じ得ることは認識されるであろう。
いくつかの態様では、架橋部分は活性化されて架橋することができる部分である。活性化部分は、生体分子、および／または存在する場合非生体分子上に存在する架橋部分が、その部分が、架橋部分を含む別の生体分子、および／または存在する場合非生体分子に架橋できるようにする状態にあることを意味する。複数の生体分子および／または非生体分子上の架橋部分は、その複数におけるあらゆる生体分子および／または非生体分子に対し同じとすることができ、またはその複数における少なくとも２つの生体分子および／または非生体分子は異なる架橋部分を含むことができる。単一の生体分子および／または非生体分子はまた１を超える架橋部分を含むように企図され、それらの部分は同じかまたは異なるものとすることができる。
１つの態様では、架橋部分は、各生体分子、および／または存在する場合非生体分子中の同じ位置に配置され、これはある条件下では、全ての生体分子および非生体分子を同じ方向に配向させる。
別の態様では、架橋部分は生体分子、および／または非生体分子中の異なる位置に配置され、これはある条件下では、架橋後に生体分子の混交配向を提供することができる。
形状
その複数の各ナノ複合体の形状は、その生成において使用される表面により、任意でその生成において使用される生体分子および／または非生体分子により、ならびに生体分子および／または非生体分子間の架橋の程度および型により決定される。表面は、様々な態様では、平面または三次元である。必然的に平面表面は平面ナノ複合体を生じさせ、三次元表面は三次元表面を模倣する三次元形状を生じさせる。表面が除去された場合、平面表面を用いて形成されたナノ複合体は依然として平面であり、三次元表面を用いて形成されたナノ複合体は三次元表面の形状を有し、中空となるであろう。
密度
架橋の程度および調製混合物中の、開始成分、すなわち、生体分子または生体分子および非生体分子の混合物の量によって、提供されるナノ複合体は、様々な密度を有するように企図される。このように、表面は、１つの態様では、架橋生体分子または生体分子および非生体分子の架橋混合物により完全に被覆され、または別の態様では、架橋生体分子または生体分子および非生体分子の架橋混合物によりかなり被覆され、あるいは架橋生体分子または生体分子および非生体分子の架橋混合物によりわずかに被覆される。１つの態様では、表面の被覆密度は、全表面にわたって均一であり、または別の態様では、密度は表面にわたって不均一である。
ナノ複合体の架橋生体分子または生体分子および非生体分子の架橋混合物の密度、および／または表面にわたる密度の均一性または均一性の喪失は、ナノ複合体の多孔性を決定するであろう。様々な態様では、多孔性は、表面が除去された後、ナノ複合体の以下で記載される追加の、非構造作用物質をナノ複合体の内部に捕捉する能力を決定する。
追加の作用物質
非構造成分に関しては、提供されるナノ複合体は、１つの態様では、上記で記載されるように、中空ナノ複合体の内部に捕捉される追加の作用物質を任意で含む。また、追加の作用物質は、構造架橋生体分子または架橋生体分子および非生体分子の混合物中に埋め込まれ、または巻き込まれ、あるいは構造架橋生体分子または架橋生体分子および非生体分子の混合物の１つまたは両方の表面に単純に結合される。この追加の作用物質は、１つの態様ではナノ複合体と共有結合され、または別の態様では、ナノ複合体と非共有結合されることが企図される。しかしながら、本開示は、１つ以上の追加の作用物質が、ナノ複合体と共有結合および非共有結合の両方により結合されるナノ複合体を提供することが理解される。非共有結合としては、ハイブリダイゼーション（すなわち、ポリヌクレオチド間）、タンパク質結合（すなわち、結合することができるタンパク質間）および／または疎水性相互作用（すなわち、脂質と、十分疎水性のドメインを含む他の作用物質の間）が挙げられることも理解されるであろう。他の態様では、追加の作用物質は、中空ナノ複合体の内部に捕捉される。ナノ複合体がこの追加の作用物質を含む場合、１つの態様では、追加の作用物質の全てが同じである、他の態様では、追加の作用物質の少なくとも２つが異なることが企図される。
本開示により企図される追加の作用物質としては、生体分子、非生体分子、検出可能なマーカー、コーティング、ポリマー剤、コントラスト剤、塞栓剤、低分子内部相補的ポリヌクレオチド（ｓｉｃＰＮ）、転写制御因子、治療薬、抗生物質および標的部分が挙げられるが、それらに限定されない。これらの型の追加の作用物質は下記で詳細に記載される。
生体分子/非生体分子
他の生体分子および／または非生体分子に架橋する能力を有する生体分子、および存在する場合非生体分子は、ナノ複合体の構造成分を表す。上記のように、生体分子および非生体分子はまた、ナノ複合体の追加の非構造作用物質となるように企図される。記載されるように、生体分子としては、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、小分子、治療薬、コントラスト剤およびそれらの組み合わせが挙げられる。
本開示の構造生体分子および／または非生体分子の全てに共通するのは、これらが１つ以上の架橋部分を含むことである。非構造生体分子および／または非生体分子は、架橋能力を有するか、または有しないことが企図されるが、架橋する非構造生体分子および／または非生体分子はナノ複合体構造を維持するのに不可欠ではない。
以下の記載は、構造または非構造のいずれかである生体分子および／または非生体分子について取り組む。上記のように、追加の作用物質としての非構造生体分子および非生体分子はまた、下記の別のセクションで詳細に記載される。
ポリヌクレオチド
本開示により企図されるポリヌクレオチドとしては、本明細書で規定されるＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾形態およびそれらの組み合わせが挙げられる。したがって、いくつかの態様では、ナノ複合体はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは二本鎖であり、さらなる実施形態では、ＤＮＡは一本鎖である。さらなる態様では、ナノ複合体はＲＮＡを含み、さらに別の態様では、ナノ複合体は二本鎖ＲＮＡを含み、特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ作用物質は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。「ＲＮＡ」という用語は、２つの別個の鎖の二本鎖、ならびに一本鎖構造を含む。一本鎖ＲＮＡはまた、二次構造を有するＲＮＡを含む。１つの態様では、ヘアピンループを有するＲＮＡが企図される。
ナノ複合体が複数の構造ポリヌクレオチド生体分子を含む場合、ポリヌクレオチドは、いくつかの態様では、ポリヌクレオチドの標的配列に十分相補的である配列を含み、よって、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションが起こる。ポリヌクレオチドは、様々な態様では、二本鎖分子がまた、標的ポリヌクレオチドの一本鎖配列にハイブリダイズする一本鎖配列を含む限り、一本鎖または二本鎖である。いくつかの態様では、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは二本鎖標的ポリヌクレオチドと三本鎖構造を形成する可能性がある。別の態様では、三本鎖構造は、ナノ複合体の一部である二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより形成され得る。三本鎖ポリヌクレオチド複合物のさらなる説明は、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／４０１２４号において見られ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるスペーサを含む。スペーサは、１つの態様では、１つのポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドへの架橋を促進する１つ以上の架橋部分を含む。
「ポリヌクレオチド」は、当技術分野においては、個々に重合されたヌクレオチドサブユニットを含むと理解される。「ヌクレオチド」という用語またはその複数形は、本明細書では、本明細書で記載される、およびそうでなければ当技術分野で知られている修飾形態と置換可能である。場合によっては、当技術は、天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドを含む非天然ヌクレオチドを包含する「核酸塩基」という用語を使用する。よって、ヌクレオチドまたは核酸塩基は天然核酸塩基、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を意味する。非天然核酸塩基としては、例えば、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよびBenner et al., 米国特許第５，４３２，２７２号およびSusan M. Freier and Karl−Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: pp 4429−4443に記載される「非天然」核酸塩基が挙げられるがそれらに限定されない。「核酸塩基」という用語はまた、公知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、それらの複素環類似体および互変異性体を含む。さらなる天然および非天然核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号(Merigan, et al.)、Chapter 15 by Sanghvi, in アンチセンス Research and Application, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993、in Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613−722 (特に６２２および６２３ページを参照されたい)、およびConcise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990, pages 858−859, Cook, Anti−Cancer Drug Design 1991, 6, 585−607, 1990, pages 858−859, Cook, Anti−Cancer Drug Design 1991, 6, 585−607（それらの各々は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる）で開示されるものが挙げられる。様々な態様では、ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の「ヌクレオシド塩基」または「塩基ユニット」を含み、これらは核酸塩基のように機能することができる複素環化合物などの化合物を含む非天然ヌクレオチドのカテゴリであり、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能する「ユニバーサル塩基」が含まれる。ユニバーサル塩基としては、３−ニトロピロール、任意で置換されたインドール（例えば、５−ニトロインドール）、および任意で置換されたヒポキサンチンが挙げられる。他の望ましいユニバーサル塩基としては、ピロール、ジアゾールまたはトリアゾール誘導体、例えば当技術分野で知られているユニバーサル塩基が挙げられる。
修飾ヌクレオチドはＥＰ １ ０７２ ６７９号およびＷＯ ９７／１２８９６号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾ヌクレオチドとしては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンおよび他のピリミジン塩基のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられるが、それらに限定されない。さらなる修飾塩基としては、三環系ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。修飾塩基はまた、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンと置換されたものを含み得る。追加の核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号において開示されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858−859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990において開示されたもの、Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613により開示されたもの、ならびにSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289−302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993により開示されたものが挙げられる。これらの塩基のいくつかは、結合親和性を増加させるのに有用であり、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６−置換プリン、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシン置換が、核酸二本鎖安定性を０．６−１．２℃だけ増加させることが示されており、ある態様では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号；５，１３０，３０２号；５，１３４，０６６号；５，１７５，２７３号；５，３６７，０６６号；５，４３２，２７２号；５，４５７，１８７号；５，４５９，２５５号；５，４８４，９０８号；５，５０２，１７７号；５，５２５，７１１号；５，５５２，５４０号；５，５８７，４６９号；５，５９４，１２１号、５，５９６，０９１号；５，６１４，６１７号；５，６４５，９８５号；５，８３０，６５３号；５，７６３，５８８号；６，００５，０９６号；５，７５０，６９２号および５，６８１，９４１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
所定の配列のポリヌクレオチドの製造方法はよく知られている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) and F. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, 1st Ed. (Oxford University Press, New York, 1991)を参照されたい。固相合成法は、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドのために好ましい（ＤＮＡを合成するよく知られた方法はまた、ＲＮＡを合成するのに有用である）。ポリリボヌクレオチドはまた、酵素的に調製することができる。非天然核酸塩基は、同様に、ポリヌクレオチドに組み込むことができる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号; Katz, J. Am. Chem. Soc., 74:2238 (1951); Yamane, et al., J. Am. Chem. Soc., 83:2599 (1961); Kosturko, et al., Biochemistry, 13:3949 (1974); Thomas, J. Am. Chem. Soc., 76:6032 (1954); Zhang, et al., J. Am. Chem. Soc., 127:74−75 (2005); およびZimmermann, et al., J. Am. Chem. Soc., 124:13684−13685 (2002)を参照されたい。
ポリヌクレオチド、またはその修飾形態を鋳型化するために使用された提供される表面は一般に約５ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド長のポリヌクレオチドを含む。より詳細には、ナノ複合体は、約５〜約９０ヌクレオチド長、約５〜約８０ヌクレオチド長、約５〜約７０ヌクレオチド長、約５〜約６０ヌクレオチド長、約５〜約５０ヌクレオチド長、約５〜約４５ヌクレオチド長、約５〜約４０ヌクレオチド長、約５〜約３５ヌクレオチド長、約５〜約３０ヌクレオチド長、約５〜約２５ヌクレオチド長、約５〜約２０ヌクレオチド長、約５〜約１５ヌクレオチド長、約５〜約１０ヌクレオチド長のポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチドが所望の結果を達成することができる程度まで特定的に開示されるそのサイズの長さの中間にあるポリヌクレオチド全てを含む。したがって、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上のヌクレオチド長のポリヌクレオチドが企図される。
本明細書で規定されるように、ポリヌクレオチドはアプタマーを含む。アプタマーの生成および使用は、当業者に知られている。一般に、アプタマーは、標的リガンドに強く結合し、慎重に区別することができる核酸またはペプチド結合種である[Yan et al., RNA Biol. 6(3) 316−320 (2009)、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる]。いくつかの実施形態では、アプタマーは、試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）プロセスと呼ばれる技術により得ることができる[Tuerk et al., Science 249:505−10 (1990)、米国特許第５，２７０，１６３号および米国特許第５，６３７，４５９号、各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる］。核酸アプタマーの一般的な記載は、例えば、限定はされないが、Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols (Mayer編, Humana Press, 2009)およびCrawford et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2(1): 72−79 (2003)において見られる。ＲＮＡアプタマーの選択、ＤＮＡアプタマーの選択、標的タンパク質に共有結合することができるアプタマーの選択、修飾アプタマーライブラリの使用および診断薬および治療薬としてのアプタマーの使用を含むがそれらに限定されない、アプタマーの追加の記載は、Kopylov et al., Molecular Biology 34(6): 940−954 (2000) translated from Molekulyarnaya Biologiya, Vol. 34, No. 6, 2000, pp. 1097−1113（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において提供される。様々な態様では、アプタマーは１０−１００ヌクレオチド長の間である。
スペーサ
ある態様では、ナノ複合体がさらにスペーサを含む生体分子を含むものを含有するナノ複合体が企図される。様々な態様では、スペーサは下記で記載される１つ以上の架橋部分を含む。
本明細書では、「スペーサ」は１つ以上の架橋部分を含むように、または、ナノ複合体がナノ粒子を含むいくつかの態様では、ナノ粒子と生体分子の間の距離を増加させる、または、複数のコピーでナノ粒子に付着された場合、個々の生体分子間の距離を増加させるように機能する部分を意味する。ナノ複合体が生物活性のために使用される、本開示の態様では、スペーサは、それが付着される生体分子の活性に直接関与しないことが企図される。
よって、いくつかの態様では、スペーサは本明細書では１つ以上の架橋部分を介して架橋を促進ように企図される。様々な態様では、スペーサはさらに、生体分子が同じ配列を有するか、異なる配列を有するかに関係なく、個々の生体分子間にタンデムに配置されるものとして企図される。１つの態様では、スペーサは存在する場合、有機部分である。別の態様では、スペーサはポリマーであり、水溶性ポリマー、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
スペーサがポリヌクレオチドである場合、スペーサの長さは、様々な実施形態では、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、または３０をさらに超えるヌクレオチドである。スペーサは、ポリヌクレオチドの、ナノ粒子または標的ポリヌクレオチドに結合する能力を妨害しない任意の配列を有し得る。スペーサは、互いに、またはポリヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するべきではないが、標的ポリヌクレオチドにすべて、または一部相補的であってもよい。ある態様では、ポリヌクレオチドスペーサの塩基は全てアデニン、全てチミン、全てシチジン、全てグアニン、全てウラシル、全ていくつかの他の修飾塩基である。
修飾ポリヌクレオチド
上記で記載されるように、修飾ポリヌクレオチドは、ナノ複合体を生成させる際に使用するために企図され、表面により鋳型化される。様々な態様では、表面上で鋳型化されたポリヌクレオチドは、完全修飾または部分修飾される。よって、様々な態様では、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドユニットの１つ以上、または全ての糖および／または１つ以上または全てのヌクレオチド間結合が「非天然」基により置換される。
１つの態様では、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を企図する。ＰＮＡ化合物では、ポリヌクレオチドの糖バックボーンは、アミド含有バックボーンにより置換される。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号；５，７１４，３３１号；および５，７１９，２６２号、ならびにNielsen et al., Science, 1991, 254, 1497−1500（開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
開示されたポリヌクレオチドのために企図されるヌクレオチドと非天然ヌクレオチドの間の他の結合としては、米国特許第４，９８１，９５７号；５，１１８，８００号；５，３１９，０８０号；５，３５９，０４４号；５，３９３，８７８号；５，４４６，１３７号；５，４６６，７８６号；５，５１４，７８５号；５，５１９，１３４号；５，５６７，８１１号；５，５７６，４２７号；５，５９１，７２２号；５，５９７，９０９号；５，６１０，３００号；５，６２７，０５３号；５，６３９，８７３号；５，６４６，２６５号；５，６５８，８７３号；５，６７０，６３３号；５，７９２，７４７号；および５，７００，９２０号；米国特許公開第２００４０２１９５６５号；国際特許公開第ＷＯ９８／３９３５２号およびＷＯ９９／１４２２６号；Mesmaeker et. al., Current Opinion in Structural Biology 5:343−355 (1995)およびSusan M. Freier and Karl−Heinz Altmann, Nucleic Acids Research, 25:4429−4443 (1997)（開示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載されるものが挙げられる。
ポリヌクレオチドの具体例としては、修飾バックボーンまたは非天然ヌクレオシド間結合を含むものが挙げられる。修飾バックボーンを有するポリヌクレオチドとしては、バックボーン中にリン原子を保持するものおよびバックボーン中にリン原子を有さないものが挙げられる。リン原子をそのヌクレオシド間バックボーン中に有さない修飾ポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の意味の範囲内にあると考えられる。
リン原子を含む修飾ポリヌクレオチドバックボーンとしては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィナート、ホスホロアミダート、例えば３’−アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、またはチオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェート（普通の３’−５’結合を有する）、これらの２’−５’結合類似体、および逆極性を有するもの（１つ以上のヌクレオチド間結合は、３’−３’、５’−５’または２’−２’結合である）が挙げられる。逆極性を有し、最も３’−のヌクレオチド間結合で単一の３’−３’結合、すなわち、脱塩基（ヌクレオチドが欠失している、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）であり得る単一の逆ヌクレオシド残基を含むポリヌクレオチドもまた企図される。塩、混合塩および遊離酸形態もまた、企図される。
上記リン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号；４，４６９，８６３号；４，４７６，３０１号；５，０２３，２４３号；５，１７７，１９６号；５，１８８，８９７号；５，２６４，４２３号；５，２７６，０１９号；５，２７８，３０２号；５，２８６，７１７号；５，３２１，１３１号；５，３９９，６７６号；５，４０５，９３９号；５，４５３，４９６号；５，４５５，２３３号；５，４６６，６７７号；５，４７６，９２５号；５，５１９，１２６号；５，５３６，８２１号；５，５４１，３０６号；５，５５０，１１１号；５，５６３，２５３号；５，５７１，７９９号；５，５８７，３６１号；５，１９４，５９９号；５，５６５，５５５号；５，５２７，８９９号；５，７２１，２１８号；５，６７２，６９７号および５，６２５，０５０号（開示は参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
リン原子を含まない修飾ポリヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを含む。これらとしては、モルホリノ結合を有するもの；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；リボアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他のものが挙げられる。さらに他の実施形態では、米国特許第５，４８９，６７７号および５，６０２，２４０号に記載される、ホスホロチオエートバックボーンを有するポリヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを有するオリゴヌクレオシドが提供され、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む。例えば、米国特許第５，０３４，５０６号；５，１６６，３１５号；５，１８５，４４４号；５，２１４，１３４号；５，２１６，１４１号；５，２３５，０３３号；５，２６４，５６２号；５，２６４，５６４号；５，４０５，９３８号；５，４３４，２５７号；５，４６６，６７７号；５，４７０，９６７号；５，４８９，６７７号；５，５４１，３０７号；５，５６１，２２５号；５，５９６，０８６号；５，６０２，２４０号；５，６１０，２８９号；５，６０２，２４０号；５，６０８，０４６号；５，６１０，２８９号；５，６１８，７０４号；５，６２３，０７０号；５，６６３，３１２号；５，６３３，３６０号；５，６７７，４３７号；５，７９２，６０８号；５，６４６，２６９および５，６７７，４３９号（開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
様々な形態において、ポリヌクレオチド中の２つの連続するモノマー間の結合は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、−Ｓｉ（Ｒ’’）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ’’）−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、および−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−から選択される２〜４、望ましくは３の基／原子から構成され、ここでは、ＲＨは水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ’’はＣ１−６−アルキルおよびフェニルから選択される。そのような結合の例示的な例は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続のモノマーへの結合として使用される場合Ｒ５を含む）、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＨ２−−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＳ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｃ（＝ＮＲＨ）−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝（後続のモノマーへの結合として使用される場合Ｒ５を含む）、−ＣＨ２−Ｏ−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲＨ、−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続のモノマーへの結合として使用される場合Ｒ５を含む）、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−；−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ’’）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ’’）２−Ｏ−であり；その中で−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−Ｏ−Ｐ（−Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−ＮＲＨＰ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ’’）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ３）−Ｏ−、および−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−が企図され、ここで、ＲＨは水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ’’はＣ１−６−アルキルおよびフェニルから選択される。さらなる例示的な例がMesmaeker et. al., 1995, Current Opinion in Structural Biology, 5: 343−355および Susan M. Freier and Karl−Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol 25: pp 4429−4443において与えられる。
ポリヌクレオチドのさらに別の修飾形態は、米国特許出願第２００４０２１９５６５号において詳細に記載され、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
修飾ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の置換糖部分を含み得る。ある態様では、ポリヌクレオチドは、２’位に下記のうちの１つを含み：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。他の実施形態はＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含み、ここでｎおよびｍは１〜約１０である。他のポリヌクレオチドは、２’位に下記のうちの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、ポリヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはポリヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。１つの態様では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）(Martin et al., 1995, Helv. Chim. Acta, 78: 486−504)すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。他の修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野では、２’−Ｏ−ジメチルアミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
さらに別の修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−修飾はアラビノ（アップ）位またはリボ（ダウン）位に存在し得る。１つの態様では、２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様の修飾はまた、ポリヌクレオチド上の他の位置で、例えば、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位でまたは２’−５’結合ポリヌクレオチドにおいて、および５’末端ヌクレオチドの５’位でなされ得る。ポリヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりに糖模倣物、例えばシクロブチル部分を有し得る。例えば米国特許第４，９８１，９５７号；５，１１８，８００号；５，３１９，０８０号；５，３５９，０４４号；５，３９３，８７８号；５，４４６，１３７号；５，４６６，７８６号；５，５１４，７８５号；５，５１９，１３４号；５，５６７，８１１号；５，５７６，４２７号；５，５９１，７２２号；５，５９７，９０９号；５，６１０，３００号；５，６２７，０５３号；５，６３９，８７３号；５，６４６，２６５号；５，６５８，８７３号；５，６７０，６３３号；５，７９２，７４７号；および５，７００，９２０号（それらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
１つの態様では、糖の修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に結合され、よって二環糖部分が形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。結合は、ある態様では、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、ｎは１または２である。ＬＮＡおよびその調製は、ＷＯ９８／３９３５２号およびＷＯ９９／１４２２６号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載される。
ポリヌクレオチド特徴
提供される各ナノ複合体は複数の生体分子を含み、様々な態様では、生体分子はポリヌクレオチドである。結果として、各ナノ複合体は十分相補的な配列を有する複数の標的ポリヌクレオチドに結合する能力を有する。例えば、特定のポリヌクレオチドが標的とされる場合、単一のナノ複合体は同じ分子の複数のコピーに結合する能力を有する。１つの態様では、ナノ複合体が同一のポリヌクレオチドを含む、すなわち、各ポリヌクレオチドが同じ長さおよび同じ配列を有する方法が提供される。他の態様では、ナノ複合体は同一ではない２つ以上のポリヌクレオチドを含み、すなわち、ナノ複合体のポリヌクレオチドの少なくとも１つが、ナノ複合体の他のポリヌクレオチドの少なくとも１つと、異なる長さおよび／または異なる配列を有するという点で異なる。ナノ複合体が異なるポリヌクレオチドを含む態様では、これらの異なるポリヌクレオチドは同じ単一の標的ポリヌクレオチドに、異なる位置で結合する、または異なる遺伝子産物をコードする異なる標的ポリヌクレオチドに結合する。したがって、様々な態様では、１を超える遺伝子産物の発現を阻止する方法において単一のナノ複合体が使用され得る。ポリヌクレオチドはこのように、遺伝子発現の所望のレベルの阻止を実施することが必要とされるので、標的ポリヌクレオチドにおける１つ以上の特定の領域で、または標的ポリヌクレオチドの全長にわたって関係なく、特定のポリヌクレオチドを標的とするように使用される。
したがって、１つの態様では、ポリヌクレオチドは、標的配列の知識を用いて設計される。また、ナノ複合体中のポリヌクレオチドは、本明細書で記載される所望の効果を達成するために、標的生体分子にハイブリダイズする必要はない。とにかく、所定の配列のポリヌクレオチドを作製する方法はよく知られている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989)およびF. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, 1st Ed. (Oxford University Press, New York, 1991)を参照されたい。オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方に対し固相合成法が企図される（ＤＮＡを合成するよく知られた方法はまた、ＲＮＡを合成するのに有用である）。オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドはまた、酵素的に調製することができる。
また、ポリヌクレオチドはライブラリから選択される。この型のライブラリの調製は、当技術分野においてよく知られている。例えば、オリゴヌクレオチドライブラリ：２００５年９月２９日に公開された米国特許出願２００５０２１４７８２号を参照されたい。
ナノ複合体の生成のために企図されるポリヌクレオチドとしては、１つの態様では、標的ポリヌクレオチドから発現される遺伝子産物の発現を調節するものが挙げられる。したがって、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、翻訳を阻止するアンチセンスポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、ＲＮＡｓｅ活性（例えばＲＮＡｓｅ Ｈ）を開始させるｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、二本鎖ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、転写を阻止する三重らせん形成ポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、翻訳を阻止するリボザイムが企図される。
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドを基本とするナノ複合体は、ナノ複合体の効率的な取り込みを可能にする。様々な態様では、ポリヌクレオチドは、ナノ複合体の取り込み効率を増加させるヌクレオチド配列を含む。本明細書では、「効率」は、細胞中での／によるナノ複合体の取り込みの数または速度を示す。ナノ複合体が細胞に出入りするプロセスは動的なものであるので、効率は、より多くのナノ複合体を取り込むことにより、または細胞に入ったそれらのナノ複合体をより長い期間保持することにより増加させることができる。同様に、効率は、より少ないナノ複合体を取り込むことにより、または細胞に入ったそれらのナノ複合体をより短い期間保持することにより減少させることができる。
よって、ヌクレオチド配列は、望ましい任意のヌクレオチド配列とすることができ、様々な態様では、ナノ複合体の細胞取り込みまたは遺伝子制御を増加または減少させるように選択され得る。ヌクレオチド配列は、いくつかの態様では、ポリヌクレオチドが付着されたナノ粒子が細胞によって取り込まれる効率に影響するホモポリマー配列を含む。したがって、ホモポリマー配列は効率を増加または減少させる。様々な態様では、ヌクレオチド配列は核酸塩基の組み合わせであり、そのため、厳密にはホモポリマー配列ではないこともまた企図される。例えば、限定はされないが、様々な態様では、ヌクレオチド配列は交互のチミジンおよびウリジン残基、２つのチミジン、その後２つのウリジンまたは取り込みの増加に影響する任意の組み合わせを含み、本開示により企図される。いくつかの態様では、取り込み効率に影響するヌクレオチド配列は、追加の配列を含むポリヌクレオチド中にあるドメインとして包含される。この「ドメイン」は、取り込み効率に影響する特徴として機能するように働き、一方、追加のヌクレオチド配列は、例えば、限定はされないが、遺伝子発現を制御するように機能するように働く。様々な態様では、ポリヌクレオチド中のドメインは、ナノ複合体に対し近位、遠位、または中心位置のいずれかに位置することができる。ポリヌクレオチドは１を超えるドメインを含むこともまた企図される。
ホモポリマー配列は、いくつかの実施形態では、細胞によるナノ複合体の取り込み効率を増加させる。いくつかの態様では、ホモポリマー配列はチミジン残基（ポリＴ）またはウリジン残基（ポリＵ）の配列を含む。さらなる態様では、ポリＴまたはポリＵ配列は２つのチミジンまたはウリジンを含む。様々な態様では、ポリＴまたはポリＵ配列は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００以上のチミジンまたはウリジン残基を含む。
いくつかの実施形態では、ホモポリマー配列を含むポリヌクレオチドを含むナノ複合体は同じポリヌクレオチドを含むが、ホモポリマー配列が欠けているナノ複合体よりも大きな効率で、細胞に取り込まれることが企図される。様々な態様では、ホモポリマー配列を含むポリヌクレオチドを含むナノ複合体は、同じポリヌクレオチドを含むが、ホモポリマー配列が欠けているナノ複合体よりも、細胞により約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍以上、より効率的に取り込まれる。
他の態様では、ドメインはホスフェートポリマー（Ｃ３残基）である。いくつかの態様では、ドメインは、２つのホスフェートを含むホスフェートポリマー（Ｃ３残基）を含む。様々な態様では、Ｃ３残基は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００以上のホスフェートを含む。
いくつかの実施形態では、あるドメインを含むポリヌクレオチドを含むナノ複合体は、同じポリヌクレオチドを含むが、ドメインが欠けているナノ複合体よりも低い効率で、細胞により取り込まれることが企図される。様々な態様では、あるドメインを含むポリヌクレオチドを含むナノ複合体は、同じポリヌクレオチドを含むが、ドメインが欠けているナノ複合体よりも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍以上、低い効率で細胞により取り込まれる。
本明細書では、「結合部位」は、コントラスト剤が付着されるポリヌクレオチド上の部位を意味することが理解される。ある態様では、本開示はまた、ナノ複合体の一部であり、結合部位を含まない１つ以上のポリヌクレオチド、同じナノ複合体の一部であり、結合部位を含む１つ以上ポリヌクレオチドを提供する。コントラスト剤のナノ複合体への結合部位を介する結合は一般にＰＣＴ／ＵＳ２０１０／４４８４４号において記載され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示は、１つの態様では、ポリヌクレオチドを含むナノ複合体を提供し、ここで、ポリヌクレオチドは１から約１０の結合部位を含む。別の態様では、ポリヌクレオチドは５の結合部位を含む。一般に、ヌクレオチドでは、そのバックボーン（リン酸基）および核酸塩基は両方とも修飾され得る。したがって、本開示は、２ｎ個の結合部位が存在し、ｎ＝ポリヌクレオチド鋳型の長さであることを企図する。関連する態様では、組成物は複数のポリヌクレオチドを含むナノ複合体を含むことが企図される。いくつかの態様では、複数のポリヌクレオチドは、コントラスト剤が１つ以上の結合部位を介して結合された少なくとも１つのポリヌクレオチド、ならびに本明細書で記載される遺伝子制御活性を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
したがって、いくつかの実施形態では、ナノ複合体の一部である１つ以上のポリヌクレオチドは、コントラスト剤に結合されず、一方、同じナノ複合体の一部である１つ以上のポリヌクレオチドはコントラスト剤に結合されることが企図される。
本開示はまた、ポリヌクレオチドを含むナノ複合体を含み、さらに、標的細胞内で標的ポリヌクレオチドの転写を誘導する転写制御因子を含む組成物を提供する。
ポリヌクレオチド長
提供される組成物および方法におけるナノ複合体は、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、またはその修飾形態を含み、これは約５〜約１００ヌクレオチド長である。ポリヌクレオチドが約５〜約９０ヌクレオチド長、約５〜約８０ヌクレオチド長、約５〜約７０ヌクレオチド長、約５〜約６０ヌクレオチド長、約５〜約５０ヌクレオチド長約５〜約４５ヌクレオチド長、約５〜約４０ヌクレオチド長、約５〜約３５ヌクレオチド長、約５〜約３０ヌクレオチド長、約５〜約２５ヌクレオチド長、約５〜約２０ヌクレオチド長、約５〜約１５ヌクレオチド長、約５〜約１０ヌクレオチド長、およびポリヌクレオチドが所望の結果を達成することができる程度まで特定的に開示されるサイズの長さの中間にあるポリヌクレオチド全てである方法もまた企図される。したがって、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４，２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、および１００以上のヌクレオチド長のポリヌクレオチドが企図される。
ポリヌクレオチドコピー−同じ／異なる配列
単一ポリヌクレオチドにおける単一配列または単一ポリヌクレオチドにおける単一配列の複数のコピーはナノ複合体の一部であるものを含むナノ複合体が提供される。よって様々な態様では、単一の配列の複数のコピーがタンデムである、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のタンデム反復であるポリヌクレオチドが企図される。
また、ナノ複合体は異なる配列を有する少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。上記のように、異なるポリヌクレオチド配列は、様々な態様では、タンデムに（すなわち、単一のポリヌクレオチド上）および／または複数のコピーで（すなわち、少なくとも２つのポリヌクレオチド上）配列される。異なる配列を有するポリヌクレオチドがナノ複合体の一部である方法では、本開示の態様は、異なるポリヌクレオチド配列が同じポリヌクレオチド上の異なる領域にハイブリダイズするものを含む。また、異なるポリヌクレオチド配列は、異なるポリヌクレオチドにハイブリダイズする。
ポリペプチド
本明細書では、「ポリペプチド」はアミノ酸残基からなるポリマーを示す。本開示のいくつかの態様では、ナノ複合体は本明細書で記載されるポリペプチドを含む。ポリペプチドは当技術分野で理解されており、それらとしては、抗体、酵素、構造ポリペプチドおよびホルモンが挙げられるが、それらに限定されない。関連する態様では、ポリペプチドを含むナノ複合体は、標的分子を認識し、それと結合し、標的分子の検出を可能にする。本開示のポリペプチドは、それぞれ本明細書で記載される生体分子または追加の作用物質とすることができる。
本開示のポリペプチドは天然かまたは非天然とすることができる。ポリペプチドは任意で、上記本明細書で記載されるスペーサを含む。上記のように、構造ポリペプチドは、架橋部分を有し、それを介してポリペプチドは、ナノ複合体調製プロセスにおいて１つ以上の他の生体分子と架橋することができる。ポリペプチドが追加の作用物質である場合、ポリペプチドは、架橋部分を含む必要はないが、含んでもよい。追加のポリペプチド作用物質が架橋部分を含む場合、ポリペプチドは一般に、ナノ複合体が構造完全性を維持するのに必要とされる様式ではナノ複合体に架橋しない。
天然ポリペプチド
天然ポリペプチドとしては、自然に存在し、または、例えば化学合成もしくは組み換え発現技術により自然で見られる形態で生成させることができる生物活性ポリペプチド（抗体を含む）が挙げられるが、それらに限定されない。天然ポリペプチドはまた、リポタンパク質および翻訳後修飾タンパク質、例えば、例として限定はされないが糖化タンパク質を含む。
本開示の方法および組成物において使用するために企図される抗体としては、インビボまたはインビトロのいずれかで標的分子を認識し、結合する抗体が挙げられるが、それらに限定されない。
本開示により企図される構造ポリペプチドとしては、アクチン、チューブリン、コラーゲン、エラスチン、ミオシン、キネシンおよびダイニンが挙げられるが、それらに限定されない。
非天然ポリペプチド
本開示により企図される非天然ポリペプチドとしては、合成ポリペプチド、ならびに本明細書で規定される天然または非天然ポリペプチドの断片、類似体および変異体が挙げられるが、それらに限定されない。非天然ポリペプチドはまた、それらの構造の一部として、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−もしくはＬ−立体配置の修飾、誘導体化、非天然アミノ酸および／またはペプチド模倣ユニットを有するタンパク質またはタンパク質物質を含む。「タンパク質」という用語は、典型的には大きなポリペプチドを示す。「ペプチド」という用語は、典型的には短いポリペプチドを示す。
非天然ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成機を使用して、または所望のポリペプチドをコードする修飾ポリヌクレオチドを使用する組み換え発現技術を使用して調製される。
本明細書では、ポリペプチドの「断片」は、全長ポリペプチドまたはタンパク質発現産物より小さいポリペプチドまたはタンパク質のいずれかの部分を示すことを意味する。
本明細書では、「類似体」は、構造が実質的に類似し、および同じ生物活性を有するが、全体分子、またはその断片のいずれかに対し様々な程度の活性を有することができる２つ以上のポリペプチドのいずれかを示す。類似体は、他のアミノ酸に関する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加を含む１つ以上の変異に基づき、アミノ酸配列の組成が異なる。置換は置換されたアミノ酸およびそれを置換するアミノ酸の物理化学または機能関連性に基づき保存的または非保存的とすることができる。
本明細書では、「変異体」は、普通はその分子の一部ではない追加の化学的部分を含むように修飾されたポリペプチド、タンパク質またはその類似体を示す。そのような部分は、例えば、限定はされないが、分子の溶解度、吸収、および／または生物学的半減期を調節することができる。そのような効果を媒介することができる部分はRemington's Pharmaceutical Sciences (1980)において開示されている。そのような部分を分子に結合させるための手順は、当技術分野においてよく知られている。様々な態様では、ポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、および／またはポリシアリル化により修飾される。
融合タンパク質、例えば１つの融合成分が、断片または模倣物質である融合タンパク質もまた企図される。本明細書では、「模倣物質」は、模倣物質の元であるタンパク質に匹敵する生物活性を有するペプチドまたはタンパク質を意味する。例として、内皮増殖因子模倣物質は、天然の内皮増殖因子に匹敵する生物活性を有するペプチドまたはタンパク質である。この用語はさらに、例えば対象のタンパク質の天然リガンドの効果を増強することにより、対象のタンパク質の活性を間接的に模倣するペプチドまたはタンパク質を含む。
この生体分子の群は、抗体をそれらの断片および誘導体と共に含み、例えばＦａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｃ断片、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、個々の重鎖、個々の軽鎖、二量体重および軽鎖（無傷抗体において見られるヘテロ四量体重および軽鎖に対立するものとして）、単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、ヒト化抗体（ならびにヒト化抗体の様式で修飾されたが、得られた抗体は非ヒト種における抗体によりよく似ている抗体）、キレート化組換え抗体（ＣＲＡＢｓ）、二特異性抗体および多特異性抗体、ならびに当技術分野で知られている他の抗体誘導体または断片が挙げられるが、それらに限定されない。
リン脂質
本開示により、リン脂質を含むナノ複合体もまた企図される。他の生体分子に対し上記で記載したように、リン脂質生体分子は、ある態様では、任意的なスペーサ成分を含む。構造生体分子であるリン脂質は、他の生体分子に対し上記で記載される架橋部分を含み、これを介してリン脂質は他の生体分子に架橋することができる。非構造生体分子であるリン脂質は、架橋部分を有してもよいが、その必要はない。
脂質およびリン脂質由来ホルモンは、構造および非構造生体分子として企図され、これらの化合物は、脂質、例えばリノール酸およびアラキドン酸ならびにリン脂質に由来する。主なクラスは、コレステロールに由来するステロイドホルモンおよびエイコサノイドである。
１つの特定の実施形態では、合成高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）ナノ複合体は、金ナノ粒子をリン脂質およびＡＰＯ１Ａの高密度シェルで修飾することにより構築される。ＨＤＬはアテローム性動脈硬化および結果として起こる疾患、例えば心疾患および脳卒中の発症を防ぐ動的血清ナノ複合体である。天然ＨＤＬのように、この合成コンストラクトは、その疎水性リン脂質シェル中でコレステロールに結合することができる。それらのコア材料に関係なく、それらの独特な生物システムと相互作用するの能力を付与するのは、無機ナノ粒子表面上の生物リガンドの高密度多価配列である。
金属錯体
本明細書で規定される金属錯体は、それぞれ、本明細書で記載される構造非生体分子および／または追加の作用物質とすることができる。金属錯体は任意で上記本明細書で記載されるスペーサを含む。
本明細書では、「金属錯体」は、金属を示し、限定はされないが、本明細書で記載される白金化合物、ゲルマニウム（ＩＶ）、チタン（ＩＶ）、スズ（ＩＶ）、ルテニウム（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、おび銅（ＩＩ）を含む。金属錯体が構造非生体分子である場合、必然的に架橋部分を含み、これを介して、他の生体分子および／または非生体分子に架橋する。追加の作用物質である金属錯体は架橋部分を含んでもよいが、その必要はない。
オリゴ糖
それぞれ、本明細書で記載される構造生体分子および／または追加の作用物質となるオリゴ糖が本開示により企図される。
オリゴ糖としては、α−またはβ−グリコシド結合のいずれかにより結合された約２〜約１０以上の単糖類を含む任意の炭水化物が挙げられる。オリゴ糖は、自然界全体で遊離および結合形態の両方で見られる。他の生体分子に対し上記で記載したように、リン脂質生体分子は、ある態様では、任意的なスペーサ成分を含む。構造生体分子であるオリゴ糖は、他の生体分子に対し上記で記載される架橋部分を含み、これを介して、オリゴ糖は他の生体分子に架橋することができる。非構造生体分子であるオリゴ糖は架橋部分を含んでもよいが、その必要はない。オリゴ糖は、任意で上記本明細書で記載されるスペーサを含む。
他の非生体分子
本明細書では、非生体分子は、希釈剤分子、上記で記載される金属錯体および当技術分野で知られている任意の非炭素含有分子からなる群より選択される。
ナノ複合体構造
本明細書で記載されるように、各ナノ複合体の構造は（ｉ）ナノ複合体の製造において使用される表面（ｉｉ）ナノ複合体を形成する生体分子の型、および（ｉｉｉ）表面上および／またはその周りの個々の生体分子間の架橋度および型により規定される。本明細書で記載されるように、提供されるナノ複合体のあらゆる態様では、生体分子は、非生体分子と共に、または非生体分子なしで、架橋される。架橋は１つ以上の架橋部分の使用により実施される。
架橋
本開示により企図される架橋部分としては、アミン、アミド、アルコール、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、ジスルフィド、カルボン酸、フェノール、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドラゾン、アジドおよびアルキンが挙げられるが、それらに限定されない。当業者に知られている方法により生体分子および／または非生体分子に付着することができる限り、任意の架橋部分を使用することができる。
様々な実施形態では、アルキンは、生体分子と分解性部分を介して結合される。例えば、限定はされないが、アルキンは、様々な態様では、生体分子と、細胞の内側のエンドソームに入ると分解される酸に不安定な部分を介して結合される。
いくつかの態様では、生体分子が結合する表面は、架橋部分に対する触媒として作用する。適切な条件下、架橋部分を表面と接触させると、架橋部分が活性化され、よって時として、構造生体分子および／または非生体分子の間で自発的架橋が開始される。１つの特定の態様では、架橋部分はアルキンであり、表面は金からなる。この態様では、本明細書で記載されるように、金表面は触媒として作用し、アルキン架橋部分を活性化し、よって、アルキン架橋部分を含む生体分子とアルキン架橋部分を含む別の生体分子の間で架橋を形成させる。
生体分子間の架橋を実施するために化学薬品が使用される製造方法もまた、企図される。生体分子を架橋する際に使用するために企図される化学薬品は下記で記載する。
方法において使用するために企図されるポリヌクレオチドとしては、ナノ複合体と任意の手段により結合されるものが挙げられる。ポリヌクレオチドがナノ複合体と結合される手段に関係なく、様々な態様では、結合は５’結合、３’結合、いくつかの型の内部結合、およびこれらの付着の任意の組み合わせにより実施され、ポリヌクレオチド内での架橋部分の位置に依存する。例として、ポリヌクレオチドの３’端上の架橋部分は、ポリヌクレオチドがナノ複合体とその３’端で結合することを意味する。
様々な態様では、架橋部分はスペーサ内に配置される。スペーサは、上記本明細書で記載され、スペーサ内のヌクレオチドは架橋部分を含むことが企図される。さらなる態様では、スペーサ内のヌクレオチドは、１を超える架橋部分を含み、１を超える架橋部分は同じかまたは異なる。さらに、スペーサ内の各ヌクレオチドは１つ以上の架橋部分を含むことができ、これは同じか、または異なるものとすることができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはスペーサを含まない。これらの態様では、ポリヌクレオチドは、その長さに沿って１つ以上の架橋部分を含む。架橋部分は同じか、または異なるものとすることができ、ポリヌクレオチド内の各ヌクレオチドは１つ以上の架橋部分を含むことができ、これらもまた同じか、または異なるものとすることができる。
１つの態様では、ポリヌクレオチドは、１つの架橋部分を含み、これは任意で、スペーサが存在する場合、ポリヌクレオチドのスペーサ部分中に存在し得る。ポリヌクレオチドが１つの架橋部分を含む場合、ポリヌクレオチドは、ナノ複合体に架橋される追加の作用物質であることが企図される。
さらなる態様では、ポリヌクレオチドは、約１〜約５００架橋部分、または約１〜約１００、または約５〜約５０、または約１０〜約３０、または約１０〜約２０個の架橋部分を含む。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０以上の架橋部分を含む。スペーサが１を超える架橋部分を含む態様では、その部分は全て同じとすることができ、または異なるものとすることができ、架橋部分の任意の組み合わせが使用され得る。
１つの態様では、架橋部分は、各ポリヌクレオチド中の同じ位置に配置され、これは、ある条件下で、ポリヌクレオチド全てを同じ方向に配向させる。いくつかの態様では、方向は、ポリヌクレオチドの５’および３’端が互いに全く反対となるようなものである。これらの態様では、スペーサ端は、ナノ複合体表面に対しより「近位」になり、反対端は、ナノ複合体表面に対しより「遠位」となる。「近位」および「遠位」ならびにそれらのナノ複合体表面に対する関係に関し、位置は、表面が存在する場合、その任意的な少なくとも部分的な除去前に決定されることが理解されるであろう。ナノ複合体における同じ方向のポリヌクレオチドの配向は、例えば、限定はされないが、ポリヌクレオチドが標的生体分子にハイブリダイズされる場合に有用であり、というのも、ナノ複合体構造は、標的生体分子を認識し、結合するように配置されたポリヌクレオチドの多価ネットワークを提供するからである。
別の態様では、架橋部分は、ポリヌクレオチド中の異なる位置に配置され、ある条件下、架橋後にポリヌクレオチドの混合された配向を提供することができる。
いくつかの実施形態では、架橋部分を含む生体分子および／または非生体分子は、ナノ粒子に付着され、この付着は置換可能である。よって、１つの態様では、表面と結合する架橋部分は表面と結合したままであることができ、または別の生体分子および／または非生体分子上に存在する別の架橋部分との反応により表面から置換させることができる。前に記載したように、いくつかの実施形態では、架橋部分を含む生体分子および／または非生体分子の表面との結合により、生体分子および／または非生体分子の、表面と結合している別の生体分子および／または非生体分子への架橋が得られる。
形状を提供するナノ粒子
複数の各ナノ複合体の形状は、１つにはその生成において使用される表面、および１つにはその生成において使用される生体分子および／または非生体分子により決定される。表面は、様々な態様では平面または三次元である。よって、様々な態様では、表面はナノ粒子である。
一般に、企図されるナノ粒子としては、本明細書で記載されるナノ複合体の生成を実施するのに生体分子に対し高い積載能力を有する任意の化合物または物質が挙げられ、例えば、限定はされないが、金属、半導体、および絶縁体粒子組成物、およびデンドリマー（有機対無機）が挙げられる。
よって、様々な無機材料（例えば、米国特許出願第２００３０１４７９６６号で記載される金属、半導体材料またはセラミックが挙げられるがそれらに限定されない）を含むナノ粒子が企図される。例えば、金属系ナノ粒子としては、本明細書で記載されるものが挙げられる。セラミックナノ粒子材料としては、ブルシャイト、リン酸三カルシウム、アルミナ、シリカ、およびジルコニアが挙げられるが、それらに限定されない。ナノ粒子が生成される有機材料としては炭素が挙げられる。ナノ粒子ポリマーとしては、ポリスチレン、シリコーンゴム、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリエーテル、およびポリエチレンが挙げられる。生分解性、バイオポリマー（例えば、ポリペプチド、例としてＢＳＡ、多糖、など）、他の生物材料（例えば炭水化物）、および／またはポリマー化合物もまた、ナノ粒子を生成させるのに使用するために企図される。
１つの実施形態では、ナノ粒子は金属であり、様々な態様では、ナノ粒子はコロイド金属である。よって、様々な実施形態では、方法の実施に有用なナノ粒子としては、金属（例えば、限定はされないが、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、鉄、インジウム、ニッケル、またはナノ粒子形成を受けやすい任意の他の金属）、半導体（例えば、限定はされないが、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳでコートされたＣｄＳまたはＣｄＳｅ）および磁性（例えば、強磁性）コロイド材料が挙げられる。発明の実施において有用な他のナノ粒子としては、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｆｅ、Ｆｅ＋４、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ａｌ、鋼、コバルト−クロム合金、Ｃｄ、チタン合金、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓが挙げられるが、それらに限定されない。ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓナノ粒子を製造する方法もまた、当技術分野で知られている。例えば、 Weller, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32, 41 (1993); Henglein, Top. Curr. Chem., 143, 113 (1988); Henglein, Chem. Rev., 89, 1861 (1989); Brus, Appl. Phys. A., 53, 465 (1991); Bahncmann, in Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy (eds. Pelizetti and Schiavello 1991), page 251; Wang and Herron, J. Phys. Chem., 95, 525 (1991); Olshavsky, et al., J. Am. Chem. Soc., 112, 9438 (1990); Ushida et al., J. Phys. Chem., 95, 5382 (1992)を参照されたい。
実際、複合物形成を妨害しない程度まで、方法において使用するのに好適な任意の好適なナノ粒子を使用する組成物および方法が提供される。粒子のサイズ、形状および化学組成は、得られるナノ複合体の特性の一因となる。これらの特性としては、例えば、光学特性、光電子特性、電気化学特性、電子特性、様々な溶液中での安定性、磁気特性、ならびに細孔およびチャネルサイズ変化が挙げられる。異なるサイズ、形状および／または化学組成を有する粒子混合物の使用、ならびに均一のサイズ、形状および化学組成を有するナノ粒子の使用が企図される。好適な粒子の例としては、ナノ粒子、凝集物粒子、等方性（例えば球状粒子）および異方性粒子（例えば非球状ロッド、４面体、角柱）およびコア−シェル粒子例えば、２００２年１２月２８日に出願された米国特許出願第１０／０３４，４５１号、および２００２年１２月２８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／５０８２５号で記載されるもの（これらの開示は参照によりその全体が組み込まれる）が挙げられるが、それらに限定されない。
金属、半導体および磁性ナノ粒子を製造する方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Schmid, G. (ed.) Clusters and Colloids (VCH, Weinheim, 1994); Hayat, M. A. (ed.) Colloidal Gold: Principles, Methods, and Applications (Academic Press, San Diego, 1991); Massart, R., IEEE Transactions On Magnetics, 17, 1247 (1981); Ahmadi, T. S. et al., Science, 272, 1924 (1996); Henglein, A. et al., J. Phys. Chem., 99, 14129 (1995); Curtis, A. C., et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 27, 1530 (1988)を参照されたい。調製されたポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子の調製がFattal, et al., J. Controlled Release (1998) 53: 137−143および米国特許第４，４８９，０５５号において記載される。ポリ（Ｄ−グルカルアミドアミン）を含むナノ粒子を製造するための方法がLiu, et al., J. Am. Chem. Soc. (2004) 126:7422−7423において記載される。重合されたメチルメタクリレート（ＭＭＡ）を含むナノ粒子の調製が、Tondelli, et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26:5425−5431において記載され、デンドリマーナノ粒子の調製が例えば、Kukowska−Latallo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:4897−4902 (Starburst polyamidoamine dendrimers)において記載される。
また、米国特許出願第２００３０１４７９６６号に記載されるように、本明細書で記載される材料を含むナノ粒子は、例えば、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．（金）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（金）およびＮａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（金）から市販されており、またはそれらは、溶液中での進行性核生成（例えば、コロイド反応による）から、または様々な物理および化学蒸着プロセス、例えばスパッタ蒸着により生成させることができる。例えば、HaVashi, (1987) Vac. Sci. Technol. July/August 1987, A5(4):1375−84; Hayashi, (1987) Physics Today, December 1987, pp. 44−60; MRS Bulletin, January 1990, pgs. 16−47を参照されたい。
米国特許出願第２００３０１４７９６６号でさらに記載されるように、企図されるナノ粒子は、ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸還元剤を用い、当技術分野で知られている方法を使用して生成される。例えば、Marinakos et al., (1999) Adv. Mater. 11: 34−37; Marinakos et al., (1998) Chem. Mater. 10: 1214−19; Enustun & Turkevich, (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 3317を参照されたい。約１４０ｎｍの分散凝集物粒子サイズを有する酸化スズナノ粒子は、日本の千葉のＶａｃｕｕｍ Ｍｅｔａｌｌｕｒｇｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から市販されている。様々な組成およびサイズ範囲の他の市販のナノ粒子は、例えば、カリフォルニア州バーリンゲームがのＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である。
ナノ粒子サイズ
様々な態様では、提供される方法は、約１ｎｍ〜約２５０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約２４０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約２３０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約２２０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約２１０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約２００ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約１９０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約１８０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約１７０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約１６０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約１５０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約１４０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約１３０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約１２０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約１１０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約１００ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約９０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約８０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約７０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約６０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約５０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約４０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約３０ｎｍの平均直径、または約１ｎｍ〜約２０ｎｍの平均直径、約１ｎｍ〜約１０ｎｍの平均直径のサイズ範囲のナノ粒子を使用するものを含む。他の態様では、ナノ粒子のサイズは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均直径）、約５〜約５０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍである。ナノ粒子のサイズは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均直径）、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍである。方法で使用されるナノ粒子のサイズは、それらの特定の使用または用途により要求されるように変化する。サイズの変化は、ナノ粒子のある物理特性、例えば、光学特性を最適化させるために、または本明細書で記載されるように誘導体化させることができる表面積に達するように都合よく使用される。
生体分子密度
本明細書で提供されるナノ複合体は、ナノ複合体の表面上で、様々な態様では、単一のナノ複合体上でナノ複合体と生体分子の間の協同的挙動が得られるのに十分なある密度の生体分子を有する。別の態様では、ナノ複合体間の協同的挙動は、生体分子の分解に対する抵抗性を増加させ、ナノ複合体の一部ではない生体分子に関し、鋭い融解転移を提供する。１つの態様では、細胞によるナノ複合体の取り込みは、ナノ粒子と結合したポリヌクレオチドの密度に影響される。ＰＣＴ／ＵＳ２００８／６５３６６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において記載されるように、ポリヌクレオチド機能化ナノ粒子の表面上のポリヌクレオチドの密度が高いほど、細胞によるナノ粒子の取り込みが増加する。この態様は同様に、ナノ複合体の特性となるように企図され、ナノ複合体を構成する生体分子の密度が高いほど、細胞によるナノ粒子の取り込みが増加する。
ナノ複合体を安定にするのに十分な表面密度およびナノ複合体および生体分子の所望の組み合わせに対しそれを得るのに必要な条件は、実験的に決定することができる。概して、使用される生体分子および／または非生体分子が小さいほど、生体分子および／または非生体分子が達成することができる表面密度が高くなる。一般に、安定なナノ複合体−組成物を提供するには少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２の表面密度で十分であろう。いくつかの態様では、表面密度は少なくとも１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。生体分子がナノ複合体中に、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも６ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも７ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも８ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上の表面密度で存在する方法もまた提供される。
ナノ複合体中のポリヌクレオチドの密度は、表面上のポリヌクレオチドおよび／またはナノ複合体自体との特異的な生体分子および／または非生体分子相互作用を調節することが企図される。様々な条件下、いくつかのポリペプチドは、ポリヌクレオチドの密度により引き起こされる立体障害に基づき、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドと相互作用しないようにされ得る。そうでなければ立体障害により排除される生体分子および／または非生体分子とのポリヌクレオチドの相互作用が望ましい態様では、ナノ複合体中のポリヌクレオチドの密度は減少され、生体分子および／または非生体分子がポリヌクレオチドと相互作用できるようにされる。
より大きな直径のナノ粒子が、いくつかの態様では、ナノ複合体生成中により多くの数のポリヌクレオチを用いて鋳型化されるように企図される[Hurst et al.、Analytical Chemistry 78(24): 8313−8318 (2006)]。そのため、いくつかの態様では、ナノ複合体の生成において使用されるポリヌクレオチドの数は、１ナノ複合体あたり約１０〜約２５，０００ポリヌクレオチドである。さらなる態様では、ナノ複合体の生成において使用されるポリヌクレオチドの数は、１ナノ複合体あたり約５０〜約１０，０００ポリヌクレオチドであり、さらに別の態様ではナノ複合体の生成において使用されるポリヌクレオチドの数は、１ナノ複合体あたり約２００〜約５，０００ポリヌクレオチドである。様々な態様では、ナノ複合体の生成において使用されるポリヌクレオチドの数は、１ナノ複合体あたり約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、約２００、約２０５、約２１０、約２１５、約２２０、約２２５、約２３０、約２３５、約２４０、約２４５、約２５０、約２５５、約２６０、約２６５、約２７０、約２７５、約２８０、約２８５、約２９０、約２９５、約３００、約３０５、約３１０、約３１５、約３２０、約３２５、約３３０、約３３５、約３４０、約３４５、約３５０、約３５５、約３６０、約３６５、約３７０、約３７５、約３８０、約３８５、約３９０、約３９５、約４００、約４０５、約４１０、約４１５、約４２０、約４２５、約４３０、約４３５、約４４０、約４４５、約４５０、約４５５、約４６０、約４６５、約４７０、約４７５、約４８０、約４８５、約４９０、約４９５、約５００、約５０５、約５１０、約５１５、約５２０、約５２５、約５３０、約５３５、約５４０、約５４５、約５５０、約５５５、約５６０、約５６５、約５７０、約５７５、約５８０、約５８５、約５９０、約５９５、約６００、約６０５、約６１０、約６１５、約６２０、約６２５、約６３０、約６３５、約６４０、約６４５、約６５０、約６５５、約６６０、約６６５、約６７０、約６７５、約６８０、約６８５、約６９０、約６９５、約７００、約７０５、約７１０、約７１５、約７２０、約７２５、約７３０、約７３５、約７４０、約７４５、約７５０、約７５５、約７６０、約７６５、約７７０、約７７５、約７８０、約７８５、約７９０、約７９５、約８００、約８０５、約８１０、約８１５、約８２０、約８２５、約８３０、約８３５、約８４０、約８４５、約８５０、約８５５、約８６０、約８６５、約８７０、約８７５、約８８０、約８８５、約８９０、約８９５、約９００、約９０５、約９１０、約９１５、約９２０、約９２５、約９３０、約９３５、約９４０、約９４５、約９５０、約９５５、約９６０、約９６５、約９７０、約９７５、約９８０、約９８５、約９９０、約９９５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、約３０００、約３１００、約３２００、約３３００、約３４００、約３５００、約３６００、約３７００、約３８００、約３９００、約４０００、約４１００、約４２００、約４３００、約４４００、約４５００、約４６００、約４７００、約４８００、約４９００、約５０００、約５１００、約５２００、約５３００、約５４００、約５５００、約５６００、約５７００、約５８００、約５９００、約６０００、約６１００、約６２００、約６３００、約６４００、約６５００、約６６００、約６７００、約６８００、約６９００、約７０００、約７１００、約７２００、約７３００、約７４００、約７５００、約７６００、約７７００、約７８００、約７９００、約８０００、約８１００、約８２００、約８３００、約８４００、約８５００、約８６００、約８７００、約８８００、約８９００、約９０００、約９１００、約９２００、約９３００、約９４００、約９５００、約９６００、約９７００、約９８００、約９９００、約１００００、約１０１００、約１０２００、約１０３００、約１０４００、約１０５００、約１０６００、約１０７００、約１０８００、約１０９００、約１１０００、約１１１００、約１１２００、約１１３００、約１１４００、約１１５００、約１１６００、約１１７００、約１１８００、約１１９００、約１２０００、約１２１００、約１２２００、約１２３００、約１２４００、約１２５００、約１２６００、約１２７００、約１２８００、約１２９００、約１３０００、約１３１００、約１３２００、約１３３００、約１３４００、約１３５００、約１３６００、約１３７００、約１３８００、約１３９００、約１４０００、約１４１００、約１４２００、約１４３００、約１４４００、約１４５００、約１４６００、約１４７００、約１４８００、約１４９００、約１５０００、約１５１００、約１５２００、約１５３００、約１５４００、約１５５００、約１５６００、約１５７００、約１５８００、約１５９００、約１６０００、約１６１００、約１６２００、約１６３００、約１６４００、約１６５００、約１６６００、約１６７００、約１６８００、約１６９００、約１７０００、約１７１００、約１７２００、約１７３００、約１７４００、約１７５００、約１７６００、約１７７００、約１７８００、約１７９００、約１８０００、約１８１００、約１８２００、約１８３００、約１８４００、約１８５００、約１８６００、約１８７００、約１８８００、約１８９００、約１９０００、約１９１００、約１９２００、約１９３００、約１９４００、約１９５００、約１９６００、約１９７００、約１９８００、約１９９００、約２００００、約２０１００、約２０２００、約２０３００、約２０４００、約２０５００、約２０６００、約２０７００、約２０８００、約２０９００、約２１０００、約２１１００、約２１２００、約２１３００、約２１４００、約２１５００、約２１６００、約２１７００、約２１８００、約２１９００、約２２０００、約２２１００、約２２２００、約２２３００、約２２４００、約２２５００、約２２６００、約２２７００、約２２８００、約２２９００、約２３０００、約２３１００、約２３２００、約２３３００、約２３４００、約２３５００、約２３６００、約２３７００、約２３８００、約２３９００、約２４０００、約２４１００、約２４２００、約２４３００、約２４４００、約２４５００、約２４６００、約２４７００、約２４８００、約２４９００、約２５０００以上である。
ポリヌクレオチド表面密度は、ナノ複合体と結合したポリヌクレオチドの安定性を調節することも企図される。よって、１つの実施形態では、ポリヌクレオチドがナノ複合体の一部でない同一のポリヌクレオチドの半減期と少なくとも実質的に同じである半減期を有する、ポリヌクレオチドを含むナノ複合体が提供される。他の実施形態では、ナノ粒子と結合したポリヌクレオチドは、ナノ複合体の一部でない同一のポリヌクレオチドの半減期よりも、５％超〜約１，０００，０００倍超以上である半減期を有する。
中空ナノ複合体
本明細書で記載されるように、様々な態様では、本開示により提供されるナノ複合体は中空である。中空ナノ複合体の多孔性および／または剛性は、１つには、ナノ複合体生成中にナノ粒子の表面上で架橋される生体分子、および存在する場合非生体分子の密度に依存する。一般に、ナノ粒子の表面上で架橋される生体分子の密度が低いほど、より多孔性のナノ複合体が得られ、ナノ粒子の表面上で架橋される生体分子の密度が高いほどより剛性のナノ複合体が得られる。中空ナノ複合体の多孔性および密度はまた、生体分子および／または非生体分子間の架橋度および型に依存する。
いくつかの態様では、中空ナノ複合体は生成された後、所望の追加の作用物質が含められ、その後、ナノ複合体はコーティングにより被覆され、追加の作用物質が漏れないように防止される。コーティングはまた、いくつかの態様では、追加の作用物質であり、以下でより詳細に記載される。
追加の作用物質
本開示により企図される追加の作用物質としては、生体分子、非生体分子、検出可能なマーカー、コーティング、ポリマー剤、コントラスト剤、塞栓剤、低分子内部相補的ポリヌクレオチド（ｓｉｃＰＮ）、転写制御因子、治療薬、抗生物質および標的部分が挙げられる。
治療薬
本明細書では「治療薬」、「薬物」または「活性剤」は治療または診断目的のために有用な任意の化合物を意味する。本明細書では、これらの用語は、本開示のナノ粒子またはナノ複合体なしで投与された場合よりも、本開示のナノ粒子またはナノ複合体に付着された場合、より効率的に細胞膜を横切ることができる、病状の治療のために患者に投与される任意の化合物を意味すると理解される。
本開示は、送達が望まれる任意の治療薬に適用可能である。そのような活性剤ならびに疎水性薬物の非制限的な例は米国特許７，６１１，７２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において見られる。
様々な実施形態では、ナノ複合体が多様な治療薬を含む本明細書で開示される組成物および方法が提供される。１つの態様では、多様な治療薬が特異的に１つのナノ複合体に付着される組成物および方法が提供される。別の態様では、多様な治療薬は１を超えるナノ複合体に特異的に付着される。
本開示の材料および方法において有用な治療薬は、当業者によって決定され得る。例えば、限定はされないが、本明細書で例示されるように、治療薬が、ナノ複合体への付着なしよりも、ナノ複合体に付着されると、より有効に、細胞の細胞膜を横切ることができるかどうかを決定するルーチンインビトロ試験を実施することができる。
様々な実施形態では、ナノ複合体および治療薬を含む薬物送達組成物が提供され、治療薬は、ナノ複合体に付着された場合の治療薬の送達に比べ、治療薬のナノ複合体への付着が存在しないと、著しく低いレベルで送達可能なものであり、ナノ複合体上のポリヌクレオチドの、ナノ複合体に付着された治療薬に対する比は、治療薬の細胞内への輸送を可能にするのに十分なものである。本明細書では、「比」は、ポリヌクレオチドの治療薬に対する数比較を示す。例えば、限定はされないが、１：１比は、ナノ複合体に付着された治療薬分子１つに１つのポリヌクレオチド分子が存在することを示す。
１つの実施形態では、治療薬が、ナノ複合体に付着された場合、ナノ複合体に付着されない場合に比べ、より効率的に細胞膜を横切ることができる方法および組成物が提供される。様々な態様では、治療薬は、ナノ複合体に付着された場合、ナノ複合体に付着されない場合に比べ、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍または約１００倍以上効率的に細胞膜を横切ることができる。
治療薬としては、親水性および疎水性化合物が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、本開示により企図される治療薬としては、薬物様分子、生体分子および非生体分子が挙げられるが、それらに限定されない。
タンパク質治療薬としては、ペプチド、酵素、構造タンパク質、受容体および他の細胞または循環タンパク質ならびにそれらの断片および誘導体が挙げられるが、それらに限定されず、その異常発現は１つ以上の障害を発生させる。治療薬はまた、１つの特定の実施形態として、化学療法薬を含む。治療薬はまた、様々な実施形態では、放射性物質を含む。
様々な態様では、タンパク質治療薬はサイトカインまたは造血因子を含み、例えば、限定はされないが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、アンジオポエチン、例えば、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチド、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、骨形成タンパク質−１、骨形成タンパク質−２、骨形成タンパク質−３、骨形成タンパク質−４、骨形成タンパク質−５、骨形成タンパク質−６、骨形成タンパク質−７、骨形成タンパク質−８、骨形成タンパク質−９、骨形成タンパク質−１０、骨形成タンパク質−１１、骨形成タンパク質−１２、骨形成タンパク質−１３、骨形成タンパク質−１４、骨形成タンパク質−１５、骨形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体、サイトカイン誘導好中球走化性因子１、サイトカイン誘導好中球、走化性因子２α、サイトカイン誘導好中球走化性因子２β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮増殖因子、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞由来神経栄養因子受容体α２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子、神経成長因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子２、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、例えばＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β１．２、トランスフォーミング増殖因子β２、トランスフォーミング増殖因子β３、トランスフォーミング増殖因子β５、潜在的トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、血管内皮増殖因子、およびキメラタンパク質ならびにそれらの生物または免疫活性断片が挙げられる。生物学的作用物質の例としては、免疫調節タンパク質、例えばサイトカイン、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、癌抑制遺伝子、および癌ワクチンが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の組成物および方法と共に使用され得るインターロイキンの例としては、インターロイキン２（ＩＬ−２）、およびインターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）が挙げられるが、それらに限定されない。サイトカイン以外の他の免疫調節薬としては、カルメット・ゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、レバミゾール、およびオクトレオチドが挙げられるが、それらに限定されない。
本開示により記載されるように、いくつかの態様では治療薬は小分子を含む。「小分子」という用語は、本明細書では、化合物、例えば、任意で誘導体化され得るペプチド模倣薬、または任意の天然か合成の他の低分子量有機化合物を示す。そのような小分子は、治療的に送達され得る物質としてもよく、または送達を促進するようにさらに誘導体化されてもよい。
「低分子量」により、１０００ダルトン未満、典型的には３００と７００ダルトンの間の分子量を有する化合物が意味される。低分子量化合物は、様々な態様では、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約１０００ダルトン以上である。
「薬物様分子」という用語は、当業者によく知られており、医薬において、例えば、限定はされないが薬剤中の活性剤として、使用するのに好適なものとする特性を有する化合物の意味を含む。よって、例えば、限定はされないが、薬物様分子は有機化学の技術により、または分子生物学もしくは生化学の技術により、合成された分子であり、いくつかの態様では本明細書で規定される小分子である。薬物様分子は、様々な態様では、さらに特定の１つまたは複数のタンパク質との選択的相互作用の特徴を示し、生物が利用可能であり、および／または単独で、または本開示の組成物または方法と共に細胞膜を透過することができる。
様々な実施形態では、米国特許７，６６７，００４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において記載される治療薬が、本明細書で開示される組成物および方法において使用するために企図され、アルキル化剤、抗生物質製剤、代謝拮抗薬、ホルモン剤、植物由来作用物質、および生物学的作用物質が挙げられるが、それらに限定されない。
アルキル化剤の例としては、ビスクロロエチルアミン（ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード）、アジリジン（例えばチオテパ）、アルキルアルコンスルホネート（例えばブスルファン）、ニトロソ尿素（例えばカルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン）、非古典的アルキル化剤（アルトレタミン、ダカルバジン、およびプロカルバジン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチンおよび白金（ＩＶ）（Ｐｔ（ＩＶ）））が挙げられるが、それらに限定されない。
抗生物質製剤の例としては、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびアントラセンジオン）、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカトマイシンが挙げられるが、それらに限定されない。追加の抗生物質製剤は以下で詳細に記載される。
代謝拮抗薬の例としては、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート、ロイコボリン、ヒドロキシ尿素、チオグアニン（６−ＴＧ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シタラビン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン（２−ＣＤＡ）、アスパラギナーゼ、メシル酸イマチニブ（またはＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、およびゲムシタビンが挙げられるが、それらに限定されない。
ホルモン剤の例としては、合成エストロゲン（例えばジエチルスチルベストロール）、抗エストロゲン剤（例えばタモキシフェン、トレミフェン、フルオキシメステロールおよびラロキシフェン）、抗アンドロゲン剤（ビカルタミド、ニルタミド、フルタミド）、アロマターゼ阻害薬（例えば、アミノグルテチミド、アナストロゾールおよびテトラゾール）、ケトコナゾール、酢酸ゴセレリン、リュープロリド、酢酸メゲストロールおよびミフェプリストンが挙げられるが、それらに限定されない。
植物由来作用物質の例としては、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンゾリジンおよびビノレルビン）、ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド（ＶＰ−１６）およびテニポシド（ＶＭ−２６））、カンプトテシン化合物（例えば、２０（Ｓ）カンプトテシン、トポテカン、ルビテカン、およびイリノテカン）、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）が挙げられるが、それらに限定されない。
使用するために企図される化学療法薬としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：アルキル化剤、例えば：ナイトロジェンマスタード、例えばメクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファランおよびクロラムブシル；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）；エチレンイミン／メチルメラミン例えばトリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）；アルキルスルホネート、例えばブスルファン；トリアジン、例えばダカルバジン（ＤＴＩＣ）；代謝拮抗薬、例えば葉酸類似体、例としてメトトレキサートおよびトリメトレキサート、ピリミジン類似体、例えば５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジン、プリン類似体、例えば６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）；天然物、例えば有糸分裂阻害剤、例えばパクリタキセル、ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、およびビノレルビン、タキソテール、エストラムスチン、およびリン酸エストラムスチン；エピポドフィロトキシン、例えばエトポシドおよびテニポシド；抗生物質、例えばアクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、およびアクチノマイシン；酵素、例えばＬ−アスパラギナーゼ；生体応答修飾物質、例えばインターフェロン−α、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ；様々な作用物質、例えば白金配位錯体、例えばシスプラチン、Ｐｔ（ＩＶ）およびカルボプラチン、アントラセンジオン、例えばミトキサントロン、置換尿素、例えばヒドロキシ尿素、メチルヒドラジン誘導体、例えばＮ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジン、副腎皮質抑制薬、例えばミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド；ホルモンおよび拮抗薬、例えば副腎皮質ステロイド拮抗薬、例えばプレドニゾンおよび等価物、デキサメタゾンおよびアミノグルテチミド；プロゲスチン、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール等価物；抗エストロゲン、例えばタモキシフェン；アンドロゲン、例えばプロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／等価物；抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体およびリュープロリド；および非ステロイド抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド。
本開示により企図される追加の治療薬としては、下記表２の治療薬が挙げられるが、それらに限定されない。


















抗生物質組成物
いくつかの態様では、追加の作用物質は、抗生物質組成物とすることができ、他の態様ではナノ複合体自体が、抗生物質組成物として機能する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は本明細書で記載されるナノ複合体を含む抗生物質組成物を提供する。機能化ナノ粒子の一部としての抗生物質組成物はまた、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２０５５８号において記載され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ナノ複合体がポリヌクレオチドを構造生体分子または非構造追加作用物質のいずれかとして含む態様では、ある態様では、ポリヌクレオチドは原核生物遺伝子の標的コードまたは非コード配列に十分相補的であり、ハイブリダイゼーション可能な条件下で標的配列にハイブリダイズすることが企図される。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドを含むナノ複合体の、原核生物遺伝子へのハイブリダイゼーションは、原核生物細胞の増殖を阻止（または防止）することが企図される。よって、ポリヌクレオチドを含むナノ複合体の原核生物遺伝子へのハイブリダイゼーションは、原核生物が細菌である態様において静菌または殺菌効果が得られるように企図される。ハイブリダイゼーションがインビボで起こる態様では、原核生物細胞の増殖は、ポリヌクレオチド修飾ナノ粒子との接触のない原核生物細胞の増殖に比べ阻止される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを含むナノ複合体の原核生物遺伝子へのハイブリダイゼーションは、原核生物遺伝子によりコードされる機能原核生物タンパク質の発現を阻止する。本明細書では、「機能原核生物タンパク質」は、原核生物遺伝子によりコードされる全長野生型タンパク質を示し、ある態様では、機能タンパク質は原核生物細胞増殖に不可欠である。
増殖に不可欠な原核生物タンパク質としては、グラム陰性遺伝子産物、グラム陽性遺伝子産物、細胞周期遺伝子産物、ＤＮＡ複製に関与する遺伝子産物、細胞分裂遺伝子産物、タンパク質合成に関与する遺伝子産物、細菌ジャイレース、およびアシルキャリアー遺伝子産物が挙げられるが、それらに限定されない。これらのクラスは本明細書で、以下説明される。
本開示はまた、原核生物遺伝子の標的非コード配列へのハイブリダイゼーションにより、変化した活性を有する原核生物遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が得られる抗生物質組成物を企図する。いくつかの実施形態では、抗生物質組成物は、抗生物質に対し抵抗性を付与する原核生物遺伝子の標的非コード配列にハイブリダイズする。これらの遺伝子は、当業者に知られており、例えば、Liu et al., Nucleic Acids Research 37: D443−D447, 2009（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において記載される。いくつかの態様では、抗生物質組成物の、抗生物質に対し抵抗性を付与する原核生物遺伝子の標的非コード配列へのハイブリダイゼーションにより、原核生物の抗生物質への感受性が増加する。１つの態様では、原核生物の抗生物質に対する感受性は、抗生物質組成物と接触されなかった原核生物の感受性に比べ増加される。抗生物質に対する相対的な感受性は、当業者により、本明細書で記載されるルーチン技術を用いて決定され得る。
抗生物質を用いた併用療法
いくつかの実施形態では、ナノ複合体を含む抗生物質組成物は、抗生物質製剤と併せて投与されるように製剤化され、この場合、ナノ複合体および抗生物質製剤は両方とも治療的有効量で投与される。
本明細書では、「抗生物質製剤」という用語は、主に感染症の治療に使用される、細菌、および他の微生物の増殖を阻止し、または死滅させる能力を有する化学物質の群のいずれかを意味する。例えば、米国特許第７，６３８，５５７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗生物質製剤の例としては、ペニシリンＧ；メチシリン；ナフシリン；オキサシリン；クロキサシリン；ジクロキサシリン；アンピシリン；アモキシシリン；チカルシリン；カルベニシリン；メズロシリン；アズロシリン；ピペラシリン；イミペネム；アズトレオナム；セファロチン；セファクロル；セフォキシチン；セフロキシム；セフォニシド；セフメタゾール；セフォテタン；セフプロジル；ロカルベフ；セフェタメト；セフォペラゾン；セフォタキシム；セフチゾキシム；セフトリアキソン；セフタジジム；セフェピム；セフィキシム；セフポドキシム；セフスロジン；フレロキサシン；ナリジクス酸；ノルフロキサシン；シプロフロキサシン；オフロキサシン；エノキサシン；ロメフロキサシン；シノキサシン；ドキシサイクリン；ミノサイクリン；テトラサイクリン；アミカシン；ゲンタマイシン；カナマイシン；ネチルマイシン；トブラマイシン；ストレプトマイシン；アジスロマイシン；クラリスロマイシン；エリスロマイシン；エリスロマイシンエストレート；エリスロマイシンエチルスクシネート；グルコヘプトン酸エリスロマイシン；ラクトビオン酸エリスロマイシン；ステアリン酸エリスロマイシン；バンコマイシン；テイコプラニン；クロラムフェニコール；クリンダマイシン；トリメトプリム；スルファメトキサゾール；ニトロフラントイン；リファンピン；ムピロシン；メトロニダゾール；セファレキシン；ロキシスロマイシン；コ−アモキシクラブアネート；ピペラシリンおよびタゾバクタムの組み合わせ；ならびにそれらの様々な塩、酸、塩基、および他の誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。抗菌抗生物質製剤としては、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、グリコペプチド、キノロン、テトラサイクリン、マクロライド、およびフルオロキノロンが挙げられるが、それらに限定されない。
生体分子マーカー/標識
本明細書で記載される生体分子は、様々な態様では、任意で検出可能な標識を含む。したがって、本開示は、生体分子複合物形成が、検出可能な変化により検出される組成物および方法を提供する。１つの態様では、複合物形成は裸眼により、分光学的に観察される色の変化を生じさせる。
生体分子 複合物形成に起因する検出可能な変化を可視化するための方法はまた、任意の蛍光検出法を含み、例えば、限定はされないが、蛍光顕微鏡観察、マイクロタイタープレートリーダーまたは蛍光標識細胞分取(FACS)が挙げられる。
本開示により企図される標識は、本明細書で記載されるフルオロフォアのいずれか、ならびに当技術分野で知られている他の検出可能な標識を含むことは理解されるであろう。例えば、標識としてはまた、酸化還元活性プローブ、化学発光分子、放射性標識、染料、蛍光分子、リン光分子、下記で記載される造影剤および／またはコントラスト剤、量子ドット、ならびに分光学的手段を用いて検出することができる任意のマーカー、すなわち、顕微鏡観察および細胞数測定を用いて検出可能なそれらのマーカーが挙げられるが、それらに限定されない。検出可能な標識が検出される本開示の態様では、本開示は、いずれの発光、蛍光、またはリン光分子または粒子も効率的に、貴金属表面によりクエンチされ得ることを提供する。したがって、各型の分子は、開示される組成物および方法において使用するために企図される。
生体分子を蛍光分子で標識し、蛍光を測定する方法は、当技術分野においてよく知られている。
好適な蛍光分子はまた、当技術分野においてよく知られており、例えば、１，８−ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）、５−（および−６）−カルボキシ−２’、７’−ジクロロフルオレセインｐＨ９．０、５−ＦＡＭ ｐＨ９．０、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）、５−ＲＯＸ ｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ、５−ＴＡＭＲＡ ｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ−ＭｅＯＨ、６ ＪＯＥ、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、６−カルボキシローダミン６ＧｐＨ７．０、６−カルボキシローダミン６Ｇ、塩酸塩、６−ＨＥＸ、ＳＥ ｐＨ９．０、６−ＴＥＴ、ＳＥ ｐＨ９．０、７−アミノ−４−メチルクマリンｐＨ７．０、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４０５、Ａｌｅｘａ４３０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ６６０、Ａｌｅｘａ６８０、Ａｌｅｘａ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４３０抗体複合体ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗体複合体ｐＨ８．０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヒドラジド−水、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２抗体複合体ｐＨ ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５抗体複合体ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８抗体複合体ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６１０Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７抗体複合体ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０抗体複合体ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０抗体複合体ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００抗体複合体ｐＨ７．２、アロフィコシアニンｐＨ７．５、ＡＭＣＡ複合体、アミノクマリン、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、Ａｔｔｏ ６４７、ＢＣＥＣＦ ｐＨ５．５、ＢＣＥＣＦ ｐＨ９．０、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、ＢＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−３−ＤＮＡ、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５−Ｘ、ＭｅＯＨ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ複合体、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＭｅＯＨ、Ｂｏｄｉｐｙ Ｒ６Ｇ ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＭｅＯＨ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ抗体複合体ｐＨ７．２、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ−Ｘ複合体、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘ ファラシジン ｐＨ７．０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘ、ＳＥ、ＢＯＰＲＯ−１、ＢＯＰＲＯ−３、カルセイン、カルセインｐＨ９．０、カルシウムクリムゾン、カルシウムクリムゾンＣａ２＋、カルシウム緑、カルシウム緑１Ｃａ２＋、カルシウム橙、カルシウム橙Ｃａ２＋、カルボキシナフトフルオレセインｐＨ１０．０、カスケード青、カスケード青ＢＳＡｐＨ７．０、カスケード黄、カスケード黄抗体複合体ｐＨ８．０、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＣＩ−ＮＥＲＦ ｐＨ２．５、ＣＩ−ＮＥＲＦ ｐＨ６．０、シトリン、クマリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＣｙＱＵＡＮＴ ＧＲ−ＤＮＡ、ダンシルカダベリン、ダンシルカダベリン、ＭｅＯＨ、ＤＡＰＩ、ＤＡＰＩ−ＤＮＡ、Ｄａｐｏｘｙｌ（２−アミノエチル）スルホンアミド、ＤＤＡＯ ｐＨ９．０，Ｄｉ−８ ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ−脂質、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤＭ−ＮＥＲＦ ｐＨ４．０、ＤＭ−ＮＥＲＦ ｐＨ７．０、ＤｓＲｅｄ、ＤＴＡＦ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｅＣＦＰ（増強シアン蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）、エオシン、エオシン抗体複合体ｐＨ８．０、エリスロシン−５−イソチオシアネートｐＨ９．０、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体、エチジウムホモ二量体−１−ＤＮＡ、ｅＹＦＰ（増強黄色蛍光タンパク質）、ＦＤＡ、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ抗体複合体ｐＨ８．０、ＦｌＡｓＨ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−３ Ｃａ２＋、Ｆｌｕｏ−４、Ｆｌｕｏｒ−Ｒｕｂｙ、フルオレセイン、フルオレセイン０．１Ｍ ＮａＯＨ、フルオレセイン抗体複合体ｐＨ８．０、フルオレセインデキストランｐＨ８．０、フルオレセインｐＨ９．０、フルオロ−エメラルド、ＦＭ１−４３、ＦＭ１−４３脂質、ＦＭ４−６４、ＦＭ４−６４、２％ＣＨＡＰＳ、Ｆｕｒａ赤Ｃａ２＋、Ｆｕｒａ赤、高Ｃａ、Ｆｕｒａ赤、低Ｃａ、Ｆｕｒａ−２Ｃａ２＋、Ｆｕｒａ−２、高Ｃａ、Ｆｕｒａ−２、Ｃａフリー、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、ＨｃＲｅｄ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８−ＤＮＡ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｉｎｄｏ−１Ｃａ２＋、Ｉｎｄｏ−１、Ｃａなし、Ｉｎｄｏ−１、Ｃａ飽和、ＪＣ−１、ＪＣ−１ｐＨ８．２、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅローダミン、ＬＯＬＯ−１−ＤＮＡ、Ｌｕｃｉｆｅｒ黄、ＣＨ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ青、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ青ｐＨ５．０、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ緑、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ緑ｐＨ５．０、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ黄ｐＨ３．０、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ黄ｐＨ９．０、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ青、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ緑、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ赤、マグネシウム緑、マグネシウム緑Ｍｇ２＋、マグネシウム橙、Ｍａｒｉｎａ青、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ緑、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ緑ＦＭ、ＭｅＯＨ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ橙、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ橙、ＭｅＯＨ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ赤、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ赤、ＭｅＯＨ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲＦＰ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＮＢＤ−Ｘ、ＮＢＤ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ ５００／５２５、緑色蛍光Ｎｉｓｓｌ染色−ＲＮＡ、Ｎｉｌｅ青、ＥｔＯＨ、Ｎｉｌｅ赤、Ｎｉｌｅ赤脂質、Ｎｉｓｓｌ、Ｏｒｅｇｏｎ緑４８８、Ｏｒｅｇｏｎ緑４８８抗体複合体ｐＨ８．０、Ｏｒｅｇｏｎ緑５１４、Ｏｒｅｇｏｎ緑５１４抗体複合体ｐＨ８．０、Ｐａｃｉｆｉｃ青、Ｐａｃｉｆｉｃ青抗体複合体ｐＨ８．０、フィコエリトリン、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡ定量化試薬、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−３、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化プロピジウム−ＤＮＡ、Ｒ−フィコエリトリンｐＨ７．５、ＲｅＡｓＨ、レゾルフィン、レゾルフィンｐＨ９．０、Ｒｈｏｄ−２、Ｒｈｏｄ−２Ｃａ２＋、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１１０ｐＨ７．０、ローダミン１２３、ＭｅＯＨ、ローダミン緑、ローダミンファロイジンｐＨ７．０、ローダミン赤Ｘ抗体複合体ｐＨ８．０、ローダミン緑ｐＨ７．０、Ｒｈｏｄｏｌ緑抗体複合体ｐＨ８．０、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＳＢＦＩ−Ｎａ＋、ナトリウム緑Ｎａ＋、スルホローダミン１０１、ＥｔＯＨ、ＳＹＢＲ緑Ｉ、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ、ＳＹＴＯ１３−ＤＮＡ、ＳＹＴＯ４５−ＤＮＡ、ＳＹＴＯＸ青ＤＮＡ、テトラメチルローダミン抗体複合体ｐＨ８．０、テトラメチルローダミンデキストランｐＨ７．０、Ｔｅｘａｓ赤Ｘ抗体複合体ｐＨ７．２、ＴＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−３−ＤＮＡ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１ Ｃａ２＋、ＹＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＹＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＹＯＹＯ−１−ＤＮＡ、およびＹＯＹＯ−３−ＤＮＡが挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの態様では、蛍光 ポリペプチドが使用されることもまた、本開示により企図される。
当技術分野で知られている任意の検出可能なポリペプチドは、本開示の方法において有用であり、いくつかの態様では、蛍光タンパク質である。いくつかの態様では、蛍光タンパク質は、下記表３のタンパク質のリストから選択される。

コントラスト剤
様々な態様では、ナノ複合体を含む方法および組成物が本明細書で開示され、ここで生体分子はポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドは、結合部位を介してコントラスト剤に結合される。さらなる態様では、コントラスト剤は、本明細書で記載される任意の他の生体分子に結合される。本明細書では、「コントラスト剤」は、様々な器官および組織の見かけ密度の差を生成させ、描かれた隣接する体組織および器官の観察をより容易にするために、細胞に導入される化合物または他の物質である。コントラスト剤の本明細書で記載される任意の生体分子への結合は、本開示の組成物および方法において有用であることは理解されるであろう。
本開示により提供される方法としては、ナノ複合体と結合されたコントラスト剤の緩和性が、ナノ粒子と結合されていないコントラスト剤の緩和性に比べ増加されるものが挙げられる。いくつかの態様では、その増加は約１倍〜約２０倍である。さらなる態様では、増加は約２倍〜約１０倍であり、さらに別の態様では、増加は約３倍である。
いくつかの実施形態では、コントラスト剤は、ガドリニウム、キセノン、酸化鉄、マンガンキレート（Ｍｎ−ＤＰＤＰ）および銅からなる群より選択される。よって、いくつかの実施形態では、コントラスト剤は常磁性化合物であり、いくつかの態様では、常磁性化合物はガドリニウムである。
本開示はまた、ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）走査に有用であるコントラスト剤を企図する。いくつかの態様では、ＰＥＴコントラスト剤は放射性核種である。ある実施形態では、コントラスト剤は、１１Ｃ、１３Ｎ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇｅ、９９ｍＴｃおよび８２Ｒｕからなる群より選択される標識を含むＰＥＴコントラスト剤を含む。特定の実施形態では、コントラスト剤は、［１１Ｃ］コリン、［１８Ｆ］フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）、［１１Ｃ］メチオニン、［１１Ｃ］コリン、［１１Ｃ］アセテート、［１８Ｆ］フルオロコリン、６４Ｃｕキレート、９９ｍＴｃキレート、および［１８Ｆ］ポリエチレングリコールスチルベンからなる群より選択されるＰＥＴコントラスト剤である。
本開示はまた、ＰＥＴコントラスト剤がポリヌクレオチド合成プロセス中にポリヌクレオチド内に導入され、ポリヌクレオチド合成後ヌクレオチドに結合される方法を提供する。例えば、限定はされないが、リン原子の１つが３２Ｐまたは３３Ｐと置換され、リン酸基中の酸素原子の１つが３５Ｓと置換され、または１つ以上の水素原子が３Ｈと置換されたヌクレオチドが合成され得る。放射性核種を含む官能基はまた、結合部位を介してヌクレオチドに結合され得る。
ＭＲＩコントラスト剤としては、ポジティブコントラスト剤および／またはネガティブコントラスト剤が挙げられるが、それらに限定されない。ポジティブコントラスト剤は、Ｔ１緩和時間の減少（Ｔ１加重画像に対するシグナル強度の増加）を引き起こす。それらは（ＭＲＩ上で明るく見える）典型的には活性元素としてガドリニウム、マンガン、または鉄を含む小分子量化合物である。これらの元素は全て、それらの外殻中に不対電子スピンおよび長い緩和能を有する。特定の群のネガティブコントラスト剤（ＭＲＩ上で暗く見える）としては、パーフルオロカーボン（パーフルオロ化学薬品）が挙げられ、というのも、それらの存在は、ＭＲイメージングにおいてシグナルに関与する水素原子を排除するからである。
本開示の組成物は、様々な態様では、約５０〜約２．５×１０６のコントラスト剤を含むナノ複合体を含むように企図される。いくつかの実施形態では、ナノ複合体は約５００〜約１×１０６のコントラスト剤を含む。
ターゲティング部分
本明細書では、「ターゲティング部分」という用語は、特定の標的、標的領域に結合、またはそうでなければ限定する、標的細胞（複数可）に入る、または標的受容体に結合するのに化合物または他の分子を支援する任意の分子構造を示す。例えば、限定はされないが、ターゲティング部分はタンパク質を含んでもよく、所望の標的部位にインビボまたはインビトロで結合することができる抗体およびタンパク質断片、ペプチド、小分子、抗癌剤、ポリヌクレオチド結合剤、炭水化物、細胞表面受容体のためのリガンド、アプタマー、脂質（例えば、カチオン性、中性、およびステロイド脂質、ビロソーム、およびリポソーム）、抗体、レクチン、リガンド、糖、ステロイド、ホルモン、および栄養分が挙げられ、ターゲティング部分として機能し得る。ターゲティング部分は、ナノ複合体の特定の細胞型および／または器官、ならびに細胞内位置への送達に有用である。
いくつかの実施形態では、ターゲティング部分はタンパク質である。本開示の組成物のタンパク質部分は、いくつかの態様では、組成物を標的細胞に標的させることができるタンパク質である。本開示のターゲティングタンパク質は、受容体、基質、抗原決定基、または標的細胞上の他の結合部位もしくは他の標的部位に結合することができる。
ターゲティングタンパク質として有用な抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。特定の型の細胞に結合する多くのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が開発されている。遺伝子工学またはタンパク質工学により誘導された抗体も同様に使用され得る。
本開示においてターゲティング作用物質として使用される抗体は、無傷分子、その断片、またはその機能等価物とすることができる。本開示の組成物において有用な抗体断片の例は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’ＦａｂおよびＦｖ断片であり、これらは従来の方法により、または遺伝子またはタンパク質工学により生成され得る。
いくつかの実施形態では、ナノ複合体のポリヌクレオチド部分は追加のまたは補助的なターゲティング部分として機能し得る。ポリヌクレオチド部分は、細胞外ターゲティングを支援するように、または細胞内ターゲティング部分として機能するように選択され、または設計され得る。すなわち、ポリヌクレオチド部分は、標的細胞を探し求めるＤＮＡプローブとして機能し得る。この追加のターゲティング能力は、組成物の標的細胞への送達における特異性を改善するように機能するであろう。ポリヌクレオチドは、さらにまたはその代わりに、標的細胞内の組成物を標的するように選択されまたは設計され得るが、ターゲティングタンパク質は、複合体を細胞外で標的する。
ターゲティング部分は、様々な実施形態では、ナノ複合体と結合できることが企図される。ナノ複合体がナノ粒子を含む態様では、ターゲティング部分は、ナノ粒子、または生体分子あるいはその両方に付着されることが企図される。さらなる態様では、ターゲティング部分はナノ複合体組成物と結合し、他の態様ではターゲティング部分は本開示の組成物の投与前に、投与と同時に、投与後に投与される。
低分子内部相補的ポリヌクレオチド（ｓｉｃＰＮ）
いくつかの態様では、追加の作用物質はｓｉｃＰＮである。ｓｉｃＰＮはナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドと結合し、標的ポリヌクレオチドがナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドにハイブリダイズした場合、置換および／または放出されるポリヌクレオチドである。１つの態様では、ｓｉｃＰＮはナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドに対しより低い結合親和性または結合力を有し、そのため、標的分子のナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドとの結合により、ｓｉｃＰＮはナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドとの結合から置換および／または放出される。
本明細書では、「置換する」は、ｓｉｃＰＮが、そのポリヌクレオチドとの結合から部分的に変性されることを意味する。置換されたｓｉｃＰＮは依然として、部分的にそれが結合しているポリヌクレオチドと結合している。本明細書では「放出する」は、ｓｉｃＰＮが十分置換され（すなわち、完全に変性され）、それが結合しているポリヌクレオチドからの分離が引き起こされる。ｓｉｃＰＮが検出可能なマーカーを含むいくつかの態様では、ｓｉｃＰＮの放出により、検出可能なマーカーが検出されることが企図される。
ｓｉｃＰＮを使用して標的分子を検出するための方法が本明細書で以下記載される。
転写制御因子
本開示は、ナノ複合体を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、ナノ複合体はポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドはさらに、転写制御因子を含む。これらの態様では、転写制御因子は、標的細胞における標的ポリヌクレオチドの転写を誘導する。
本明細書では、転写制御因子はｍＲＮＡの転写の変化を誘導する何かであることが企図される。その変化は、様々な態様では、転写の増加または減少のいずれかとすることができる。様々な実施形態では、転写制御因子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、人工転写因子（ＡＴＦ）および転写を制御することが知られている、または推測される任意の分子からなる群より選択される。
本開示の組成物および方法は、転写制御因子がポリペプチドであるものを含む。ｍＲＮＡの転写を増加または減少させるように作用する任意のポリペプチドが本明細書で使用のために企図される。ペプチドもまた転写制御因子として使用するために企図される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは転写因子である。一般に、転写因子は、モジュール構造であり、および下記ドメインを含む。
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、これは制御される遺伝子に隣接するＤＮＡの特定の配列（例えば、限定はされないが、エンハンサーまたはプロモーター配列）に付着する。転写因子に結合するＤＮＡ配列はしばしば、応答エレメントと呼ばれる。
トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）、これは他のタンパク質、例えば転写共制御因子に対する結合部位を含む。これらの結合部位はしばしば活性化官能基（ＡＦ）と呼ばれる[Warnmark et al., Mol. Endocrinol. 17(10): 1901−9 (2003)]。
任意的なシグナル感知ドメイン（ＳＳＤ）（例えば、限定はされないが、リガンド結合ドメイン）、これは外部シグナルを感知し、それに応じて、これらのシグナルを転写複合体の残りに伝達し、よって、遺伝子発現の上方または下方制御が得られる。また、ＤＢＤおよびシグナル感知ドメインは、いくつかの態様では、別々のタンパク質上に存在し、転写複合体内で関連し、遺伝子発現を制御する。
制御因子ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、転写因子は、制御因子ポリヌクレオチドである。ある態様では、ポリヌクレオチドはＲＮＡであり、さらなる態様では、制御因子ポリヌクレオチドは非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）である。
いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡは、一般的な転写装置と相互作用し、よって転写を阻止する[Goodrich et al., Nature Reviews Mol Cell Biol 7: 612−616 (2006)]。一般に、そのような制御機能を有するＲＮＡは、タンパク質をコードする必要がなく、よって、ｎｃＲＮＡｓと呼ばれる。真核生物ｎｃＲＮＡは３つの核ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＩ、ＩＩまたはＩＩＩ）のうちの１つによりゲノムから転写される。その後、それらは３つの基本的なメカニズムの１つを介して生物学的応答を誘発する：生体反応の触媒、タンパク質への結合およびその活性の調節、または標的核酸との塩基対形成。
ｎｃＲＮＡは、遺伝子発現を含む、様々な生体反応、例えばスプライシング、ｍＲＮＡ代謝回転、遺伝子サイレンシングおよび翻訳の多くに積極的に参加することが示されている[Storz, et al., Annu. Rev. Biochem. 74: 199−217 (2005)]。特に、いくつかの研究により最近、ｎｃＲＮＡはまた、遺伝子発現の制御に対するキーポイントである、真核生物ｍＲＮＡ転写を積極的に制御することが明らかにされている。
別の実施形態では、制御ポリヌクレオチドは、転写因子と結合することができ、よって、その量を設定するものである。いくつかの態様では、制御ポリヌクレオチド使用濃度の増加は、転写因子の量を増加させｍＲＮＡの転写の抑制解除が得られる。
さらなる実施形態では、制御ポリヌクレオチドはアプタマーである。
コーティング
コーティングは、無毒性である分解性ポリマー、生体分子または化学薬品である任意の物質とすることができる。また、コーティングは生体吸収性コーティングとすることができる。本明細書では、「コーティング」は、全体で、ナノ複合体上に堆積される構成要素を示す。コーティングは、ナノ複合体上に形成された、コート層すべてを含む。「コート層」は、化合物、より典型的には特定の溶液中に懸濁、溶解または分散された１つ以上の化合物を含む組成物を堆積させることにより形成される。本明細書では、「生分解性」または「分解性」という用語は、材料または成分が、時間、例えば分、時間、日、週、月または年にわたって分解するまたは、生成物、副産物、成分またはサブコンポーネントに分解される材料または成分の分解または感受性として規定される。本明細書では、「生体吸収性」という用語は、代謝および／または排泄による分解生成物のいずれかの生物学的排除として規定される。
生分解性および／または生体吸収性材料であるコーティングの非制限的な例は、バルク浸食ポリマー（ホモポリマー、コポリマーまたはポリマーブレンドのいずれか）、例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）群に属するポリエステルのいずれか１つである。これとしては、脂肪族ポリエステル、例えばポリ（乳酸）；ポリ（グリコール酸）；ポリ（カプロラクトン）；ポリ（ｐ−ジオキサノン）およびポリ（トリメチレンカーボネート）；ならびにそれらのコポリマーおよびブレンドが挙げられる。生体吸収性材料として有用な他のポリマーとしては、アミノ酸誘導ポリマー、リン含有ポリマー、およびポリ（エステルアミド）が挙げられるが、それらに限定されない。生分解性および／または生体吸収性材料の加水分解速度は、バルク浸食ポリマーを調製するために使用されるモノマーの型に依存する。例えば、吸収時間（分解を完了するまたは完全に分解する時間）は、下記のように推定される：ポリ（カプロラクトン）およびポリ（トリメチレンカーボネート）は３年超かかる；ポリ（乳酸）は約２年かかる；ポリ（ジオキサノン）は約７ヶ月かかる；およびポリ（グリコール酸）は約３ヶ月かかる。モノマーから調製されたコポリマー、例えばポリ（乳酸−コ−グリコール酸）；ポリ（グリコール酸−コ−カプロラクトン）；およびポリ（グリコール酸−コ−トリメチレンカーボネート）に対する吸収速度は、モノマーのモル量に依存する。
ナノ複合体はまた、当業者によく知られた他の放出制御手段または送達装置により投与され得る。これらとしては、例えば、限定はされないが、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、ゲル、透過膜、多層コーティング（下記を参照されたい）、リポソーム、または、様々な割合で所望の放出プロファイルを提供するための上記のいずれかの組み合わせが挙げられる。化合物の放出制御送達の他の方法は、当業者に知られており、発明の範囲内である。
方法
ナノ複合体の製造方法
本開示はナノ粒子上で生体分子を架橋するための戦略を提供する。１つの態様では、戦略は、アルキンを含むリガンドの使用を含む。これらのリガンドは、金ナノ粒子の表面上に自己組織化し、これらのリガンドのアルキン部分は、金表面により活性化され、リガンドシェル内に存在する求核試薬と反応する。この架橋反応は、任意の所望の表面機能性を有する中空ナノ複合体の形成に好適である。さらに、ポリアルキンまたはモノアルキン部分に付着され得る任意の生体分子または非生体分子は、このリガンドシェルに組み入れられ、または独立してリガンドシェルを形成するであろう。
生体分子架橋
ポリアルキン化学
Ａｕ（Ｉ）およびＡｕ（ＩＩＩ）イオンおよびそれらの複合物は著しい親アルキン性を示し、有機変換のための強力な触媒としてますます認識されるようになっている[Hashmi, Chem. Rev. 107: 3180−3211 (2007); Li et al., Chem. Rev. 108: 3239 (2008); Furstner et al., Angew. Chem. Int. Ed. 46: 3410 (2007); Hashmi et al., Angew. Chem. Int. Ed. 45: 7896 (2006)]。近年、Ａｕ（０）表面はまた、末端アセチレン基を吸着し、かなり高密度の安定な単層を形成することが証明されている[Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 129: 4876 (2006)]。しかしながら、アルキンと金表面間に存在する相互作用の型はよく理解されていない。
さらに、そのような相互作用がアセチレン基を、化学反応、例えば、典型的にはイオン性金−アルキン複合物を用いて観察される求核付加をより受けやすくしているかどうかは明らかではない。複数のサイドアームプロパルギルエーテル基を有すると、ポリマー１（スキーム１）は、Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ−Ｆｒｅｎｓ方法に従い水溶液中で調製されたクエン酸安定化１３ｎｍＡｕＮＰ上に容易に吸着する［Frens, Coll. Polym. Sci. 250: 736 (1972)]。過剰ポリマーは、反復遠心分離およびその後の再懸濁工程により除去される。得られたポリマーコートＡｕＮＰは、分散された粒子に特有の、５２４ｎｍのプラズモン共鳴を示し、室温での８週間の貯蔵後でさえも、凝集の証拠はない。そのため、１が潜在的な粒子間架橋剤であっても、ＡｕＮＰの凝集には至らず、その結果は動的光散乱（ＤＬＳ）および電子顕微鏡観察により確証された（下記実施例を参照されたい）。
１つの実施形態では、本開示は、ペンダントプロパルギルエーテル基を含む線形の生体分子（１）から、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を、シェルの形成のための鋳型および架橋反応のための触媒の両方として使用し、ナノ複合体を合成するための方法を提供する（スキーム１）。追加の架橋剤または合成操作は必要ない。反応により、生体分子が架橋された後、ナノ粒子が除去されると、明確な、均質中空ナノ複合体が得られる。
１つの態様では、生体分子は本明細書で規定されるポリヌクレオチドである。これらの態様では、ポリヌクレオチドはアルキンを含むことが企図される。様々な実施形態では、１〜１００のアルキン部分がポリヌクレオチド上に存在する。さらなる態様では、約５〜約５０のアルキン部分、または約１０〜約２０のアルキン部分がポリヌクレオチド上に存在する。１つの態様では、１０のアルキン部分がポリヌクレオチド上に存在する。さらなる態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上のアルキン部分がポリヌクレオチド上に存在する。
別の実施形態では、ポリヌクレオチド上のアルキン部分は５’末端上にある。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド上のアルキン部分は３’末端上にある。いくつかの態様では、アルキン部分は、ポリヌクレオチドの長さの一部のみを表すことが企図される。例として、ポリヌクレオチドが２０ヌクレオチド長である場合、最初の１０ヌクレオチド（様々な態様では５’または３’末端のいずれかから計算）は、アルキン部分を含むことが企図される。よって、総数２０ヌクレオチドからアルキン部分を含む１０ヌクレオチドは、アルキン部分と結合するポリヌクレオチド中のヌクレオチドの５０％となる。様々な態様では、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの約０．０１％〜約１００％がアルキン部分と結合することが企図される。さらなる態様では、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの約１％〜約７０％、または約２％〜約６０％、または約５％〜約５０％、または約１０％〜約５０％、または約１０％〜約４０％、または約２０％〜約５０％、または約２０％〜約４０％がアルキン部分と結合する。さらに別の態様では、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％がアルキン部分と結合することが企図される。
１つの態様では、この架橋反応は、アルキン部分およびリン脂質を含むポリマーおよびＡＰＯ１Ａタンパク質（図１６）を使用することによる中空ＨＤＬナノ粒子の形成に利用することができる。
ポリアルキン架橋アプローチを使用して架橋を実施する方法に戻ると、下記工程が含まれる。最初に、本明細書で記載されるようにナノ粒子の溶液が調製される（ナノ粒子調製工程）（実施例１）。溶液は、多反応性基を含む生体分子を含む溶液と接触される（接触工程）。使用される多反応性基によって、任意的な活性化工程が含められる（活性化工程）。得られた混合物はその後、架橋を起こすようにインキュベートされ（インキュベーション工程）、その後、単離される（単離工程）。ナノ粒子コアの任意的な溶解（溶解工程）がその後実施され、中空ナノ複合体が生成される。標識工程もまた、任意で含められる（標識工程）。
本開示により使用のために企図される求核試薬としては、本明細書で記載されるものが挙げられる。一般に、使用のために企図される求核試薬は、炭素求核試薬、ＨＸ求核試薬（例えば、限定はされないが、ＨＦおよびＨＣｌ）、酸素および硫黄求核試薬、および窒素求核試薬に分類することができる。上記の任意のタンデム組み合わせもまた、企図される。
ナノ粒子調製工程．ナノ粒子の溶液は、実施例１で記載されるように調製される。ポリアルキン架橋の場合、１つの態様では金ナノ粒子溶液が調製される。
接触工程．多反応性基を含むか、または多反応性基を含むように修飾された対象の生体分子が、ナノ粒子溶液と接触させられる。本明細書では、多反応性基はアルキンとすることができ、または多反応性基は光反応性基、あるいは、例えば、限定はされないが、超音波処理またはマイクロ波で活性化される基とすることができる。使用される多反応性基に関係なく、多反応性基を含む生体分子の溶液は、ナノ粒子溶液と接触させられ、架橋が促進される。
いくつかの態様では、使用される架橋戦略に関係なく、添加する生体分子の量は、得られるナノ複合体の特性に関係する。一般に、本開示は、ナノ複合体に架橋させるのに使用される生体分子の濃度によって、より高密度の、またはより低密度のナノ複合体を提供する。生体分子の濃度がより低いと、ナノ粒子上の密度がより低くなり、より多孔性のナノ複合体が得られることとなる。反対に、生体分子の濃度がより高いと、ナノ粒子上の密度がより高くなり、より剛性のナノ複合体が得られることとなる。これらの態様に関連するように、「より低い密度」は約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。また、これらの態様に関連するように、「より高い密度」は約１０１ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。
活性化工程．生体分子および／または非生体分子上に存在する多反応性基が活性化を必要とする本開示の態様では、活性化工程が方法に含まれることが企図される。この工程では、活性化源が適用され、これは限定はされないが、レーザ（多反応性基が光反応性である場合）、または音（多反応性基が超音波処理により活性化される場合）、またはマイクロ波（多反応性基がマイクロ波により活性化される場合）とすることができる。
いくつかの実施形態では、表面自体が生体分子および／または非生体分子上に存在する多反応性基を活性化することができる。これらの実施形態では、活性化工程は必要でない。
インキュベーション工程．多反応性基を含む生体分子を含む溶液をナノ粒子溶液と接触させるとすぐに、混合物がインキュベートされ、架橋が起こる。インキュベーションは、約４℃〜約５０℃の温度で起こすことができる。インキュベーションは、約１分〜約４８時間以上の間起こすことができる。いくつかの態様では、インキュベーションは、時間の長さに関係なく起こすことができることが企図される。
単離工程．架橋ナノ複合体はその後、単離することができる。単離のために、混合物を遠心分離し、上清を除去し、架橋ナノ複合体を適切な緩衝液中に再懸濁させる。様々な態様では、１を超える遠心分離工程が架橋ナノ複合体をさらに精製するために実施され得る。
溶解工程．本明細書で記載される組成物または方法のいずれかにおいて、生体分子の架橋後にナノ粒子を保持するかどうかは、任意的であり、目的の用途に依存する。
本開示の組成物がナノ粒子を含まないそれらの実施形態では、生体分子のナノ複合体への架橋後に、ナノ粒子は溶解されるか、または別の方法で除去されることが企図される。
ナノ粒子コアの溶解は、当技術分野における通常の技術範囲内であり、１つの態様では酸素の存在下でＫＣＮを使用することにより達成される。さらなる態様では、ヨウ素または王水が、ナノ粒子コアを溶解するのに使用される。１つの態様では、ナノ粒子コアは金を含む。本明細書で記載されるように、ＫＣＮがクエン酸安定化ＡｕＮＰに添加される場合、ＡｕＮＰの不安定化および凝集の結果、溶液の色は赤色から紫色に変化する。しかしながら、ポリマーコートＡｕＮＰでは、色は溶解プロセス中、溶液が透明になるまで、わずかに赤みを帯びた橙色に徐々に変化する（図９Ａ）。
溶解プロセスは、透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）により可視化することができる（図９Ｃ）。ＡｕＮＰの外層は部分的に溶解するので、上記保護シェルは、ＴＥＭグリッドの酢酸ウラニル染色により観察することができる。鋳型の完全除去により、高い忠実度で鋳型のサイズおよび形状を保持する中空ナノ複合体が得られる。
追加の架橋方法
直接鎖架橋（ＤＳＣ）は、ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドが、化学手段により架橋され得る１つ以上の架橋部分で修飾される方法である。ＤＳＣ方法は、１つの態様では、様々な化学手段により架橋され得る部分によるポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの修飾により実施される。様々な態様では、架橋部分を含む１つ以上のヌクレオチドは、スペーサ中に存在する。
１つの態様では、アミン修飾チミジンホスホラミダイト（ＴＮ）をスペーサ中に組み込むポリヌクレオチドが合成される。ポリヌクレオチドは、全てこの修飾塩基で構成し、架橋効率を最大にすることができる。鎖は、１つの態様では、２つのアミン反応性ＮＨＳ−エステル部分を有する、スルホ−ＥＧＳのようなホモ二官能性架橋剤の使用により架橋される。アミンが１つの実施形態では使用のために企図されるが、この設計は、多くの他の反応基（例えば、限定はされないが、アミン、アミド、アルコール、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、ジスルフィド、カルボン酸、フェノール、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドラゾン、アジド、およびアルキン）に適合する。
表面支援架橋（ＳＡＣ）と呼ばれる追加の方法は、ナノ粒子表面上で構築され、共に架橋される修飾核酸および反応性チオール化分子の混合単層を含む。
対象の生体分子の架橋を引き起こす化学薬品は当業者に知られており、例えば下記が挙げられるが、それらに限定されない：ジスクシンイミジルグルタラート、スベリン酸ジスクシンイミジル、ビス［スルホスクシンイミジル］スベラート、トリス−スクシンイミジルアミノトリアセテート、スクシンイミジル４−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン、スクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタレート塩酸塩、スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート、ジチオビス［スクシンイミジルプロピオネート］、３，３’−ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオネート］、酒石酸ジスクシンイミジル、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］、エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］、アジプイミド酸ジメチル・２ＨＣｌ、ピメルイミド酸ジメチル・２ＨＣｌ、スベルイミド酸ジメチル・２ＨＣｌ、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、β−［トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィノ］プロピオン酸、ビス−マレイミドエタン、１，４−ビスマレイミドブタン、ビスマレイミドヘキサン、トリス［２−マレイミドエチル］アミン、１，８−ビス−マレイミド−ジエチレングリコール、１，１１−ビス−マレイミド−トリエチレングリコール、１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン、ジチオビスマレイミドエタン、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン、１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン、ビス［ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド、Ｎ−（ａ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−ａ−［２−ピリジルジチオ］トルエン、４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート）、ヨード酢酸Ｎ−スクシンイミジル、スクシンイミジル３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート、スルホスクシンイミジル［４−アジドサリチルアミド］−ヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル−（パーフルオロアジドベンズアミド）エチル−１，３’−ジチオプロプリオネート、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）エチル−１，３’−プロプリオネート、スルホスクシンイミジル２−［７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセトアミド］エチル−１，３’ジチオプロピオネート、スクシンイミジル４，４’−アジペンタノエート、スクシンイミジル６−（４，４’−アジペンタンアミド）ヘキサノエート、スクシンイミジル２−（［４，４’−アジペンタンアミド］エチル）−１，３’−ジチオプロプリオネート、スルホスクシンイミジル４，４’−アジペンタノエート、スルホスクシンイミジル６−（４，４’−アジペンタンアミド）ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル２−（［４，４’−アジペンタンアミド］エチル）−１，３’−ジチオプロプリオネート、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド，トリフルオロ酢酸塩、［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド，トリフルオロ酢酸塩、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩酸塩、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネート、およびスクシンイミジル−［４−（ソラレン−８−イルオキシ）］−ブチラート。
生体分子のＤＳＣおよびＳＡＣ架橋は、一般的には上記で記載される。これらの架橋戦略のための方法の工程は、活性化工程がこれらの架橋戦略では任意的であることを除き、ポリアルキン架橋のために上記で記載されたものに大体酷似する。本明細書で記載されるように、生体分子の架橋を促進するために化学薬品が使用される。このように、ナノ粒子調製工程、接触工程、活性化工程、インキュベーション工程、単離工程および任意的な溶解工程が実施される。標識工程は、同様に任意で含められる。これらの工程は本明細書で上記で記載されている。
上記方法はまた、任意で、ナノ複合体がさらに本明細書で規定される追加の作用物質を含む工程を含む。追加の作用物質は、様々な態様では生体分子および／または非生体分子の架橋中に混合物に添加することができ、またはナノ複合体の生成後に添加することができる。
治療薬の付着
本開示は、いくつかの実施形態では、組成物がさらに治療薬を含むナノ複合体組成物を提供する。治療薬は、いくつかの態様では、ナノ複合体組成物の一部である生体分子に付着される。さらなる態様では、生体分子はポリヌクレオチドである。治療薬または化学療法薬をポリヌクレオチドに付着させる方法は、当技術分野で知られており、Ｐｒｉｅｓｔ、米国特許第５，３９１，７２３号、Ａｒｎｏｌｄ、Ｊｒ．ら、米国特許第５，５８５，４８１号、Ｒｅｅｄら、米国特許第５，５１２，６６７号およびＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２３２５号（それらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
様々な態様では、本明細書で記載される治療薬はナノ粒子に付着されることは、認識されるであろう。
ナノ複合体を使用する方法
中空ナノ複合体を使用する方法
中空ナノ複合体は、いくつかの実施形態では、送達媒体として有用である。よって、１つの態様では、本明細書で規定される追加の作用物質がナノ複合体内部に局在化される中空ナノ複合体が製造される。関連する態様では、追加の作用物質は、本明細書で記載されるナノ複合体と結合される。送達媒体として使用されるナノ複合体は、いくつかの態様では、より多孔性とされ、そのため、追加の作用物質がナノ複合体内部へ配置されることが企図される。ナノ複合体の多孔性は、特定の用途によって実験的に決定することができ、当技術分野における技術の範囲内にある。機能化ナノ粒子の全ての利点（例えば、限定はされないが、細胞取り込みの増加およびヌクレアーゼ分解への抵抗性）は中空ナノ複合体に付与される。
いくつかの態様では、送達媒体として使用されるナノ複合体は、少なくとも部分的に分解性である生体分子を用いて生成され、そのため、ナノ複合体が対象位置に標的されるとすぐに、溶解し、そうでなければ分解し、追加の作用物質が放出されることがさらに企図される。生体分子分解経路は、当業者に知られており、ヌクレアーゼ経路、プロテアーゼ経路およびユビキチン経路が挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの態様では、本開示の組成物は、持続放出製剤として作用する。これらの態様では、ナノ複合体は、その生体適合性および広範囲の生分解性のためにポリ−乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを使用して生成される。ＰＬＧＡの分解生成物、乳酸およびグリコール酸は、ヒトの体内で迅速に除去され得る。さらに、このポリマーの分解性は、その分子量および組成によって数ヶ月から数年で調節することができる[Lewis, " Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug De肝臓y Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1−41（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）]。
ハイブリダイゼーション速度を増加させる方法
いくつかの実施形態では、ナノ粒子に付着される生体分子はポリヌクレオチドである。したがって、提供される方法は、ｓｉｃＰＮの使用によるポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドとの結合速度の増加を可能にするものを含む。結合速度の増加は、様々な態様では、ｓｉｃＰＮのない場合の結合速度に対し、約２倍〜約１００倍である。本開示によれば、標的ポリヌクレオチドと結合するポリヌクレオチドはナノ複合体の一部である。さらに、全配列ではなく、ナノ複合体を生成させるのに使用されるポリヌクレオチド上の標的ポリヌクレオチド結合部位の一部と重なるｓｉｃＰＮが添加される。
よって、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドの一本鎖部分が残る。標的ポリヌクレオチドが、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドの一本鎖部分と結合する場合、ｓｉｃＰＮを置換および／または放出し、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドとの結合速度の増強が得られる。
ポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドとの結合は、さらにｓｉｃＰＮを置換し、いくつかの態様では、放出する。ｓｉｃＰＮまたは標的ポリヌクレオチドは、様々な実施形態では、さらに、検出可能な標識を含む。よって、標的ポリヌクレオチドの検出が望まれる方法の１つの態様では、検出可能な標識の作用により検出可能な変化を発生させるのは、ｓｉｃＰＮの置換および／または放出である。標的ポリヌクレオチドの検出が望まれる別の方法では、それ自体の検出可能な標識により検出可能な変化を発生させるのは、標的ポリヌクレオチドである。標的ポリヌクレオチド発現の阻止が望まれる方法では、アンチセンスメカニズムにより標的ポリヌクレオチド発現の阻止を発生させるのはナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドとの結合である。
本開示の組成物は、複数のポリヌクレオチドと結合することができ、複数の標的ポリヌクレオチドと特異的に結合するために１つ以上の表面上で使用され得る複数のｓｉｃＰＮを含む。よって、下記で記載される方法の工程または工程の組み合わせは、１つ以上のナノ複合体の一部である１つまたは複数のポリヌクレオチド、ｓｉｃＰＮおよび標的ポリヌクレオチドに当てはまる。
様々な態様では、方法は標的ポリヌクレオチドに１００％相補的、すなわち、完全一致であるポリヌクレオチドの使用を含み、一方、他の態様では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが標的遺伝子産物の望まれる阻止を達成することができる程度まで、ポリヌクレオチドの長さにわたって、ポリヌクレオチドに少なくとも（それに等しいか、それ以上を意味する）約９５％相補的、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％相補的である。ハイブリダイゼーションの程度は、標的ポリヌクレオチドの結果として得られる検出よりも有意性が低く、または、遺伝子産物発現の阻止の程度であることは、当業者には理解されるであろう。
標的ポリヌクレオチドを検出する方法
本開示は、標的生体分子を本明細書で記載される組成物と接触させることを含む、標的生体分子を検出する方法を提供する。接触により、様々な態様では、本開示により提供される遺伝子発現の制御が得られる。別の態様では、接触により検出可能な変化が得られ、検出可能な変化は、標的生体分子の検出を示す。検出可能な標識の検出は、本明細書で記載される方法のいずれかにより実施され、検出可能な標識は、ナノ複合体の一部である生体分子上に存在することができ、または標的生体分子上に存在することができる。
いくつかの態様では、上記で記載されるように、検出可能な変化を発生させるのは、ｓｉｃＰＮの置換および／または放出である。検出可能な変化は、検出可能な標識の使用により評価され、１つの態様では、ｓｉｃＰＮは、検出可能な標識で標識される。さらに、本方法によれば、検出可能な標識は、ナノ複合体を鋳型化するのに使用される表面付近にある時にクエンチされる。当技術分野においては、「クエンチ」または「クエンチする」という用語は、しばしば蛍光マーカーと関連させられることが理解されるが、クエンチされるマーカーのいずれかのシグナルは、比較的検出不能であることが、本明細書では企図される。よって、蛍光マーカーを使用する、この説明により具体化される方法は、企図される方法の１つの実施形態としてのみ提供され、クエンチされることができる任意のマーカーが、例示的な蛍光マーカーの代わり使用され得ることが理解されるべきである。
よって、ｓｉｃＰＮはナノ複合体と、検出可能な標識が、その検出をクエンチするために表面付近にあるように結合される。ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドと接触および結合すると、ｓｉｃＰＮの置換および／または放出を引き起こす。よって、ｓｉｃＰＮの放出によりｓｉｃＰＮ上に存在する検出可能な標識とポリヌクレオチドが鋳型化される表面との間の距離が増加する。この距離の増加により、前にクエンチされた検出可能な標識の検出が可能になり、標的ポリヌクレオチドの存在が示される。
よって、１つの実施形態では、複数のポリヌクレオチドが、本明細書で記載される方法によりナノ複合体を生成させるために使用される方法が提供される。ポリヌクレオチドはストリンジェントな条件下で、１つ以上の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるように設計される。ハイブリダイゼーションは、当技術分野で知られており、本明細書で記載される異なるストリンジェントな条件下で実施することができる。複数のポリヌクレオチドを用いたナノ複合体の生成後、任意で検出可能な標識を含む複数のｓｉｃＰＮが添加され、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドとハイブリダイズされる。いくつかの態様では、複数のポリヌクレオチドおよびｓｉｃＰＮは、最初に互いにハイブリダイズされ、その後、二本鎖がナノ複合体を生成させるのに使用される。複数のポリヌクレオチドが複数のｓｉｃＰＮにハイブリダイズされ、二本鎖がナノ複合体を生成させるのに使用される順序に関係なく、次の工程は、ナノ複合体を標的ポリヌクレオチドと接触させることである。標的ポリヌクレオチドは、様々な態様では、溶液中とすることができ、または細胞内に存在することができる。いくつかの態様では、溶液は標的ポリヌクレオチドの有無に対し試験され、他の態様では、溶液は標的ポリヌクレオチドの相対量に対し試験されることは理解されるであろう。
二本鎖を標的ポリヌクレオチドと接触させた後、標的ポリヌクレオチドは、その、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの結果、ｓｉｃＰＮを置換および／または放出する。ｓｉｃＰＮの置換および放出により、表面とｓｉｃＰＮの間の距離が増加し、ｓｉｃＰＮ上の標識が検出可能になる。ｓｉｃＰＮの置換および放出の結果検出される標識の量は、溶液中に存在する標的ポリヌクレオチドの量と関係する。一般に、検出可能な標識の量の増加は、溶液中の標的ポリヌクレオチドの数の増加と相関する。
いくつかの実施形態では、溶液中で１を超える標的ポリヌクレオチドを検出することが望ましい。これらの実施形態では、１を超えるｓｉｃＰＮが使用され、各ｓｉｃＰＮが独特な検出可能な標識を含む。したがって、各標的ポリヌクレオチド、ならびにその相対量は、各独特な検出可能な標識の検出に基づき、個々に検出可能である。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ナノフレア技術において有用である。ナノフレアは、生細胞内部の生体分子レベル蛍光検出のためにｓｉｃＰＮ構造を利用することができるポリヌクレオチド機能化ナノ粒子の関連で前に記載されている［ＷＯ２００８／０９８２４８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において記載される］。この系では、ｓｉｃＰＮは「フレア」として作用し、検出可能に標識され、入ってくる標的ポリヌクレオチドにより表面から置換または放出される。よって、ナノフレア技術は、本明細書で記載されるナノ複合体の関連で有用であることが企図される。
さらなる態様では、ナノ複合体は試料中のシステインの存在または量を検出するために使用され、Ｈｇ２＋を含む複合物およびナノ複合体の集団を含む第１の混合物を提供することを含み、ここで、集団は、一本鎖ポリヌクレオチドの対の１つを含むナノ複合体、およびその対の他の一本鎖ポリヌクレオチドを含むナノ複合体を含み、その対は適切な条件下で少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを有する二本鎖を形成し、ならびに、第１の混合物を、システインを有すると思われる試料と接触させ、第２の混合物を形成させること、および第２の混合物中の二本鎖の融点を検出することを含み、ここで、融点は、試料中のシステインの存在または量を示す。いくつかの態様では、ヌクレオチドミスマッチは、内部ヌクレオチドミスマッチである。さらなる態様では、ミスマッチはＴ−Ｔミスマッチである。さらに別の態様では、システインを含む試料は、システインを含まない試料よりも少なくとも約５℃低い融点を有する。
遺伝子発現を阻止する方法
本開示により提供される追加の方法は、標的ポリヌクレオチドを本明細書で記載される組成物と接触させることを含み、接触は、遺伝子産物の発現を阻止するのに十分なものである、標的ポリヌクレオチドから発現される遺伝子産物の発現を阻止する方法を含む。遺伝子産物の阻止は、標的ポリヌクレオチドの本開示の組成物とのハイブリダイゼーションに起因する。
ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドの配列は、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするためには、その標的ポリヌクレオチドの配列に１００％相補的である必要はないことが、当技術分野において理解される。さらに、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたって標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、そのため、介在または隣接セグメントはハイブリダイゼーション事象（例えば、限定はされないが、ループ構造またはヘアピン構造）に関与しない。相補性パーセントは、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドの長さにわたって決定される。例えば、ポリヌクレオチドの２０ヌクレオチドのうちの１８が、全長１００ヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド中の２０ヌクレオチド領域に相補的である、ポリヌクレオチドを含むナノ複合体を考えると、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドは９０％相補的である。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドはクラスター化され、相補的ヌクレオチドが散在され、互いに、または相補的ヌクレオチドに近接する必要はない。ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドの領域との％相補性はルーチン的に当技術分野で知られているＢＬＡＳＴプログラム（ベーシックローカルアラインメントサーチツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを使用して決定することができる(Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403−410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649−656)。
提供される遺伝子産物発現を阻止するための方法は、生体分子および／または非生体分子を含むナノ複合体なしの遺伝子産物発現に比べ、標的遺伝子産物の発現が少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％阻止されるものを含む。言い換えれば、提供される方法は、標的遺伝子産物の発現の本質的にいくらかの程度の阻止が得られるものを含む。
阻止の程度は、インビボで体液試料または生検試料から、当技術分野でよく知られたイメージング技術により決定される。または、阻止の程度はインビトロで細胞培養アッセイにおいて、一般に、本明細書で記載される組成物の使用からインビボで予測することができる阻止の程度の予測可能な尺度として決定される。標的ポリヌクレオチドの阻止は、ある細胞に対する阻止の効果を評価するために使用されることが、本開示により企図される。非制限的な例として、遺伝子産物の阻止の効果を研究することができ、ここで遺伝子産物は、シグナル伝達経路の一部である。また、遺伝子産物の阻止を研究することができ、ここで遺伝子産物は、アポトーシス経路に関与すると仮定される。
本明細書で記載される方法のいずれかを組み合わせて使用して、所望の結果を達成することができることが理解されるであろう。例えば、限定はされないが、本明細書で記載される方法は、組み合わせることができ、標的ポリヌクレオチドを検出する、ならびにその発現を制御することの両方が可能になる。いくつかの実施形態では、この組み合わせを使用して、インビトロまたはインビボのいずれかで、時間に伴う標的ポリヌクレオチド発現の阻止を定量化することができる。時間に伴う定量は、１つの態様では、培養物から特定の時間点で細胞を除去し、各時間点で標的ポリヌクレオチドの発現の相対レベルを評価することにより、達成される。１つの態様では、検出可能な標識の可視化により評価される、時間に伴う標的ポリヌクレオチドの量の減少は、標的ポリヌクレオチドの阻止速度を示す。
よって、あるポリヌクレオチドの、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、その発現を阻止する有効性を決定すること、ならびにあるポリヌクレオチドの細胞上での阻止の効果を決定することは、企図される態様である。
イメージング方法
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
ある実施形態では、ポリヌクレオチドに結合されたＭＲＩコントラスト剤は、鉄または常磁性放射性トレーサおよび／または複合物であり、例えば、ガドリニウム、キセノン、酸化鉄、および銅が挙げられるがそれらに限定されない。
蛍光
本開示の組成物の存在が、観察可能な変化により検出される方法が提供される。１つの態様では、組成物の存在は、本明細書で開示される特定のマーカーを検出することができる装置を用いて観察される色の変化を生じさせる。例えば、限定はされないが、蛍光顕微鏡は、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドに結合されるフルオロフォアの存在を検出することができる。
触媒金属堆積による複合物可視化
本明細書で記載される方法は、本明細書で規定されるナノ複合体と標的分子の間で形成される複合物上に金属を堆積させ、複合物の検出を増加させることを含む。金属は、ナノ粒子／標的分子複合物が金属増強溶液と、金属層を複合物上に堆積させる条件下で接触させられた場合、ナノ粒子／標的分子上に堆積される。よって、本開示はまた、ナノ複合体を含む組成物を提供し、ナノ複合体は単一の触媒金属堆積物を有し、組成物は少なくとも約２５０ｎｍｓの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、平均直径は約２５０ｎｍ〜約５０００ｎｍである。いくつかの態様では、１を超える触媒金属堆積物が企図される。
金属増強溶液は、本明細書では、ナノ複合体−標的分子複合物と接触させられ、金属を複合物上に堆積させる溶液である。様々な態様では、堆積される金属の型によって、金属増強溶液は、例えば、限定はされないが、ＨＡｕＣｌ４、硝酸銀、ＮＨ２ＯＨおよびヒドロキノンを含む。
いくつかの実施形態では、標的分子は、ナノ複合体と接触される場合、サポート上に固定される。サポートとしては、本明細書では、カラム、膜、またはガラスもしくはプラスチック表面が挙げられるが、それらに限定されない。ガラス表面サポートとしては、ビーズまたはスライドが挙げられるが、それらに限定されない。本開示により企図されるプラスチック表面としては、スライド、およびマイクロタイタープレートが挙げられるが、それらに限定されない。マイクロアレイは、本開示により企図される追加のサポートであり、典型的にはガラス、シリコンベースまたはポリマーのいずれかである。マイクロアレイは当業者に知られており、サポート上に、アドレス可能な位置で配列された標的分子を含む。マイクロアレイ、例えば、限定はされないが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．から購入できる。
いくつかの実施形態では、標的分子は溶液中にある。この型のアッセイでは、ナノ複合体は溶液中の標的分子と接触させられ、ナノ粒子／標的分子複合物を形成し、これはその後、複合物上に金属が堆積された後検出される。この型の方法は、標的分子が溶液または体液中にあるかに関係なく有用である。例えば、限定はされないが、本明細書では溶液は緩衝溶液、水、または有機溶液を意味する。体液としては、血液（血清または血漿）、リンパ液、脳脊髄液、精液、尿、滑液、涙、粘液、および唾液が挙げられるが、それらに限定されず、当業者にとってルーチン的な方法により得ることができる。
本開示はまた、金属イオン（例えば、限定はされないが、水銀イオン（Ｈｇ２＋））を検出するための、本明細書で記載される組成物および方法の使用を企図する。これらの態様では、方法は、ＤＮＡポリヌクレオチドを含むナノ複合体の協同的結合および触媒特性ならびにＨｇ２＋に対するチミン−チミンミスマッチの選択的結合を利用する[Lee et al., Anal. Chem. 80: 6805−6808 (2008)]。
本明細書で記載される方法はまた、バイオバーコードアッセイと組み合わせて使用するために企図される。バイオバーコードアッセイは、一般に米国特許第６，９７４，６６９号および第７，３２３，３０９号（各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。
本開示の方法は、銀もしくは金またはそれらの組み合わせが標的分子との複合物中のナノ複合体上に堆積されるものを含む。
１つの実施形態では、本明細書で記載されるナノ複合体上での銀堆積方法は、単一の銀堆積後、約３ｐＭの標的分子の検出限界を与える。別の態様では、第２の銀堆積により、検出限界が約３０ｆＭまで改善される。よって、銀の堆積数が、標的分子の検出限界と関連する。したがって、当業者であれば、本開示の方法は、ある濃度の標的分子と相関するように調整され得ることを理解するであろう。例えば、限定はされないが、３０ｆＭの標的分子では、２つの銀堆積を使用することができる。銀堆積により検出するのに好適な標的分子濃度は、約３ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約０．５ｐＭ、約４００ｆＭ、約３００ｆＭ、約２００ｆＭ、約１００ｆＭ以下である。
提供される方法では、ナノ複合体は、第１の分子を含む試料と、ナノ複合体と第１の分子の間で複合物形成が可能となる条件下で接触させられる。
第２の分子が第１の分子と、ナノ複合体と第１の分子の接触前に複合物形成が可能となる条件下で接触させられる方法もまた、提供される。
標的分子が第１のナノ複合体と結合する第２のナノ複合体に付着される方法もまた企図される。いくつかの態様では、第２のナノ複合体は固体サポート上に固定される。他の態様では、第２のナノ複合体は溶液中にある。
提供される方法はまた、ナノ複合体を含む組成物を、１を超える標的分子と接触させることを一般に企図する。したがって、いくつかの態様では、１を超えるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含むナノ複合体は、１を超える標的分子を同時に認識し、結合することができることが企図される。
さらなる実施形態では、ハイスループット検出および同定のための「サンドイッチ」プロトコルを使用して標的ポリヌクレオチドが同定される。例えば、限定はされないが、標的ポリヌクレオチドを認識し、選択的に結合するポリヌクレオチドは、固体サポート上に固定される。標的ポリヌクレオチドを含む試料は、ポリヌクレオチドを含む固体サポートと接触させられ、よって、結合が起こり得る。非特異的相互作用の除去後、本明細書で記載されるナノ複合体を含む組成物が添加される。これらの態様では、ナノ複合体は、標的ポリヌクレオチドと選択的に結合する分子を含み、よって、ポリヌクレオチド−標的ポリヌクレオチド−ナノ複合体の「サンドイッチ」が生成される。この複合物はその後、本明細書で記載される金属堆積プロセスに暴露され、高感度検出が得られる。相互作用の定量により、疾患進行、治療有効性、疾患同定、および疾患感受性に関連するが、それらに限定されない決定が可能になる。
複合物の検出を増強させるための、本明細書で規定されるナノ複合体と標的分子の間で形成される複合物上の金属の触媒堆積の追加の説明は米国出願番号第１２／７７０，４８８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において見られる。
標的ポリヌクレオチドの転写の調節の検出
本開示により提供される方法は、ナノ複合体および転写制御因子を投与すること、検出可能な変化を測定することを含み、転写制御因子は、転写制御因子のない場合の転写レベルに対し、標的細胞における標的ポリヌクレオチドの転写を増加または減少させる、標的ポリヌクレオチドの転写の調節を検出する方法を含む。
本開示はまた、標的ポリヌクレオチドを同定する方法を企図する。これらの方法のいくつかの態様では、ポリヌクレオチドのライブラリが、その標的ポリヌクレオチドの転写の増加または減少を検出する能力に対しスクリーニングされる。ライブラリは、様々な態様では、ポリヌクレオチドライブラリである。これらの方法のいくつかの態様では、知られている配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドが、ナノ複合体を生成するために使用され、第１のナノ複合体が作製される。いくつかの態様では、二本鎖ポリヌクレオチドの１つの鎖はさらに、ポリヌクレオチドの２つの鎖が互いにハイブリダイズされたままである間にクエンチされる検出可能なマーカーを含む。ナノ複合体がその後、標的細胞と、転写制御因子と同時に接触させられる。ナノ複合体を生成するのに使用される、知られている配列のポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする場合、検出可能な変化が得られる。検出可能な変化は、いくつかの態様では、蛍光である。標的細胞をポリヌクレオチドが第１のナノ複合体とは異なる配列を含む第２のナノ複合体と接触させることにより観察される検出可能な変化とは著しく異なる検出可能な変化の観察は、標的ポリヌクレオチドの同定を示す。よって、さらなる態様では、各ナノ複合体は知られている配列のポリヌクレオチドを含み、さらに別の態様では、ライブラリ内のポリヌクレオチドを含む異なるナノ粒子が投与される場合に測定される検出可能な変化に対する、転写制御因子が投与された場合の検出可能な変化の増加または減少は標的ポリヌクレオチドの同定を示す。したがって、いくつかの態様では、方法はある転写制御因子により制御されるｍＲＮＡの同定を提供する。様々な態様では、ｍＲＮＡは増加され、いくつかの態様ではｍＲＮＡは減少される。
ナノ複合体を含む組成物のヒトへの局所送達が、本開示のいくつかの態様で企図される。局所送達はインターベンショナルラジオロジーおよび本開示の組成物との併用での塞栓剤の使用を含む。
ナノ複合体のプローブとしての使用
ナノ複合体は、１つの態様では、診断アッセイにおいて、核酸を検出するためのプローブとして使用される。
標的核酸を検出する方法のいくつかの実施形態は、基材を使用する。検出可能な変化の観察を可能にする任意の基材を使用することができる。好適な基材としては、透明固体表面（例えば、ガラス、石英、プラスチックおよび他のポリマー）、不透明固体表面（例えば、白色固体表面、例えばＴＬＣシリカプレート、濾紙、ガラス繊維フィルタ、硝酸セルロース膜、ナイロン膜）、および導電固体表面（例えば、インジウム−酸化スズ（ＩＴＯ））が挙げられる。基材は任意の形状または厚さとすることができ、一般に平坦で薄い。透明基材、例えばガラス（例えば、ガラススライド）またはプラスチック（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）が好ましい。ポリヌクレオチドを基材に付着する方法およびナノ複合体に関するその使用が米国特許出願第２００２０１７２９５３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で開示される。
基材を使用することにより、検出可能な変化を増幅させ、アッセイの感度を増加させることができる。１つの態様では、方法は、標的ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドが付着された基材と接触させる工程を含み、ポリヌクレオチドは、（ｉ）標的核酸の配列の第１の部分に相補的な配列を有し、接触工程は、基材上のポリヌクレオチドの標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で実施され、ならびに、（ｉｉ）基材に結合された標的核酸を、付着されたポリヌクレオチドを有する第１の型のナノ複合体と接触させる工程を含み、ポリヌクレオチドは、標的核酸の配列の第２の部分に相補的な配列を有し、接触工程は、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドの標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で実施される。次に、基材に結合された第１の型のナノ複合体がポリヌクレオチドを含む第２の型のナノ複合体と接触させられ、第２の型のナノ複合体上のポリヌクレオチドは、第１の型のナノ複合体を生成させるのに使用されるポリヌクレオチドの配列の少なくとも一部に相補的な配列を有し、接触工程は第１および第２の型のナノ複合体上のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で起こる。最後に、これらのハイブリダイゼーションにより生成される検出可能な変化が観察される。
ナノ複合体上のポリヌクレオチドの核酸へのハイブリダイゼーションで起こる検出可能な変化は色変化、ナノ複合体の凝集物の形成、または凝集ナノ複合体の沈殿であってもよい。色変化は、肉眼で、または分光学的に観察することができる。ナノ複合体の凝集物の形成は、電子顕微鏡観察または比濁法に観察することができる。凝集ナノ複合体の沈殿は肉眼でまたは顕微鏡で観察することができる。肉眼で観察することができる変化が好ましい。肉眼で観察可能な色変化が特に好ましい。
肉眼による色変化の観察に基づく標的核酸ハイブリダイゼーションを検出する方法は、安価で、迅速で、簡単で、強固（試薬が安定である）であり、特殊なまたは高価な装置を必要とせず、ほとんど、あるいは全く器具類が必要とされない。これらの利点により、例えば、特定の病原体の存在を検出する分野におけるＤＮＡ配列決定における研究および分析研究所、治療のための薬物の処方を支援するための感染の迅速同定のために診療所で、および高価でない第一線スクリーニングのために家およびヘルスセンターにおいて使用するのに、特に好適なものとなる。
ポリヌクレオチドを含むナノ複合体は、対象の標的分子を標的にするアッセイにおいて使用することができる。よって、ポリヌクレオチドを含むナノ複合体は、バイオバーコードアッセイなどのアッセイにおいて使用することができる。例えば、米国特許第６，３６１，９４４号；６，４１７，３４０号；６，４９５，３２４号；６，５０６，５６４号；６，５８２，９２１号；６，６０２，６６９号；６，６１０，４９１号；６，６７８，５４８号；６，６７７，１２２号；６６８２，８９５号；６，７０９，８２５号；６，７２０，１４７号；６，７２０，４１１号；６，７５０，０１６号；６，７５９，１９９号；６，７６７，７０２号；６，７７３，８８４号；６，７７７，１８６号；６，８１２，３３４号；６，８１８，７５３号；６，８２８，４３２号；６，８２７，９７９号；６，８６１，２２１号；および６，８７８，８１４号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
用量および医薬組成物
本明細書で記載される組成物のいずれも、所望の治療効果を達成する治療的有効量で哺乳類に投与され得ることは認識されるであろう。
本明細書では、「治療的有効量」という用語は、同定された疾患または病状を治療、寛解、または防止する、または検出可能な治療、予防、または阻害効果を示すのに十分な組成物の量を示す。効果は、例えば、臨床症状の改善、症状の低減により、または本明細書で記載されるアッセイにより検出することができる。被験体に対する正確な有効量は、被験体の体重、サイズ、および健康；病状の性質および程度；ならびに投与のために選択される抗生物質組成物または組成物の組み合わせに依存する。ある状況に対する治療的有効量は、臨床医の技術および判断の範囲内にあるルーチン実験により決定することができる。
本明細書で記載される組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と共に製剤化して医薬組成物としてもよい。化合物または組成物は、例えば、限定はされないが、本明細書で記載される疾患、障害または感染の治療を可能にする任意の経路により投与することができる。好ましい投与経路は経口投与である。さらに、抗生物質組成物を含む化合物または組成物は、任意の標準投与経路を用いて、例えば非経口で、例として、静脈内、腹腔内、肺内、皮下または筋肉内、くも膜下腔内で、経皮的に（本明細書で記載されるように）、直腸、経口、経鼻または吸入により、患者に送達され得る。
徐放製剤はまた、消化管内の体液と接触する活性剤の放出制御を達成するために、および血液血漿中で活性剤の実質的に一定の有効レベルを提供するために本明細書で記載される作用物質から調製され得る。結晶形態が、この目的のために生分解性ポリマー、水溶性ポリマーまたは両方の混合物、および任意で好適な界面活性剤のポリマーマトリクス中に埋め込まれ得る。埋込は、この関係において、微小粒子のポリマーマトリクス中での組み込みを意味することができる。放出制御製剤はまた、公知の分散またはエマルジョンコーティング技術を介する分散微小粒子または乳化微小滴の封入により得られる。
投与は単一用量投与の形態をとることができ、または実施形態の化合物は、ある期間にわたって分割投与で、または連続放出製剤もしくは投与方法（例えば、ポンプ）で投与することができる。しかしながら、実施形態の化合物は、被験体に投与され、投与される化合物の量および選択される投与経路は、病状の効果的な治療を可能にするように選択されるべきである。治療薬の組み合わせの投与（すなわち、併用療法）もまた企図されるが、ただし、少なくとも１つの治療薬が本明細書で記載されるナノ複合体と関連することを条件とする。
一実施形態では、医薬組成物は、特定の投与方法および剤形によって、薬学的に許容される賦形剤、例えば担体、溶媒、安定化剤、アジュバント、希釈剤などと共に製剤化され得る。医薬組成物は一般に、生理学的に適合可能なｐＨを達成するように製剤化されるべきであり、製剤および投与経路によってｐＨ約３〜ｐＨ約１１、好ましくは約ｐＨ３〜約ｐＨ７の範囲とすることができる。別の実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８の範囲に調節することが好ましい。より特定的には、医薬組成物は、様々な態様では治療的または予防的有効量の本明細書で記載される少なくとも１つの組成物を、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と共に含む。本明細書で記載されるように、医薬組成物は任意で本明細書で記載される化合物の組み合わせを含み得る。
「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、医薬品、例えば本明細書で記載される化合物の投与のための賦形剤を示す。その用語は、不当な毒性なしで投与され得る任意の医医薬賦形剤を示す。
薬学的に許容される賦形剤は、１つには、投与される特定の組成物により、ならびに組成物を投与するのに使用される特定の方法により決定される。したがって、医薬組成物の広範囲の好適な製剤が存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciencesを参照されたい)。
好適な賦形剤は大きな、徐々に代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子を含む担体分子とすることができる。他の例示的な賦形剤としては、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、および／またはヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、油、水、生理食塩水、グリセロールおよび／またはエタノール）、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、などが挙げられる。リポソームはまた、薬学的に許容される賦形剤の定義に含まれる。
さらに、医薬組成物は、滅菌注射調製物、例えば滅菌注射水性エマルジョンまたは油性懸濁液の形態とすることができる。このエマルジョンまたは懸濁液は、当業者により、好適な分散または湿潤剤および懸濁剤を使用して製剤化され得る。滅菌注射調製物はまた、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液、例えば１，２−プロパン−ジオール中の溶液とすることができる。
滅菌注射調製物はまた、凍結乾燥粉末として調製され得る。さらに、滅菌固定油が溶媒または懸濁媒質として使用され得る。このために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無菌性固定油が使用され得る。さらに、脂肪酸（例えば、オレイン酸）が同様に注射液の調製に使用され得る。
経皮送達
本開示のいくつかの態様では、ナノ複合体および皮膚ビヒクルを含む組成物を、その必要のある患者の皮膚に投与する工程を含むナノ複合体の経皮送達の方法が提供される。
１つの態様では、ナノ複合体の送達は経皮的である。別の態様では、ナノ複合体の送達は局所的である。別の態様では、ナノ複合体の送達は、局所投与後表皮および真皮にされる。いくつかの実施形態では、皮膚ビヒクルは軟膏を含む。いくつかの態様では、軟膏はＡｑｕａｐｈｏｒである。
方法のさらなる実施形態では、組成物の投与は、皮膚障害を寛解する。様々な実施形態では、皮膚障害は、癌、遺伝的障害、加齢、炎症、感染、および美容上の異形からなる群より選択される。
ナノ粒子組成物の経皮送達およびそれらの使用方法のさらなる説明については、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／２７３６３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ビヒクル
いくつかの実施形態では、本開示の組成物および方法はビヒクルを含む。本明細書では、「ビヒクル」は、ナノ複合体組成物が結合する主剤である。
本開示の組成物および方法において有用なビヒクルは当業者に知られており、例えば、軟膏、クリーム、ローション、ジェル、フォーム、緩衝溶液（例えば、限定はされないが、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液）または水が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、ビヒクルは１つ以上の追加の物質、例えば、限定はされないがサリチル酸、αヒドロキシ酸、または尿素を含み、これらは角質層を通る浸透を増強させる。
様々な態様では、本開示の組成物および方法において使用するために企図されるビヒクルとしては、、Ａｑｕａｐｈｏｒ（登録商標）治癒軟膏、Ａ＋Ｄ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、鉱物油、Ｖａｓｅｌｉｎｅ集中治療クリーム（鉱物油およびグリセリンを含む）、黄色ワセリン、ＤＭＬ（ワセリン、グリセリンおよびＰＥＧ２０を含む）、ＤＭＬ（ワセリン、グリセリンおよびＰＥＧ１００を含む）、Ｅｕｃｅｒｉｎ保湿クリーム、Ｃｅｔａｐｈｉｌ（ワセリン、グリセロールおよびＰＥＧ３０を含む）、Ｃｅｔａｐｈｉｌ、ＣｅｒａＶｅ（ワセリンおよびグリセリンを含む）、ＣｅｒａＶｅ（グリセリン、ＥＤＴＡおよびコレステロールを含む）、Ｊｅｒｇｅｎｓ（ワセリン、グリセリンおよび鉱物油を含む）、ならびにＮｉｖｅａ（ワセリン、グリセリンおよび鉱物油を含む）が挙げられるが、それらに限定されない。当業者は上記リストから、追加のビヒクルが本開示の組成物および方法において有用であることを理解するであろう。
本明細書では、軟膏は、油中水の製剤である。本明細書では、クリームは水中油の製剤である。一般に、ローションは、クリームまたは軟膏よりも多くの水を有し；ジェルはアルコールを含み、フォームは、液体中に気泡をトラップさせることにより形成された物質である。これらの用語は当業者により理解される。
塞栓剤
本開示の組成物との併用での塞栓剤の投与もまた、企図される。塞栓剤は、意図的に塞栓を導入することによる血管の選択的閉塞を介して標的部位で局在化される薬物濃度を増加させ、一方、動脈流入を減少させることにより薬物洗い流しを減少させるように作用する。よって、ポリヌクレオチドが結合部位を介してコントラスト剤に結合される、ポリヌクレオチドを含むナノ粒子を含む組成物は、塞栓剤をなしで、組成物が標的部位にとどまる期間に比べ、標的部位により長い期間、塞栓剤と共にとどまるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は本明細書で記載される組成物を、塞栓剤と併用することを企図する。
本開示の組成物および方法の様々な態様では、使用される塞栓剤は、脂質エマルジョン（例えば、限定はされないが、ヨード化ケシ油エチルエステルまたはリピオドール）、ゼラチンスポンジ、トリスアセチルゼラチンミクロスフェア、塞栓形成コイル、エタノール、小分子薬物、生分解性ミクロスフェア、非生分解性ミクロスフェアまたはポリマー、および自己組織化塞栓材料からなる群より選択される。
本明細書で開示される組成物は、望まれる組織または細胞のイメージング、および／または疾患または病状の治療を可能にする任意の経路により投与される。１つの態様では、投与経路は、動脈内投与である。さらに、ナノ複合体を含む組成物は、任意の標準投与経路、例えば、限定はされないが、経口、非経口、例えば静脈内、腹腔内、肺内、心臓内、骨内注入（「ＩＯ」）、皮下または筋肉内、くも膜下腔内、経皮、皮内、直腸、経口、経鼻または吸入もしくは経粘膜送達を用いて患者に送達される。本明細書で提供される組成物の直接注射もまた、企図され、いくつかの態様では、皮下針を介して送達される。徐放製剤もまた、体液と接触する本明細書で記載される組成物の１つ以上の成分の放出制御を達成するために、血液血漿中で組成物の１つ以上の成分の実質的に一定で有効なレベルを提供するために、本明細書で記載される組成物から調製され得る。
標的部位同定および組成物送達
細胞を本開示の組成物と、コントラスト剤を細胞に送達するのに十分な条件下で接触させることを含むコントラスト剤を細胞に送達させる方法が、本明細書で提供される。組成物の送達後、いくつかの態様では、方法はさらに、コントラスト剤を検出する工程を含む。コントラスト剤の検出は、本明細書で記載されるものを含む、当技術分野で知られている方法のいずれかにより実施される。
特定の実施形態では、コントラスト剤は、イメージング手順により検出され、および様々な態様では、イメージング手順はＭＲＩ、ＣＴ、および蛍光からなる群より選択される。
提供される方法はまた、本開示の組成物が標的部位に局所的に送達されるものを含む。標的部位が同定された時点で、本開示の組成物が、１つの態様では、動脈内に送達される。別の態様では、本開示の組成物が静脈内に送達される。本開示の組成物の送達のための標的細胞は、様々な態様では、癌細胞、幹細胞、Ｔ細胞、およびβ−島細胞からなる群より選択される。
様々な態様では、標的部位は病変形成部位である。
いくつかの態様では、病変形成部位は癌である。様々な態様では、癌は、肝臓、膵臓、胃、結腸直腸、前立腺、精巣、腎細胞、乳房、膀胱、尿管、脳、肺、結合組織、血液、心血管、リンパ、皮膚、骨、目、鼻咽頭、喉頭、食道、口膜、舌、甲状腺、耳下腺、縦隔、卵巣、子宮、付属器、小腸、虫垂、カルチノイド、胆嚢、下垂体、転移拡散から生じる癌、および内胚葉、中胚葉または外胚葉に由来する組織から生じる癌からなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、病変形成部位は実質臓器疾患である。様々な態様では、実質臓器は、心臓、肝臓、膵臓、前立腺、脳、目、甲状腺、下垂体、耳下腺、皮膚、脾臓、胃、食道、胆嚢、小腸、胆管、虫垂、結腸、直腸、乳房、膀胱、腎臓、尿管、肺、および内胚葉、外胚葉または中胚葉に由来する組織からなる群より選択される。
化学療法薬の活性化
本開示によれば、本明細書で記載されるナノ複合体に付着される化学療法薬は、細胞に侵入すると活性化されることが企図される。いくつかの態様では、活性化された化学療法薬は、ポリヌクレオチドに付着されていない化学療法薬に比べ細胞毒性を増加させ、ここでポリヌクレオチドはナノ複合体の一部であり、細胞毒性の増加は、インビトロ細胞培養アッセイを用いて測定される。インビトロ細胞培養アッセイは、例えば、限定はされないが、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＭＴＴ）アッセイである。したがって、上記で記載される細胞毒性の増加は、細胞への侵入前に、ナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドに付着された化学療法薬の毒性の減少と関連する。
標的分子
本明細書で記載される組成物のいずれも、標的分子を検出するために使用することができることが、本開示により企図される。様々な態様では、標的分子はポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドは、真核生物、原核生物、またはウイルスのいずれかのものである。
いくつかの態様では、標的分子はポリヌクレオチドである。
ポリヌクレオチドが少量存在する場合、当技術分野で知られている方法により増幅させることができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) and B. D. Hames and S. J. Higgins, Eds., Gene Probes 1 (IRL Press, New York, 1995)を参照されたい。一般に、限定はされないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、標的核酸の濃度を、より容易に検出することができる程度まで増加させるために実施することができる。
様々な実施形態では、提供される方法は、標的ポリヌクレオチドが遺伝子産物をコードするｍＲＮＡであり、遺伝子産物の翻訳が阻止され、または標的ポリヌクレオチドが遺伝子産物をコードする遺伝子中のＤＮＡであり、遺伝子産物の転写が阻止されるものを含む。標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである方法では、ポリヌクレオチドは、ある態様では阻止される遺伝子産物をコードするＤＮＡである。他の方法では、ＤＮＡは、遺伝子産物に対するコード領域に相補的である。さらに他の態様では、ＤＮＡは遺伝子産物の発現に必要とされる調節エレメントをコードする。「調節エレメント」としては、エンハンサー、プロモーター、サイレンサー、ポリアデニル化シグナル、制御タンパク質結合エレメント、制御イントロン、リボソーム侵入部位、などが挙げられるが、それらに限定されない。さらに別の態様では、標的ポリヌクレオチドは、内因性複製に必要とされる配列である。さらなる実施形態では、標的分子はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。
抗原核生物標的ポリヌクレオチド
原核生物標的ポリヌクレオチドでは、様々な態様では、ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡである。真核生物標的ポリヌクレオチドでは、ポリヌクレオチドは動物ポリヌクレオチド、植物ポリヌクレオチド、真菌ポリヌクレオチド、例えば酵母ポリヌクレオチドである。上記のように、標的ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列から転写されたＲＮＡのいずれかである。ある態様では、標的ポリヌクレオチドはミトコンドリアポリヌクレオチドである。ウイルス標的ポリヌクレオチドでは、ポリヌクレオチドはウイルスゲノムＲＮＡ、ウイルスゲノムＤＮＡ、またはウイルスゲノムＤＮＡから転写されたＲＮＡである。
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは生理的条件下で標的原核生物配列にハイブリダイズするように設計される。
当業者は容易に、ポリヌクレオチドを含むナノ複合体のための適切な標的を決定し、当技術分野で知られている技術を使用してポリヌクレオチドを設計し、合成することができることが理解されるであろう。標的は、例えば、対象の標的核酸の配列を（例えば、ＧｅｎＢａｎｋから）入手し、これを他の核酸配列と、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ ６．０プログラム、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム、ＢＬＯＳＵＭ ３０マトリクス、およびデフォルトパラメータを用いて整列させることにより同定することができ、核酸整列のための、１０のギャップ開始ペナルティおよび５．０のギャップ伸張ペナルティが含まれる。
任意の必須原核生物遺伝子が本開示の方法を用いる標的遺伝子として企図される。上記のように、任意の原核生物種に対する必須原核生物遺伝子は、様々な方法、例えば大腸菌に対するＧｅｒｄｅｓにより記載されるもの[Gerdes et al., J Bacteriol. 185(19): 5673−84, 2003]を用いて決定することができる。多くの必須遺伝子が、細菌界全体で保存され、よって、標的選択における追加のガイダンスが提供される。標的遺伝子配列は、容易に入手可能な生物情報学源、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）により維持されているものを用いて同定することができる。
最適活性を示すポリヌクレオチドを含むナノ複合体は、その後、ヒト感染症を治療するために使用する前に、動物モデル、または獣医動物において試験される。
細胞分裂および細胞周期標的タンパク質のための標的配列
本開示のポリヌクレオチドは、必須原核生物遺伝子をコードする原核生物核酸の配列にハイブリダイズするように設計される。例示的な遺伝子としては、細胞分裂、細胞周期タンパク質のために必要とされるもの、または脂質生合成もしくは核酸複製のために必要とされる遺伝子が挙げられるが、それらに限定されない。
これらの３つのタンパク質の各々に対し、米国特許出願第２００８０１９４４６３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表１は多くの重要な病原菌の各々に対する標的配列を含む例示的な細菌配列を提供する。これらの遺伝子配列は、各細菌株に対するＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ全ゲノム配列に由来する。
原核生物１６ＳリボソームＲＮＡに対する標的配列
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ核酸配列をコードする配列に、生理的条件下、３７℃よりも実質的に大きなＴｍで、例えば、少なくとも４５℃、好ましくは６０℃−８０℃でハイブリダイズするように設計される。
１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に対する例示的な細菌および関連するＧｅｎＢａｎｋ受入番号が米国特許第６，６７７，１５３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表１において提供される。
追加の標的分子
標的分子は細胞、組織試料、または生体液に存在することができ、これもまた当技術分野で知られている。
様々な実施形態では、本開示は１を超える標的ポリヌクレオチドが標的細胞において検出されることを企図する。
さらなる実施形態では標的分子はイオンである。本開示は、１つの態様では、イオンが亜硝酸イオン（ＮＯ２−）であることを企図する。いくつかの態様では、イオンは水銀（Ｈｇ２＋）、Ｃｕ２＋およびＵＯ２＋からなる群より選択される金属イオンである。
キット
本開示の組成物を含むキットもまた提供される。１つの実施形態では、キットは、少なくとも１つの容器を含み、容器は、本明細書で記載される１つ以上のポリヌクレオチドを含む本明細書で記載される少なくとも１つの型のナノ複合体を保持する。第１の型のナノ複合体の一部であるポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの第１の部分の１つ以上の配列に相補的（または本明細書で開示されるように十分相補的）である１つ以上の配列を有する。容器は任意で、標的ポリヌクレオチドの第２の部分の１つ以上の配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドを含む１つ以上の追加の型のナノ複合体を含む。
別の実施形態では、キットは少なくとも２つの容器を含む。第１の容器は、標的生体分子および／または非生体分子の１つ以上の部分に結合することができる本明細書で記載される１つ以上の生体分子および／または非生体分子を含む本明細書で開示される１つ以上のナノ複合体を保持する。第２の容器は、標的生体分子および／または非生体分子の同じまたは異なる部分の１つ以上の配列と結合することができる１つ以上の生体分子および／または非生体分子を含む１つ以上のナノ複合体を保持する。
別の実施形態では、キットは生体分子および／または非生体分子ならびにナノ粒子を別々の容器中に有し、ナノ複合体は、本明細書で記載される方法のために使用される前に生成される。１つの態様では、生体分子および／または非生体分子および／またはナノ粒子は、ナノ複合体が生成できるように機能化される。また、生体分子および／または非生体分子および／またはナノ粒子は、キットにおいて官能基なしで提供され、この場合、それらはアッセイを実施する前に機能化されなければならない。追加の態様では、生体分子および／または非生体分子の架橋を促進するために、化学薬品が提供される。
提供されるキットの様々な態様では、生体分子および／または非生体分子は標識を含み、またはキットは、生体分子および／または非生体分子に付着され得る標識を含む。また、キットは標識されたナノ粒子またはナノ粒子に付着され得る標識を含む。各実施形態では、キットは任意で説明書を含み、各容器は標識を含み、キット自体は標識を含み、キットは任意で１つ以上の非特異的生体分子（対照として用いるため）を含む。
実施例１
材料
材料は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、別記しない限り、さらに精製せずに使用した。ＴＥＭキャラクタリゼーションをＨｉｔａｃｈｉ Ｈ８１００電子顕微鏡で実施した。ＮＭＲ実験を、ＤＣＨ Ｃｒｙｏプローブと結合させたＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ５００ＭＨｚを用いて実施した。ＤＬＳデータをＭＡＬＶＥＲＮ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ、Ｎａｎｏ−ＺＳから獲得した。ＩＲ結果をＢｒｕｋｅｒ ＴＥＮＳＯＲ３７から入手し、ＯＰＵＳソフトウエアを用いて分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定をＢｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ ＳｍａｒｔＢｅａｍ質量分析計で実施した。
ポリ（Ｎ−（２−（３−（プロプ−２−イニルオキシ）プロパンアミド）エチル）アクリルアミド）１の合成
ポリアクリルアミドエチルアミン１２０（ＰＡＥＡ１２０）を文献で報告された方法に従い調製した[Zhang et al., Biomaterials 31: 1805 (2010); Zhang et al., Biomaterials 30: 968 (2009)]。ＰＡＥＡ１２０（６７．５ｍｇ、４．９μｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解し、３時間撹拌し、その後、プロパルギル−ｄＰＥＧ１−ＮＨＳエステル（１５０ｍｇ、６６０μｍｏｌ、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２０４μＬ １．１７ｍｍｏｌ）を含む１ｍＬＤＭＳＯ溶液を添加した。反応混合物を一晩中撹拌させ、ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）の添加により希釈し、予め浸漬させた透析チューブ（ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）に移し、ナノピュア水（＞１８．０ＭΩ・ｃｍ）に対し３日間透析した。その後、溶液を凍結乾燥し、水（１５ｍＬ）に再懸濁させた。少量の濁りを観察したが、これを、０．２μｍシリンジフィルタを通して濾過することにより除去した。残留アミン基は、ニンヒドリン試験により検出されなかった。１のＩＲおよび１Ｈ−１３Ｃ ＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトルを図１２に示す。
メチル末端ポリ（エチレングリコール）−プロパルギルエーテル複合体５の合成
単分散ｍＰＥＧ２４−アミン（３９．０ｍｇ、３４．６μｍｏｌ、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）を、１．０ｍＬのｐＨ＝８．０リン酸緩衝液に溶解し、これにプロパルギル−ｄＰＥＧ１−ＮＨＳエステル（１２．１ｍｇ、５３．７μｍｏｌ）を添加した。混合物を１２時間、４℃で振盪させた。所望の複合体を反応混合物から逆相ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル、Ｖａｒｉａｎ ＤＹＮＡＭＡＸ Ｃ１８カラム（２５０×１０．０ｍｍ））により単離した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：１２２０．５５３［Ｍ＋Ｎａ］＋。１Ｈ−１３Ｃ ＨＳＱＣ ＮＭＲ：図１１。
１３ｎｍ ＡｕＮＰの合成
ＨＡｕＣｌ４の水溶液（１ｍＭ、５００ｍＬ）を撹拌しながら還流させ、その後、クエン酸三ナトリウム溶液（５０ｍＬ、７７．６ｍＭ）を、沸騰混合物に迅速に添加した。溶液をさらに１５分間還流させ、室温まで冷却させた。金ナノ粒子の平均直径をＴＥＭにより決定した（１２．８±１．２ｎｍ）。この研究で使用される他のサイズのＡｕＮＰをＴｅｄ Ｐｅｌｌａから購入した。
ナノ複合体の調製のための一般的方法
１０ｍＬのＡｕＮＰ溶液（１０ｎＭ）に、１０μＬの１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を添加した。その後、１を含む水溶液を添加し、２０ｎＭの最終濃度を得た。溶液を２日間撹拌し、その後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４２４遠心分離機を用いて１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離に供した。上清を注意深いピペット操作により除去し、ＡｕＮＰをナノピュア水に再懸濁させた。プロセスを３回繰り返し、確実に、過剰のポリマーを完全に除去した。最終遠心分離後、ポリマーコートＡｕＮＰを１ｍＬまで濃縮し、５０μＬの１．０Ｍ ＫＣＮ水溶液を添加し、金コアを除去した。得られた溶液をその後ナノピュア水（＞１８．０ＭΩ・ｃｍ）に対し、予め浸漬させた透析チューブ（ＭＷＣＯ＝６−８ｋＤａ）を用い３日間透析した。最終ナノ複合体溶液は透明で、わずかに黄色がかって見えた。ＮＭＲおよびＩＲ分析のために十分な量のナノ複合体を調製するために多量の金ナノ粒子鋳型（＞５００ｍＬ）が必要とされた。
実施例２
金表面上でＤＮＡの高密度単層を共に架橋することができる適切な直交化学を探求して、ポリアルキンを含むＤＮＡ鎖は、金ナノ粒子表面上で、追加の触媒なしで自動架橋することが観察された。最初の実験では、所望の化学部分で修飾することができる合成により修飾された塩基を使用するＤＮＡ鎖を合成した。ホスホラミダイト化学のモジュール性質のために、これらの塩基はポリヌクレオチド配列に、任意の位置で組み入れられる。この系のために選択された修飾塩基は、アミン修飾チミジン残基であり、これは、アルキン−ＮＨＳエステルと反応させて、その配列内でアルキン修飾チミジンを生成させることができる（図１）。しかしながら、アルキンに変換することができる任意の部分を使用することができる。その後、付着のためのチオール部分、１０アミン修飾Ｔモノマーの架橋領域（ＣＲ）、５Ｔ残基のスペーサ、およびプログラム可能なＤＮＡまたはＲＮＡ結合領域（ＢＲ）を組み込んだ鎖を合成した。ＣＲをその後、アルキンＮＨＳエステルで修飾し、これにより、ＢＲ中に１０アルキンユニットを有する鎖が得られた。使用した２つの例示的な配列は５’ＴＣＡ−ＣＴＡ−ＴＴＡ−ＴＴＴＴＴ−（アルキン−修飾Ｔ）１０−ＳＨ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１） および５’ＴＡＡ−ＴＡＧ−ＴＧＡ−ＴＴＴＴＴ−（アルキン修飾Ｔ）１０−ＳＨ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）であった。
典型的な実験では、１Ｏ．Ｄ．のＤＴＴ処理アルキンＤＮＡを、１ｍＬの１３ｎｍ金ナノ粒子に、約１０ｎＭの濃度で添加した。ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）およびリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）をその後、ナノ粒子に、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０および５０ｍＭリン酸緩衝液の最終濃度で添加した。ポリヌクレオチドは、架橋のためにできるだけ近接していなければならないので、ナノ粒子を１．０Ｍの高塩化ナトリウム濃度に到達させ、添加を最大にした。その後、粒子を３回、遠心分離し（１３．２ｋｒｐｍ）、ＰＢＳ／ＳＤＳに再懸濁させ、過剰のＤＮＡを除去した。
ＡｕＮＰコアの溶解は、酸素の存在下、ＫＣＮを用いて達成した。ＫＣＮをクエン酸安定化ＡｕＮＰに添加すると、ＡｕＮＰの不安定化および凝集の結果、溶液の色は、赤色から紫色にすぐに変化した（図２Ａ）。同様の効果が、チオール化ポリヌクレオチドで密に機能化されたＡｕＮＰに対して観察されるが、プロセスはより遅い（図２Ａ）。しかしながら、アルキンＤＮＡ ＡｕＮＰでは、色は溶解プロセス中、溶液が透明になるまで、わずかに赤みがかった橙色に徐々に変化した（図２Ｂ）。この観察から、アルキン修飾ＤＮＡが、高密度架橋シェルを形成し、これが酸化的に溶解されるＡｕＮＰに特有である典型的な凝集を防止することが示唆された。さらに、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、５２４ｎｍから５１８ｎｍへのプラズモン共鳴の段階的な減少を示し（図２Ｂ）、これはＡｕＮＰサイズの減少から予測された（図２Ｃ）[Link et al., J. Phys. Chem. B 103(21): 4212−4217 (1999)]。
透析後、構造をＴＥＭにより、溶解プロセスの異なる段階で、酢酸ウラニル染色を用いて分析した（図３）。溶解反応を急速スピンフィルタリングによりクエンチさせ、これはＫＣＮの全てを除去し、粒子をフィルタ上に保持する。粒子が溶解すると、高密度リガンドシェルがＫＣＮ中での粒子の顕著な安定性に関与することは明らかであった。中間時間点で、染色により、粒子のサイズが縮むと、粒子表面の周りで高密度シェルが明らかになった。溶解プロセスが完了した後、ＤＮＡの球状粒子が明らかに観察できた。
実施例３
これらの構造はほとんど完全にＤＮＡから作られたので、ゲル電気泳動が架橋反応の完全性および得られた構造の品質を分析するための強力な方法であった。透析後、未反応アルキンＤＮＡ鎖を、鋳型方法で形成させた粒子と比較した。中空粒子は、遊離鎖よりずっと遅く、未溶解ＤＮＡ−ＡｕＮＰ複合体と同様に移動した。次に、ＤＮＡの密度が、これらの中空ＤＮＡナノ複合体の形成において果たす役割を分析した（図４）。ナノ粒子表面上のＤＮＡの密度は機能化中、ＤＮＡ／金ナノ粒子溶液中のナトリウムイオン濃度により、容易に制御することができた。低いＤＮＡ表面密度では、架橋生成物のある分布が得られ、表面密度の増加に伴い、架橋生成物のサイズの劇的な増加が明白となることが明らかであった。０．５Ｍ ＮａＣｌに塩老化させた粒子から得られた臨界密度では、高分子量数で、鋭いバンドが現れた。このバンドは、１．０Ｍ ＮａＣｌに塩老化させた粒子由来の生成物の大部分となり（デンシトメトリーにより約９９％）、最大表面密度を有する。
実施例４
次に、ある範囲のサイズの金ナノ粒子から中空ＤＮＡナノ複合体を得る能力を試験した。実際、ジェルを通る中空粒子の移動は、得られた中空構造のサイズに直接関連し、より大きな中空粒子は、小さなものより遅く移動する（図５Ａ）。ＣＲ中のアルキンの数をその後、総残基の数を一定に維持しながら変化させ、このプロセスの最小アルキン密度を決定した（例として、３アルキンを有する鎖は、７の未修飾Ｔ残基をＣＲ中に有する）。ＣＲ中約５アルキンの閾値で、前の実験からのものと同様のサイズの粒子が得られる（図５ｂ）。しかしながら、アルキンユニットの数が５からより大きな数に増加するにつれ、粒子はわずかに速く移動し、これは、より高密度に架橋されたナノ複合体を示す。
実施例５
この方法が全て架橋ＤＮＡからなるナノ複合体を生成することができることを確立した後、それらの機能特性を研究した。ポリヌクレオチドがＡｕＮＰの表面に高密度に配列されると、多くの新しい挙動が現れ、例えば、融解転移の上昇および狭まり、標的への結合の増強、可逆定方向構築、トランスフェクト剤なしでの高い細胞取り込み、劇的なヌクレアーゼ抵抗性および強固なアンチセンス／ＲＮＡｉ結合が挙げられるがそれらに限定されない。これらの特性は、金ナノ粒子の表面上でのＤＮＡの高密度多価配列によって現れる。そのため、中空ナノ複合体中のＤＮＡがその結合能力を維持した場合、多価ＤＮＡに特徴的な結合特性が観察可能である。
そのため、ナノ粒子上の鎖が、１つの配列内で自己相補性がなく、そのため、その鎖の１つで機能化された粒子は溶液中で安定であるように設計された２つのナノ粒子系が設計された。しかしながら、２つの粒子が共に混合される場合、鎖の相補性は、共にナノ粒子を巨視的ポリマー構築に至らせる。非常に強い可視光学特性を有するＡｕＮＰとは対照的に、中空ナノ複合体は、可視スペクトルに吸光度を有さないので、系は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）活性フルオロフォア（フルオレセイン（Ｆｌ）およびＣｙ３）を配列端で含むように設計された。よって、粒子がハイブリダイズする場合、ＦｌはエネルギーをＣｙ３に移動し、Ｃｙ３の橙色蛍光が観察される。中空ＤＮＡナノ複合体は、これらの新しい鎖を用いてうまく合成され、アガロースゲルを介して同様の移動を示した。フルオレセインは、ＵＶ光源を用いて励起することができるが、Ｃｙ３はできない。Ｆｌ修飾粒子の溶液は、明るい緑色を示し、Ｃｙ３粒子は典型的な橙色蛍光を示さなかった。しかしながら、これらの粒子が共に混合されると、Ｃｙ３の橙色蛍光がＵＶランプ下で容易に目に見えた。その後、これらの粒子は巨視的凝集物を形成し、これらは時間と共に溶液から沈殿した（図６）。興味深いことに、これらの粒子を加熱すると、フルオレセインの明るい緑色蛍光が目に見え、このプロセスが可逆であることが示された。この操作された緑色から橙色への変化は、ＤＮＡ−ＡｕＮＰが同様にハイブリダイズされた時に見られる赤色から紫色へのシフトに類似する。
これらの粒子が時間と共に巨視的凝集物を形成したことは、これらがＤＮＡ−ＡｕＮＰ凝集物と類似する協同的様式で結合することを示した。ＵＶ−Ｖｉｓ融解アッセイを実施し、粒子間の協同性の程度を分析した。ナノ粒子の表面上のＤＮＡの密度は、得られた凝集物の融解転移の幅および温度に直接関連することがよく知られている[Jin et al., J. Am. Chem. Soc. 125(6): 1643−1654 (2003)]。
遊離鎖、ＤＮＡ−ＡｕＮＰ凝集物および中空ＤＮＡ凝集物の吸光度を、２６０ｎｍの光で温度の関数としてモニタした（図７）。この系の遊離鎖は、約２３℃で融解転移を有した。ＡｕＮＰはこれらの鎖で機能化され、共に混合された場合、典型的な赤色から紫色のプラズモンシフトが起こり、凝集物が形成した[Mirkin et al., Nature 382(6592): 607−609 (1996)]。これらの凝集物は、予測されるように約４３℃で鋭く融解した（融解転移の誘導体の半値全幅（ＦＷＨＭ）は約２℃であった）。中空ナノ複合体から形成された凝集物は、約４０℃で同様に鋭い融解転移を示し、融解転移の誘導体のＦＷＨＭは約２℃に及んだ。この非常に類似する融解挙動は、ＤＮＡ−ＡｕＮＰ複合体と関連する多価融解挙動が、リガンドシェルの架橋および金コアの溶解後に保存されたことを直接示した。
実施例６
中空ＤＮＡナノ複合体は、そのＤＮＡ−ＡｕＮＰ対応物のサイズ、形状、および機能を維持することを証明してきたが、それらの遺伝子制御剤としての有効性を次に研究した。ＲＮＡ中空粒子を、ＤＮＡ中空粒子と同じ様式で合成したが、この場合、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラを使用し、この場合、鎖のＣＲは、依然として１０アルキン−Ｔユニットを含み、合成から得られたＣＰＧは、ＲＮＡ合成に移動され、合成が完了した。さらに、アンチセンスＲＮＡ鎖を、Ｃｙ５で標識し、そのため、中空粒子は細胞中で、蛍光顕微鏡観察により可視化されるであろう。中空粒子の透析後、架橋鎖のアンチセンス相補体を、中空粒子に１００倍過剰で添加し、粒子の表面上で二本鎖を形成させた。ＨｅＬａ細胞を、これらの粒子で２４時間トランスフェクトし、共焦点顕微鏡観察によりイメージングした。トランスフェクション後収穫した粒子は、未処理細胞に比べ明白に青色であり、これは、細胞内の非常に多数の粒子を示した。
ＥＧＦＲを標的とするＲＮＡ配列をその後合成した。ＥＧＦＲは癌と関連する重要な標的である。ＳＣＣ１２（ヒト扁平上皮癌）細胞を、様々な期間（４８、７２、９６時間）トランスフェクトし、それらのタンパク質およびｍＲＮＡ量に対し収穫した。最初の実験は、参照遺伝子、ＧＡＰＤＨに正規化されたＥＧＦＲの強固なノックダウンを示した（図８Ａ）。さらに、ウエスタンブロットは、未処置細胞に比べた場合のＥＧＦＲの著しいノックダウンを示した（図８Ｂ）。
実施例７
上記実施例は、中空ナノ複合体を作製することができることを示し；次に、このプロセスにおける化学の性質を調査した。そのために、複数のモデル系を作製し、これらの構造の形成のメカニズムを調査した。これらのモデル系は全て、アルキンを架橋のためにリガンドシェル組み込んだ。ポリマー系、単一アルキンＤＮＡ系、および単一アルキンＰＥＧ系を設計した。
アルキン部分を有するポリマー１は、１．１０の狭い多分散性指数で、ポリアクリルアミドエチルアミン１２０の後重合修飾により容易に調製された。[Zhang et al., Biomaterials 30 (5), 968−977 (2009)]。荷電基を含まないと、１は、室温で、水中で中程度の溶解度を示した。溶解度は温度が低いほど増加した。複数のサイドアームプロパルギルエーテル基を有すると、１は、Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ−Ｆｒｅｎｓ方法により水溶液中で調製されたクエン酸安定化１３ｎｍ ＡｕＮＰ上に容易に吸着された（スキーム１を参照されたい）。過剰のポリマーを複数の遠心分離−再懸濁工程により除去した。得られたポリマーコートＡｕＮＰは、５２４ｎｍでプラズモン共鳴を保持し、数ヶ月安定であったが、対照的に、未修飾ポリ−アミンポリマーは同じ条件下で即座に、粒子に衝突する。
ＡｕＮＰコアの溶解は、１ｍＭ ＫＣＮを酸素の存在下で用いることにより達成した。ＫＣＮをクエン酸安定化ＡｕＮＰに添加すると、ＡｕＮＰの不安定化および凝集の結果、溶液の色は、赤色から紫色にすぐに変化した。しかしながら、ポリマーコートＡｕＮＰでは、色は溶解プロセス中、溶液が透明になるまで、わずかに赤みがかった橙色に徐々に変化した（図９Ａ）。この観察から、１が、高密度架橋シェルを形成し、これが酸化的に溶解されるＡｕＮＰに特有である典型的な凝集を防止することが示唆された。さらに、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、ＡｕＮＰサイズの減少から予測されるように、５２４ｎｍから５１７ｎｍへのプラズモン共鳴の段階的な減少を示した（図９Ｂ）。
溶解プロセスは、透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）により可視化された（図９Ｃ）。ＡｕＮＰの外層が部分的に溶解されるにつれ、上記保護シェルが、ＴＥＭグリッドの酢酸ウラニル染色により観察された。鋳型を完全に除去すると、それらの鋳型のサイズおよび形状を高い忠実度で保持する中空ナノ複合体が得られた。ある範囲のサイズにわたるＡｕＮＰ鋳型を使用した場合（１０、２０、３０および４０ｎｍ）、得られたポリマーナノ複合体（ＰＮＳ）のサイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）およびＴＥＭにより測定されるように、元の鋳型のサイズと直接関連した（図１０）。これらの結果から、ＡｕＮＰは鋳型としてだけでなく、アルキン部分を介するＰＮＳの形成のための触媒としても機能することができることが示された。しかしながら、１から結果として得られるＰＮＳへの変換において、どの種類の化学経路がアクセスされたのかについての疑問が提起された。
実施例８
１３ｎｍ ＡｕＮＰの表面上での架橋前後の１のＩＲ分光法は、アセチレンＣ≡Ｃ伸縮（２１１４ｃｍ−１）、Ｃ−Ｈ伸縮（３８０５ｃｍ−１）および屈曲（１２７４、６４６ｃｍ−１）振動の完全損失を示し、プロパルギルエーテル基が反応に関与したことが示された。１３ｎｍ ＡｕＮＰから製造されたＰＮＳのＮＭＲ分光法は可能でなかったが、これは比較的大きな構造に対する溶媒露出度が減少したためであろう（図１１Ｄ）。
しかしながら、５ｎｍ ＡｕＮＰは、分析に好適なＰＮＳを生成した。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ分光法は、プロパルギル基からの共鳴の損失を示し、これはアクリルアルデヒドの脱離によりヒドロキシル基を残す可能性がある（図１１Ｂ）[Fukuda et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 64: 2013−2015 (1991)]。得られたヒドロキシル基はその後、残りのアルキン−Ａｕ複合物のための新規求核試薬として機能することができ、アセタール結合を生成させる[Fukuda et al., J. Org. Chem. 56(11): 3729−3731 (1991)]。実際、１Ｈ−１３Ｃ ＨＳＱＣスペクトルは、第一級アルコール（δ３．８１ｐｐｍ、１Ｈ）、アルキルエーテル（δ３．７４ｐｐｍ、１Ｈ）およびアセタール（δ４．３２ｐｐｍ、１Ｈ）基のα−Ｈ由来の共鳴の出現を示した。そのような変換は、イオン性金触媒を用いた場合にのみ可能であることが前に知られている。理論に縛られないが、妥当な経路が提案され得る（図１７）。
求アルキン性ＡｕＮＰの１への配位後、水の求核付加が起こり、中間体２が得られ、脱離により３を形成する。ＡｕＮＰの表面での局所濃度が高いので、ヒドロキシル基とＡｕ−アルキン複合物との間の反応は高温でなくても可能であり、アセタールおよびエーテル架橋４が得られ、触媒ＡｕＮＰ表面部位が再生した。しかしながら、ＡｕＮＰはさらに反応を触媒することができず、というのは、形成した高密度シェルが遊離ポリマーのアクセスを防止するはずであるからである。実際、溶液中に残ったポリマーは、専ら開始材料１のみであることが見いだされた。さらに、この経路はまた、単一のアルキン部分が３アーム架橋を形成することができることを示す。
提案したメカニズムをサポートするために、単分散ポリ（エチレングリコール）２４−プロパルギルエーテル複合体５を合成し、便利な質量およびＮＭＲ分析（図１１Ｂ）を可能にした。ＡｕＮＰとのインキュベーションで、５はマトリクス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）およびＮＭＲ分光法により証明されるように、定量的に第一級アルコールに変換された（図１２）。化学が様々な官能基を含む複合物分子と適合することを証明するために、ＤＮＡ誘導体化アルキン６を合成し、ＡｕＮＰとインキュベートした。また、６は３８質量単位を失い、第一級アルコールを与えることが見いだされた。より興味深いことには、アガロースゲル電気泳動およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳから、二量体および三量体が観察された（図１３）。
実施例９
次に、合成されたポリマーを機能モデル系で使用した。機能タンパク質は、ＡｕＮＰ鋳型上で多価プロパルギルエーテル１と共にシェルを共形成することにより、ポリマーナノ複合体の外側シェルに組み入れることができる（図１４Ａ）。そのようなコンストラクトは、プロテオナノ複合体と呼ばれる。証拠として、ストレプトアビジンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を、モデルタンパク質として使用した。ストレプトアビジンはテザービオチン部分を用いて表面に結合することができ、よって、プロテオナノ複合体を固定する。存在する場合、ＨＲＰはその後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と過酸化水素の間の発色反応を触媒することにより読み取り手段を提供することができる。原理上は、両方のタンパク質がプロテオナノ複合体中に存在する場合にのみ、両方のタンパク質がＡｕＮＰ溶解プロセス後に活性なままである場合、シグナルが観察されるであろう（図１４Ｂ）。実際、シグナルは、ストレプトアビジン、ＨＲＰおよびポリマー１がプロテオナノ複合体シェルの作製において使用された場合のみ観察された（図１５）。ＨＲＰまたはポリマー１のいずれかが存在しないと、系は非機能性となった。
実施例１０
本開示は、様々な態様では、ナノ複合体上でポリヌクレオチドを架橋するための方法を提供する。この実施例は、架橋を実施するための追加の方法を提供する。上記のように、追加の方法はＤＳＣおよびＳＡＣを含む。
典型的な実験では、１Ｏ．Ｄ．のＤＮＡを、１ｍＬの１３ｎｍ金ナノ粒子に、約１０ｎＭの濃度で添加する。ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）およびリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）をその後、ナノ粒子に、それぞれ、０．０１％および５０ｍＭの最終濃度のために添加する。ポリヌクレオチドは、架橋のためにできるだけ近接していなければならないので、ナノ粒子を１．０Ｍの高塩化ナトリウム濃度に到達させ、添加を最大にする。その後、粒子を３回、遠心分離し（１３．２ｋｒｐｍ）、ＰＢＳ／ＳＤＳに再懸濁させ、過剰のＤＮＡを除去する。
架橋工程は、スルホ−ＥＧＳを１μＭの最終濃度まで徐々に添加することにより実施する。徐々に付加することは粒子間架橋を防止するのに、また、架橋なしになってしまうＤＮＡ鎖の架橋剤による飽和を防止するのに必要である。溶液はその明るい赤色を保持し、凝集は観察されない。その後、粒子を遠心分離（１３．２ｋｒｐｍで３回）により精製し、溶解する状態となる。
金コアを溶解させるために、シアン化カリウムをナノ粒子溶液に添加する。粒子が溶解するにつれ、溶液の明るい赤色が完全に薄れ、透明な溶液となる。興味深いことに、アミン修飾鎖により機能化されたが、架橋されていない粒子に比べ、架橋粒子は、溶解するのに著しく長い時間かかる。非架橋粒子は１分以内に溶解するが、架橋粒子は、幾分光加熱しても、完全に溶解するまで最大１０分かかる場合がある。この同じ効果は、他の所でも観察され(Langmuir, 2008, 24 (19), pp 11169−11174)、これは架橋構造の証拠である。
中空構造の特性をさらに試験するために、表面に存在する全クーロン電荷を、ゼータ電位測定を用いて分析した。金ナノ粒子−ＤＮＡ複合体は、表面上の負に荷電されたＤＮＡ鎖の密接な配列により、非常に負に荷電される。中空構造は、架橋が有効であれば、この特性を維持するはずである。３つの試料を分析した：ＤＮＡ−ナノ粒子複合体、溶解させた、架橋させていないＤＮＡ−ナノ粒子複合体、および溶解させた、架橋ＤＮＡ−ナノ粒子−中空構造。予測されるように、溶解させた粒子は、下記表４で表されるように、純粋金ナノ粒子−ＤＮＡ複合体に対する測定値とほぼ同一であり、その誤差の範囲内にあるゼータ電位測定値を示した。
最後に、中空構造の構造特性をゲル電気泳動により試験した。電気泳動分析では、分子またはナノ複合体のサイズおよび電荷の両方に関する情報を収集することができる。２％アガロースゲル、臭化エチジウム染色、１２０Ｖを使用して、溶解させた非架橋および架橋（中空）粒子からのＤＮＡの移動を比較した。架橋構造からのＤＮＡは、非架橋粒子から遊離された遊離鎖よりも速く移動した。これは、中空粒子のような球状形状をとることができるスーパーコイルＤＮＡは、より小さなサイズの遊離鎖ＤＮＡよりも速く、ジェルを通って移動するという事実により説明することができる。
追加のアプローチでは、２つの別個のポリヌクレオチドナノ複合体を含むポリヌクレオチドが合成される。第１は、標的に特異的なヌクレオチド配列である。他の領域は、多くのペンダントアルキルアミンを有するスペーサ領域である。これらのアミンは、スキーム２（下記）に示されるように、ポリヌクレオチドをアミン反応性ホモ二官能性リンカーを用いて架橋するための合成ハンドルとして使用される。また、これらのアミンは、それらの基を有するＮＨＳエステルを介してアジドおよびアルキンに変換することができる。その場合、「クリック」ケミストリーを使用して、ポリヌクレオチドを架橋することができる。高密度ポリヌクレオチドナノ複合体を金ナノ粒子なしで合成することへの追加のアプローチは、ポリヌクレオチドをポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーの表面に結合するものである。末端デカン酸部分で機能化させたポリヌクレオチドを、ＥＤＣおよびＮＨＳで活性化し、ＰＡＭＡＭデンドリマーと混合する。また、カルボキシレート基末端とされたＰＡＭＡＭデンドリマーを、ＥＤＣおよびＮＨＳで活性化し、アミン末端ポリヌクレオチドと反応させる。
ポリヌクレオチドナノ複合体は、その質量および多分散性を測定するゲル電気泳動により特徴づけられる。次に、ポリヌクレオチドナノ複合体の協同特性は、融解実験、酵素アッセイ、および細胞研究により調査する。融解研究では、２種類のポリヌクレオチドナノ複合体を、相補的配列を用いて合成する。アニーリング後、ポリヌクレオチドナノ複合体を融解させ、融点プロファイルを同じ遊離ポリヌクレオチド配列のものと比較する。ポリヌクレオチドナノ複合体は遊離ポリヌクレオチドに対し、鋭く、上昇した融解転移を有する。ポリヌクレオチドナノ複合体の協同特性は、ヌクレアーゼアッセイを用いて調査する。これらの実験では、ナノ複合体および遊離ポリヌクレオチドに対して鎖分解速度が測定され、比較される。
このように設計される全ての鋳型系が遊離ポリヌクレオチドと比べた場合、酵素分解に抵抗する。細胞取り込み研究を実施し、これらの構造に対するエンドサイトーシスの増強を調べる。さらに、遺伝子ノックダウン研究を実施し、構造のタンパク質 発現を制御する能力を測定する。
本実施例は、１つの態様では、ナノ粒子表面上での鋳型構築、架橋、およびホモ二官能性架橋剤の使用により、中空およびコアレスポリヌクレオチドナノ複合体を得るための、追加の方法を提供する。これらの事柄は、ＤＮＡおよびｓｉＲＮＡ戦略の両方の使用による、細胞内標的に向けられる遺伝子制御方法において有用である。

Claims (69)

  1. 各ナノ複合体が、規定された構造を有し、単層中の複数の架橋生体分子、その上で構造が構築される鋳型を提供する表面を含み、前記表面は、前記構造が規定された後に任意で少なくとも部分的に除去される、複数のナノ複合体。
  2. 前記表面はナノ粒子である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ナノ粒子は球、ロッドおよび角柱からなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記ナノ粒子は金属である、請求項２または３に記載の組成物。
  5. 前記ナノ粒子はコロイド金属である、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記ナノ粒子は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、アルミニウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、銅ナノ粒子、コバルトナノ粒子、インジウムナノ粒子、およびニッケルナノ粒子からなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記複数の生体分子中の各生体分子は同じである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
  8. 前記複数の生体分子中の生体分子の少なくとも２つは異なる、請求項１〜６のいずれか一つに記載の組成物。
  9. 前記生体分子は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、小分子、治療薬、コントラスト剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
  10. 前記複数の生体分子は単分散である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
  11. 前記単分散性は、前記複数のナノ複合体の直径において約２５％の変動があることである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
  12. 前記単分散性は、前記複数のナノ複合体の直径において約１０％の変動があることである、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の組成物。
  13. 前記単分散性は、前記複数のナノ複合体の直径において約１％の変動があることである、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の組成物。
  14. 前記表面上の架橋生体分子の密度は、前記生体分子間の協同的挙動のために十分である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
  15. 前記表面上の架橋生体分子の密度は、約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
  16. 前記表面上の架橋生体分子の密度は、約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、請求項１〜１４のいずれか一つに記載の組成物。
  17. 前記複数のナノ複合体はさらに、追加の作用物質を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
  18. 前記追加の作用物質は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、金属錯体、小分子、治療薬、コントラスト剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記追加の作用物質は、前記複数の生体分子の少なくとも１つの生体分子と結合される、請求項１７または１８に記載の組成物。
  20. 前記追加の作用物質は、ハイブリダイゼーションにより前記複数の生体分子の少なくとも１つの生体分子と結合される、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記追加の作用物質は、前記複数の生体分子の少なくとも１つの生体分子と共有結合される、請求項１９に記載の組成物。
  22. 前記追加の作用物質は、前記複数の生体分子の少なくとも１つの生体分子と非共有結合される、請求項１９に記載の組成物。
  23. 前記追加の作用物質は、前記複数のナノ複合体の少なくとも１つの架橋生体分子中に捕捉される、請求項１９に記載の組成物。
  24. 前記複数のナノ複合体における少なくとも１つのナノ複合体は、前記表面がない場合中空である、前記請求項のいずれか一つに記載の組成物。
  25. 前記複数のナノ複合体における大多数のナノ複合体は、前記表面がない場合中空である、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記複数のナノ複合体における実質的に全てのナノ複合体は、前記表面がない場合中空である、請求項２４に記載の組成物。
  27. 追加の作用物質は、そうでなければ中空であるナノ複合体に封入される、請求項２４〜２６のいずれか一つに記載の組成物。
  28. 第１の生体分子を表面と接触させることにより前記第１の生体分子を活性化する工程を含み、前記活性化により、前記第１の生体分子が第２の生体分子に架橋する、構造化ナノ複合体を架橋する方法。
  29. 前記表面は、前記構造が構築される鋳型を提供する、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記表面はナノ粒子である、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. 前記ナノ粒子は球、ロッドおよび角柱からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ナノ粒子は金属である、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 前記ナノ粒子はコロイド金属である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ナノ粒子は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、アルミニウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、銅ナノ粒子、コバルトナノ粒子、インジウムナノ粒子、およびニッケルナノ粒子からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記表面は、架橋後少なくとも部分的に除去される、請求項２８〜３４のいずれか一つに記載の方法。
  36. 前記第１の生体分子および前記第２の生体分子は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、小分子、治療薬、コントラスト剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２８〜３５のいずれか一つに記載の方法。
  37. 前記第１の生体分子および前記第２の生体分子は少なくとも１つのアルキン部分を含む、請求項２８〜３６のいずれか一つに記載の方法。
  38. 前記第１の生体分子および前記第２の生体分子はそれぞれ約１０のアルキン部分を含む、請求項２８〜３７のいずれか一つに記載の方法。
  39. 前記アルキン部分は、前記表面との接触で活性化される、請求項３７または３８に記載の方法。
  40. 前記活性化により、前記アルキンは求核試薬の影響を受けやすくなる、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記求核試薬は、水、アルコール、アミン、チオール、エステル、チオエステル、尿素、アミド、アルデヒド、カーボネート、カルバメート、分子内ヒドロキシル基、メチルエーテル基、ベンジルエーテル基、カルボン酸、ケトン、イミン、フェノール、２−ピロリドン、インドール、酢酸、β−ケトエステルおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記活性化は、前記第１の生体分子の前記第２の生体分子への架橋を引き起こす、請求項３９〜４１のいずれか一つに記載の方法。
  43. 前記第１の生体分子はポリヌクレオチドである、請求項２８〜４２のいずれか一つに記載の方法。
  44. 前記第２の生体分子はポリヌクレオチドである、請求項２８〜４２のいずれか一つに記載の方法。
  45. 前記ポリヌクレオチドはＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドである、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. 前記ポリヌクレオチドは約５〜約１００ヌクレオチド長、約５〜約９０ヌクレオチド長、約５〜約８０ヌクレオチド長、約５〜約７０ヌクレオチド長、約５〜約６０ヌクレオチド長、約５〜約５０ヌクレオチド長、約５〜約４５ヌクレオチド長、約５〜約４０ヌクレオチド長、約５〜約３５ヌクレオチド長、約５〜約３０ヌクレオチド長、約５〜約２５ヌクレオチド長、約５〜約２０ヌクレオチド長、約５〜約１５ヌクレオチド長、または約５〜約１０ヌクレオチド長である、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記追加の作用物質は前記第１の生体分子および前記第２の生体分子に、前記活性化工程中に添加される、請求項１７〜４６のいずれか一つに記載の方法。
  48. 前記追加の作用物質は、前記ナノ複合体の形成後、前記表面の少なくとも部分的な除去前に、前記ナノ複合体に添加される、請求項１７〜４６のいずれか一つに記載の方法。
  49. 前記追加の作用物質は、前記ナノ複合体の形成後、前記表面の少なくとも部分的な除去後に、前記ナノ複合体に添加される、請求項１７〜４６のいずれか一つに記載の方法。
  50. 表面を含む多価ナノ複合体を含む組成物であって、前記ナノ複合体はさらに、複数のポリヌクレオチドを含み、前記複数のポリヌクレオチドの各々のスペーサ端は、修飾され、前記複数のポリヌクレオチドを化学薬品と接触させると、前記複数のポリヌクレオチドは架橋し、架橋後、前記表面は任意で少なくとも部分的に除去される、組成物。
  51. 前記修飾は、アミン、アミド、アルコール、エステル、アルデヒド、ケトン、チオール、ジスルフィド、カルボン酸、フェノール、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドラゾン、アジドおよびアルキンからなる群より選択される、前記請求項５０に記載の組成物。
  52. 前記修飾は、アミン修飾ヌクレオチドである、前記請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記アミン修飾ホスホラミダイトヌクレオチドは、アミン修飾チミジンホスホラミダイト（ＴＮ）である、前記請求項５２に記載の組成物。
  54. 化学薬品は、ジスクシンイミジルグルタラート、スベリン酸ジスクシンイミジル、ビス［スルホスクシンイミジル］スベラート、トリス−スクシンイミジルアミノトリアセテート、スクシンイミジル４−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン、スクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタレート塩酸塩、スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート、ジチオビス［スクシンイミジルプロピオネート］、３，３’−ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオネート］、酒石酸ジスクシンイミジル、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］、エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］、アジプイミド酸ジメチル・２ＨＣｌ、ピメルイミド酸ジメチル・２ＨＣｌ、スベルイミド酸ジメチル・２ＨＣｌ、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、β−［トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィノ］プロピオン酸、ビス−マレイミドエタン、１，４−ビスマレイミドブタン、ビスマレイミドヘキサン、トリス［２−マレイミドエチル］アミン、１，８−ビス−マレイミド−ジエチレングリコール、１，１１−ビス−マレイミド−トリエチレングリコール、１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン、ジチオビスマレイミドエタン、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン、１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン、ビス［ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド、Ｎ−（ａ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチラート、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−ａ−［２−ピリジルジチオ］トルエン、４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート）、ヨード酢酸Ｎ−スクシンイミジル、スクシンイミジル３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート、スルホスクシンイミジル［４−アジドサリチルアミド］−ヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル−（パーフルオロアジドベンズアミド）エチル−１，３’−ジチオプロプリオネート、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）エチル−１，３’−プロプリオネート、スルホスクシンイミジル２−［７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセトアミド］エチル−１，３’ジチオプロピオネート、スクシンイミジル４，４’−アジペンタノエート、スクシンイミジル６−（４，４’−アジペンタンアミド）ヘキサノエート、スクシンイミジル２−（［４，４’−アジペンタンアミド］エチル）−１，３’−ジチオプロプリオネート、スルホスクシンイミジル４，４’−アジペンタノエート、スルホスクシンイミジル６−（４，４’−アジペンタンアミド）ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル２−（［４，４’−アジペンタンアミド］エチル）−１，３’−ジチオプロプリオネート、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド，トリフルオロ酢酸塩、［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド，トリフルオロ酢酸塩、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩酸塩、Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネートおよびスクシンイミジル−［４−（ソラレン−８−イルオキシ）］−ブチラートからなる群より選択される、前記請求項５０〜５３のいずれか一つに記載の組成物。
  55. 前記表面はナノ粒子を含む、請求項５０〜５４のいずれか一つに記載の組成物。
  56. 前記ナノ粒子は球、ロッドおよび角柱からなる群より選択される、請求項５５記載の組成物。
  57. 前記ナノ粒子は金属である、請求項５５または５６記載の組成物。
  58. 前記ナノ粒子はコロイド金属である、請求項５７記載の組成物。
  59. 前記ナノ粒子は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、アルミニウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、銅ナノ粒子、コバルトナノ粒子、インジウムナノ粒子、およびニッケルナノ粒子からなる群より選択される、請求項５８記載の組成物。
  60. 前記複数のポリヌクレオチドはＤＮＡポリヌクレオチド、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはそれらの組み合わせを含む、請求項５０〜５９のいずれか一つに記載の組成物。
  61. 前記ポリヌクレオチドは約５〜約１００ヌクレオチド長、約５〜約９０ヌクレオチド長、約５〜約８０ヌクレオチド長、約５〜約７０ヌクレオチド長、約５〜約６０ヌクレオチド長、約５〜約５０ヌクレオチド長、約５〜約４５ヌクレオチド長、約５〜約４０ヌクレオチド長、約５〜約３５ヌクレオチド長、約５〜約３０ヌクレオチド長、約５〜約２５ヌクレオチド長、約５〜約２０ヌクレオチド長、約５〜約１５ヌクレオチド長、または約５〜約１０ヌクレオチド長である、請求項６０に記載の組成物。
  62. 請求項２８に記載の方法を用いる、請求項１に記載のナノ複合体の製造方法。
  63. 標的分子を請求項１〜２８または請求項５０〜６１のいずれか一つに記載の組成物と接触させることを含み、前記標的分子と前記組成物の接触で、検出可能な変化が得られる、標的分子を検出する方法。
  64. 前記検出はインビトロである、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記検出はインビボである、請求項６４に記載の方法。
  66. 標的ポリヌクレオチドを、請求項１〜２８または請求項５０〜６１のいずれか一つに記載の組成物と、遺伝子産物の発現を阻止するのに十分な条件下で接触させることを含む、標的ポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子産物の発現を阻止する方法。
  67. 前記遺伝子産物の発現はインビボで阻止される、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記遺伝子産物の発現はインビトロで阻止される、請求項６６に記載の方法。
  69. 前記遺伝子産物の発現は、少なくとも約５％阻止される、請求項６６〜６８のいずれか一つに記載の方法。
JP2012537179A 2009-10-30 2010-11-01 鋳型ナノ複合体 Active JP5866119B2 (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25664009P 2009-10-30 2009-10-30
US61/256,640 2009-10-30
US37455010P 2010-08-17 2010-08-17
US61/374,550 2010-08-17
US38684610P 2010-09-27 2010-09-27
US61/386,846 2010-09-27
PCT/US2010/055018 WO2011053940A2 (en) 2009-10-30 2010-11-01 Templated nanoconjugates

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015160147A Division JP2015205937A (ja) 2009-10-30 2015-08-14 鋳型ナノ複合体

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2013509445A true JP2013509445A (ja) 2013-03-14
JP2013509445A5 JP2013509445A5 (ja) 2013-12-19
JP5866119B2 JP5866119B2 (ja) 2016-02-17

Family

ID=43923058

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012537179A Active JP5866119B2 (ja) 2009-10-30 2010-11-01 鋳型ナノ複合体
JP2015160147A Pending JP2015205937A (ja) 2009-10-30 2015-08-14 鋳型ナノ複合体

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015160147A Pending JP2015205937A (ja) 2009-10-30 2015-08-14 鋳型ナノ複合体

Country Status (9)

Country Link
US (3) US9376690B2 (ja)
EP (1) EP2494075B1 (ja)
JP (2) JP5866119B2 (ja)
KR (1) KR20120136345A (ja)
CN (1) CN102666879B (ja)
AU (1) AU2010313154B2 (ja)
CA (1) CA2779099C (ja)
DK (1) DK2494075T3 (ja)
WO (1) WO2011053940A2 (ja)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103966345A (zh) 2007-02-09 2014-08-06 西北大学 检测细胞内标靶的颗粒
US20100233270A1 (en) 2009-01-08 2010-09-16 Northwestern University Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles
KR101048429B1 (ko) * 2009-09-09 2011-07-11 한국생명공학연구원 바이오칩을 이용한 표적 물질 검출 및 정량 방법
WO2011091065A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Northwestern University Synthetic nanostructures including nucleic acids and/or other entities
JP2014531898A (ja) 2011-09-11 2014-12-04 オーラセンス, エルエルシーAurasense, Llc 細胞取り込み制御システム
WO2013040499A1 (en) * 2011-09-14 2013-03-21 Northwestern University Nanoconjugates able to cross the blood-brain barrier
EP2812446B1 (en) * 2012-02-09 2017-05-10 Life Technologies Corporation Conjugated polymeric particle and method of making same
CN117462693A (zh) 2012-02-27 2024-01-30 阿穆尼克斯运营公司 Xten缀合组合物和制造其的方法
KR101974577B1 (ko) * 2012-05-21 2019-05-02 삼성전자주식회사 나노입자 제작용 주형 및 이를 이용한 나노입자의 제조 방법
CN102752315B (zh) * 2012-07-25 2015-03-18 烽火通信科技股份有限公司 一种灵活适应ims系统业务标签的业务解析方法
WO2014052887A2 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Rhodia Operations Process for making silver nanostructures and copolymer useful in such process
CA2919268C (en) 2013-07-25 2023-09-05 Exicure, Inc. Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
KR20160045726A (ko) 2013-07-25 2016-04-27 엑시큐어, 인크. 면역조절제로서의 구형 핵산-기재 구축물
WO2015023797A1 (en) 2013-08-13 2015-02-19 Northwestern University Lipophilic nanoparticles for drug delivery
WO2015066708A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Northwestern University Quantification and spatio-temporal tracking of a target using a spherical nucleic acid (sna)
AU2014383024B2 (en) 2013-12-03 2020-04-30 Exicure, Inc. Liposomal particles, methods of making same and uses thereof
CN103769603B (zh) * 2014-01-23 2016-04-20 永新股份（黄山）包装有限公司 纳米银粒子及其合成方法
US10413565B2 (en) 2014-04-30 2019-09-17 Northwestern University Nanostructures for modulating intercellular communication and uses thereof
WO2015187966A1 (en) 2014-06-04 2015-12-10 Aurasense Therapeutics, Llc Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
CN107002081A (zh) 2014-10-06 2017-08-01 埃克西奎雷股份有限公司 抗tnf化合物
US11213593B2 (en) 2014-11-21 2022-01-04 Northwestern University Sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
US10078092B2 (en) 2015-03-18 2018-09-18 Northwestern University Assays for measuring binding kinetics and binding capacity of acceptors for lipophilic or amphiphilic molecules
CN107922974B (zh) 2015-07-02 2021-11-09 生命技术公司 羧基官能亲水微珠的偶合
US10150992B2 (en) 2015-07-06 2018-12-11 Life Technologies Corporation Substrates and methods useful in sequencing
US9950079B2 (en) 2015-09-03 2018-04-24 International Business Machines Corporation Functionalization of nanoparticles with polythioaminal thiol-containing polymers
WO2017193087A1 (en) 2016-05-06 2017-11-09 Exicure, Inc. Liposomal spherical nucleic acid (sna) constructs prsenting antisense oligonucleotides(aso) for specific knockdown of interleukin 17 receptor mrna
WO2018039629A2 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Northwestern University Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates
CN106770080A (zh) * 2016-11-15 2017-05-31 山西大学 一种Pd2+检测试剂及其合成方法和应用
US10973956B2 (en) 2017-01-05 2021-04-13 The Regents Of The University Of Michigan Microporous hydrogel scaffolds for cell transplantation
US11696954B2 (en) 2017-04-28 2023-07-11 Exicure Operating Company Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
US20210145870A1 (en) * 2017-05-24 2021-05-20 Norheastern University Silver Palladium and Silver Platinum Nanoparticles Useful as Antimicrobial and Anticancer Agents
MX2020000387A (es) 2017-07-13 2020-08-17 Univ Northwestern Método general y directo para preparar nanopartículas de estructura organometálica funcionalizadas con oligonucleotidos.
US11331019B2 (en) 2017-08-07 2022-05-17 The Research Foundation For The State University Of New York Nanoparticle sensor having a nanofibrous membrane scaffold
US10973927B2 (en) 2017-08-28 2021-04-13 The Chinese University Of Hong Kong Materials and methods for effective in vivo delivery of DNA nanostructures to atherosclerotic plaques
WO2019108954A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Materials and methods relating to single molecule arrays
CN108088994B (zh) * 2017-12-15 2022-04-19 南京医科大学第二附属医院 一种中空核壳纳米颗粒及制备方法、试纸条及测试方法
WO2020068905A1 (en) * 2018-09-25 2020-04-02 Northwestern University Stabilization of colloidal crystals engineered with nucleic acid
CN109622944B (zh) * 2019-01-11 2020-11-06 临沂大学 一种功能化金纳米粒子及其制备方法、金纳米粒子二聚体的制备方法及其应用
US20220175956A1 (en) 2019-03-06 2022-06-09 Northwestern University Hairpin-like oligonucleotide-conjugated spherical nucleic acid
CN114436316B (zh) * 2020-11-03 2024-05-28 中国石油天然气集团有限公司 一种单分散花形氧化铜/碳纳米复合材料及其制备方法
CN112345475B (zh) * 2020-11-11 2022-09-20 昆明理工大学 一种快速检测食品中亚硝酸盐的方法
CN116511516B (zh) * 2023-06-26 2023-09-19 中国农业大学 一种新型铜基纳米材料及其在抗氧化和抑菌方面的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003327641A (ja) * 2002-05-08 2003-11-19 Japan Science & Technology Corp 高分子グラフト微粒子の秩序構造体
WO2005099889A1 (ja) * 2004-04-07 2005-10-27 Keio University リポソームを鋳型とする中空ナノ粒子の作製方法
US20090148535A1 (en) * 2007-12-06 2009-06-11 Minerva Biotechnologies Corporation Method for treating cancer using interference rna

Family Cites Families (258)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
US4289872A (en) 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US5541308A (en) 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
NZ225176A (en) 1987-06-24 1990-09-26 Florey Howard Inst Nucleoside derivatives
PT88550A (pt) 1987-09-21 1989-07-31 Ml Tecnology Ventures Lp Processo para a preparacao de reagentes de ligacao nao nucleotidicos para sondas nucleotidicas
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
EP0348458B1 (en) 1987-11-30 1997-04-09 University Of Iowa Research Foundation Dna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
EP0942000B1 (en) 1989-10-24 2004-06-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-Modified oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
WO1992002258A1 (en) 1990-07-27 1992-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
EP0541722B1 (en) 1990-08-03 1995-12-20 Sterling Winthrop Inc. Compounds and methods for inhibiting gene expression
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
CA2092002A1 (en) 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
CA2095212A1 (en) 1990-11-08 1992-05-09 Sudhir Agrawal Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
US7223833B1 (en) 1991-05-24 2007-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
CA2122030C (en) 1991-10-24 1997-03-04 Muthiah Manoharan Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
DE637965T1 (de) 1991-11-26 1995-12-14 Gilead Sciences Inc Gesteigerte bildung von triple- und doppelhelices aus oligomeren mit modifizierten pyrimidinen.
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
CA2118130A1 (en) 1992-04-14 1993-10-28 Jean M. J. Frechet Dendritic based macromolecules and method of production
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5472881A (en) 1992-11-12 1995-12-05 University Of Utah Research Foundation Thiol labeling of DNA for attachment to gold surfaces
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
ATE155467T1 (de) 1993-03-30 1997-08-15 Sanofi Sa Acyclische nucleosid analoge und sie enthaltende oligonucleotidsequenzen
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
NL9301919A (nl) 1993-05-27 1994-12-16 Pelt & Hooykaas Werkwijze voor het afvangen van milieuschadelijke stoffen uit met dergelijke stoffen verontreinigd materiaal.
EP0748382B1 (en) 1993-09-02 2002-11-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Non-nucleotide containing enzymatic nucleic acid
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
DE69415343T2 (de) 1993-10-27 1999-08-26 Ribozyme Pharmaceuticals 2'-amido-und 2'-peptido-modifizierte oligonukleotide
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
EP0733059B1 (en) 1993-12-09 2000-09-13 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US5912340A (en) 1995-10-04 1999-06-15 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Selective binding complementary oligonucleotides
US20050059016A1 (en) 2002-11-05 2005-03-17 Ecker David J. Structural motifs and oligomeric compounds and their use in gene modulation
US6750016B2 (en) 1996-07-29 2004-06-15 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
CA2262018C (en) 1996-07-29 2007-10-02 Nanosphere Llc Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20020172953A1 (en) 1996-07-29 2002-11-21 Mirkin Chad A. Movement of biomolecule-coated nanoparticles in an electric field
US7098320B1 (en) 1996-07-29 2006-08-29 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6506564B1 (en) 1996-07-29 2003-01-14 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6361944B1 (en) 1996-07-29 2002-03-26 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6582921B2 (en) 1996-07-29 2003-06-24 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof
US20060002949A1 (en) 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
JP2002514919A (ja) 1997-04-04 2002-05-21 バイオサイト ダイアグノスティックス，インコーポレイテッド 多価ライブラリーおよびポリクローナルライブラリー
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
AU750244B2 (en) 1997-09-04 2002-07-11 Gryphon Sciences Modular protein libraries and methods of preparation
DE04020014T1 (de) 1997-09-12 2006-01-26 Exiqon A/S Bi-zyklische - Nukleosid,Nnukleotid und Oligonukleotid-Analoga
US6242246B1 (en) 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip
US6403312B1 (en) 1998-10-16 2002-06-11 Xencor Protein design automatic for protein libraries
US6827979B2 (en) 1999-01-07 2004-12-07 Northwestern University Methods utilizing scanning probe microscope tips and products therefor or produced thereby
AR022404A1 (es) 1999-01-25 2002-09-04 Photogen Inc Metodo y agentes para la terapia de radiacion mejorada
WO2001094626A1 (en) 1999-04-30 2001-12-13 Cyclops Genome Sciences Limited Polynucleotides
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
AU784040B2 (en) 1999-06-25 2006-01-19 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
EP1072679A3 (en) 1999-07-20 2002-07-31 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure
DE60038695T2 (de) 1999-11-29 2009-05-28 Avi Biopharma, Inc., Corvallis Gegen bakterielle 16s und 23s rrnas gerichtete ungeladene antisense oligonukleotide und deren verwendungen
US20030181412A1 (en) 1999-12-21 2003-09-25 Ingeneus Corporation Method for modifying transcription and/or translation in an organism for therapeutic, prophylactic and/or analytic uses
WO2001049869A1 (fr) 1999-12-30 2001-07-12 Aventis Pharma S.A. Compositions comprenant des acides nucleiques incorpores dans des particules minerales bilamellaires
CA2396113C (en) 2000-01-13 2009-04-07 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
EP1301625B1 (en) 2000-03-28 2010-11-03 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6991900B2 (en) 2000-06-28 2006-01-31 California Institute Of Technology Methods for identifying an essential gene in a prokaryotic microorganism
EP1360318B1 (en) 2000-07-11 2006-04-26 Northwestern University Method of detection by enhancement of silver staining
US6678548B1 (en) 2000-10-20 2004-01-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Unified probabilistic framework for predicting and detecting seizure onsets in the brain and multitherapeutic device
EP1873259B1 (en) 2000-12-01 2012-01-25 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. RNA interference mediated by 21 and 22nt RNAs
DE10065475A1 (de) 2000-12-28 2002-07-18 Switch Biotech Ag Verwendung von "intermediate-conductance" Kaliumkanälen und Modulatoren zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten mit gestörter Keratinozytenfunktion
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
US20060019917A1 (en) 2001-05-18 2006-01-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2002096262A2 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Northwestern University Non-alloying core shell nanoparticles
CN100384480C (zh) 2001-05-30 2008-04-30 斯克里普斯研究学院 核酸传递系统
ES2304467T3 (es) 2001-07-10 2008-10-16 North Carolina State University Vehiculo de liberacion de nanoparticulas.
WO2003046173A1 (fr) 2001-11-28 2003-06-05 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. Systeme d'expression d'arn si et procede de production de cellules d'inactivation de genes fonctionnelles et analogues au moyen de ce systeme
CA2470965C (en) 2001-12-17 2015-10-27 Tao Chen System biology approach: high throughput screening (hts) platforms with multiple dimensions
US20030124194A1 (en) 2002-01-02 2003-07-03 Gaw Debra A. Amine functionalized superparamagnetic nanoparticles for the synthesis of bioconjugates and uses therefor
US20040038303A1 (en) 2002-04-08 2004-02-26 Unger Gretchen M. Biologic modulations with nanoparticles
WO2003101386A2 (en) 2002-05-30 2003-12-11 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Kinase suppressor of ras inactivation for therapy of ras mediated tumorigenesis
DE10238298A1 (de) 2002-08-21 2004-03-04 Beiersdorf Ag Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden zur Behandlung von degenerativen Hauterscheinungen
CA2502649A1 (en) 2002-10-18 2004-04-29 Nucleonics Inc. Double-stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
US20040219565A1 (en) 2002-10-21 2004-11-04 Sakari Kauppinen Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest
US20060105343A1 (en) 2003-01-09 2006-05-18 Children's Medical Center Corporation Methods for diagnosis and prognosis of cancer
US7727969B2 (en) 2003-06-06 2010-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery
GB0313259D0 (en) 2003-06-09 2003-07-16 Consejo Superior Investigacion Magnetic nanoparticles
US20050096263A1 (en) 2003-10-30 2005-05-05 Keay Susan K. Novel antiproliferative factor and methods of use
US20080057128A1 (en) 2003-07-18 2008-03-06 Omeros Corporation Biodegradable triblock copolymers, synthesis methods therefore, and hydrogels and biomaterials made there from
US7611728B2 (en) 2003-09-05 2009-11-03 Supernus Pharmaceuticals, Inc. Osmotic delivery of therapeutic compounds by solubility enhancement
KR20060132802A (ko) 2003-09-09 2006-12-22 제론 코포레이션 텔로머라제 억제를 위한 변형 올리고뉴클레오티드
US7846412B2 (en) 2003-12-22 2010-12-07 Emory University Bioconjugated nanostructures, methods of fabrication thereof, and methods of use thereof
WO2005089287A2 (en) 2004-03-15 2005-09-29 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna
US20050287593A1 (en) 2004-05-03 2005-12-29 Schering Corporation Use of cytokine expression to predict skin inflammation; methods of treatment
WO2005112619A2 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Genentech, Inc. Novel gene disruptions, compositions and methods relating thereto
US20080213177A1 (en) 2004-05-24 2008-09-04 Thomas William Rademacher Nanoparticles Comprising Rna Ligands
US20060008907A1 (en) 2004-06-09 2006-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Control of gene expression via light activated RNA interference
WO2006012695A1 (en) 2004-08-04 2006-02-09 Panvax Limited An immunogenic composition
WO2006044716A2 (en) * 2004-10-15 2006-04-27 Washington University In St.Louis CELL PERMEABLE NANOCONJUGATES OF SHELL-CROSSLINKED KNEDEL (SCK) AND PEPTIDE NUCLEIC ACIDS ('PNAs') WITH UNIQUELY EXPRESSED OR OVER-EXPRESSED mRNA TARGETING SEQUENCES FOR EARLY DIAGNOSIS AND THERAPY OF CANCER
TW200616606A (en) 2004-10-19 2006-06-01 Schering Ag Treatment and prevention of multi-drug resistance
CN101080241A (zh) 2004-12-17 2007-11-28 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于分子成像的靶向剂
BRPI0518952A2 (pt) 2004-12-17 2008-12-16 Koninkl Philips Electronics Nv mÉtodo para a produÇço de um agente de contraste marcador ou um agente terapÊutico, agentes de contraste marcadores, e, uso dos agentes de contraste marcadores ou dos agentes terapÊuticos de marcaÇço
EP1674128A1 (en) 2004-12-22 2006-06-28 Steinbeis-Transferzentrum für Herz-Kreislaufforschung Magnetic pole matrices useful for tissue engineering and treatment of disease
WO2006078777A2 (en) 2005-01-19 2006-07-27 William Marsh Rice University Method to fabricate inhomogeneous particles
KR100704011B1 (ko) 2005-02-16 2007-04-04 한국과학기술원 금속나노입자와 양자점의 ｆｒｅｔ에 의한 생체분자특이결합 검출 방법
US8246995B2 (en) 2005-05-10 2012-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Hydrophobic nanotubes and nanoparticles as transporters for the delivery of drugs into cells
WO2006138145A1 (en) 2005-06-14 2006-12-28 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
JP2007101498A (ja) 2005-10-07 2007-04-19 Fujifilm Corp 蛍光プローブ及び蛍光検出方法
WO2007047455A2 (en) 2005-10-13 2007-04-26 Northwestern University Colorimetric screening of dna binding/intercalating agents with gold nanoparticle probes
FR2892819B1 (fr) 2005-10-28 2008-02-01 Centre Nat Rech Scient Nanoparticules a luminescence persistance pour leur utilisation en tant qu'agent de diagnostic destine a l'imagerie optique in vivo
US20100167051A1 (en) 2006-03-31 2010-07-01 Goia Dan V Process for Manufacture of Silver-Based Particles and Electrical Contact Materials
WO2008030624A2 (en) 2006-09-08 2008-03-13 The Research Foundation Of State University Of New York Nanoparticles for two-photon activated photodynamic therapy and imaging
CN103966345A (zh) 2007-02-09 2014-08-06 西北大学 检测细胞内标靶的颗粒
US8323694B2 (en) 2007-05-09 2012-12-04 Nanoprobes, Inc. Gold nanoparticles for selective IR heating
US20100234579A1 (en) 2007-05-10 2010-09-16 North Western University Silver nanoparticle binding agent conjugates based on moieties with triple cyclic disulfide anchoring groups
AU2008259907B2 (en) 2007-05-30 2014-12-04 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
US20100183504A1 (en) 2007-06-14 2010-07-22 Fanqing Frank Chen Multimodal imaging probes for in vivo targeted and non-targeted imaging and therapeutics
US20080317768A1 (en) 2007-06-21 2008-12-25 Boeing Company Bioconjugated nanoparticles
US7638557B2 (en) 2007-10-31 2009-12-29 Meta Cosmetics, Llc Prostaglandin analog compositions to treat epithelial-related conditions
US20090148384A1 (en) 2007-12-10 2009-06-11 Fischer Katrin Functionalized, solid polymer nanoparticles comprising epothilones
US20110262976A1 (en) 2008-01-17 2011-10-27 Indigene Pharmaceuticals, Inc. PRODUCTION OF R-a-LIPOIC ACID BY FERMENTATION USING GENETICALLY ENGINEERED MICROORGANISMS
IE20080211A1 (en) 2008-03-20 2009-11-25 Nat Univ Ireland Biodegradable nanoshells for delivery of therapeutic and/or imaging molecules
US20110172404A1 (en) 2008-05-19 2011-07-14 Cornell University Self-Assembly of Nanoparticles Through Nuclei Acid Engineering
DK2365803T3 (en) 2008-11-24 2018-01-22 Univ Northwestern POLYVALENT RNA NANOPARTICLE COMPOSITIONS
US8298765B2 (en) 2009-01-01 2012-10-30 Cornell University Multifunctional nucleic acid nano-structures
AU2010203474B2 (en) 2009-01-08 2015-11-19 Northwestern University Inhibition of bacterial protein production by polyvalent oligonucleotide modified nanoparticle conjugates
KR20120022938A (ko) 2009-04-15 2012-03-12 노오쓰웨스턴 유니버시티 올리고뉴클레오티드 관능화된 나노입자의 전달
US20100291707A1 (en) 2009-04-29 2010-11-18 Northwestern University Multiplexed Scanometric Assay for Target Molecules
WO2011017690A2 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Northwestern University Intracellular delivery of contrast agents with functionalized nanoparticles

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003327641A (ja) * 2002-05-08 2003-11-19 Japan Science & Technology Corp 高分子グラフト微粒子の秩序構造体
WO2005099889A1 (ja) * 2004-04-07 2005-10-27 Keio University リポソームを鋳型とする中空ナノ粒子の作製方法
US20090148535A1 (en) * 2007-12-06 2009-06-11 Minerva Biotechnologies Corporation Method for treating cancer using interference rna

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN5013000370; ＲＥＴＨＯＲＥ: 'ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＣＨＩＴＯＳＡＮ／ＰＯＬＹＧＬＵＴＡＭＩＣ　ＡＣＩＤ　ＳＰＨＥＲＥＳ　ＢＡＳＥＤ　ＯＮ　ＴＨＥ　ＵＳＥ　ＯＦ　ＰＯＬＹＳＴＹＲＥＮＥ　ＴＥＭＰＬＡＴＥ　以下備考' ＴＩＳＳＵＥ　ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ Ｖ１５　Ｎ４, 200904, Ｐ６０５-６１３ *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2779099C (en) 2021-08-10
CN102666879B (zh) 2016-02-24
US9757475B2 (en) 2017-09-12
US20160206747A1 (en) 2016-07-21
AU2010313154B2 (en) 2016-05-12
DK2494075T3 (en) 2018-07-23
EP2494075A4 (en) 2015-05-06
EP2494075A2 (en) 2012-09-05
KR20120136345A (ko) 2012-12-18
AU2010313154A1 (en) 2012-05-17
US9376690B2 (en) 2016-06-28
JP5866119B2 (ja) 2016-02-17
CN102666879A (zh) 2012-09-12
US20180117175A1 (en) 2018-05-03
EP2494075B1 (en) 2018-04-04
US20120282186A1 (en) 2012-11-08
WO2011053940A3 (en) 2011-07-28
CA2779099A1 (en) 2011-05-05
WO2011053940A2 (en) 2011-05-05
JP2015205937A (ja) 2015-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5866119B2 (ja) 鋳型ナノ複合体
US20130101512A1 (en) Crosslinked polynucleotide structure
US20160159834A1 (en) Alkyne phosphoramidites and preparation of spherical nucleic acid constructs
Yu et al. Image‐guided prostate cancer therapy using aptamer‐functionalized thermally cross‐linked superparamagnetic iron oxide nanoparticles
JP6797108B2 (ja) タンパク質／オリゴヌクレオチドコアシェルナノ粒子治療薬
Hull et al. Highlights of recent developments and trends in cancer nanotechnology research—View from NCI Alliance for Nanotechnology in Cancer
JP5906327B2 (ja) 磁性ナノ粒子−ＳＡＭｉＲＮＡ複合体およびその製造方法
JP2018024703A (ja) 血液脳関門を通過することができるナノ抱合体
JP2015017124A (ja) 担体としてオリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子を使用する治療薬の送達
US9051583B2 (en) Modified silica shell particles, and methods of making and using the same
Yu et al. Multifunctional DNA polycatenane nanocarriers for synergistic targeted therapy of multidrug‐resistant human leukemia
KR102075823B1 (ko) 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자를 포함하는 간동맥 화학색전술용 조성물
US20160361266A1 (en) Modified silica shell particles, and methods of making and using the same
JP2008194035A (ja) 高いヌクレアーゼ耐性と優れたｒｎａ干渉効果を発現可能な二本鎖ｒｎａ
Giljohann Gene regulation with polyvalent oligonucleotide nanoparticle conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20131031

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20131031

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140717

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20140718

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20141016

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20141023

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150116

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150414

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150713

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150814

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150907

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20151113

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20151222

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20151230

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5866119

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250