JP2013027395A - 改善されたファージ耐性をもつ培養物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】1つまたはそれ以上のcas遺伝子或いはタンパク質を用いる組成物および方法。菌株の組み合わせ、およびスターター培養物のローテーションの開発および利用に役立つ方法および組成物。バクテリアを標識化および/または同定する方法。細胞に対するファージの潜在的な毒性を決定するためにCRISPR遺伝子座を利用、およびファージの遺伝子配列を調節して毒性レベルを増加させるためにCRISPR−casを利用する方法。生物的防除剤としてファージを開発および利用する手段および組成物。
【選択図】なし
Description
ストレプトコッカス・サーモフィルス菌株DGCC7710−RH1のCRISPR1配列(5’−3’)
本明細書において別に定義されなければ、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されることを実施するのに、本明細書に記載されるのと同様または等価な任意の方法および材料が役立つとは言え、例となる方法および物質は、本明細書に記載される。本明細書では、文脈に明らかに別の指示がなければ、単数用語「a(1つの)」「an(1つの)」「the(前記、該)」は、複数の参照を含む。別の指示がなければ、核酸は、5’から3’方向に左から右に書かれる;アミノ酸配列は、それぞれ、アミノからカルボキシ方向に左から右に書かれる。当然のことながら、記載される特定の方法論、プロトコル、および薬剤は、当業者がそれらを用いる状況によって変化しうるので、本発明は、これらには限定されない。
CRISPR(規則的なスペースをもつ、クラスター化した短いパリンドローム様リピート)は、SPIDR(スペーサーが散在したディレクトリピート:SPacer Interspersed Direct Repeats)としても知られており、最近記載されたように、典型的に特定のバクテリア種に固有のDNA遺伝子座のファミリーを構成する。CRISPR遺伝子座は、大腸菌で最初に認められた散在する短い配列リピート(SSR:short sequence repeat)の異なった種類である(イシノ(Ishino)ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー 169:5429−5433[1987];およびナカタ(Nakata)ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー 171:3553−3556[1989])。同様の散在SSRは、ハロフェラックス・メディテラネイ、化膿性連鎖球菌、アナベナ属、および結核菌で同定されている(グレーネン(Groenen)ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー 10:1057−1065[1993];ホー(Hoe)ら、イマージング・インフェクシャス・ディジーズ(Emerg.Infect.Dis.)5:254−263[1999];マセポール(Masepohl)ら、バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ(Biochim.Biophys.Acta)1307:26−30[1996];およびモジカら、モレキュラー・マイクロバイオロジー 17:85−93[1995]を参照)。CRISPR遺伝子座は、他のSSRとリピートの構造が異なっており、これは、短い規則的にスペースのあるリピート(SRSR:short regularly spaced repeat)と呼ばれてきた(ジャンセンら、オーミクス・ジャーナル・オブ・インテグライティブ・バイオロジー(OMICS J.Integ.Biol.)6:23−33[2002];およびモジカら、モレキュラー・マイクロバイオロジー 36:244−246[2000])。このリピートは,短いエレメントがクラスター状に生じたもので、一定の長さをもつユニークな介在配列がこれらの間に常に規則的なスペースを成している(モジカら、[2000]、上記を参照)。リピート配列は、菌株間で高度に保存されるが、散在するリピートの数、およびスペーサー領域の配列は菌株毎に異なっている(ファン・エムデン(van Embden)ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー 182:2393−2401[2000])。
本明細書では、「CRISPRスペーサー」は、CRISPR遺伝子座の複数の短い直接リピート(すなわち、CRISPRリピート)の間に見出される非反復のスペーサー配列を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、「CRISPRスペーサー」は、2つのCRISPRリピートが隣接する核酸セグメントを指す。CRISPRスペーサー配列は、しばしば様々な可動性のDNA分子(例えば、バクテリオファージおよびプラスミド)に対して著しい類似性をもつことが見出されている。いくつかの好ましい実施形態において、CRISPRスペーサーは、2つの同一のCRISPRリピートの間に位置する。いくつかの実施形態において、CRISPRスペーサーは、2つのCRISPRリピートの間に位置するDNA伸長鎖における配列解析によって同定される。いくつかの好ましい実施形態において、CRISPRスペーサーは、2つの同一の短いパリンドローム様の多重直接リピートの間に自然に存在する。
微生物種のうちの特定のCRISPRタイプに対して、CRISPRスペーサーのサイズは変化しうるが、典型的に予め確定した長さを示す。これまでに記載されたCRISPRタイプは、主に約20bpおよび約58bpの間のスペーサー長を含むことが見出されている。
本明細書では、用語「偽CRISPRスペーサー」は、生物(例えば、バクテリオファージを含むがそれには限定されない、ドナー生物)に存在し、好ましくは機能、および/または生存、および/または複製、および/または感染性などに好ましくは必須で、CRISPRスペーサー配列を備える核酸配列を指す。いくつかの実施形態において、偽CRISPRスペーサーは、偽CRISPRスペーサーに対して相補的か、または相同的なCRISPRスペーサー配列を産生するのに役立つ。いくつかの特に好ましい実施形態において、これらの配列は、耐性を調節するのに役立つ。
本明細書では、用語「cas遺伝子」は、当分野で用いられる従来の意味をもち、隣接するCRISPR遺伝子座に一般に連結された、結合された、近接する、或いは近傍にある1つまたはそれ以上のcas遺伝子を指す。Casタンパク質ファミリーの包括的なレビューは、ハフト(Haft)らによって示されており(ハフトら、PLoSコンピュテーショナル・バイオロジー(PLoS Comput.Biol.)1(6):e60[2005])、これまでに知られた4つの遺伝子ファミリーに加えて、新たに認められた41のCRISPRに結合した(cas)遺伝子ファミリーがそこに記載されている。そこに示されるように、異なった反復パターン、遺伝子のセット、および種の範囲をもつCRISPRシステムは、異なったクラスに属する。本明細書に示されるように、所与のCRISPR遺伝子座におけるcas遺伝子の数は、種の間で変化し得る。
本明細書では、用語「バクテリオファージ」(または「ファージ」)は、当分野で理解される従来(すなわち、1つまたはそれ以上のバクテリア種に選択的に感染するウイルス)の意味をもつ。多くのバクテリオファージは、バクテリアの特定の属または種ないし菌株に対して特異性がある。いくつかの好ましい実施形態において、ファージは、親バクテリアおよび/または宿主細胞に感染することができる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、親バクテリアに対して毒性をもつ。いくつかの実施形態において、ファージは溶菌性であり、一方で他の実施形態において、ファージは溶原性である。
[重複配列−タグ付け配列]n、但しn=2,3,4,5,6またはそれ以上。好ましくは、複数のペアの構成は、典型的に以下を備える:
[CRISPRリピート−タグ付け配列]n、但しn=2,3,4,5,6またはそれ以上。いくつかの実施形態において、複数のペアの構成は、以下の通りである:
5’−[重複配列−タグ付け配列]n−3’、但しn=2,3,4,5,6またはそれ以上。好ましくは、複数のペアの構成は、以下の通りである:
5’−[CRISPRリピート−タグ付け配列]n−3’、但しn=2,3,4,5,6またはそれ以上。
(1)バクテリオファージ非感受性変異体の1つまたはそれ以上のCRISPR遺伝子座におけるタグ付け配列の位置。本明細書に記載されるように、タグ付け配列は、標識化されたバクテリアのCRISPR遺伝子座の一方および/または両方の末端(例えば、5’および/または3’末端、より好ましくは、5’末端)に典型的に位置する。
(2)タグ付け配列は、親バクテリアがそれに対して暴露されるバクテリオファージゲノムにおける配列に対して、高い度合の相同性または同一性(例えば、100%の同一性)をもつ;および/または
(3)タグ付け配列は、親バクテリアのゲノムから複製された少なくとも1つの配列(例えば、CRISPRリピート)に、融合、連結または付着する(例えば、直接に融合、連結または付着する)。典型的に、本明細書に記載されるように、この付加的な配列ペアは、標識化されたバクテリアのCRISPR遺伝子座の一方および/または両方の末端(例えば、5’および/または3’末端、好ましくは、5末端)に位置する。
本明細書では、「標識化されたバクテリア(複数)」および「標識化されたバクテリア(単数)」は、1つまたはそれ以上のCRISPR遺伝子座、或いはその一部分が、それが暴露された1つまたはそれ以上のバクテリオファージに対して非感受性であるように改変された(例えば、変異した)、親バクテリア(単数)、親バクテリア(複数)、または親バクテリア菌株を指す。本明細書にさらに詳細に記載されるように、いくつかの実施形態において、標識化されたバクテリアは、1つより多いバクテリオファージに(例えば、反復して、順次また同時に)暴露されることであって、暴露されたバクテリオファージの各々に対して非感受性になる仕方で1つまたはそれ以上のCRISPR遺伝子座内に1つまたはそれ以上のゲノムの改変を蓄積するように暴露される。
本明細書のいくつかの実施形態に用いられるように、用語「ドナー生物」は、CRISPRリピート、および/またはcas遺伝子、および/またはそれらの組み合わせ(単数または複数)、および/またはCRISPRスペーサーがそれに由来する生物または細胞を指す。これらは、同じあっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、用語「ドナー生物」は、1つまたはそれ以上の、好ましくは、2つまたはそれ以上のCRISPRリピート、および/または1つまたはそれ以上のcas遺伝子、および/またはそれらの組み合わせ(単数または複数)、および/またはCRISPRスペーサーがそれに由来する生物または細胞を指す。これらは、同じあっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、CRISPRスペーサー、および/または偽CRISPRスペーサーは、合成起源である。またさらなる実施形態において、ドナー生物または細胞は、標的核酸またはその転写産物に対する免疫の特異性を授ける1つまたはそれ以上のCRISPRスペーサーを備える。付加的な実施形態において、cas遺伝子、および/またはCRISPRリピート、および/またはそれらの組み合わせがそれに由来するドナー生物または細胞は、組換えCRISPR遺伝子座のための受容細胞/生物でもある。これらは、同じであっても異なっていてもよい。他の実施形態において、CRISPRスペーサーがそれに由来するドナー生物または細胞は、組換えCRISPR遺伝子座のための受容細胞/生物でもある。これらは、同じであっても異なっていてもよい。ドナー生物がバクテリア細胞である実施形態では、ドナー生物は、標的核酸またはその転写産物に対する特異免疫を授けるCRISPRスペーサーを典型的に備える。いくつかの実施形態において、該生物はバクテリア細胞であり、一方で他の実施形態において、それはバクテリオファージである。
本明細書では、用語「宿主細胞」は、本明細書による組み合わせ、コンストラクトまたはベクターなどを備える任意の細胞を指す。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ベクター(例えば、クローニング・ベクター)に含まれるヌクレオチド配列により形質転換または形質移入される。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列を複製および/または発現するためにベクターが担うことができる。該細胞は、ベクターと適合するように、いくつかの実施形態において、原核生物(例えば、バクテリア)細胞が選ばれる。
本明細書では、用語「受容細胞」は、標的核酸またはその転写産物に対する耐性が、そのなかで調節されるか、または調節されるべき任意の細胞を指す。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本発明による組換え核酸を備える任意の細胞を指す。いくつかの実施形態において、受容細胞は、1つまたはそれ以上の、好ましくは、2つまたはそれ以上のCRISPRリピート、および1つまたはそれ以上のcas遺伝子或いはタンパク質を備える。適切には、CRISPRリピートおよびcas遺伝子またはタンパク質は、本明細書に記載されるように、受容細胞において機能的な組み合わせを成す。いくつかのさらなる実施形態において、宿主細胞は、1つまたはそれ以上の改変されたCRISPRリピート、および/または1つまたはそれ以上の改変されたcas遺伝子或いはタンパク質を備える。適切には、改変されたCRISPRリピート、および/または改変されたcas遺伝子またはタンパク質は、本明細書に記載されるように、受容細胞において機能的な組み合わせを成す。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、1つまたはそれ以上の遺伝子操作されたCRISPRリピート、および/または1つまたはそれ以上の遺伝子操作されたcas遺伝子或いはタンパク質を備える。適切には、遺伝子操作されたCRISPRリピート、および/または遺伝子操作されたcas遺伝子またはタンパク質は、本明細書に記載されるように、受容細胞における機能的な組み合わせを成す。いくつかの代わりの実施形態において、受容細胞は、1つまたはそれ以上の組換えCRISPRリピート、および/または1つまたはそれ以上の組換えcas遺伝子或いはタンパク質を備える。適切には、本明細書に記載されるように、組換えCRISPRリピート、および/または組換えcas遺伝子或いはタンパク質は、受容細胞において機能的な組み合わせを成す。さらに付加的な実施形態において、受容細胞は、1つまたはそれ以上の自然発生のCRISPRリピート、および1つまたはそれ以上の自然発生のcas遺伝子或いはタンパク質を備える。適切には、CRISPRリピート(単数または複数)、およびcas遺伝子(単数または複数)またはタンパク質は、機能的な組み合わせを成す。
本明細書では、用語「親バクテリア(単数)」、「親バクテリア(複数)」および「親菌株」は、1つまたはそれ以上のバクテリオファージ(単数または複数)に暴露される任意のバクテリア(単数)/バクテリア(複数)/菌株を指す。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、親バクテリア菌株に対して毒性があり、一方で他の実施形態において、それらは非毒性である。いくつかの特に好ましい実施形態において、親バクテリアは、毒性ファージに対して感受性をもつ。いくつかの好ましい実施形態において、親菌株は、バクテリオファージに感染する。いくつかの特に好ましい実施形態において、ファージによる感染は、親バクテリア(単数)/バクテリア(複数)/菌株またはそれらの亜集団をバクテリオファージによるさらなる感染に対して非感受性にする。いくつかの好ましい実施形態において、1つまたはそれ以上のバクテリオファージによる「親バクテリア」の感染は、その結果としてバクテリオファージに対する非感受性に基づいて選択され得る標識化された菌株をつくり出す。いくつかの好ましい実施形態において、「バクテリオファージ耐性変異体」は、本発明の方法に従ってタグ付けまたは標識化されたバクテリアである。いくつかの実施形態において、親バクテリアは、野生型バクテリア菌株である。いくつかの好ましい実施形態において、親バクテリアは、これまでにいかなるバクテリオファージにも感染しなかったバクテリアの野生型菌株である。いくつかの好ましい実施形態において、親バクテリアは、これまでにタグ付けまたは標識化されなかったバクテリアの野生型菌株であり、一方でいくつかの代わりの実施形態において、親バクテリアは、これまでにタグ付けまたは標識化されたバクテリオファージ耐性変異体である。
スターター培養物は、食品産業において乳製品(例えば、ヨーグルトおよびチーズ)、並びに肉製品、パン製品、ワインおよび野菜製品を含む発酵製品の製造に広範囲に用いられる。
本発明に用いるのに特に適したスターター培養物、特に乾燥スターター培養物は、乳酸菌を備える。
本発明に用いるのに適した製品は、限定されることなしに、食料品、化粧品または医薬品を含む。培養物から調製される、または培養物を備える任意の製品が、本発明に従って考えられる。これらは、限定されることなしに、果物、マメ科植物、飼料農作物、および派生製品を含む野菜、穀物および穀物派生製品、酪農食品および酪農食品の派生製品、食用肉、鶏肉、シーフード、化粧品および医薬品を含む。
本発明の開発の間に、CRISPR−cas遺伝子が関与するファージ耐性、並びに外来DNAへの耐性におけるそれらの役割、さらにCRISPR内に挿入されたスペーサーがこの耐性の特異性に果たす役割について解明された。重要なことに、本発明は、ファージ耐性菌株、およびスターター培養物を開発する方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、親菌株「A」は、ファージ「P」に暴露されて、ファージ耐性変異株(変異株「A1.0」)が選択される。CRISPR遺伝子座内に付加的に挿入されたスペーサーの存在を確認するために、変異株A1.0が、(例えばPCR、および/またはDNA配列決定によって)解析される。付加的なスペーサー(スペーサーSp1.0)のヌクレオチド配列が次に決定される。典型的に、スペーサーSp1.0は、ファージP由来のおよそ30ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、ファージPおよび関連ファージに対する耐性を与える(「関連ファージ」は、それらのゲノムに該スペーサー配列を含み、ファージ科を規定する)。
特異免疫を授けるのにCRISPRまたはCRISPRスペーサーが関与しうることを仮定する先行技術の教えとは対照的に、本発明は、標的核酸またはその転写産物に対する免疫にはcas遺伝子またはタンパク質が必要という驚くべき知見に、部分的には基づいている。しかしながら、本発明は、いかなる特定のメカニズム、機能、または実行手段にも限定される意図をもたない。
本発明のさらなる様態において、標識化されたバクテリアを同定(例えば、分類)する方法が提供されている。
本明細書に詳述されるように、CRISPRは、原核生物に侵入する核酸に対する耐性を提供することが示されている。特に、ウイルスのDNA(例えば、バクテリオファージの核酸)に対して相同性を示すCRISPRスペーサーは、少なくとも1つのスペーサー配列と配列の同一性を共有するウイルスに対する耐性を提供することが示された。しかしながら、現時点でCRISPR遺伝子座を含まない細胞に、cas遺伝子および/またはタンパク質を、スペーサー、リピート、リーダーおよびトレーラーと一緒に含ませたCRISPRシステムが、核酸に対する耐性を新規に提供するのに役立つであろうことも考えられる。実際、いくつかの実施形態において、かかる操作は、限定されることなしに、ヒト、他の動物、真菌などを含む様々な真核生物に役立つ。CRISPRシステムを、限定されることなしに、プラスミドを介する形質転換を含めて、当分野で知られる任意の適切な方法を利用して真核細胞に導入することが考えられる。これらの実施形態において、CRISPR遺伝子座、並びに必要な転写/翻訳シグナルが、すべて真核細胞においてその配列が発現かつ機能するようにプラスミドDNAに含められる。
本発明の開発の間に、ファージ耐性変異体の自然生成の間にCRISPR遺伝子座が変化するかどうか決定するために実験が行なわれた。乳業で広く用いられる、ファージ感受性の野生型S.サーモフィルス菌株DGCC7710(WT)、および工業用ヨーグルト試料から単離された、異なるがしかし密接に関連した2つの毒性バクテリオファージ、すなわち、ファージ858およびファージ2972(レベスク(Levesque)ら、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー 71:4057[2005])からなるファージ−宿主モデルシステムが選択された。ファージ858、ファージ2972、または同時に両方をWT菌株にチャレンジすることによって、9つのファージ耐性変異体が独立に生み出され、それらのCRISPR遺伝子座が解析された。CRISPR遺伝子座には一貫して違いが観測され、WT菌株に存在する32のスペーサーの隣に、1から4の付加的なスペーサーが挿入されていた(図9を参照)。ファージ感染に反応しての新しいスペーサーの付加は、CRISPR遺伝子座の一方の末端に向かって極性をもつように思われた。これは、様々な菌株におけるCRISPR遺伝子座のリーダー末端におけるスペーサーの超可変性に関するこれまでの観測とつじつまが合う(例えば、プールセルら、マイクロバイオロジー 151:653[2005];およびリレストル(Lillestol)ら、アーキア 2:59[2006]を参照)。様々なファージ耐性変異体のCRISPR遺伝子座に挿入された付加的なスペーサーの配列解析は、チャレンジに用いたファージゲノム内に見出される配列に対する類似性を明らかにした。類似性は、ファージゲノムの至るところ、ほとんどの機能モジュールのコードおよび非コード鎖上の両方に観測された。いかなる特定の配列、遺伝子または官能基も特異的に標的にされているように思われなかった。これらの結果は、バクテリオファージ耐性をもった時点で、CRISPR遺伝子座が、ファージDNAに由来すると思われる新規のスペーサーの組込みによって改変されたことを示唆する。しかしながら、本発明は、任意の特定のメカニズムに限定される意図を持たない。
本発明は、生物的防除剤としてファージを開発する方法および組成物も提供する。本明細書に示されるように、バクテリアは、活性なCRISPR遺伝子座にファージ由来の配列(スペーサー)を取り込むことによって、ファージ攻撃に対して耐性になることができる。ファージは、所与のCas−CRISPRシステムに対応する、スペーサーまたはCRISPRモチーフ認識配列に対応するゲノム配列の変異によって、この耐性をエスケープすることができる。宿主菌株のCRISPR介在ファージ耐性誘導体をつくり出すためのファージ・チャレンジ、およびファージ・エスケープ変異体の単離の反復ラウンドを通じて、本発明は、CRISPR標的配列、および/またはスペーサー挿入を方向づける想定CRISPR認識部位内が変化したファージを提供する。さらにまた、本発明は、所与のCas−CRISPRシステムに対するCRISPRモチーフ配列が削除されるように、合成的に設計されたファージを提供する。これらの「変化した」ファージは、カクテルとして、または「順次ローテ―ションの仕組み」で適用され、標的バクテリアが、CRISPRシステムを介して耐性に適応する能力を低減させる。実際、本発明は、生物的防除剤として用いるための毒性ファージの多様な一組を提供する。特に好ましい実施形態において、この多様性は、ファージ攻撃に対抗して(CRISPRを介して)急速に進化する、宿主生物の能力を著しく低減または喪失させるために、CRISPR指向のファージ耐性メカニズムが目標とされる。多様なファージの管理は、カクテルとして、または順次ローテ―ションの仕組みのいずれにしろ、宿主生物が、CRISPR指向のファージ耐性に適応するか、またはそれを発達させる可能性をさらに低減させる。
次の実施例は、本発明のいくつかの好ましい実施形態、および様態を実証し、さらに例示するために提供されるもので、その範囲を限定すると解釈すべきではない。
この実施例では、ファージに特異的なスペーサーを操作するために行なわれた実験が記載される。いくつかの実験では、対応するファージに対する耐性を提供するために、ファージに特異的なスペーサーが、機能している既存のCRISPRに挿入されたことが記載される。用いられたバクテリア菌株はストレプトコッカス・サーモフィルスST0089、ファージはファージ2972であった。S.サーモフィルスST0089は、ヨーグルトの製造に用いられる工業的に重要な菌株である。この菌株は、遺伝的な操作が容易で、よく知られる毒性ファージ2972に感染されやすい。
これらの実験では、CRISPR遺伝子座へのCRISPRスペーサーの組込みが、該CRISPRスペーサーがそれに対して同一性を示すバクテリオファージに対する耐性を提供することが示された。これらの実験では、S.サーモフィルス菌株DGCC7710RH1がつくられた。
−DGCC7710の第28スペーサーは菌株CNRZ1575(Genbank受入番号DQ072991)の第31CRISPR1スペーサーと100%同一である;
−DGCC7710の第30スペーサーは菌株CNRZ703(Genbank受入番号DQ072990)の第27CRISPR1スペーサーと100%同一である;
−DGCC7710の第31スペーサーは菌株CNRZ703(Genbank受入番号DQ072990)の第28CRISPR1スペーサーと100%同一である;
−DGCC7710の第32スペーサーは菌株CNRZ703(Genbank受入番号DQ072990)の第30CRISPR1スペーサーと100%同一である。
5’caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgag 3’(配列番号:688)
(GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtcaacaattgcaacatcttataacccactt;配列番号:689)は大文字で、CRISPRスペーサー(すなわち、タグ付け配列)は小文字でされ;両方とも上に灰色で示されている。CRISPRリピートの末端リピートおよびトレーラー配列は、以下に示される:
末端リピート:5’gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt3’(配列番号:3)
トレーラー配列:5’ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt(配列番号:691)
5’−caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgag−3’(配列番号:688)。
(GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACttacgtttgaaaagaatatcaaatcaatga;配列番号:694)。CRISPRリピートの末端リピートおよびトレーラー配列が、以下に示される:
末端リピート:5’−gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt−3’(配列番号:3)
トレーラー配列:5’−ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt−3’(配列番号:691)。
(30ヌクレオチドにわたって、D858のゲノム配列に対して100%の同一性をもつ):
この実施例では、コンストラクトの組込み、およびノックアウトに用いる方法が記載される。
S.サーモフィルスDGCC7710親菌株、ファージ858および2972に感受性がある
S.サーモフィルスDGCC7778 CRISPR変異体、858に耐性がある
S.サーモフィルスDGCC7778cas1KO
S.サーモフィルスDGCC7778cas4KO
S.サーモフィルスDGCC7778RT
S.サーモフィルスDGCC7778RT’
S.サーモフィルスDGCC7710R2 CRISPR変異体、2972に耐性がある
S.サーモフィルスDGCC7710R2S1S2
大腸菌EC1,000が提供するpOR128(Russell and Klaenhammer,Appl.Environ.Microbiol.,67:43691−4364[2001]を参照)
大腸菌pCR2.1TOPOが提供するpTOPO(インビトロジェン(Invitrogen)カタログ#K4500−01を参照)
pTOPO、様々なコンストラクトのサブクローニングに用いられるプラスミド
pTOPOcas1koは、cas1の不可欠なフラグメントを含む
pTOPOcas4koは、cas4の不可欠なフラグメントを含む
pTOPOS1S2は、S1S2スペーサーコンストラクトを含む
pTOPO RTは、RT末端リピートコンストラクトを含む
pORI28は、S.サーモフィルス菌株の染色体に様々なコンストラクトを組込むために用いられるプラスミドである
pORIcas1koは、cas1の不可欠なフラグメントを含む
pORIcas4koは、cas4の不可欠なフラグメントを含む
pORIS1S2は、S1S2スペーサーコンストラクトを含む
puristは、RT末端リピートコンストラクトを含む
Cas1
5’−caaatggatagagaaacgc−3’(配列番号:670)、および5’−ctgataaggtgttcgttgtcc−3’(配列番号:671)
Cas4
5’−ggagcagatggaatacaagaaagg−3’(配列番号:672)、および5’−gagagactaggttgtctcagca−3’(配列番号:673)
S1S2およびRT
P1 5’−acaaacaacagagaagtatctcattg−3’tg−3フィート(配列番号:666)
P2 5’−aacgagtacactcactatttgtacg−3’(配列番号:667)
P3 5’−tccactcacgtacaaatagtgagtgtactcgtttttgtattctcaagatttaagtaactgtacagtttgattcaacataaaaag−3’(配列番号:668)
P4 5’−ctttccttcatcctcgctttggtt−3’(配列番号:669)
図4に示されるように操作されたコンストラクを用いて、図5に示されるように、コンストラクトがcas4のすぐ後に挿入された。親DGCC7778は、ファージ858に対して耐性をもつ。親は、ファージ858のDNAと同一の2つのスペーサー(S1およびD2)をもつ。結果として生じた菌株(RT)は、ファージ858に対する耐性を喪失した。この結果は、耐性を授けるためには、cas遺伝子がスペーサー(単数または複数)のごく近傍に存在する必要があることを示す。図3に示されるように、親DGCC7778は、cas1遺伝子が破壊されるように操作された結果、耐性が失われており、このことは耐性を授けるためにcas1が必要なことを意味する。図3に示されるように、親DGCC7778は、cas4遺伝子が破壊されるように操作された。加えて、図6〜8に示されるように、S1S2コンストラクトが親DGCC7710に組込まれた。
この実施例では、ファージ耐性変異体の単離およびCRISPR配列の確認に用いる方法が記載される。野生型宿主菌株DGCC7710(「RD534」とも呼ばれる)に、ファージ2972および/またはファージ858をチャレンジすることによってS.サーモフィルスのファージ耐性変異体が得られた(レベスクら、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー 71:4057[2005])。宿主菌株は、0.5%のラクトースを補充したM17ブロス(LM17)10ml中において42℃で成長させた。光学濃度(600nm)が0.3に達したとき、ファージおよび塩化カルシウム10mMをそれぞれの最終濃度が107pfu/mlおよび50mMとなるように加えた。ファージを含む培養物が42℃で24時間インキュベートされ、溶菌のモニターが行われた。次に、100μlの溶菌液が10mlの新鮮なLM17中に接種された。残った溶菌液は遠心分離されて、ペレットが10mlの新鮮なLM17を含んだまた別の試験管中に接種された。これら2つの培養物は、42℃で16時間インキュベートされた。最終的に、これらの培養物が希釈されて、LM17上で平板培養された。単離されたコロニーは、当分野で知られるようなファージ感受性のテストが行われた(モアノー(Moineau)ら、カナディアン・ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー(Can.J.Microbiol.)38:875[1992]を参照)。耐性をもつ分離株のCRISPR遺伝子座がPCR産物の配列決定によって、かつ当分野で知られる関連ファージゲノム情報を用いて検証された(レベスクら、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー 71:4057[2005]を参照)。
この実施例では、CRISPRスペーサーを操作するために、いくつかの実施形態で用いられる方法が記載される。制限酵素消化およびPCRを行うために用いる酵素は、インビトロジェンから購入されて製造者のインストラクションに従って用いられた。PCRは、当分野で知られる方法を用いて、Eppendorf Mastercycler Gradientサーモサイクラー上で行われた。
cas5の不活性化のために、cas5の801bpの内部小片が、プライマー5’−caaatggatagagaaacgc−3’(配列番号:670)および5’−ctgataaggtgttcgttgtcc−3’(配列番号:671)を用いてPCRによって増幅されて、大腸菌pCR2.1−TOPO(インビトロジェン)中にサブクローニングされた。このコンストラクトは、EcoRVおよびHindIIIで消化されて、次にEcoRVおよびHindIII部位でpORI中にクローニングされた。このコンストラクトのWTΦ858 +S1S2のcas5遺伝子への組込みは、遺伝子の該内部小片の相同組換えを通じて生じ、WTΦ858 +S1S2::pcas5−をもたらした。
この実施例では、バクテリア菌株のCRISPR遺伝子座への付加的な配列の挿入を自然に生じさせるのに用いる方法が記載される。本明細書で用いられる「付加的な配列」は、CRISPRリピート配列に結合したスペーサー配列として定義される。より詳しくは、「付加的な配列」は、部分的には標的バクテリアに感染することができるドナーファージに、かつ部分的にはCRISPRリピート配列の複製に起源がある。ドナーファージのDNAのバクテリア細胞への導入は、ドナーファージによる細胞の感染をもたらす。付加的な配列を含む細胞の選択は、選択された改変細胞がファージに対する耐性をもつように、ドナーファージによる選択圧を通じてなされる。
この実施例では、同じ親菌株からの、同じファージに由来する付加的な配列が異なった変異菌株の一組を選択するのに用いる方法が記載される。ドナーファージの様々な部分は、付加的な配列の供給源として役立つので、複数の異なった変異菌株を所与のドナーファージから生み出すことができる。その上、各々の変異菌株は、異なった付加的な配列をもつ。その結果として、実施例7に記載された変異菌株に加えて、同じ親菌株から複数の菌株が開発された。いくつかの実験では、これらの付加的な菌株は、受容菌株を同じドナーファージに暴露することによって生み出された。結果として生じた様々な変異菌株が、ファージ感受性の異なったスペクトルを提示することが考えられた。
この実施例では、CRISPR遺伝子座に第2の付加的な配列の挿入を引き起こすために用いる自然な方法が記載される。所与のドナーからの付加的な配列がバクテリアのCRISPR遺伝子座に挿入された時点で、変異株菌株は、このファージに対して耐性になるか、または少なくともより低感受性になる。それ故に、実施例7に記載される方法は、この変異菌株のCRISPR遺伝子座に付加的な配列を挿入するのにもはや能率的ではない。例えば、変異菌株WTphi2972 +S6は、D2972に対する感受性が著しく減少したため(実施例7を参照)、ドナーファージにD2972を用いて、この方法をWTphi2972 +S6(親菌株)に適用することはできない。
CRISPR遺伝子座に第2の付加的な配列を挿入するための自然な別法が記載される。所与の親菌株は、1つより多いファージ科に対して感受性をもち得ることが知られている。本明細書に記載されるように、変異菌株のCRISPR遺伝子座に付加的な配列を挿入するために、この感受性の多様性が有利に用いられた。これらの実験では、親菌株および変異菌株(単数または複数)に対する取り揃えたファージの毒性をテストすることによって、第2のドナーファージが選択された。注目すべき第2のドナーファージは、両方の菌株に対して毒性があった。これらのファージは、最初のドナーファージが代表するファージ科とは異なったファージ科を代表するであろうと考えられた。その選択に続いて、第2のドナーファージが変異菌株への感染に用いられた。上述の方法に記載されたように、第2世代ファージ耐性変異菌株が単離されて、CRISPR遺伝子座内の付加的な配列がテストされた。
すべてのファージに対する耐性を所与の菌株に授けるためには、CRISPR遺伝子座への2つのファージ配列の付加だけでは不十分なことから、この実施例では、ファージの配列をCRISPR遺伝子座に反復して付加することによる、複数ファージ耐性菌株の開発について記載される。例えば、(実施例10に記載された)菌株WTphi2972 +S4 phi858 +S18は、他の複数のファージに対して感受性をもつことが見出された。複数ファージ耐性菌株を開発するプロセスで、変異菌株を選択するために親菌株が第1のファージで処理され、次に該菌株が第2のファージで処理されて、両方のファージに対する耐性をもつ第2世代変異菌株が選択される。次に、最後の変異菌株は、入手可能なすべてのファージに対する耐性をもつ最終的な変異菌株が得られるまで、まだ感受性をもつファージで反復して処理された。
この実施例では、CRISPR遺伝子座に複数の付加的な配列を挿入するための方法が記載される。これらの方法では、様々なファージを反復して用いるのではなく、親菌株が、複数のファージを含んだ混合物に暴露された。一群のファージが、それらの宿主スペクトルを決定するために典型的な微生物学的方法を用いて複数の菌株に対してテストされた。親菌株に対して毒性をもつが、しかし異なった宿主スペクトラムを有するファージが選択された。変異菌株のCRISPR遺伝子座における付加的な配列の挿入を引き起こすために、選択されたファージが混合されて上述の方法に用いられた(実施例7を参照)。
この実施例では、親(すなわち、野生型、受容)菌株よりもしろ変異菌株の使用により、発酵においてファージと戦う方法が記載される。かくして、この実施例は、変異株によって提供される利益に関するさらに別の記載を示す。
この実施例では、単一の菌株を用いる代わりに、変異菌株の組み合わせの使用を通じて発酵においてファージと戦う方法が記載される。かくして、この実施例は、1つより多い変異菌株(すなわち、変異菌株の組み合わせ)の同時の使用について説明する。同じ機能性であるが、しかし異なったファージ感受性パターンを示す菌株の混合物がかかる応用に役立つ。例えば、本明細書に記載されるような2つ、または3つないしより多くの変異菌株がかかる応用に役立つ。それらのCRISPR遺伝子座に付加された異なったスペーサー配列をもつ変異菌株の組み合わせを用いることは、出現する任意の変異ファージに容易に耐える発酵を行うことを可能にする。
付加的な実験では、変異菌株がローテーションして用いられた。いくつかの実験では、菌株は、機能性は同じであるが、しかし異なったファージ感受性パターンを有した。かくして、この実施例では、いくつかの異なった菌株(すなわち、CRISPRが改変された変異菌株)をローテーションの仕組みで順次、反復して/続けて用いることに関して行われた実験が記載される。
この実施例では、ファージに対する耐性を与えられたCRISPR改変菌株が、該ファージを破壊する能力を決定するために行われた実験が記載される。CRISPR改変菌株による発酵の間に、ファージの個体数が検知できないレベルまで低減されるかどうか決定するように、特に実験のデザインがなされた。
この実施例では、S.サーモフィルスDGC7710に2つのスペーサーを挿入するために用いる方法および組成物が記載される。(フランスの「コレクション・ナショナル・ド・カルチャー・ド・ミクロオーガニズム(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)」に、番号CNCM1−2423のもとに寄託された)S.サーモフィルス菌株DGCC7710は、少なくとも3つのCRISPR遺伝子座:CRISPR1、CRISPR2およびCRISPR3を所有する。完全なゲノム配列が知られる菌株、CNRZ1066およびLMG18311(ボロティンら、[2004]、上記を参照)では、CRISPR1は、同じ染色体遺伝子座:str0660(またはstu0660)およびstr0661(またはstu0661)の間に位置する(図18を参照)。菌株DGCC7710では、CRISPR1は、同じ染色体遺伝子座におけるよく類似した遺伝子間に同様に位置する。菌株DGCC7710のCRISPR1は、(末端リピートを入れて)33リピート、従って32スペーサーを含む(図19を参照)。これらのスペーサーのすべては、互いと異なっている。これらのスペーサーの大部分は、CRISPR遺伝子座内にあるとして、これまで記載されていなかったが、しかしCRISPR1トレーラーに近い4スペーサーは、既知のCRISPR1スペーサーと同一である。例えば、DGCC7710の第28スペーサーは菌株CNRZ1575(Genbank受入番号DQ072991)の第31CRISPR1スペーサーと100%同一である;DGCC7710の第30スペーサーは菌株CNRZ703(Genbank受入番号DQ072990)の第27CRISPR1スペーサーと100%同一である;DGCC7710の第31スペーサーは菌株CNRZ703(Genbank受入番号DQ072990)の第28CRISPR1スペーサーと100%同一である;DGCC7710の第32スペーサーは菌株CNRZ703(Genbank受入番号DQ072990)の第30CRISPR1スペーサーと100%同一である。菌株DGCC7710のCRISPR1配列(5’〜3’)は、以下の配列番号:678に示される:
この実施例では、DGCC7710のタグ付けに用いる方法、および標識化された菌株DGCC7778の選択について記載される。約2.106cfu/mlの菌株DGCC7710、および約1.105pfu/mlのD858を低温殺菌乳に接種することによって、菌株DGCC7710がファージD858に感染/チャレンジされた。接種乳は、35℃で12時間培養された。インキュベーション後に、生菌(すなわち、バクテリオファージ非感受性突然変異体と思われるもの)が、感染培養物を然るべく希釈したものを用いて35℃の非選択培地(ミルク寒天平板)上で単離された。DGCC7778と名付けた1つの分離株が35℃のM17−グルコース液体培地で増殖されて、当分野で知られる典型的なDNA抽出プロトコルを用いてそのDNAが抽出された。
この実施例では、第2のタグ付け菌株をつくるために用いる方法が記載される。天然のファージ耐性変異体としてS.サーモフィルス菌株DGCC7710−RH1が、親菌株としてDGCC7710、毒性ファージとしてD858を用いて単離された。
この例では、第3のタグ付け菌株をつくるために用いる方法が記載される。天然のファージ耐性変異体としてS.サーモフィルス菌株DGCC7710−RH2が、親菌株としてS.サーモフィルス菌株DGCC7710、毒性ファージとしてD858を用いて単離された。S.サーモフィルス菌株DGCC7710−RH2のCRISPR1は、(末端リピートを入れて)34リピート、従って33スペーサーを含む。S.サーモフィルス菌株DGCC7710のCRISPR1配列と比較したとき、S.サーモフィルス菌株DGCC7710−RH2のCRISPR1配列は、CRISPR遺伝子座の一方の末端(すなわち、リーダーの近く、CRISPR遺伝子座の5’末端)に、1つの付加的なスペーサー(すなわち、タグ付け配列)(およびもちろん、新しいスペーサーに隣接する1つの付加的なリピート)を所有する。CRISPR1遺伝子座の他のすべてのスペーサーは、変化していない。
(GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACttacgtttgaaaagaatatcaaatcaatga;配列番号:694)は、灰白で示され、CRISPRリピート(大文字)、および小文字で示されたCRISPRスペーサー(すなわち、タグ付け配列)を含む。末端リピート(5’gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt(配列番号:3)、トレーラー配列:5’ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt3’(配列番号:691)が示される。
この実施例では、CRISPRエスケープ・ファージ構築のための方法が記載される。ファージ耐性宿主変異株が、上述の実施例に記載されるように最初に構築される。これらの実験では、親菌株「A」がファージ「P」に暴露されて、ファージ耐性変異株(変異株「A1.0」)が選択される。変異株A1.0は、CRISPR遺伝子座内に挿入された付加的なスペーサーの存在を確認するために、(例えば、PCRおよび/またはDNA塩基配列決定法によって)解析される。付加的なスペーサー(スペーサーSp1.0)のヌクレオチド配列が次に決定される。典型的に、スペーサーSp1.0は、ファージP由来のおよそ30ヌクレオチド・サイズのフラグメントであり、ファージPおよび関連ファージに対する耐性を与える(「関連ファージ」は、ゲノムに該スペーサーの配列を含むもので、ファージ科を規定する)。
この実施例では、第2レベルの(すなわち、複数のスペーサーに向けた複数の変異をもつ)CRISPRエスケープ・ファージを構築するための実験が記載される。
この実施例は、本発明に役立つ様々な機能的な組み合わせを提供する。単に例を示すものとして、本発明に従って、次の機能的な組み合わせを用いることができる。
cas配列:配列番号:461から配列番号:465まで、および配列番号:473から配列番号:477まで(これらすべてはS.サーモフィルス配列である)が以下に示される。
cas配列:配列番号:466から配列番号:472まで、および配列番号:478から配列番号:487まで(これらすべてはS.サーモフィルスの配列である)が以下に示される。
cas配列:配列番号:488から配列番号:508まで、および配列番号:517から配列番号:521までが、以下に示される。配列番号:488〜497はS.アガラクチアから、一方で配列番号:498〜503はS.ミュータンスから、および配列番号:504〜508、517〜521はS.ピオゲネスからである。
cas配列:配列番号:509から配列番号:516まで(これらすべてはS.ピオゲネスからである)が、以下に示される。
Claims (16)
- CRISPRエスケープ・ファージ変異体を生み出す方法であって、
(a)少なくとも1つの親ファージ、および少なくとも1つのCRISPR遺伝子座を備えるファージ耐性バクテリア菌株を得るステップであって、前記CRISPR遺伝子座は、前記少なくとも1つの親ファージのゲノムにおける少なくとも1つの原スペーサー配列に対して、少なくとも95%同一な核酸配列を備えることを特徴とするステップ;
(b)少なくとも1つのファージ変異株がつくられる条件下で、前記少なくとも1つの親ファージを前記ファージ耐性バクテリア菌株に暴露するステップ;および
(c)前記少なくとも1つのファージ変異株であって、前記ファージ耐性バクテリア菌株に感染する能力を示し、かつCRISPRエスケープ・ファージ変異体である前記少なくとも1つのファージ変異株を選択するステップ
を備える方法。 - 前記ファージ耐性バクテリア菌株は、
(a)改変されたCRISPR遺伝子座を備える少なくとも1つのバクテリオファージ耐性変異菌株を備えるバクテリアの混合物をつくるために、CRISPR遺伝子座の少なくとも一部分を備える親バクテリア株を、少なくとも1つの核酸配列に暴露するステップ;
(b)バクテリアの前記混合物から前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ;
(c)前記親バクテリア菌株の前記CRISPR遺伝子座にはない少なくとも1つの付加的な核酸フラグメントを前記改変されたCRISPR遺伝子座に備えるバクテリオファージ耐性変異株菌株を同定するために、前記親バクテリア菌株の前記CRISPR遺伝子座またはその一部分、および前記バクテリオファージ耐性変異菌株の前記改変されたCRISPR遺伝子座を比較するステップ;
(d)前記改変されたCRISPR遺伝子座に付加的な核酸フラグメントを備える前記バクテリオファージ耐性変異菌株を選択するステップ;
(e)前記少なくとも1つのバクテリオファージ耐性変異菌株を同定するために、前記改変されたCRISPR遺伝子座における前記少なくとも1つの付加的な核酸フラグメントを解析するステップ;および
(f)前記少なくとも1つのバクテリオファージ耐性変異菌株を単離するステップからなる方法を用いて得られるバクテリオファージ耐性変異菌株である、請求項1に記載の方法。 - 前記ファージ変異株における前記少なくとも1つの原スペーサー配列の少なくとも一部分および前記少なくとも1つの原スペーサー配列の近くに位置するCRISPRモチーフを、前記親ファージの前記少なくとも1つの原スペーサー配列、およびCRISPRモチーフと比較するステップをさらに備える、請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、前記ファージ耐性バクテリア菌株に感染する前記変異株ファージを選択するステップをさらに備え、前記変異株ファージは、前記CRISPRエスケープ・ファージ変異体を備え、前記CRISPRエスケープ・ファージは、前記CRISPRエスケープ・ファージ変異体の前記少なくとも1つの原スペーサー配列および/または前記CRISPRモチーフに、少なくとも1つの変異を備える、請求項3に記載の方法。
- 前記方法は、前記CRISPRエスケープ・ファージ変異体、および少なくとも1つのCRISPR遺伝子座を備える異なったCRISPRファージ耐性バクテリア菌株を用いて、1回またはそれ以上反復して繰り返され、前記CRISPR遺伝子座は、前記CRISPRエスケープ・ファージ変異体のゲノムにおける少なくとも1つの原スペーサー配列に対して少なくとも95%同一な核酸配列を備える、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのバクテリオファージは、次の通り、コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、マイオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、およびテクティウイルス科からなるウイルス科の群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ファージ耐性バクテリア菌株は、エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルウィニア属、エルシニア属、バチルス属、ビブリオ属、レジオネラ属、シュードモナス属、ナイセリア属、ボルデテラ属、ヘリコバクター属、リステリア属、アグロバクテリウム属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、フランシセラ属、ブルセラ属、カンピロバクター属、クレブシエラ属、フランキア属、バルトネラ属、リケッチア属、シュワネラ属、セラチア属、エンテロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、ブロコトリクス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属およびオエノコッカス属から選択される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法を用いて得られるCRISPRエスケープ・ファージ変異体。
- 少なくとも2つの原スペーサー配列および/または前記CRISPRモチーフに2つまたはそれ以上の変異が存在する、請求項8に記載のCRISPRエスケープ・ファージ変異体。
- 前記CRISPRエスケープ・ファージ変異体の前記ゲノムは、少なくとも1つの原スペーサーおよび/または前記CRISPRモチーフに変異を備えるために遺伝子操作されている、CRISPRエスケープ・ファージ変異体。
- 少なくとも1つの前記CRISPRモチーフが変異した、CRISPRエスケープ・ファージ変異体。
- 少なくとも1つの前記CRISPRモチーフが削除された、CRISPRエスケープ・ファージ変異体。
- 請求項8乃至12に記載の少なくとも1つのCRISPRエスケープ・ファージ変異体を備える組成物。
- 前記発酵培地は、望ましくないバクテリアの少なくとも1つの個体数を含む発酵培地に請求項13に記載の前記組成物を、前記望ましくないバクテリアの前記個体数が低減される条件下で暴露することを備える、製品におけるバクテリアの個体数を制御する方法であって、前記発酵培地は、前記製品を生み出すために用いられる方法。
- 前記製品は、食品、飼料、化粧品、パーソナルケア製品、ヘルスケア製品、動物薬品、およびダイエタリーサプリメントから選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記方法は、少なくとも1回繰り返され、請求項13に記載の前記異なった組成物は、ローテーションして用いられる、請求項14に記載の方法。
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