JP2013245171A - ヘンナの花部抽出物の取得方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヘンナの花部を乾燥するかまたはせずして抽出対象物を作製し、カットされたかまたはされていない前記抽出対象物を水または水性アルコールで抽出し、得られる抽出液を濃縮し、ヘンナの花部抽出物を得ることを特徴とするヘンナの花部抽出物の取得方法により上記課題を解決する。
【選択図】なし
Description
ヘンナの葉を粉末にしたものはヘンナ染料と呼ばれ、染料および顔料として古来より用いられてきた。
このような性質から、ヘンナの葉は天然の染料として、毛髪のカラーリングなどに用いられている。
また、本発明によれば、前記方法により得られるヘンナの花部抽出物を有効成分として含有する医薬組成物が提供される。
また、本発明によれば、メラニン生成抑制作用を有する前記化粧品が提供される。
また、本発明によれば、ヒアルロニダーゼ阻害作用を有する前記化粧品が提供される。
さらに、本発明の化粧品は、ヒアルロニダーゼ阻害作用を有するので、皮膚の保湿、乾燥防止、ハリおよび弾力性の維持、ならびに皺形成防止に優れた効果を発揮できる。
また、副作用が低く、ヒアルロニダーゼを阻害する有効な物質は未だ見つかっていない。
したがって、ヒアルロニダーゼ阻害作用を示す物質は、皮膚の乾燥、ハリおよび弾力性の維持ならびに皺形成抑制効果が期待できる。
この理由としては、癌患者が死亡するのは癌が他の臓器に転移するからであり、癌転移を抑制することができれば長期生存率は飛躍的に向上するといわれている。
癌転移抑制剤の研究は世界中で行われているが、未だ有効な薬剤がないのが現状である。また、末期の癌患者や白血病の患者では、血中に癌細胞が多く存在しており、これらを外科手術で除去することは不可能であるので、そしてこれらの癌細胞が脳や脊髄に転移することにより致死に至る。これらを少しでも防ぐことも今後の課題の一つである。
上記の方法において用いられるヘンナの花部の産地は、特に限定されるものではない。
また、上記の方法において用いられる花部は、開花前の花の蕾、開花した花びら、花全体のいずれをも意味し、雄しべ、雌しべ、花弁なども含む。
また、上記の方法は、任意に抽出対象物をカットする工程を含んでいてもよい。この工程においては、当業者に公知の任意の方法に従って、上記の抽出対象物をカットし、より小さく細かい形態の抽出対象物を作製する。上記の抽出対象物をカットすることにより、次なる抽出工程における抽出効率を高めることができる。
上記の溶媒がメタノールである場合、メタノールと水との比は、1〜100:1〜100であり、好ましくは1〜10:1〜10であり、より好ましくは3〜5:7〜5である。
抽出温度は、室温〜溶媒の沸点程度の温度の間で任意に設定できるが、例えば50℃〜抽出溶媒の沸点の温度で、振盪下もしくは非振盪下または還流下に、ヘンナの花部を抽出溶媒に浸漬することによって行うのが適当である。
抽出操作は、同一材料について1回だけ行ってもよいが、複数回、例えば2〜5回程度繰り返すのが抽出効率の点から好ましい。
固形剤に添加され得る媒体としては、医薬的に許容される賦形剤、結合剤、崩壊剤およびその他の添加剤、例えば滑沢剤、流動化剤、抗酸化剤、保存剤などが挙げられる。
上記の製剤には、さらに当該技術分野で通常用いられている矯味矯臭剤または着香剤(メントールなど)および帯電防止剤などを加えてもよい。
コーティング製剤は、フィルムコーティング機を用いて、コーティング基剤を含有するコーティング剤を未コーティング製剤(素顆粒、素錠など)に噴霧することにより得ることができる。
さらに液剤には、添加剤として、流動化剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、溶解補助剤、増粘剤、緩衝剤、防腐剤または保存剤、抗酸化剤、殺菌剤または抗菌剤などの当業者に周知の添加剤を添加してもよい。
上記の抽出物または組成物を化粧品に添加する場合、局所または全身用の皮膚化粧品類;頭皮・頭髪に適用する薬用および/または化粧用の製剤類;浴湯に投じて使用する浴用剤;皮膚貼付用シートおよび化粧用シートなどの適当な形態にある化粧品として用いることができる。
上記の各抽出物の乾燥重量としての含量は、通常、上記の化粧品の全重量に対して、0.00001〜0.1重量%であればよい。この含量が、0.00001重量%未満では十分な美容効果を期待できず、逆に、0.1重量%を超えても超過分に見合った美容効果の増強は期待できず、不経済である。
上記の抽出物または組成物は、食品に添加して使用する場合、そのような食品としては、通常の食品よりも積極的な意味で保健、健康維持・増進などを目的とした健康食品が好ましく、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅうなどの菓子類、清涼飲料、茶、栄養飲料、スープなどが挙げられる。
測定機器・使用条件
試薬は、特に明記しないものは和光純薬工業株式会社製試薬 (特級) を用いた。実験で得られた数値は、平均値±標準誤差で表記し、対照群との平均値の有意差の検定にはDunnettの方法を使用し、p値が0.05以下のものを有意とみなした。IC50値は、縦軸に阻害率(%)、横軸にLog(濃度)をプロットしたグラフから算出した。
細胞培養はMCO-18AIC(三洋電機株式会社製)CO2インキュベーターを使用し、37℃、5%CO2存在下飽湿状態で行った。
メタノール(MeOH)で抽出する場合には、インド産ヘンナ(Lawsonia inermis)乾燥花部を、還流下MeOH(ナカライテスク社)での熱時(80℃、3時間)抽出を3回繰り返した後、各濾液を全て回収し、溶媒を減圧留去し、MeOH抽出エキスを得た。
また、H2Oで抽出する場合には、乾燥花部を、還流下蒸留水での熱時(80℃、3時間)抽出を3回繰り返した後、各濾液を全て回収し、溶媒を減圧留去し、H2O抽出エキスを得た。
マウスメラノーマ細胞におけるメラニン生成抑制作用の判定
マウスメラノーマ由来B16 melanoma 4A5細胞(HSRRB社)を10%ウシ胎児血清(FBS;Fetal Bovine Serum、Serum source international,Inc.)、100unit/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシンを含有するDMEM(グルコース濃度:4500mg/L)培地(Sigma Aldrich社)で培養 (5%CO2、37℃)した。
24ウェルマルチプレートの各ウェル中の培地400μLに2.0×104細胞を播種し、24時間前培養した後、被験物質およびテオフィリン(終濃度1mM) を添加した。72時間培養後、トリプシン処理により細胞を剥離、回収後、PBSで洗浄し、1.0N のNaOH水溶液に溶解(120μL/ウェル、80℃、30分)し、96ウェルマイクロプレートに細胞溶解液を分取(100μL/ウェル)し、生成したメラニンの吸光度をマイクロプレートリーダー(SH-1000、コロナ電気)で測定した(測定波長:405nm)。なお、被験物質はDMSOに溶解し、培地に添加した(DMSOの終濃度0.1%)。
被験物質の阻害率(%)を以下の式により算出した。
阻害率(%)=((A−B)/A)/(C/100)×100
[A:被験サンプル未添加 (コントロール) の吸光度、B:被験サンプル添加時の吸光度、C:細胞生存率]
96ウェルマイクロプレートの各ウェル中の培地100μLに5.0×103細胞を播種し、24時間前培養した後, 被験物質およびテオフィリン(終濃度1mM)を培地添加した。70時間培養後、WST-8(製品名Cell counting kit-8、Dojindo社)を10μLずつ添加した。2時間培養後、生成したWST-8ホルマザンの吸光度をマイクロプレートリーダー(SH-1000、コロナ電気)にて測定した(測定波長:450nm、参照波長:655nm)。なお、被験物質はDMSOに溶解し、培地添加した(DMSO終濃度0.1%)。
被験物質の阻害率(%)を以下の式により算出した。
阻害率(%)=((A−B)/A)×100
[A:被験サンプル未添加(コントロール)の吸光度、B:被験サンプル添加時の吸光度]
0.1Mリン酸バッファー(pH6.5)1.8 mLに、2.5mMのL-DOPAリン酸バッファー溶液を1mL加え、ついで100μLの試料溶液(DMSO溶液)を加え撹拌後、チロシナーゼの100μLリン酸バッファー溶液(1380unit/mL)を加えて酵素反応(25℃、5分)させ、マイクロプレートリーダー(SH-1000、コロナ電気)を用いて生成されたメラニンの吸光度を測定した(測定波長:405nm)。
被験物質の阻害率(%)を以下の式により算出した。
阻害率(%)=((A−B)/A)×100
[A:被験サンプル未添加(コントロール)の吸光度、B:被験サンプル添加時の吸光度]
1.9mg/mLのヒアルロニダーゼ(製品名Hyaluronidase, from bovine testes, Sigma社)10μLにサンプルを20μL加え、37℃で20分間インキュベート後、0.5mg/mLのcompound48/80を20μL加え、37℃で20分間インキュベートし、0.8mg/mLのヒアルロン酸(製品名Hyaluronic Acid、Calbiochem社)を50μL加えた。37℃で40分間インキュベート後、0.4NのNaOHを20μL、0.7Nのホウ酸溶液20μLを加え、100℃で3分間加熱した。放冷後、10mg/mLのp-ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬を600μL加え、37℃で20分間インキュベートした後、96ウェルマイクロプレートに300μL/ウェル分取し、マイクロプレートリーダー(SH-1000、コロナ電気)にて吸光度(580nm)を測定した。
0.04U/mLのDPP-4(製品名DPP4(CD26)、ATGEN社)溶液25μLに被験サンプル溶液25μLを加え、37℃で3分予備加温した。その後、基質として0.8mMのGly-Pro-pNA・Tos溶液50μLを加え、37℃で30分反応させた。反応後、405nmにおける吸光度からDPP-4阻害率を求めた。各サンプルにつきDPP-4溶液に代え、トリス−マレイン酸緩衝液25μLを加え、同様の操作を行ったものをブランクとして調整した。DPP-4を、0.1%のBSAを含むpH7.2のトリス−マレイン酸−NaOH緩衝液に溶解し、20mU/mL(1U=1分間に1μmolの基質を分解する酵素活性)に調整したものを、0.8mMのGly-Pro-pNA・Tos溶液は、40mMのGly-Pro-pNA・Tos DMSO溶液をトリス−マレイン酸−NaOH緩衝液で50倍に希釈したものをそれぞれ用いた。被験サンプル溶液は、DMSOを用いて溶解した液をトリス−マレイン酸緩衝液に添加し、添加後のDMSO濃度を0.4%として用いた。
20mg/mLに調整したBSA(製品名 牛血清アルブミン(F-V)、ナカライテスク社)溶液500μLと250mg/mLに調整したD-グルコース溶液400μLおよび調整した被験物質100μLをサンプルチューブ内で混和し、60℃で3日間反応させた後、ブラックプレートに分取し、蛍光強度を測定した(em:440nm、ex:355nm)。
ヒューマンサイエンス研究資源バンクから購入したヒト線維肉腫HT1080細胞を10%ウシ胎児血清(FBS)、100unit/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシンを含有するMinimum Essential Medium Eagle(MEM、Sigma社)で培養(5%CO2、37℃)した。
セルカルチャーインサート8.0ミクロンPETメンブレン(Falcon社)を24ウェルセルカルチャーインサート用プレート(Falcon社)に取り付け、250μg/mLのMATRIGEL PBS溶液(100μL/インサート)を分注し、37℃で4時間インキュベートした。その後、室温で乾燥させることによってコーティング処理を行った。
コーティング済セルカルチャーインサートを取り付けた24ウェルプレートの下層に10%のFBSを含有するMEMを、700μL/ウェル分注し、上層すなわちセルカルチャーインサート内に無血清MEMに懸濁したHT1080細胞1.0×105 細胞/ウェル(100μL/ウェル)を播種し、被験物質を添加した。24時間培養後、下層に浸潤したHT1080細胞を回収し、FBSおよびフェノールレッドを含有しないMEMに懸濁し、96ウェルブラックプレート(NUNC社)に播種した。4時間培養後、calcein-AM(3',6'−ジ(O-アセチル)-2',7'-ビス[N,N-ビス(カルボキシメチル)アミノメチル]フルオレセイン tert-アセトメチルエステル;製品名Cell counting kit-F、Dojindo社)のPBS溶液を添加し, 室温で30分間攪拌しながら反応させた後、蛍光測定マイクロプレートリーダー(FLUOstar OPTIMA,BMG Labtechnologies社)にて蛍光強度(励起波長;485nm,測定波長;520nm)を測定した。
なお、被験物質は、DMSOに溶解し、培地に添加した(DMSOの終濃度0.1%)。
96ウェルマイクロプレートに100unit/mLの5%FBS、100unit/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシンを含有するRPMI培地(製品名RPMI-1640、Sigma社)に懸濁したRAW264.7細胞(製品名RAW264.7、HSRRB社)を5.0×105細胞(100μL培地/ウェル)ずつ播種し、1時間前培養(5%CO2、37℃)し、PBSで非接着性細胞を洗浄除去した後に、被験物質および10μg/mLのLPS(Salmonella Enteritidis由来、Sigma社)を含む培地(200μL/ウェル)で20時間培養した。培地上清中に蓄積したNO2 -をGriess法により定量しNO産生量とした。すなわち、培地上清に同量のGriess試薬を加えて混和し、10分間室温で放置した後、マイクロプレートリーダーにて吸光度(測定波長:570nm、参照波長:655nm)を測定し、培地で希釈したNaNO2をスタンダードとして培地上清に蓄積したNO2 -を定量した。なお、被験物質は、DMSOに溶解し、培地に添加した(DMSOの終濃度0.5%)。
Inagakiらの方法を改変して行った。ddY系雄性マウス(4週令)の両耳介にPBSで50倍に希釈した抗DNP-IgE抗体(終濃度20μg/mL;製品名Monoclonal Anti-Dinitrophenyl, Clone SPE-7、Sigma社)を10μLずつ皮内投与して感作を行った。その際、未刺激コントロール(PBS)群は両耳介にPBSを10μLずつ皮内投与した。47時間後に被験物質を経口投与し、さらにその3時間後に0.25mgのDNP-BSAと2.0%のEvans blue(wako社)をPBSに溶解した溶液を尾静脈より0.25mL投与してPCA反応を惹起させた。30分後に頸椎脱臼により致死させ、一匹のマウスから得られた耳介一対を10mLの共栓試験管にとり、1MのKOH溶液500μLを加えて37℃で一晩放置し溶解させた。これにアセトンと0.2Mのリン酸混液(体積比13:5)を4.5mL加えて振とうし、2分ほど放置後、上清4mLを別の試験管に移し取り遠心分離(4000rpm、10分間)した。得られた上清3mLをさらに別の試験管に移し取り、吸光度を620nmで測定し、抑制率を次の式により求めた。
基質として100μLのトリオレイン溶液[トリオレイン80mg、ホスファチジルコリン10mg、タウロコール酸5mgに0.1Mトリス緩衝液(0.1MのNaClを含む、pH7.0)を9mL加え、10分間超音波処理を行った溶液]に被験サンプル溶液を5μL加え、トリス緩衝液(pH7.0)を95μL加え、全量を200μLとした。37℃で3分間予備加温したのち、0.25mg/mLのブタ膵臓由来リパーゼ(製品名Lipase、Sigma社)溶液を50μL加えて30分間反応させ、その後2分間沸騰水浴(90〜100℃)に入れて反応を停止させた。別に、各サンプルにつきリパーゼ溶液に代えてトリス緩衝液を50μL加え、同様の操作を行ったものを盲験として調製した。生成したFFAの量をNEFA Cキット法(NEFA C-テストワコー)により測定した。
リパーゼはトリス緩衝液に溶解し,本実験条件下で約0.7meq/L のFFAが生成する濃度に調整した。被験サンプルはDMSOを用いて溶解し、希釈した。比較対照薬としてオルリスタット(製品名Xenical(登録商標)、ロシュ社)を用いた。
ヘンナの花部のメタノールまたは水抽出物の製造
インド産ヘンナの花部2.0kgを100%メタノール10Lで抽出し、メタノール抽出物636.52gを得た。また、ヘンナの花部1.0kgを5Lの水で抽出し、水抽出物362.51gを得た。
得られた抽出物について活性試験を行った。なお、以下の実施例で用いた抽出物には、抽出液を一度乾燥させることにより得られたドライエキスを用いた。
メラニン生成抑制試験(美白作用)
実施例1で得られた抽出物を用いて、B16 melanoma 4A5細胞におけるメラニン生成抑制試験を行った。その結果を以下の表1に示す。
ヒアルロニダーゼ阻害試験(保湿、皮膚の乾燥、ハリおよび弾力性の低下、ならびに皺の形成抑制)
実施例1で得られた抽出物を用いて、ヒアルロニダーゼ試験を行った。その結果を以下の表3に示す。
DPP-4阻害試験(抗糖尿病治療作用)
実施例1で得られた抽出物を用いて、DPP-4阻害試験を行った。その結果を以下の表4に示す。
AGEs生成抑制作用(老化防止)
実施例1で得られた抽出物を用いて、AGEs生成阻害試験を行った。その結果を以下の表5に示す。
このことから、ヘンナの花部のメタノール抽出物および水抽出物は、AGEsの生成を強力に抑制することにより、様々な生体内老化現象を抑えることが期待される。
癌細胞浸潤抑制作用 (癌転移抑制作用)
実施例1で得られた抽出物を用いて、癌細胞HT1080の癌浸潤抑制試験を行った。その結果を以下の表6に示す。
NO産生抑制作用 (抗炎症作用)
実施例1で得られた抽出物を用いて、RAW細胞におけるNO産生抑制試験を行った。その結果を以下の表4に示す。
また、天然植物であるという観点からも、安全かつ安定した供給を伴った有効な抗炎症剤となると考えられる。
アレルギー反応抑制作用 (耳介PCA試験)
実施例1で得られた抽出物を用いて、マウス耳介を用い、PCA反応抑制試験を行った。その結果を以下に示す。なお、数値は健常群を100とした時の数値を表わし、コントロール群に対する有意差を検定した。結果を以下の表8に示す。
脂質吸収抑制作用 (リパーゼ阻害試験)
実施例1で得られた抽出物を用いて、膵リパーゼ阻害試験を行った。その結果を以下の表9に示す。
美白用化粧水の調製
以下の処方:
美白用乳液の調製
以下の処方:
美白用クリームの調製
以下の処方:
美白用エッセンスの調製
以下の処方:
美白用パックの調製
以下の処方:
クレンジングクリームの調製
以下の処方:
洗顔料の調製
以下の処方:
化粧用下地の調製
以下の処方:
日焼け止めクリームの調製
以下の処方:
ファンデーションの調製
以下の処方:
ボディーシャンプーの調製
以下の処方:
ボディローションの調製
以下の処方:
全身用日焼け止め乳液
以下の処方:
シャンプーの調製
以下の処方:
トリートメントの調製
以下の処方:
頭髪用ローションの調製
以下の処方:
頭髪用パックの調製
以下の処方:
ハンドクリームの調製
以下の処方:
リップクリームの調製
以下の処方:
入浴剤の調製
以下の処方:
米粉50重量部、砂糖5重量部、全卵10重量部、実施例1で得られたヘンナの花部の水抽出物1重量部を秤量した。
全卵に砂糖を混合した後、予め篩に通した米粉を加え、軽く混ぜ合わせて生地を作り、これを適当な形に成形し、オーブンで焼き上げて、せんべいを作った。
小麦粉100重量部、塩4重量部、実施例1で得られたヘンナの花部の水抽出物5重量部および水45重量部を秤量し、常法に従ってこれらをよく混合して、うどんを製造した。
Claims (8)
- ヘンナの花部を乾燥するかまたはせずして抽出対象物を作製し、カットされたかまたはされていない前記抽出対象物を水または水性アルコールで抽出し、得られる抽出液を濃縮し、ヘンナの花部抽出物を得ることを特徴とするヘンナの花部抽出物の取得方法。
- 請求項1に記載の方法により得られるヘンナの花部抽出物。
- 請求項2に記載の抽出物を有効成分として含有する医薬組成物。
- メラニン生成抑制作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用、DPP-4阻害作用、AGEs生成抑制作用、癌細胞浸潤抑制作用、NO生産抑制作用、アレルギー反応抑制作用および脂質吸収抑制作用からなる群より選択される少なくとも1つの作用を有する請求項3に記載の組成物。
- 請求項2に記載の抽出物または請求項3もしくは4に記載の組成物を含む化粧品。
- メラニン生成抑制作用を有する請求項5に記載の化粧品。
- ヒアルロニダーゼ阻害作用を有する請求項5に記載の化粧品。
- 請求項2に記載の抽出物または請求項3もしくは4に記載の組成物を含む健康食品。
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JP2020156403A (ja) * | 2019-03-27 | 2020-10-01 | 三栄源エフ・エフ・アイ株式会社 | 飲食品の香味又は風味の劣化抑制用組成物及び劣化抑制方法 |
JP7282560B2 (ja) | 2019-03-27 | 2023-05-29 | 三栄源エフ・エフ・アイ株式会社 | 飲食品の香味又は風味の劣化抑制用組成物及び劣化抑制方法 |
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