JP2012022135A - 共焦点顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明では、正確に測定対象平面を検出すると共に、測定時間の短縮が可能な共焦点顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【解決手段】観察試料８の観察面に光を集束する少なくとも１つの対物レンズ７と、観察試料８と対物レンズ７との距離を所定間隔で変化させるＺレボルバ１６と、観察試料８と対物レンズ７との距離に応じて所定間隔を設定する測定条件情報指示部１９と、設定された所定間隔で上記距離を変化させるようにＺレボルバ１６を駆動制御するＺ駆動制御部２２と、観察面からの反射光を検出する光検出器１２と、上記所定間隔の距離毎に観察面上に光を二次元走査して光検出器１２で検出される検出信号により平面画像を生成し、生成された複数の平面画像を用いて三次元画像を生成するコントローラ２を有する共焦点顕微鏡装置１００により、上記課題の解決を図る。
【選択図】 図１

Description

本発明は、観察試料に対し、三次元画像を作成する共焦点顕微鏡装置に関する。

従来、レーザ光源から観察試料に集光して照射された光を、共焦点位置に配置されたピンホールを介して検出することにより、像の濃度情報を得る共焦点顕微鏡がある。このような共焦点顕微鏡においては、観察試料の平面方向に関しては、レーザ光を二次元走査することにより、平面画像を得ることができる。段差のある観察試料に関しては、レーザ光の光軸方向に照射の焦点位置を移動させることによって、観察を行うことができる。

上記のような共焦点顕微鏡で三次元画像を作成する場合には、レーザ光の光軸方向に焦点位置を移動させながら、レーザ光を二次元走査してスライス画像を繰り返し取込む方法を用いている。しかし、このスライス画像の取込み開始から終了までの間、光軸方向に移動する際の測定ピッチを変更せずに一定速度で対物レンズを観察試料に対して相対移動させて三次元画像を作成しているため、測定には時間がある程度必要であり、特に高段差のある観察試料の測定には多くの測定時間を要する。そのため、高段差のある観察試料に対し、測定時間を短縮しつつ、特定の平面部分だけは正確に測定することが望まれている。

このような問題を解決する方法として、スライス画像の取得開始前にプレスキャンにより得られた輝度データ中で、輝度が最大となるピーク位置から測定対象面を検出し、その検出範囲についての高さ測定を行うことが提案されている。なお、プレスキャンとは、観察試料面を一方向に１ラインのみスキャンを行いながら、対物レンズの位置をレーザの光軸方向に所定の速度で移動させて連続的な輝度データを取得することである（例えば、特許文献１参照）。

また、レーザ光軸方向の各取込み位置におけるスライス画像中の一定以上の輝度の画素数と、全スライス画像における所定条件に合致する画素数とに応じて、スライス画像の取得開始および終了を決定し、必要な範囲の三次元画像を自動的に得られるようにした共焦点顕微鏡が開示されている（例えば、特許文献２参照）。

特開２００２−３９７２２号公報 特開２００８−１３４３３９号公報

しかしながら、特許文献１に記載の共焦点顕微鏡装置においては、観察試料全体が一定の段差になっている場合には、プレスキャンを行うことで測定対象面を検出することは可能であるが、例えば、観察試料の平面上の一部分に段差があるなど、観察試料全体が一定段差ではない場合には、プレスキャンのライン上に測定対象面が含まれるか否かは不明である。

上記問題に対し、プレスキャンを行うライン数を増やすことで測定対象平面の検出精度を向上させることは可能である。しかしながら、正確に検出できるとは言えず、測定範囲全体において一定の測定ピッチでスライス画像の取込みを行うことになり、測定時間を多く必要とする。また、プレスキャンのライン数の増加も、測定時間の増加に繋がってしまう。

特許文献２に記載の共焦点顕微鏡においては、スライス画像の取得開始および終了を自動で規定することにより、不要な範囲のスライス画像を取得することにより測定時間が増大することは防止できる。しかしながら、高段差を有する試料であるような場合には段差全体を測定するため測定範囲が広くなることから、測定時間の短縮はあまり期待できない。

上記課題に鑑み、本発明では、観察試料全体が一定の段差ではなく、特に高段差である場合においても、正確に測定対象平面を検出すると共に、測定時間の短縮が可能となる共焦点顕微鏡装置を提供することを目的とする。

本発明にかかる共焦点顕微鏡装置は、観察試料の観察面に光を集束して二次元走査するとともに、前記光の光軸方向に集束位置を移動しながら共焦点画像を取得する共焦点顕微鏡装置であって、前記観察試料を載置するステージと、前記光軸上に配置され、所定の倍率で前記光を前記観察面に集束する少なくとも１つの対物レンズと、前記観察試料の所望の前記観察面に前記光を集束させるために前記ステージと前記対物レンズとの距離を所定間隔で変化させる移動手段と、前記距離に応じて前記所定間隔を設定する測定条件設定手段と、前記測定条件設定手段が設定した前記所定間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御する駆動制御手段と、前記観察面からの反射光を検出する光検出手段と、前記所定間隔で変化させた前記距離毎に前記観察面上に前記光を二次元走査することにより前記光検出手段が検出した検出信号に基づき複数の画素よりなる二次元画像を生成する二次元画像生成手段と、前記二次元画像生成手段で生成された複数の前記二次元画像を用いて三次元画像を生成する三次元画像生成手段と、を有することを特徴としている。

このとき、前記測定条件設定手段は、前記距離の所定の上限および所定の下限と、前記距離が前記上限から下限までの所定距離範囲内において前記距離を変化させる第１の間隔と、前記第１の間隔より大きい第２の間隔とを少なくとも１組設定し、前記駆動制御手段は、前記所定距離範囲内では前記第１の間隔で前記距離を変化させ、前記所定距離範囲外では前記第２の間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御することができる。

前記対物レンズの倍率に応じた第１のレンズ依存間隔と第１のレンズ依存間隔より大きい第２のレンズ依存間隔とを保持する測定間隔記憶手段と、前記光軸上に配置された前記対物レンズの倍率を検出し、前記測定間隔記憶部から前記対物レンズの倍率に応じた前記第１のレンズ依存間隔と前記第２のレンズ依存間隔とを取得する測定間隔取得手段と、をさらに有し、前記測定条件設定手段は、前記測定間隔取得手段が取得した前記第１のレンズ依存間隔を前記第１の間隔として設定し、前記第２のレンズ依存間隔を前記第２の間隔として設定するようにしてもよい。

前記測定条件設定手段は、前記距離の前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を設定するための画面を表示する設定画面表示手段、を有することもできる。前記設定画面表示手段で設定された前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を測定条件として記憶する測定条件記憶手段、をさらに備えるようにしてもよい。

前記測定条件設定手段は、前記測定条件記憶手段から前記測定条件を読込み、前記駆動制御手段は、読込んだ前記測定条件に応じて前記移動手段を駆動制御することが好ましい。

また、前記観察試料において、少なくとも一点の測定指示点を指定する測定指示点指定手段と、各々の前記測定指示点に前記光を集束させる場合の前記距離を少なくとも１つの合焦距離として計測する合焦距離計測手段と、をさらに有し、前記測定条件設定手段は、少なくとも１つの前記合焦距離に応じて前記所定間隔を設定することを特徴とすることができる。

前記測定条件設定手段は、前記距離の上限および下限と、前記距離が前記上限から下限までの所定距離範囲内において前記距離を変化させる第１の間隔と、前記第１の間隔より大きい第２の間隔とを少なくとも１組設定し、前記駆動制御手段は、前記所定距離範囲内では前記第１の間隔で前記距離を変化させ、前記所定距離範囲外では前記第２の間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御するようにしてもよい。

ここで、前記対物レンズの倍率に応じた第１のレンズ依存間隔と第２のレンズ依存間隔とを保持する測定間隔記憶手段と、前記光軸上に配置された前記対物レンズの倍率を検出し、前記測定間隔記憶部から前記対物レンズの倍率に応じた前記第１のレンズ依存間隔と前記第２のレンズ依存間隔とを取得する測定間隔取得手段と、をさらに有し、前記測定条件設定手段は、前記測定間隔取得手段が取得した前記第１のレンズ依存間隔を前記第１の間隔として設定し、前記第２のレンズ依存間隔を前記第２の間隔として設定することもできる。

前記観察面を表示する観察面表示手段と、前記観察面表示手段において、前記観察面上の少なくとも１点を特定する測定指示点特定手段と、をさらに有し、前記測定指示点指定手段は、前記測定指示点特定手段により特定された前記点を測定指示点として指定することが好ましい。ここで、前記測定指示点を記憶する測定指示点記憶手段、をさらに備えることもできる。前記合焦距離を記憶する合焦距離記憶手段、をさらに備えるようにしてもよい。

前記合焦距離を含む前記距離の範囲であって、合焦状態である範囲を合焦範囲として検出する合焦範囲検出手段、をさらに有し、前記測定条件設定手段は、前記合焦範囲の最大距離に所定距離を加えた距離を前記上限として設定し、前記合焦範囲の最大距離から所定距離を減じた距離を前記下限として設定することもできる。

前記三次元画像生成手段が前記三次元画像を生成可能な最低数の前記平面画像を得るために必要な最低の前記所定距離範囲を最低距離範囲として記憶する最低距離範囲記憶手段、をさらに有し、前記測定条件設定手段は、設定された前記所定距離範囲が前記最低距離範囲記憶手段に記憶された前記最低距離範囲より小さい場合には、前記所定距離範囲を前記最低距離範囲に一致させるように、前記上限および前記下限を設定変更するようにしてもよい。

さらに、前記平面画像を構成する各前記画素の輝度を所定の輝度しきい値と比較し、前記輝度しきい値以下の画素数を輝度しきい値以下画素数として計数する画素数計数手段、をさらに有し、前記測定条件設定手段は、前記輝度しきい値以下画素数に応じて、前記距離を変化させる所定間隔を設定することを特徴としてもよい。

前記輝度しきい値以下画素数と所定の画素数しきい値とを比較する画素数比較手段、をさらに有し、前記測定条件設定手段は、前記画素数比較手段の比較結果に応じて、前記距離を変化させる所定間隔を設定することもできる。

前記測定条件設定手段は、前記輝度しきい値以下画素数が前記画素数しきい値以下の場合には、前記距離を変化させる所定間隔を第１の間隔に設定し、前記輝度しきい値以下画素数が前記画素数しきい値より大きい場合には、前記所定間隔を第１の間隔より大きい第２の間隔に設定するようにしてもよい。
また、前記二次元走査は、変更可能な所定の間隔で行うこともできる。

本発明の共焦点顕微鏡装置によれば、正確に測定対象平面を検出すると共に、測定時間の短縮が可能となる。

本発明の第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置の構成を示す図。 第１の実施の形態によるコントローラの構成を示す図。 第１の実施の形態による観察試料を示す斜視図。 第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置を用いて三次元画像を生成する動作を示すフローチャート。 第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置を用いた三次元画像生成の際の測定条件設定画面の一例を示す図。 第１の実施の形態による所定測定範囲の設定方法の一例を示す図。 第１の実施の形態による所定測定範囲の設定方法の別の一例を示す図。 第２の実施の形態によるコントローラの構成を示す図。 第２の実施の形態による共焦点顕微鏡装置を用いて三次元画像を生成する動作を示すフローチャート。 第２の実施の形態による測定対象平面の設定方法の一例を示す図。 第２の実施の形態による所定測定範囲の設定方法の一例を示す図。 第２の実施の形態による所定測定範囲の設定方法の別の一例を示す図。 第２の実施の形態による所定測定範囲の設定方法の別の一例を示す図。 第２の実施の形態による所定測定範囲の設定方法の別の一例を示す図。 第３の実施の形態によるコントローラの構成を示す図。 第３の実施の形態による共焦点顕微鏡装置を用いて三次元画像を生成する動作を示すフローチャート。 第３の実施の形態による輝度画像の一例を示す図。 第３の実施の形態による輝度画像のヒストグラム。 第３の実施の形態による最大輝度蓄積画像の一例を示す図。 第３の実施の形態による最大輝度蓄積画像のヒストグラム。

以下、図面を参照しながら、本発明の実施の形態による共焦点顕微鏡装置について説明する。なお本明細書において、共焦点顕微鏡装置１００の構成を示す図における対物レンズと観察試料との位置関係は、対物レンズ側を上、観察試料側を下という。また、観察試料に照射される光の光軸方向をＺ方向、Ｚ方向に垂直な平面の互いに直行する２方向をＸ方向およびＹ方向とする。

（第１の実施の形態）
まず、第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置１００の構成について、図１および図２を参照しながら説明する。図１は、第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置１００の構成例を示す図である。図１に示すように、共焦点顕微鏡装置１００は、顕微鏡本体１および対物レンズ７、レボルバ１３、Ｚレボルバ１６、電動ＸＹステージ１４、コントローラ２、表示部３を有している。観察試料８は、電動ＸＹステージ１４上に載置されている。顕微鏡本体１には、共焦点画像を形成する共焦点光学系と、実画像をカラー観察するカラー観察光学系との両方が備えられている。共焦点光学系は、レーザ光源４、偏光ビームスプリッタ（以下、ＰＢＳという）５、二次元走査部６、４分の１波長板９、結像レンズ１０ａ、ピンホール１１、光検出器１２等を備えている。カラー観察光学系は、カラーカメラ１８、結像レンズ１０ｂ、ハーフミラー５２等を備えている。

図１に示す共焦点顕微鏡１００において、レーザ光源４から出射した光は、ＰＢＳ５を透過した後、二次元走査部６に入射される。二次元走査部６は、入射された光を図示しない二次元スキャナなどにより所定ピッチで二次元に走査しつつ対物レンズ７へと導く。このとき、二次元走査部６は対物レンズ７の瞳と共役な位置に配置されている為、対物レンズ７の瞳へ入射した光は、集光となって観察試料８上を走査する。

観察試料８の表面で反射した光は、再び対物レンズ７から、１／４λ板９、二次元走査部６を介してＰＢＳ５に入射された後、ＰＢＳ５によって結像レンズ１０ａ側に反射され、結像レンズ１０ａによってピンホール１１上に集光される。そして、ピンホール１１上に集光した反射光のうち観察試料８上の集光点以外で反射された光がピンホール１１によりカットされ、ピンホール１１を通過した反射光だけが光検出器１２によって検出される。光検出器１２は、検出した反射光の輝度を電気信号に変換して、コントローラ２に出力する。なお、１／４λ板９は、入射された直線偏光を円偏光に変換する。

一方、カラー観察光学系のＬＥＤ光源１７から出射した白色光は、ハーフミラー５２、５４および対物レンズ７を介して観察試料８を照明し、観察試料表面で反射された光が結像レンズ１０ｂにより集光され、カラーカメラ１８で検出される。

ここで、レボルバ１３は、複数の対物レンズ７を搭載可能である。複数の対物レンズ７は、レボルバ１３が回転することにより光軸上に挿入され、あるいは光軸上から脱出する。Ｚレボルバ１６は、光軸方向に対物レンズ７を移動させる。電動ＸＹステージ１４は、載置されている観察試料８をＸＹ方向に移動させることができる。

コントローラ２は、共焦点顕微鏡装置１００の動作を制御する制御装置である。コントローラ２は、中央演算処理装置（以下、ＣＰＵという）、データなどを記録するメモリ、外部からのデータ入力手段である入力装置、操作画面や観察画像等を表示部３に出力する出力装置、およびプログラムを記憶するための記憶装置と、を少なくとも備える。ただし、ＣＰＵ、メモリ、入力装置、出力装置、記憶装置については、一般的な構成であるため図１には図示しない。コントローラ２は、複数の対物レンズ７のうち所望の対物レンズ７を光軸上に配置させるように制御する。コントローラ２は、電動ＸＹステージ１４の移動も制御する。

本実施の形態おいて、コントローラ２内の必要な処理部を図２に示す。コントローラ２は、測定条件情報指示部１９、測定ピッチ取得部２０、測定条件記憶部２１、およびＺ駆動制御部２２を有している。測定条件情報指示部１９は、表示部３に測定条件設定画面を表示するための指示を出力する。測定ピッチ取得部２０は、対物レンズ７毎の測定ピッチ、すなわち、二次元画像を取込む毎にＺレボルバ１６を移動させる、対物レンズ７の倍率に応じた距離を取得する。測定条件記憶部２１は、顕微鏡観察者が表示部３の顕微鏡操作画面で設定した測定条件情報を記憶する。Ｚ駆動制御部２２は、測定条件記憶部２１から測定範囲と測定ピッチの情報を得てＺレボルバ１６の駆動制御を行う。

共焦点顕微鏡１００での三次元画像の作成は、対物レンズ７をＺレボルバ１６で、対物レンズ７から出射される光の光軸方向（Ｚ方向）に相対移動させ、各Ｚ位置（以下、高さ位置ともいう）における二次元の共焦点画像(以下、スライス画像という)を順次取得し、取得した複数のスライス画像から、画素毎の最大輝度を抽出し蓄積していくことで行われる。また、この時のＺ位置の相対移動範囲を測定範囲、相対移動量を測定ピッチという。

次に、本実施形態による共焦点顕微鏡装置１００で行う三次元画像作成の動作について、図１および図２の構成図、図３の観察試料例、図４のフローチャート、および表示部３に表示する観察操作画面の一部である図５の測定条件設定画面例を用いて説明する。

ここで、図３に示すように、観察試料８は、互いに高さの異なる面Ａ、面Ｂ、面Ｃを有している。このような観察試料８に対し、まず、ステップ４０１では、観察者が観察操作画面の観察画像（図示せず）を確認しながらＺレボルバ１６を移動させて、観察試料８の面Ａが合焦となる際の、例えば電動ＸＹステージ１４に対する対物レンズ７の高さ位置を見つける。ここで、観察画像は、ＬＥＤ光源１７による画像でもよいし、レーザ光源４による輝度画像でもよい。そして、その位置よりもさらに観察試料８側（以下、下側という）にＺレボルバ１６を移動させて、観察試料８の面Ａが合焦ではなくなる位置へと移動する。

ステップ４０２では、現在の高さ位置を観察試料８の面Ａの三次元画像作成時に必要な取込み測定範囲の下限位置として登録する処理を行う。すなわち、測定条件情報指示部１９により表示指示された、図５に示す測定条件設定画面８０の番号コンボボックス１０２において１番を選択し、測定範囲設定欄１０４の下限位置ボタン１０８を押す。下限位置ボタン１０８を押すと測定条件設定画面８０のリスト部１１６において、番号コンボボックス１０２で指定した登録番号行の下限位置部１２２−１に高さ情報が表示される。高さ情報は、図５のように、ある一定の位置を基準とした座標値のように表してもよいし、電動ＸＹステージ１４から例えばＺレボルバ１６までの距離などで表すようにしてもよい。また、一度登録した値を修正したい場合は、Ｚレボルバ１６を移動させて再度下限位置ボタン１０８を押すことで可能である。

ステップ４０３では、観察者が観察操作画面の観察画像を確認しながらＺレボルバ１６を移動させて、観察試料８の面Ａが合焦となる高さ位置を見つける。そして、その位置よりもさらに観察試料８と反対側（以下、上側という）にＺレボルバ１６を移動させて、観察試料面Ａが合焦ではなくなる位置へと移動する。

ステップ４０４では、現在の高さ位置を観察試料８の面Ａの三次元画像作成時に必要な取込み測定範囲の上限位置として登録するため、図５に示す測定条件設定画面８０の番号コンボボックス１０２において１番を選択し、測定範囲設定欄１０４の上限位置ボタン１０６を押す。上限位置ボタン１０６を押すと測定条件設定画面８０のリスト部１１６において、番号コンボボックス１０２で指定した登録番号行の上限位置部１２０−１に高さ情報が表示される。上限位置に関しても、再度上限位置ボタン１０６を押すことで、下限位置同様に登録値を修正することが可能である。以下、観察試料８のある面（以下、測定平面という）に関して上記のように設定された上限位置から下限位置までを、所定測定範囲という。

ステップ４０５では、上記上限位置から下限位置までの所定測定範囲内でスライス画像を取込む際の高さ位置の間隔を測定ピッチとして設定する。ステップ４０２とステップ４０４で設定した所定測定範囲内のスライス画像取込み測定ピッチは、測定ピッチ設定欄１１０の測定範囲内ピッチ用テキストラベル１１２に表示される。表示される値は、レボルバ１３に複数搭載されている対物レンズ７のうち、光軸上に配置されている対物レンズ倍率に応じて、対物レンズ７毎に測定に必要なピッチを、測定範囲内ピッチとして測定ピッチ取得部２０から得て設定している。また、ステップ４０２とステップ４０４で設定した所定測定範囲外のスライス画像取込み測定ピッチを、測定範囲外ピッチとしてテキストボックス１１３に数値入力、またはスピンボタン１１４で数値の増減を行い設定する。

ステップ４０６では、観察者がさらに複数の測定平面に関して上記と同様の登録をするかの判断を行う。判断がＹｅｓの場合には登録済みであり、ステップ４０７へ進む。図３の観察試料８では、登録の対象となる測定平面である面Ｂ、面Ｃが残っているため、まずは判断がＮｏとなり、再度ステップ４０１からステップ４０５の操作を繰返し行い、面Ｂ、面Ｃの上下限位置と測定ピッチとを設定し、測定条件を決定する。

上記のように複数個所の測定条件を登録する際には、前回登録したリスト番号行とは異なる番号に登録するため、番号コンボボックス１０２の指定番号を変更しておく。予め表示しているリスト行番号数以上に登録したい場合は、追加ボタン１２４を押すことで測定条件登録を増やすことができる。また、既に登録した測定条件を削除したい時は、削除したいリスト行番号を番号コンボボックス１０２で指定して、削除ボタン１２６を押せばよい。以上のように設定された測定条件情報は、測定条件記憶部２１に記憶される。

ここで、複数登録した測定範囲が重なっている場合や近接している場合について、図６Ａ、および図６Ｂを参照しながら説明する。図６Ａは、面Ａに関する測定範囲の下限がＺ＝Ｚａ１、上限がＺ＝Ｚａ２、面Ｂに関する測定範囲の下限がＺ＝Ｚｂ１、上限がＺ＝Ｚｂ２であり、面Ａに関する所定測定範囲の上限が面Ｂに関する所定測定範囲の下限よりも上にあり、夫々の面に基づいて設定された所定測定範囲Ｓ１、Ｓ２が重なっている。この場合は、図６Ａに示したように、Ｚ＝Ｚａ１〜Ｚｂ２の１つの所定測定範囲Ｓ１２を設定する。

図６Ｂは、面Ａに関する所定測定範囲の上限Ｚ＝Ｚａ４と、面Ｂに関する所定測定範囲の下限Ｚ＝Ｚｂ３とが、距離Ｚ１離れている場合を示している。ここで、距離Ｚ１が測定ピッチを変える必要がないと判断される距離である場合には、図６Ｂに示したように、Ｚ＝Ｚａ３〜Ｚｂ４を１つの所定測定範囲Ｓ３４として設定する。このように２つの所定測定範囲を１つの測定範囲とみなし、無駄な測定ピッチの変更を防ぐようにしている。

ステップ４０７では、測定条件記憶部２１に登録されている情報をＺ駆動制御部２２で得て、ステップ４０６までに登録した測定条件で、スライス画像の取込みを行う。取込み開始位置は、ステップ４０６までに登録している少なくとも１組の測定条件設定内で最も試料に近い側の下限位置（以下、最下限位置という）から開始し、まず、観察試料８の面Ａを対象とした所定測定範囲の取込みを行う。

ステップ４０８では、スライス画像の取込みを終了するかの判断を行う。終了判定は、スライス画像を取込んだ現在のＺレボルバ１６の高さ位置が、ステップ４０６までに登録している少なくとも１組の測定条件設定内で最も観察試料８から遠い側の上限位置（最上限位置という）以上かどうかで判断する。判断がＹｅｓの場合には、ステップ４０９へ進み、判断がＮｏの場合には、ステップ４１０へ進む。

ステップ４１０は、ステップ４０８で現在のＺレボルバ１６の高さ位置が最上限位置未満である場合であり、現在のＺレボルバ１６の高さ位置が現在測定に用いようとしている測定条件設定内で登録した所定測定範囲内であるかの判定として、下限位置と比較する。現在の位置が下限位置より高く、判断がＹｅｓの場合には、ステップ４１１に進み、判断がＮｏの場合には、ステップ４１３に進む。

ステップ４１１では、ステップ４１０の判定で現在のＺレボルバ１６の高さ位置が下限位置以上である場合であり、次に現在のＺレボルバ１６の高さ位置を現在用いようとしている測定条件設定内で登録した所定測定範囲の上限位置と比較する。判断がＹｅｓの場合には、ステップ４１２に進み、判断がＮｏの場合には、ステップ４１６に進む。

ステップ４１２では、現在のＺレボルバ１６の高さ位置が測定条件設定内で登録した測定範囲の上限位置以下であり、観察試料８の面Ａを対象とした所定測定範囲内であるため、登録した測定範囲内ピッチに変更し、ステップ４１４に進む。

ステップ４１４では、現在設定している測定ピッチと設定されている測定範囲からＺレボルバ駆動速度を求める。
ステップ４１５では、ステップ４１４で求めたＺレボルバ駆動速度でＺレボルバ１６の高さ位置を上方へと移動させていく。そして、測定ピッチ分移動すると、再びステップ４０７へと進み、次のスライス画像取込みを行う。

ステップ４１０でＮｏの場合には、面Ａの所定測定範囲の下限よりも下であるため、所定測定範囲外となり、ピッチを粗くして測定範囲外ピッチとし、ステップ４１４へ進む。
以上のように取込みを続けて、観察試料８の面Ａを対象として登録した所定測定範囲の上限位置を超えた場合は、ステップ４１１の判定でＮｏとなりステップ４１６へと処理が進む。

ステップ４１６では、観察試料８の面Ａを対象とした測定範囲が終了したことを受けて、ステップ４１０とステップ４１１で判定条件の閾値となる下限位置と上限位置とを、観察試料８の次の面Ｂに対して登録した測定条件設定に更新し、ステップ４１３へと進む。

また、判定条件閾値更新後に観察試料８の面Ｂに対して登録した測定条件設定の下限位置より下方の位置にＺレボルバ１６があるときは、ステップ４１０の条件判定により、同様にステップ４１３へと進み、測定ピッチを測定範囲外ピッチに設定する。

以上のように、Ｚレボルバ１６を上方へと移動させながらスライス画像の取込みを行い、測定条件設定画面で登録した測定範囲と現在のＺレボルバ１６の高さ位置とを比較しながら測定ピッチを変更していき、観察試料８の面Ｃに対する測定範囲の上限位置まで到達したとき、ステップ４０８で現在のＺレボルバ１６の高さ位置が最上限位置以上となり、ステップ４０９へと進む。ステップ４０９では、上記処理により取込んだ複数の輝度画像を用いて三次元画像の構築を行う。

以上のように、第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置１００においては、観察試料８に存在する測定平面に応じて、測定範囲内ピッチで輝度画像の検出を行う所定測定範囲をあらかじめ設定する。複数の平面がある場合には、夫々に関して所定測定範囲を設定する。所定測定範囲内においては、対物レンズ７に応じた所定の間隔を測定ピッチ取得部２０で取得して測定範囲内ピッチとして用いる。所定測定範囲外においては、測定条件設定画面８０で設定した測定範囲外ピッチを用いる。ここで、測定範囲外ピッチは測定範囲内ピッチより粗く設定する。また、所定測定範囲の上限位置および下限位置、測定ピッチなどを測定条件記憶部２１に記憶しておく。

測定条件記憶部２１から設定情報を取得し、スライス画像の取込み毎にＺレボルバ１６の位置が所定測定範囲内であるかを比較しながら、その所定測定範囲に応じて測定ピッチに変更させて、Ｚ駆動制御部２２がＺレボルバの駆動制御を行う。ここで、複数の測定平面の夫々に応じた所定測定範囲が重なったり、近接したりしている場合には、１つの領域として同じ測定範囲内ピッチで輝度画像を取得するようにする。コントローラ２は、光検出器１２で得られた検出信号によりスライス画像を生成するとともに、得られたスライス画像から三次元画像を生成する。

上記第１の実施の形態において、電動ＸＹステージ１４は、本発明のステージに相当し、Ｚレボルバ１６は、本発明の移動手段に相当し、測定条件情報記憶部２１は、測定条件記憶手段に相当し、Ｚ駆動制御部２２は、駆動制御手段に相当し、光検出部１３は、光検出手段に相当する。測定ピッチ取得部２０は、本発明の測定間隔取得手段に相当し、測定条件情報指示部１９は、測定条件設定手段および設定画面表示手段に相当する。また、コントローラ２は、本発明の二次元画像生成手段および三次元画像生成手段として機能する。

以上のように、第１の実施形態による共焦点顕微鏡装置によれば、顕微鏡観察者が観察操作画面に表示された観察画像を確認しながら、Ｚレボルバを操作し、観察試料において詳細にスライス画像の取り込みを行う測定平面近傍の所定測定範囲の上下限位置と、対象外の所定測定範囲外とを区別してそれぞれの測定ピッチを設定できるため、複数段差のある観察試料の対象平面の三次元画像を確実に作成することができ、かつ、スライス画像の取込み時間も短縮することができる。

さらに、高段差の観察試料に対しては、測定範囲毎に測定ピッチを変更することができるため、スライス画像の取込み時間を短縮することができる。

（第２の実施の形態）
以下、図７〜図９および図１０Ａ〜図１０Ｄを参照しながら、第２の実施の形態による共焦点顕微鏡装置について説明する。第１の実施の形態による共焦点顕微鏡装置１００と同様の構成および動作については、同一の符号を付し、詳細説明を省略する。

本実施の形態による共焦点顕微鏡装置の構成の概略は図１で説明した共焦点顕微鏡装置１００と同様であるが、コントローラ２に代えて、図７に示すコントローラ２００を備える。

図７に示すように、コントローラ２００は、測定平面指定部２３、測定平面記憶部２４、自動焦点検出部２５、指定平面高さ記憶部２６、測定範囲算出部２６、測定ピッチ取得部２８、測定条件設定部２９、およびＺ駆動制御部３０を有している。

測定平面指定部２３は、表示部３に表示された観察試料８の画像において特定された点に基づき、測定対象とする平面を指定する。測定平面記憶部２４は、測定平面指定部２３において指定された測定平面の位置情報を記憶する。自動焦点検出部２５は、測定平面記憶部２４から測定平面として指定された平面の位置情報を読出し、指定された平面に対する合焦位置を検出する。指定平面高さ記億部２６は、自動焦点検出部２５で検出された、測定平面として指定された平面に対する合焦位置などの高さ情報を記憶する。

測定範囲算出部２７は、測定平面指定部２３において測定平面として指定された平面に対して、細かい測定ピッチで画像を取込む所定の測定範囲を算出する。測定ピッチ取得部２８は、測定範囲算出部２７で算出された所定の測定範囲において適用される測定範囲内ピッチと、それよりも粗い測定範囲外ピッチとを取得する。測定条件設定部２９は、上記所定の測定範囲を規定する上限、下限、適用される測定範囲内ピッチおよび測定範囲外ピッチを測定条件として設定する。Ｚ駆動制御部は、測定条件設定部２９で設定された測定条件に応じて、Ｚレボルバ１６を駆動制御する。

共焦点顕微鏡での三次元画像の作成は、対物レンズ７をＺレボルバ１６でＺ方向に所定ピッチずつ移動させ、各Ｚ位置におけるスライス画像を順次取得し、取得した複数のスライス画像から、画素毎の最大輝度を抽出し蓄積していくことで行われる。

次に、本実施の形態による共焦点顕微鏡装置の三次元画像作成の動作について、図２の観察試料例、図７の構成図、図８のフローチャート、および表示部３に表示される観察操作画面の一部である図９の観察画像表示画面例を参照しながら説明する。

まず、ステップ８０１では、観察者が例えば図３に示したような形状の観察試料８上で測定対象となる平面部分を指定する。図９は、表示部３に表示された観察試料８の観察画像９０を示す図である。図９に示すように、観察試料８は、面Ａ、面Ｂおよび面Ｃを有している。このとき、観察者は、測定対象にしたい面上の一点を指定することにより、測定面を指定する。すなわち、測定平面指定部２３は、例えば、図７には図示していないマウスなどの入力装置により、観察画像９０の面Ａ上の指定点８Ａ、面Ｂ上の指定点８Ｂ、面Ｃ上の指定点８Ｃを特定するように入力させ、面Ａ、面Ｂおよび面Ｃを指定する。測定平面記憶部２４は、指定された指定点Ａ、指定点Ｂ、指定点Ｃの指定位置情報を記憶する。

なお、このように、指定平面を指定する際には、ＬＥＤ光源１７によるカラー観察画像が好ましい。輝度画像では合焦箇所部のみの輝度表示となるため、試料全体像を把握しにくいためである。

ステップ８０２では、測定平面記憶部２４で記憶している指定位置情報を、自動焦点検出処理部２５へと渡し、指定位置において自動焦点検出処理を行う。自動焦点検出処理部２５では、カラー画像に対してコントラスト値の算出、輝度値の算出を実行し、これら信号処理結果に基づいて焦点位置かどうかを判定する。このとき焦点位置で無いならば、自動焦点検出処理部２５は、Ｚ駆動制御部３０に指示して信号処理結果から焦点位置と判定できる位置にＺレボルバ１６を介して対物レンズ７を移動させる。自動焦点検出処理の流れは公知の技術であるため詳細な説明は省略する。ここで、指定点Ａの自動焦点検出対象範囲９２は、図９の指定点Ａの外側に示す矩形領域であり、自動焦点検出範囲９２の中心位置が指定点Ａとなる。

ステップ８０３では、自動焦点検出処理部２５が、自動焦点検出処理により観察試料８の面Ａ、面Ｂ、面Ｃがそれぞれ合焦となる対物レンズ７の高さ位置と、自動焦点検出処理の信号処理結果から、各測定平面の合焦位置に基づき、合焦位置の上下位置にある非合焦となる高さ位置を算出する。指定平面高さ記億部２６は、取得したそれぞれの高さ情報を記憶する。非合焦となる高さ位置は、指定点に対する自動検出対象範囲で取得した高さデータから算出できる。本実施の形態においては、自動焦点検出処理により検出された合焦位置の上下位置にある非合焦となる高さ位置を、それぞれ上限位置および下限位置という。また、上限位置から下限位置までの範囲を合焦範囲という。

ステップ８０４では、指定平面高さ記憶部２６にて記憶した高さ情報を得て、測定範囲算出部２７により観察試料８の面Ａ、面Ｂ、面Ｃのそれぞれの測定平面部の三次元画像を作成するために必要な所定測定範囲を算出する。

ここで、所定測定範囲の求め方を、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄを参照しながら説明する。図１０Ａに示すように、指定平面高さ記憶部２６から得た面Ａに関する高さ情報から、Ｚ＝ＺＡａ〜ＺＡｂ間は、自動焦点処理で求めた面Ａに関する合焦範囲ＰＡ１である。この合焦範囲ＰＡ１に、予め任意に設定してある測定距離ｑを加えたＺ＝ＺＡｃ〜ＺＡｄ間を合焦範囲ＰＡ２とする。同様に、指定平面高さ記憶部２６から得た面Ｂに関する高さ情報から、Ｚ＝ＺＢａ〜ＺＢｂ間は、自動焦点処理で求めた範囲（図示せず）である。この範囲に、予め任意に設定してある測定距離を加えたＺ＝ＺＢｃ〜ＺＢｄ間を合焦範囲ＰＢ１とする。ここで、隣り合う合焦範囲ＰＡ２−ＰＢ１間を非合焦範囲Ｒとして区別する。この場合、所定測定範囲は、範囲ＰＡ２と、範囲ＰＢ１であり、この測定範囲では、測定範囲内ピッチで画像検出を行う。非合焦範囲Ｒでは、測定範囲外ピッチで画像検出を行う。

また、図１０Ｂには、図１０Ａで求めた合焦範囲ＰＡ２が、対物倍率毎に予め設定されている測定ピッチから算出した、三次元画像を生成するために最低限必要な最小測定範囲よりも小さい場合は、その最小測定範囲を合焦範囲ＳＡ１（Ｚ＝ＺＡｅ〜ＺＡｆ）とする。

さらに、図１０Ｃは、面Ａに関する合焦範囲の下限がＺ＝ＺＡｃ、上限がＺ＝ＺＡｄ、面Ｂの合焦範囲の下限がＺ＝ＺＢｃ、上限がＺ＝ＺＢｄであり、面Ａの合焦範囲の上限が面Ｂの合焦範囲の下限よりも上にあり、夫々の面に基づいて設定された合焦範囲ＰＡ５と合焦範囲ＰＢ５とが重なっている。この場合は、図１０Ｃに示したように、Ｚ＝ＺＡｃ〜ＺＢｄを１つの所定測定範囲ＳＡＢ５に設定する。

図１０Ｄは、面Ａの合焦範囲の上限Ｚ＝ＺＡｄと、面Ｂの合焦範囲の下限Ｚ＝ＺＢｃとが、距離Ｚ２離れている場合を示している。ここで、距離Ｚ２が測定ピッチを変える必要がないと判断される距離の場合には、図１０Ｄに示したように、Ｚ＝ＺＡｃ〜ＺＢｄを１つの所定測定範囲ＳＡＢ６として設定する。このように２つの所定測定範囲を１つの測定範囲とみなし、無駄な測定ピッチの変更を防ぐようにしている。

次に、測定ピッチ取得部２８において、レボルバ１３に搭載されている複数の対物レンズ７のうち、光軸上に搭載されている対物レンズ７の対物倍率情報から、対物倍率毎に予め設定されている測定範囲内ピッチ（細かい測定ピッチ）と、測定範囲外ピッチ（粗い測定ピッチ）を取得する。そして、図１０Ａ、図１０Ｂのようにして求めた測定範囲情報と、測定ピッチ取得部２８により取得した測定ピッチ情報から、合焦範囲ＰＡ２、合焦範囲ＰＢ１または合焦範囲ＳＡ１では細かい測定ピッチを、非合焦範囲Ｒでは粗い測定ピッチが選択されるように、測定ピッチ取得部２９で測定範囲と測定ピッチの組み合わせを決定する。

また、図１０Ｃに示すように観察試料８の面Ａの合焦範囲と、面Ｂの合焦範囲が一部重なる時や、図１０Ｄに示すように非合焦範囲が任意に設定できる距離以内であれば、観察試料８の面Ａの合焦範囲の下限位置から面Ｂの合焦範囲の上限位置までの範囲を一組の所定測定範囲とすることで、無駄な測定ピッチの変更を減らすことができる。

ステップ８０５では、測定ピッチ取得部２９から測定条件情報を得て、Ｚ駆動制御部３０によりＺレボルバ１６を駆動制御し、設定された測定条件内の最下限位置である、面Ａを対象とした所定測定範囲の下限位置から輝度画像の取込みを開始する。

ステップ８０６では、スライス画像の取込みを終了するかの判断を行う。終了判定は、ステップ８０４で求めた測定範囲の最上限位置を高さ閾値として、スライス画像の取込み毎に現在のＺレボルバ１６の高さ位置が、その高さ閾値以上か否かで判断する。本実施の形態による観察試料８では面Ｃが含まれる合焦範囲の上限位置が高さ閾値となる。判定がＹｅｓのときには、スライス画像の取り込みを終了し、ステップ８０７へ進む。判定がＮｏの時には、ステップ８０８へ進む。

ステップ８０８では、ステップ８０６において現在のＺレボルバ１６の高さ位置が高さ閾値以下であるときであり、現在のＺレボルバ１６の高さ位置がステップ８０４で求めた所定測定範囲内であるかを判定する。本実施の形態による観察試料８では観察試料８の面Ａ、面Ｂ、面Ｃに基づいて定められた所定測定範囲内であるかを判定することになる。判定がＹｅｓの場合には、ステップ８０９に進む。判定がＮｏの場合には、ステップ８１０に進む。

ステップ８０９では、ステップ８０８において所定測定範囲内であるため、測定ピッチを細かい値である測定範囲内ピッチに変更し、ステップ８１１に進む。
ステップ８１０は、ステップ８０８において所定測定範囲外であるため、測定ピッチを粗い値である測定範囲外ピッチに変更し、ステップ８１１に進む。ステップ８１１では、前段処理のステップ８０９、またはステップ８１２にて決定した測定ピッチと、それぞれの測定ピッチに応じた測定範囲からＺレボルバ１６の駆動速度を求める。

ステップ８１２では、ステップ８１１で求めたＺレボルバ駆動速度でＺレボルバ１６の高さ位置を上方へと移動させていく。そして、再びステップ８０５へと進み次のスライス画像取込みを行う。

以上のように取込みを続けて、ステップ８０６で現在のＺレボルバ１６の高さ位置が高さ閾値以上、すなわち、本実施の形態による観察試料８では面Ｃが含まれる合焦範囲の上限位置となる場合に、スライス画像の取込みを終了し、ステップ８０７へ進み、三次元画像の構築を行う。

以上のように、第２の実施の形態による共焦点顕微鏡装置においては、観察画面９０上で観察試料８の測定対象とする平面を測定平面指定部２３により観察者が指定する。指定された平面に対し、測定平面記憶部２４が測定対象とする平面の位置情報を記憶し、平面の位置情報に応じて、自動焦点検出処理部２５が、平面に対する合焦位置を検出し、指定平面高さ記億部２６に記憶する。測定範囲算出部２７は、検出された合焦位置に基づいて所定測定範囲を算出する。測定条件設定部２９は、算出された所定測定範囲を設定するとともに、測定ピッチ取得部２０が取得した測定範囲内ピッチおよび測定範囲外ピッチを設定する。所定測定範囲内においては、測定範囲内ピッチを用い、所定測定範囲外における測定範囲外ピッチは、測定範囲内ピッチよりも大きく設定する。この測定条件によりＺ駆動制御部２２が、Ｚレボルバ１６を駆動制御し、スライス画像を取込み、三次元画像を生成する。

また、複数の平面の夫々に応じた所定測定範囲が重なったり、近接したりしている場合には、１つの領域として同じ測定範囲内ピッチで輝度画像を取得するようにする。さらに、指定平面高さ記憶部２６から、測定平面が合焦位置となる高さ情報、例えば合焦位置ＺＡ０、ＺＢ０を取得し、合焦位置となる高さを中心位置として、その位置から上下に予め設定してある任意距離ｑ分加えた測定範囲を、合焦範囲と隣り合う合焦範囲との間の測定範囲を非合焦範囲Ｒ１と区別する。

上記第２の実施の形態において、測定平面指定部２３は本発明の測定指示点指定手段に相当し、測定平面記憶部２４は測定指示記憶手段に相当し、自動焦点検出処理部２５は合焦距離計測手段に相当し、指定平面高さ記億部２６は合焦距離記憶手段に相当する。また、測定範囲算出部２７の一部は合焦範囲検出手段に相当し、測定範囲算出部２７の別の一部は最低距離範囲記憶手段に相当し、測定ピッチ取得部２８は測定間隔記憶手段、および測定間隔取得手段に相当する。さらに、例えば不図示のマウスは、測定指示点特定手段に相当する。

以上説明したように、第２の実施の形態によれば第１の実施の形態と同様に、観察試料の測定対象平面の所定測定範囲と、所定測定範囲外を区別してそれぞれの測定ピッチを設定できるため、複数段差のある観察試料の対象平面の三次元画像を作成することができ、かつ、スライス画像の取込み時間も短縮することができる。さらに、第１の実施形態で行っていた所定測定範囲と測定ピッチの設定が、観察画像上で測定指示点を指定するだけで自動的に設定されるため、取込み開始前の設定時間も短縮できる。

また、複数段差のある観察試料に対して測定対象平面の三次元画像を得られる。さらに、高段差の観察試料に対しても、測定ピッチを変更しながらスライス画像の取得を行うため測定時間の短縮できる。

（第３の実施の形態）
以下、図１１、図１２、図１３Ａ、図１３Ｂを参照しながら、第３の実施の形態による共焦点顕微鏡装置について説明する。第１の実施の形態または第２の実施の形態による共焦点顕微鏡装置１００と同様の構成および動作については、同一の符号を付し、詳細説明を省略する。

本実施の形態による共焦点顕微鏡装置の構成の概略は、図１で説明した共焦点顕微鏡装置１００と同様であるが、コントローラ２に代えて、図１１に示すコントローラ３００を備える。また、観察試料８に存在する測定平面に応じて所定測定範囲を設定し、その所定測定範囲においては、スライス画像を取込むための測定ピッチを測定範囲内ピッチに設定し、所定測定範囲以外では、測定範囲内ピッチよりも粗い、測定範囲外ピッチに設定することは、第１の実施の形態および第２の実施の形態による共焦点顕微鏡装置と同様である。

コントローラ３００は、計数部３１、測定ピッチ取得部３２、測定条件設定部３３、Ｚ駆動制御部２２を備えている。計数部３１は、取込まれたスライス画像の各画素の輝度について、所定条件を満たす画素数を計数する。測定ピッチ取得部３２は、対物レンズ７の倍率に応じた測定範囲内ピッチ、測定範囲外ピッチを取得する。測定条件設定部２９は、測定ピッチや測定の終了条件など、所定の測定条件を設定する。Ｚ駆動制御部２２は、測定条件設定部２９の設定に基づき、Ｚレボルバ１６を駆動制御する。

共焦点顕微鏡での三次元画像の作成は、対物レンズ７をＺレボルバ１６でＺ方向に所定ピッチずつ移動させ、各Ｚ位置におけるスライス画像を順次取得し、取得した複数のスライス画像から、画像毎の最大輝度を抽出し蓄積していくことで行われる。

次に、本実施の形態における三次元画像作成の動作について、図１１の構成図と、図１２のフローチャートとを用いて説明する。ステップ９０１では、スライス画像の取込み開始前に、ステップ９０９や、ステップ９１１での条件判断の閾値となる基準画素数、すなわち後述の第１基準輝度値Ｌ１、第２基準輝度値Ｌ２、第１基準画素数Ｌ１、第２基準画素数Ｌ２等を、図１１には図示していない動作メモリ部に記憶する。また、自動取込みに必要な、例えば対物レンズ７の倍率に応じた測定ピッチなど、各種パラメータも動作メモリ部に記憶している。

ステップ９０２では、現在のＺレボルバ１６の高さ位置における輝度画像(スライス画像)の取込みを行う。ステップ９０３では、スライス画像毎に各画素で最大輝度値を蓄積した画像を作成する。この最大輝度蓄積画像は、最終的な自動取込みの終了判定を行うために使用する。ステップ９０４では、ステップ９０２で取得した、例えば、図１３Ａの輝度画像３０１のような輝度画像と、ステップ９０３で作成した、例えば、図１４Ａの最大輝度蓄積画像３１２のような最大輝度蓄積画像に対し、図１３Ｂ、図１４Ｂに示すような横軸に輝度値、縦軸に画素数のヒストグラムをそれぞれ作成する。

ステップ９０５では、計数部３１が、予め設定されている所定の第１基準輝度値Ｌ１を動作メモリ部から得て、ステップ９０４で作成した輝度画像ヒストグラムに対し、図１３Ｂに示すような、第１基準輝度値Ｌ１以下となる計数範囲Ｔ１にある画素数を計数し、輝度頻度ＬＮとする。ステップ９０６では、計数部３１が、予め設定している所定の第２基準輝度値Ｌ２を動作メモリ部から得て、ステップ９０４で作成した最大輝度蓄積画像ヒストグラムに対し、図１４Ｂに示すような、第２基準輝度値Ｌ２以上となる計数範囲Ｔ２にある画素数を計数し、最大輝度蓄積頻度ＬＭＸとする。

ステップ９０７では、ステップ９０５で求めた輝度頻度ＬＮが、動作メモリ部に記憶している第１基準画素数Ｌ１以下であるかを判断する。ステップ９０７の判定がＮｏであれば、ステップ９１１に進む。判定がＹｅｓの場合には、ステップ９０８に進む。

ステップ９０８は、ステップ９０７において、輝度頻度ＬＮが第１基準画素数Ｌ１を超えている場合、すなわち、第１基準輝度値Ｌ１以下の画素数が、第１基準画素数Ｌ１より多い場合である。このとき、このスライス画像を得た高さ位置は所定測定範囲外と判定し、測定条件設定部３３で測定ピッチを測定範囲外ピッチ（粗い測定ピッチ）に設定し、ステップ９０９に進む。

ステップ９０７で判定がＮｏの場合、すなわち、輝度頻度ＬＮが第１基準画素数Ｌ１以下の画素数が、第１基準画素数Ｌ１以下である場合、現在の高さ位置を所定測定範囲内と判断し、測定条件設定部３３で測定ピッチを測定範囲内ピッチ（細かい測定ピッチ）に設定し、ステップ９１２へ進む。

なお、ここで、設定する測定ピッチは、測定ピッチ取得部３２により、レボルバ１３に搭載されている複数の対物レンズ７のうち、光軸上に搭載されている対物レンズの対物倍率情報から、対物倍率毎に予め設定されている測定範囲内ピッチと、測定範囲外ピッチとを取得した値である。

上記のように輝度頻度ＬＮと第１基準画素数Ｌ１とを比較することで、取込んだスライス画像が、観察試料８の所定測定範囲かどうかの判断を行っている。スライス画像内の第１基準輝度値Ｌ１以下の画素数である輝度頻度ＬＮが第１基準画素数Ｌ１を超えるということは、例えば図１３Ａの輝度画像３０１のように、該スライス画像全体がほぼ低輝度値であることを意味しており、共焦点画像の特徴を考慮すれば、該スライス画像を取込んだ高さ位置の観察試料８の測定平面以外の箇所に焦点位置があると判断できる。

ステップ９０９では、ステップ９０６において求めた最大輝度蓄積頻度ＬＭＸが第２基準画素数Ｌ２を超えているかを比較し、取込みを終了するかの判断を行っている。このように、最大輝度蓄積頻度ＬＭＸと第２基準画素数Ｌ２とを比較し、計数範囲Ｔ２にある画素数を計数することで、全画素内で、観察試料８の測定対象となる測定平面の高さ情報が取得できた画素数がどれだけ検出されたかを判断している。ここで、最大輝度蓄積頻度ＬＭＸが第２基準画素数Ｌ２を超えるということは、例えば図１４Ａの最大輝度蓄積画像３１２のように、観察試料８上のいくつかの測定平面に焦点位置がある状態が検出されたと考えられる。ここで、第２基準画素数Ｌ２の値は、取込み時間に応じて変動する閾値であり、ステップ９０７の条件を満足している時間に応じて、第２基準画素数Ｌ２値を減少させることで、取込みが終了できなくなることを防いでいる。判断がＮｏの場合には、さらにスライス画像の取り込みを継続するため、ステップ９１２に進む。

ステップ９１２では、ステップ９０８、またはステップ９１１で設定した測定ピッチを測定ピッチ取得部２０から得る。また、レボルバ１３に搭載されている複数の対物レンズ７のうち、光軸上に搭載されている対物レンズ７の対物倍率情報から、対物倍率毎に予め設定されている基本測定範囲、すなわち、対物レンズ７の倍率に依存するとともに、合焦範囲を含み、しかも三次元画像の生成が可能なように設けられる所定測定範囲を動作メモリ部から得て、Ｚ駆動制御部３４によりＺレボルバ１６の駆動速度を求め、ステップ１３へ進む。

ステップ９１３では、ステップ９１２で求めたＺレボルバ駆動速度でＺレボルバ１６の高さ位置を観察試料８から離れる上方へと移動させていく。そして、再びステップ９０２へと進み次のスライス画像取込みを行う。

以上のように取込みを続けて、ステップ９０９にて最大輝度蓄積頻度ＬＭＸが第２基準画素数Ｌ２を超えた場合に、取込みを終了しステップ９１０へと進む。ステップ９１０では、三次元画像の構築を行い、処理を終了する。

第３の実施の形態において、計数部３１が、本発明の画素数係数手段に相当し、測定条件設定部３３が、画素数比較手段に相当する。
以上説明したように、第３の実施の形態による共焦点顕微鏡装置によれば、計数部３１は、ある高さ位置で取込んだスライス画像における、各画素の輝度が第１基準輝度値Ｌ１以下の画素数を輝度頻度ＬＮとして求める。輝度頻度ＬＮが、第１基準画素数Ｌ１以下の場合には、測定条件設定部３３は、現在の高さ位置を所定測定範囲外と判定し、測定ピッチを測定範囲外ピッチに設定する。輝度頻度ＬＮが、第１基準画素数Ｌ１を超えた場合には、現在の高さ位置が所定測定範囲内と判定し、測定ピッチを測定範囲内ピッチに設定する。

一方、各画素毎に最大輝度を蓄積した、最大輝度蓄積画像を作成し、最大輝度が第２基準輝度値Ｌ２を超える画素数を最大輝度蓄積頻度ＬＭＸとして算出する。最大輝度蓄積頻度ＬＭＸが、測定時間に応じて定められた第２基準画素数Ｌ２を越える際には、すべての測定対象面を検出したと判定し、処理を終了する。

第３の実施の形態において、計数部３１は、本発明の画素数計数手段に相当し、測定条件設定部３３は、画素数比較手段に相当する。
以上のように、第３の実施の形態による共焦点顕微鏡装置によれば、第１の実施の形態および第２の実施の形態と同様に、観察試料の測定対象平面に応じた所定測定範囲と、対象外の所定測定範囲外を区別してそれぞれの測定ピッチを設定できるため、複数段差のある観察試料の対象平面の三次元画像を作成することができ、かつ、スライス画像の取込み時間も短縮することができる。

さらに、第１の実施の形態で行っていた測定範囲と測定ピッチの設定を観察者に行わせることもなく、第２の実施の形態で行っていた測定対象平面を観察画像上で指定するといった操作もなく、自動的に取込みを行うことができるため、画像取込み開始前の測定条件設定時間や、所定測定範囲検出時間をより短縮でき、かつ複数段差のある観察試料に対して測定対象平面の三次元画像を得られる。さらに、高段差の観察試料に対しても、測定ピッチを変更しながらスライス画像の取得を行うため測定時間の短縮できる。

（変形例）
ここで、上記第１から第３の実施の形態の変形例について説明する。上記実施の形態と同様の部分については詳細説明を省略する。本変形例は、第１から第３の実施の形態において、測定範囲外ピッチを用いる際に、図１で説明した共焦点顕微鏡装置１００における二次元走査部６において、観察試料に照射されるレーザ光を二次元に走査する間隔を、ＸＹ方向のどちらか一方、または両方向に間引いて取込む。このようにすることで、画像サイズが小さくなり、取得する画像データ量を減らすことができ、かつ取込み時間が短縮できる。

なお、本発明は、以上に述べた実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の構成または実施形態を採用することができる。例えば、顕微鏡本体１の光学的構成については、共焦点顕微鏡であれば、例えば、ＬＥＤ光源による観察光学系を備えない例など、他の構成でもよい。

上記実施の形態および変形例においては、観察試料８に対し対物レンズ７など光学系を移動させて距離を変化させていたが、観察試料８と対物レンズ７との少なくとも一方を移動させるようにすればよい。

１ 顕微鏡本体
２ コントローラ
３ 表示部
４ レーザ光源
５ 偏光ビームスプリッタ
６ 二次元走査部
７ 対物レンズ
８ 観察試料
１０ａ、１０ｂ 結像レンズ
１１ ピンホール
１３ レボルバ
１６ Ｚレボルバ
１２ 光検出器
１９ 測定条件情報指定部
２０ 測定ピッチ取得部
２１ 測定条件記憶部
２２ Ｚ駆動制御部

Claims (18)

1. 観察試料の観察面に光を集束して二次元走査するとともに、前記光の光軸方向に集束位置を移動しながら共焦点画像を取得する共焦点顕微鏡装置であって、
   前記観察試料を載置するステージと、
   前記光軸上に配置され、所定の倍率で前記光を前記観察面に集束する少なくとも１つの対物レンズと、
   前記観察試料の所望の前記観察面に前記光を集束させるために前記ステージと前記対物レンズとの距離を所定間隔で変化させる移動手段と、
   前記距離に応じて前記所定間隔を設定する測定条件設定手段と、
   前記測定条件設定手段が設定した前記所定間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御する駆動制御手段と、
   前記観察面からの反射光を検出する光検出手段と、
   前記所定間隔で変化させた前記距離毎に前記観察面上に前記光を二次元走査することにより前記光検出手段が検出した検出信号に基づき複数の画素よりなる二次元画像を生成する二次元画像生成手段と、
   前記二次元画像生成手段で生成された複数の前記二次元画像を用いて三次元画像を生成する三次元画像生成手段と、
   を有することを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
2. 前記測定条件設定手段は、
   前記距離の所定の上限および所定の下限と、前記距離が前記上限から下限までの所定距離範囲内において前記距離を変化させる第１の間隔と、前記第１の間隔より大きい第２の間隔とを少なくとも１組設定し、
   前記駆動制御手段は、
   前記所定距離範囲内では前記第１の間隔で前記距離を変化させ、前記所定距離範囲外では前記第２の間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御することを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡装置。
3. 前記対物レンズの倍率に応じた第１のレンズ依存間隔と第１のレンズ依存間隔より大きい第２のレンズ依存間隔とを保持する測定間隔記憶手段と、
   前記光軸上に配置された前記対物レンズの倍率を検出し、前記測定間隔記憶部から前記対物レンズの倍率に応じた前記第１のレンズ依存間隔と前記第２のレンズ依存間隔とを取得する測定間隔取得手段と、
   をさらに有し、
   前記測定条件設定手段は、
   前記測定間隔取得手段が取得した前記第１のレンズ依存間隔を前記第１の間隔として設定し、前記第２のレンズ依存間隔を前記第２の間隔として設定することを特徴とする請求項２に記載の共焦点顕微鏡装置。
4. 前記測定条件設定手段は、
   前記距離の前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を設定するための画面を表示する設定画面表示手段、
   を有することを特徴とする請求項２に記載の共焦点顕微鏡装置。
5. 前記設定画面表示手段で設定された前記上限、前記下限、前記第１の間隔、および前記第２の間隔を測定条件として記憶する測定条件記憶手段、
   をさらに備えることを特徴とする請求項４に記載の共焦点顕微鏡装置。
6. 前記測定条件設定手段は、前記測定条件記憶手段から前記測定条件を読込み、
   前記駆動制御手段は、読込んだ前記測定条件に応じて前記移動手段を駆動制御することを特徴とする請求項５に記載の共焦点顕微鏡装置。
7. 前記観察試料において、少なくとも一点の測定指示点を指定する測定指示点指定手段と、
   各々の前記測定指示点に前記光を集束させる場合の前記距離を少なくとも１つの合焦距離として計測する合焦距離計測手段と、
   をさらに有し、
   前記測定条件設定手段は、
   少なくとも１つの前記合焦距離に応じて前記所定間隔を設定することを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡装置。
8. 前記測定条件設定手段は、
   前記距離の上限および下限と、前記距離が前記上限から下限までの所定距離範囲内において前記距離を変化させる第１の間隔と、前記第１の間隔より大きい第２の間隔とを少なくとも１組設定し、
   前記駆動制御手段は、
   前記所定距離範囲内では前記第１の間隔で前記距離を変化させ、前記所定距離範囲外では前記第２の間隔で前記距離を変化させるように前記移動手段を駆動制御することを特徴とする請求項７に記載の共焦点顕微鏡装置。
9. 前記対物レンズの倍率に応じた第１のレンズ依存間隔と第２のレンズ依存間隔とを保持する測定間隔記憶手段と、
   前記光軸上に配置された前記対物レンズの倍率を検出し、前記測定間隔記憶部から前記対物レンズの倍率に応じた前記第１のレンズ依存間隔と前記第２のレンズ依存間隔とを取得する測定間隔取得手段と、
   をさらに有し、
   前記測定条件設定手段は、
   前記測定間隔取得手段が取得した前記第１のレンズ依存間隔を前記第１の間隔として設定し、前記第２のレンズ依存間隔を前記第２の間隔として設定することを特徴とする請求項７または請求項８に記載の共焦点顕微鏡装置。
10. 前記観察面を表示する観察面表示手段と、
    前記観察面表示手段において、前記観察面上の少なくとも１点を特定する測定指示点特定手段と、
    をさらに有し、
    前記測定指示点指定手段は、前記測定指示点特定手段により特定された前記点を測定指示点として指定することを特徴とする請求項７から請求項９のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡装置。
11. 前記測定指示点を記憶する測定指示点記憶手段、
    をさらに備えることを特徴とする請求項７から請求項１０に記載の共焦点顕微鏡装置。
12. 前記合焦距離を記憶する合焦距離記憶手段、
    をさらに備えることを特徴とする請求項７から請求項１１のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡装置。
13. 前記合焦距離を含む前記距離の範囲であって、合焦状態である範囲を合焦範囲として検出する合焦範囲検出手段、
    をさらに有し、
    前記測定条件設定手段は、
    前記合焦範囲の最大距離に所定距離を加えた距離を前記上限として設定し、
    前記合焦範囲の最大距離から所定距離を減じた距離を前記下限として設定することを特徴とする請求項８に記載の共焦点顕微鏡装置。
14. 前記三次元画像生成手段が前記三次元画像を生成可能な最低数の前記平面画像を得るために必要な最低の前記所定距離範囲を最低距離範囲として記憶する最低距離範囲記憶手段、
    をさらに有し、
    前記測定条件設定手段は、
    設定された前記所定距離範囲が前記最低距離範囲記憶手段に記憶された前記最低距離範囲より小さい場合には、前記所定距離範囲を前記最低距離範囲に一致させるように、前記上限および前記下限を設定変更することを特徴とする請求項７から請求項１３のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡装置。
15. 前記平面画像を構成する各前記画素の輝度を所定の輝度しきい値と比較し、前記輝度しきい値以下の画素数を輝度しきい値以下画素数として計数する画素数計数手段、
    をさらに有し、
    前記測定条件設定手段は、
    前記輝度しきい値以下画素数に応じて、前記距離を変化させる所定間隔を設定することを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡装置。
16. 前記輝度しきい値以下画素数と所定の画素数しきい値とを比較する画素数比較手段、
    をさらに有し、
    前記測定条件設定手段は、
    前記画素数比較手段の比較結果に応じて、前記距離を変化させる所定間隔を設定することを特徴とする請求項１５に記載の共焦点顕微鏡装置。
17. 前記測定条件設定手段は、
    前記輝度しきい値以下画素数が前記画素数しきい値以下の場合には、前記距離を変化させる所定間隔を第１の間隔に設定し、
    前記輝度しきい値以下画素数が前記画素数しきい値より大きい場合には、前記所定間隔を第１の間隔より大きい第２の間隔に設定することを特徴とする請求項１６に記載の共焦点顕微鏡装置。
18. 前記二次元走査は、変更可能な所定の間隔で行うことを特徴とする請求項１から請求項１７のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡装置。