WO2022145391A1

WO2022145391A1 - 走査型共焦点顕微鏡および走査型共焦点顕微鏡の調整方法

Info

Publication number: WO2022145391A1
Application number: PCT/JP2021/048339
Authority: WO
Inventors: 竜也佐藤; 皐月富澤; 淳竹内; 諭史池田
Original assignee: 株式会社ニコン
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2022-07-07

Abstract

走査型共焦点顕微鏡は、照明光を供給する光源装置と、照明光を被検物に集光する対物光学系と、集光された照明光を被検物上で走査する走査部と、集光された照明光により被検物から生ずる光を集光する結像光学系と、結像光学系による集光光を検出する検出器と、検出器の受光領域を設定する開口部を形成する絞り部と、絞り部の開口部の大きさを第１領域と、第１領域より大きな開口の第２領域とに設定する開口制御部と、第２領域の開口部と集光光との相対的位置を計測する計測制御部と、を備え、計測制御部は、第２領域において開口部の端部に対して集光光を相対的に移動させる移動制御と、検出器に第２領域における光強度の変化を検出させる検出制御と、光強度の変化に基づいて、第２領域における集光光の相対的位置を算出する算出制御と、を行う。

Description

走査型共焦点顕微鏡および走査型共焦点顕微鏡の調整方法

　本発明は、走査型共焦点顕微鏡および走査型共焦点顕微鏡の調整方法に関する。
　本願は、２０２０年１２月２８日に日本に出願された特願２０２０－２１９６３７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

　従来から、光学系の共焦点位置とピンホールの位置とを一致させるレーザー顕微鏡が知られている（例えば特許文献１）。しかしながら、ピンホールの位置を試料からの反射光あるいは試料からの蛍光の集光位置に正確に合わせることは、対物レンズの収差特に色収差により容易ではなく、本来の性能を維持することは難しかった。

特開２００５－１８９２９０号公報

　第１の態様による走査型共焦点顕微鏡は、照明光を供給する光源装置と、前記照明光を被検物に集光する対物光学系と、前記集光された照明光を前記被検物上で走査する走査部と、前記集光された照明光により前記被検物から生ずる光を集光する結像光学系と、前記結像光学系による集光光を検出する検出器と、前記検出器の受光領域を設定する開口部を形成する絞り部と、前記絞り部の前記開口部の大きさを第１領域と、前記第１領域より大きな開口の第２領域とに設定する開口制御部と、前記第２領域の開口部と前記集光光との相対的位置を計測する計測制御部と、を備え、前記計測制御部は、前記第２領域において前記開口部の端部に対して前記集光光を相対的に移動させる移動制御と、前記検出器に前記第２領域における光強度の変化を検出させる検出制御と、前記光強度の変化に基づいて、前記第２領域における前記集光光の相対的位置を算出する算出制御と、を行う。
　第２の態様による走査型共焦点顕微鏡の調整方法は、照明光を供給することと、対物光学系により前記照明光を集光することと、前記集光された照明光を被検物上で走査することと、前記集光された照明光により前記被検物から生ずる光を結像光学系により集光することと、前記結像光学系による集光光を検出器により検出することと、前記検出器の受光領域を設定する開口部を有する絞り部に対して、前記開口部の大きさを第１領域と、前記第１領域よりも大きな開口の第２領域とに設定することと、前記第２領域において前記開口部の端部に対して前記集光光を相対的に移動することと、前記検出器により前記第２領域における光強度の変化を検出することと、前記光強度の変化に基づいて、前記第２領域における前記集光光の相対的位置を算出することと、を備える。
　なお、集光光により被検物から生ずる光とは、照明光により被検物からの蛍光を含み、照明光による反射光や透過光も含むものとする。

実施の形態による走査型共焦点顕微鏡の構成の一例を模式的に示す図である。実施の形態の絞り部の構成を模式的に示す図である。集光光の集光位置およびピンホールの中心のｘ方向の位置関係を模式的に示す図である。集光光の検出強度を模式的に示す図である。調整工程における処理を説明するフローチャートである。検査準備処理における動作を説明するフローチャートである。

　図面を参照しながら一実施の形態の走査型共焦点顕微鏡について説明を行う。
　図１は実施の形態の走査型共焦点顕微鏡として顕微鏡１００の構成の一例を模式的に示す図である。
　顕微鏡１００は、光源１と、照明レンズ２と、ダイクロイックミラー３と、走査部４と、対物光学系としての対物レンズ５と、フィルタ７と、結像光学系としての集光レンズ８と、絞り部９と、光検出器１０と、制御部１１と、モニタ１２とを有する。
　以下の説明において、対物レンズ５の光軸に平行な図１の紙面下向き方向を＋ｚ方向とするｘｙｚ座標系を適宜設定する。

　光源１は、多色（複数波長）の点を個別に出射可能な光源である。なお、光源１は、異なる複数の単色の光源により構成されてもよい。レーザー等の光源１から＋ｘ方向に向けて出射した照明光Ｌｉは、照明レンズ２により平行光とされ、ダイクロイックミラー３により＋ｚ方向に反射される。照明光Ｌｉは、走査部４を経て対物レンズ５に入射し、対物レンズ５により、ステージ６上に保持されている試料１６の検査面に集光される。なお、検査面とは試料１６において検査しようとする面をいう。

　走査部４は、後述する制御部１１により制御され、対物レンズ５により集光される照明光Ｌｉを試料１６の検査面上で走査する。走査部４は、例えば、照明光Ｌｉを試料１６の検査面上にてｘ方向に変位させるミラーとｙ方向に変位させるミラーと、各ミラーを駆動させるモーター等の駆動部とを有するガルバノスキャナである。
　なお、制御部１１が、試料１６を保持するステージ６を制御してｘ方向とｙ方向とに異動させることにより、照明光Ｌｉが集光する位置と試料１６とを相対走査させる構成としてもよい。また、走査部４による走査と、ステージ６による走査とを両方行う構成としてもよい。
　光源１と試料１６の検査面とは、照明レンズ２から対物レンズ５までの光学系に対して共役となっている。

　試料１６としては、例えば予め蛍光染色された細胞などを使用するが、必ずしも蛍光を発する物質には限られない。また、試料１６としては、蛍光を発する物質を使用する場合には、光源１の波長として、試料１６に含まれる蛍光物質を励起する波長を選択することが好ましい。なお、試料１６としては、蛍光を発する物質を使用する場合には、光源１の波長として、試料１６に含まれる蛍光物質を多光子励起する波長を選択してもよい。

　照明光Ｌｉにより照射された試料１６の検査面の照射点から発生した蛍光は、対物レンズ５により平行光になる。蛍光は、ダイクロイックミラー３を透過し、フィルタ（波長選択フィルタ）７により余分な波長の光が除去される。集光レンズ８は、平行光である蛍光を集光する。すなわち、集光レンズ８は、試料１６を経由した走査光（蛍光）を集光する結像光学系である。集光レンズ８は、照射点の像を絞り部９のピンホール９０を通して光検出器１０の検出面上に結像する。すなわち、試料１６における照射点と光検出器１０における集光点とは共役の関係になっている。絞り部９は光検出器１０の直前（＋ｚ方向）に配置され、光検出器１０の検出面とピンホール９０とが近接されるように配置される。光検出器１０はピンホール９０を通過して集光レンズ８により検出面に集光した集光光を検出する。制御部１１は、走査部４による走査と同期させて絞り部９を移動させて試料１６における各照射点に対応する光検出器１０の出力に基づく複数の画像信号に対応する検出信号から２次元画像を生成し、モニタ１２に表示する。
　なお、絞り部９の構成については詳細な説明を後に行う。

　制御部１１は、マイクロプロセッサやその周辺回路等を有し、不図示の記憶媒体（例えばフラッシュメモリ等）に予め記憶されている制御プログラムを読み込んで実行することにより、顕微鏡１００の各部を制御するプロセッサーである。なお、制御部１１は、ＣＰＵや、ＡＳＩＣや、プログラマブルＭＰＵ等により構成されてよい。制御部１１は、走査制御部１１１と、開口制御部１１２と、計測部１１３と、画像生成部１１４と、絞り制御部１１５と、フラッシュメモリ等の記憶媒体であるメモリ５０とを備える。

　走査制御部１１１は、走査部４の動作を制御する。画像生成部１１４は、光検出器１０を構成する複数の光電変換部からの検出信号に基づいて、試料１６の２次元画像（２次元画像データ）を生成する。開口制御部１１２は、絞り部９を制御して、開口部であるピンホール９０の大きさが異なる第１領域または第２領域の何れかとなるように設定する。計測部１１３は、第２領域を形成すように設定されたときのピンホール９０と光検出器１０に集光する集光光との相対的位置を計測する。このとき、計測部１１３は、第２領域を形成するように設定されたピンホール９０の端部に対して集光光を相対的に移動させる移動制御と、光検出器１０に第２領域における光強度の変化を検出させる検出制御と、光強度の変化に基づいて、第２領域における集光光の相対的位置を算出する算出制御とを行う。絞り制御部１１５は、試料１６の計測するための計測準備処理の際に、計測部１１３により算出された相対位置に基づいて、絞り部９のピンホール９０の中心位置を変位させる。　なお、開口制御部１１２と計測部１１３との詳細については、説明を後に行う。

　次に絞り部９の構成について説明を行う。
　図２は、絞り部９の構成を模式的に示す平面図である。なお、図２においても、図１に設定されたｘｙｚ座標系と同様の直交座標系を設定する。
　絞り部９は、光検出器１０に対して集光レンズ８により集光された集光光を通過させる開口を設定するための開口部であるピンホール９０をその大きさを可変に形成するように構成される。具体的には、絞り部９は、第１絞り部９１と第２絞り部９２とを有する。第１絞り部９１は集光レンズ８の光軸（すなわちｚ軸）に直交する平面内におけるｘ方向とｙ方向とに移動可能に構成される。第２絞り部９２は、第１絞り部９１に対してｘ方向とｙ方向とに移動することで、ピンホール９０の大きさを変化させるように構成される。

　第１絞り部９１はｚ方向に薄いＬ字型形状の板状の部材であり、共に矩形の第１部分９１１と、第２部分９１２とを有する。第１絞り部９１は、第１移動部９１３により、ｘｙ平面上にてｘ方向とｙ方向とに移動する。すなわち、第１絞り部９１は、ｘｙ平面上を任意の方向に移動可能である。第１移動部９１３は、例えば、ｘ方向およびｙ方向へのガイドレール、ボールネジ、およびボールネジを駆動させるモーター等により構成され、制御部１１の計測部１１３により制御される。第１絞り部９１のｘ方向の位置（たとえば、第２部分９１２の第２辺９１２ａのｘ方向の位置）およびｙ方向の位置（たとえば、第１部分９１１の第１辺９１１ａのｙ方向の位置）は、リニアエンコーダ等を用いて計測される。

　第２絞り部９２はｚ方向に薄いＬ字型形状の板状の部材であり、共に矩形の第３部分９２１と、第４部分９２２とを有する。第２絞り部９２は、第２移動部９２３により、ｘｙ平面上にてｘ方向とｙ方向とに移動する。すなわち、第２絞り部９２は、ｘｙ平面上を任意の方向に移動可能である。第２絞り部９２は、第２移動部９２３によって、ｘｙ平面上を第１絞り部９１に対して相対的に移動することにより、第１絞り部９１に対して、図２（ａ）に示す矢印ＡＲ１の方向に相対的に移動する。第２移動部９２３は、例えば、ｘ方向およびｙ方向のガイドレール、ボールネジ、およびボールネジを駆動させるモーター等により構成され、制御部１１の開口制御部１１２により制御される。第２絞り部９２のｘ方向の位置（たとえば、第４部分９２２の第４辺９２２ａのｘ方向の位置）およびｙ方向の位置（たとえば、第３部分９２１の第３辺９２１ａのｙ方向の位置）は、リニアエンコーダ等を用いて計測される。

　図２（ａ）に示す状態から、第２絞り部９２が第２移動部９２３により矢印ＡＲ１に沿って第１絞り部９１に接近することにより、図２（ｂ）に示す状態に移行する。このとき、第１絞り部９１の第１部分９１１の第１辺９１１ａおよび第２部分９１２の第２辺９１２ａと、第２絞り部９２の第３部分９２１の第３辺９２１ａおよび第４部分９２２の第４辺９２２ａとにより囲まれる領域が開口部、すなわちピンホール９０を形成する。第１絞り部９１と第２絞り部９２とがＬ字形状を有することにより、形成されるピンホール９０は矩形形状となる。

　上記のリニアエンコーダからの出力と、上記の第１辺９１１ａ、第２辺９１２ａ、第３辺９２１ａ、および第４辺９２２ａのそれぞれのｘ方向およびｙ方向における位置との関係は予めメモリ５０に記憶される。これにより、第２移動部９２３が第２絞り部９２の矢印ＡＲ１に沿った移動量を制御することにより、ピンホール９０の形状（大きさ）を制御することができる。また、第２移動部９２３が移動量を制御することにより、ピンホール９０が第１領域と、第１領域より大きな第２領域とを有するように設定することができる。第１領域は、試料１６の検査を行う際に設定され、検査用に設定された波長の光が通過可能な大きさを有する。第２領域は、後述するように集光レンズ８による集光光の集光位置とピンホール９０の中心位置とを調整する工程（調整工程）において設定され、試料１６の検査に用いる全ての波長の光が通過可能な大きさを有する。

　以下、調整工程について説明する。
　調整工程においては、まず、絞り部９のピンホール９０を第２領域に設定する。制御部１１の開口制御部１１２は、上述したように、絞り部９のピンホール９０が第２領域を形成するように、その大きさを制御する。この場合、開口制御部１１２は、第２移動部９２３に第２絞り部９２のＸ方向およびｙ方向への移動量を示す移動信号を出力し、第２移動部９２３はこの移動量に従って、第２絞り部９２をｘ方向およびｙ方向（すなわち、図２（ａ）の矢印ＡＲ１に沿う方向）に移動する。

　この状態で、レーザー等の光源１から試料１６に照明光Ｌｉを集光し、試料１６からの反射光を集光レンズ８により集光する。計測部１１３は、絞り部９のポンホール９０が設定した第２領域が変化しないように、第１移動部９１３および第２移動部９２３により第１絞り部９１および第２絞り部９２を移動させて、ピンホール９０と集光レンズ８により集光された集光光との相対的位置を変化させる。計測部１１３は、ピンホール９０の端部近傍を集光光が相対的に移動する際の光検出器１０の検出強度の変化に基づいて、第２領域における集光光の相対的位置を算出する。

　光源１からは検査に用いる全ての波長から選択された一つの波長の照明光Ｌｉが出射され、照明光Ｌｉが集光された試料１６からの光（反射光）は、最終的に集光レンズ８により絞り部９に到達する。絞り部９は光検出器１０の検出面の直前に配置されており、光検出器１０はピンホール９０を通過した集光光を検出して検出信号を出力する。なお、照明光Ｌｉの波長が変更された場合には、倍率色収差によりｘｙ平面上における集光光の集光位置は変化する。図２（ｂ）は、ピンホール９０の中心Ｃと集光光中心ＡＸとが一致していない場合を示す。このような場合、計測部１１３は、集光光の位置がピンホール９０の端部に対して相対的に移動させる移動制御を行い、光検出器１０に検出される光強度の変化を検出させる検出制御を行う。これにより、ピンホール９０の中心Ｃと集光光中心ＡＸとを一致させる絞り部９の位置が検出される。なお、以下の説明においては、絞り部９をｘｙ平面上で移動させることにより、ピンホール９０の端部に対して集光光を相対的に移動させる場合を例に挙げる。

　図３に、集光光中心ＡＸおよびピンホール９０の中心Ｃの位置関係と、集光光の光強度との関係を模式的に示す。図３（ａ）、（ｃ）、（ｅ）は集光光中心ＡＸおよびピンホール９０の中心Ｃのｘｙ平面における位置関係を模式的に示し、図３（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）は、それぞれ図３（ａ）、（ｃ）、（ｅ）に示す位置関係のときの集光光の強度を示す。図３においては、集光光の光強度をＬ１で示し、点Ｐ１は第４辺９２２ａのＸ方向の位置を示す。
　図３に示すように、集光光の光強度Ｌ１は、ｘ方向において、集光光中心ＡＸにピーク値を有するガウス分布を示す。

　図３（ａ）は、集光光中心ＡＸが第２絞り部９２の第４辺９２２ａよりも＋ｘ方向に位置する場合を示す。この場合、集光光の大部分が絞り部９により遮光されるため、図３（ｂ）に示すように、集光光のうち－ｘ方向の一部のみがピンホール９０を通過して光検出器１０に入射する。したがって、光検出器１０により検出される集光光の強度（検出強度）は低い。

　図３（ａ）に示す状態から、計測部１１３は第１移動部９１３と第２移動部９２３とを制御して、第１絞り部９１と第２絞り部９２とを＋ｘ方向に同一の移動量だけ移動させる。すなわち、計測部１１３は、ピンホール９０に第２領域を形成させた状態で、絞り部９を＋ｘ方向に移動させる。計測部１１３は、ピンホール９０のｘ方向に交差する矩形の第１辺（図３（ａ）の例では第２絞り部９２の第４部分９２２の第４辺９２２ａ）において、ピンホール９０の端部の近傍で、絞り部９をｘ方向に沿って移動させることにより、第２領域に対する集光光の相対移動を行う。
　絞り部９が上記のように＋ｘ方向に移動することにより、集光光中心ＡＸは、絞り部９のピンホール９０に対して相対的に－ｘ方向に移動する。これに伴って、ピンホール９０を通過する集光光の範囲が増加する。

　図３（ｃ）は、絞り部９を＋ｘ方向に移動させ、集光光中心ＡＸがピンホール９０の＋ｘ方向の第１辺（すなわち第２絞り部９２の第４部分９２２の第４辺９２２ａ）とほぼ重なった場合を示す。この場合、図３（ｄ）に示すように、集光光の光強度Ｌ１のピークがピンホール９０の＋Ｘ方向の端部と一致する。このような状態における絞り部９の＋ｘ方向の移動においては、光検出器１０での集光光の検出強度の増加率（傾き）が最大となる。

　図３（ｅ）は、ｘ方向において、全集光光がピンホール９０を通過して光検出器１０に入射する場合を示す。この場合、図３（ｆ）に示すように、集光光は実質的に全てピンホール９０を通過する。このため、光検出器１０での検出強度は最大値となり、この状態から絞り部９が＋ｘ方向に多少移動しても検出強度は変化しない。

　上記のように、計測部１１３が、矩形のピンホール９０の＋ｘ方向の端部である第１辺（図３の例では第２絞り部９２の第４部分９２２の第４辺９２２ａ）に対して集光光をｘ方向に横切って相対移動を行うように、絞り部９を移動させる。この結果、検出強度が、絞り部９の位置に応じて変化する。
　図４は、絞り部９のｘ方向の移動量（ｘ方向の位置）と光検出器１０による検出強度との関係を示す図である。図４は、横軸を絞り部９の＋ｘ方向への移動量、縦軸は検出強度である。図４における検出強度の範囲Ｒｅ１は、集光光中心ＡＸとピンホール９０の中心Ｃとのｘ方向の位置関係が図３（ａ）に示す状態から図３（ｃ）に示す状態に至るまでの検出強度の変化に対応する。図４における光の強度の範囲Ｒｅ２は、集光光中心ＡＸとピンホール９０の中心Ｃとのｘ方向の位置関係が図３（ｃ）に示す状態から図３（ｅ）に示す状態となるまでの検出強度の変化に対応する。図４において、検出強度の値Ｔｈは、検出強度の増加の割合の変曲点を示す。この変曲点における検出強度の値Ｔｈは、第２絞り部９２の第４部分９２２の第４辺９２１ａのｘ方向の位置が集光光中心ＡＸの位置とほぼ一致するときの検出強度であり、図３（ｃ）に示す場合の検出強度に対応する。

　計測部１１３は、上記のようにして得られた検出強度の変化に基づいて、第２領域に設定されたピンホール９０に対する集光光のｘ方向の相対位置を算出する算出制御を行う。この場合、計測部１１３は、メモリ５０に予め記憶された、リニアエンコーダの出力と、ピンホール９０の各辺（第１辺９１１ａ、第２辺９１２ａ、第３辺９２１ａ、および第４辺９２２ａ）のぞれぞれのｘ方向における位置との関係に基づくピンホール９０の形状（ピンホール９０の大きさ）と、検出強度の変化とに基づいて、ピンホール９０と集光光とのｘ方向の相対的位置を算出する。例えば、計測部１１３は、上述した検出強度の変曲点に相当する値Ｔｈのときのピンホール９０の位置に基づいて、集光光のｘｙ平面上での位置を算出する。この場合、計測部１１３は、リニアエンコーダからの出力により、検出強度の値がＴｈのときの第２絞り部９２の第４辺９２２ａのｘ方向の位置（座標）を検出する。計測部１１３は、検出した第４辺９２２ａのｘ座標にピンホール９０のｘ方向の長さの半分の値を加算した位置を、集光光中心ＡＸとピンホール９０の中心Ｃとが一致するときの絞り部９の位置として算出する。算出された第４辺９２２ａの位置は、位置情報として後述するようにメモリ５０に記憶される。なお、ピンホール９０の－ｘ方向（すなわち第１絞り部９１の第２辺９１２ａ）の端部にて移動制御、検出制御および算出制御を行う場合には、計測部１１３は、検出した第２辺９１２ａのｘ座標からピンホール９０のｘ方向の長さの半分の値を減算した位置を、集光光中心ＡＸとピンホール９０の中心Ｃとが一致するときの絞り部９の位置として算出する。
　なお、計測部１１３は、変曲点に相当する検出強度の値Ｔｈに基づいて位置情報を算出する例に代えて、検出強度の最小値と最大値との中間値となるときのｘ座標に基づいて位置情報を算出してもよい。

　ｙ方向においても同様の処理を行う。すなわち、計測部１１３は、移動制御において、ピンホール９０のｙ方向に交差する矩形の第２辺（図２（ａ）の例では第２絞り部９２の第３部分９２１の第３辺９２１ａ）においてピンホール９０の端部の近傍でｙ方向に沿ってピンホール９０に対する集光光の相対移動を行う。この場合も、計測部１１３は、ピンホール９０のｙ方向に交差する矩形の第２辺（第３辺９２１ａ）の端部に対して集光光をｙ方向に横切って相対移動を行う。計測部１１３は、移動制御を行いながら光検出器１０に光強度の検出を行わせ（検出制御）、検出された光強度（検出強度）の変化に基づいてピンホール９０に対する集光光のｙ方向の相対位置を算出する算出制御を行う。この場合も、計測部１１３は、検出強度の変化とピンホール９０の大きさとに基づいて、ピンホール９０に対する集光光のｙ方向の相対的位置を算出する。
　以上の処理を行うことにより、計測部１１３は、集光レンズ８の光軸に直交するｘｙ平面におけるピンホール９０と集光光との相対的位置を算出する。

　上記の調整工程は、検査に使用する全ての波長の照明光Ｌｉおよび対物レンズ５に対して行われる。波長ごとおよび対物レンズ５ごとに算出されたピンホール９０に対する集光光のｘｙ平面における相対的位置は、位置情報としてメモリ５０に記憶される。このとき、位置情報は、照明光Ｌｉの波長および対物レンズ５の種類と対応付けされてメモリ５０に記憶される。

　図５のフローチャートを用いて、調整工程における処理について説明する。図５のフローチャートに示す各処理は、制御部１１においてＲＯＭに格納された制御プログラムを実行して行われる。
　ステップＳ１においては、制御部１１は装着された対物レンズ５の倍率等の情報を取得して、処理はステップＳ２へ進む。ステップＳ２においては、制御部１１は、光源１からの照明光Ｌｉの波長を設定して、処理はステップＳ３へ進む。ステップＳ３では、走査部４を制御して、試料１６の検査面上の集光位置を変更させて、処理はステップＳ４へ進む。

　ステップＳ４では、制御部１１の開口制御部１１２は、第２移動部９２３を制御して、第２絞り部９２をｘ方向およびｙ方向に移動して、ピンホール９０に第２領域を形成させて、処理はステップＳ５へ進む。ステップＳ５では、制御部１１の計測部１１３は、第１移動部９１３および第２移動部９２３を制御して、絞り部９をｘ方向およびｙ方向に移動させながら（移動制御）、光検出器１０にピンホール９０を通過した集光光の光強度を検出させて（検出制御）、処理はステップＳ６へ進む。ステップＳ６では、計測部１１３は、ステップＳ５で取得した検出強度の変化と、第２領域に設定されたピンホール９０の大きさとに基づいて、ピンホール９０に対する集光光の相対位置を算出し（算出制御）、処理はステップＳ７へ進む。

　ステップＳ７では、制御部１１は、検査に用いる全ての対物レンズ５および全ての波長の照明光Ｌｉに対して、ピンホール９０に対する集光光の相対位置が算出されたか否かを判定する。全ての対物レンズ５および全ての波長に対して相対位置の算出が行われた場合には、制御部１１はステップＳ７を肯定判定して、処理はステップＳ８へ進む。ステップＳ８では、制御部１１は、算出された相対位置を示す位置情報を、対物レンズ５の情報および波長と関連付けてメモリ５０に記憶して、処理を終了する。

　ステップＳ７において、相対位置の算出が行われていない対物レンズ５または波長がある場合には、制御部１１はステップＳ７を否定判定して、処理はステップ９へ進む。ステップＳ９では、制御部１１は、全ての波長に対して相対位置が算出されたか否かを判定する。全ての波長に対して相対位置が算出された場合（すなわち、相対位置の算出が行われていない対物レンズ５が存在する場合）、制御部１１は、ステップＳ９を肯定判定して処理はステップＳ１へ戻る。相対位置が算出されていない波長が存在する場合には、制御部１１はステップＳ９を否定判定して、処理はステップＳ２へ戻る。

　上記のように調整工程が行われた顕微鏡１００は、試料１６に対する検査を行うためにピンホール９０の設定を行う検査準備処理と、設定されたピンホール９０を用いて試料１６を検査する検査処理を行う。検査準備処理においては、制御部１１の開口制御部１１２は、第２移動部９２３を制御して、検査に用いる対物レンズ５と照明光Ｌｉの波長に応じて、ピンホール９０を第２領域より大きさが小さい第１領域を形成すように第２絞り部９２を移動させる。

　ピンホール９０が第１領域を形成するように設定されると、制御部１１の絞り制御部１１５は、メモリ５０に記憶された位置情報に基づいて、絞り部９をｘｙ平面上で移動させる。この場合、絞り制御部１１５は、検査に用いる対物レンズ５と照明光Ｌｉとに対応付けされた相対位置をメモリ５から読みだす。絞り制御部１１５は第１移動部９１３と第２移動部９２３とを制御して、読み出した相対位置にピンホール９０の中心Ｃが一致するように、第１絞り部９１と第２絞り部９２とをｘｙ平面上で移動させる。

　図６のフローチャートを用いて、検査準備処理について説明する。図６のフローチャートに示す各処理は、制御部１１においてＲＯＭに格納された制御プログラムを実行して行われる。
　ステップＳ１１においては、制御部１１は装着された対物レンズ５の倍率等の情報を取得して、処理はステップＳ１２へ進む。ステップＳ１２においては、制御部１１は、光源１からの照明光Ｌｉの波長を設定して、処理はステップＳ１３へ進む。ステップＳ１３では、走査部４を制御して、試料１６の検査面上の集光位置を変更させて、処理はステップＳ１４へ進む。

　ステップＳ１４では、開口制御部１１２は、第２移動部９２３を制御して第２絞り部９２をｘｙ平面上で移動させて、ピンホール９０に対物レンズ５および照明光Ｌｉの波長に応じた第１領域を形成させて、処理はステップＳ１５へ進む。ステップＳ１５では、絞り制御部１１５は、対物レンズ５と照明光Ｌｉに関連付けて記憶された位置情報をメモリ５０から読み出して、処理はステップＳ１６へ進む。ステップＳ１６では、絞り制御部１１５は、読み出した位置情報に基づいて、第１移動部９１３と第２移動部９２３とを制御して第１絞り部９１と第２絞り部９２とをｘｙ平面上で移動させ、ピンホール９０の中心Ｃと集光光中心ＡＸとを一致させて処理を終了する。

　顕微鏡１００による試料１６の検査処理は、上記のステップＳ１６が完了した段階で行われる。検査処理においては、制御部１１は光源１から照明光Ｌｉを出射させ、制御部１１の走査制御部１１１は走査部４の動作を制御して、照明光Ｌｉを試料１６の検査面上でｘ方向およびｙ方向に走査する。光検出器１０は、各走査位置において試料１６からの反射光のうちピンホール９０を通過した集光光を検出して、検出信号を出力する。制御部１１の画像生成部１１４は、光検出器１０からの検出信号に基づいて、試料１６の２次元画像（２次元画像データ）を生成する。制御部１１は、画像生成部１１４により生成された２次元画像をモニタ１２に表示する。

　上述した実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）顕微鏡１００の制御部１１は、絞り部９のピンホール９０の大きさを第１領域と、第１領域より大きな開口の第２領域とに設定する開口制御部１１２と、第２領域のピンホール９０と集光光との相対的位置を計測する計測部１１３と、を備える。計測部１１３は、第２領域においてピンホール９０の端部に対して集光光を相対的に移動させる移動制御と、光検出器に第２領域における光強度の変化を検出させる検出制御と、光強度（検出強度）の変化に基づいて、第２領域における集光光の相対的位置を算出する算出制御と、を行う。これにより、使用される対物レンズ５および照明光Ｌｉの波長に応じてｘｙ平面上で異なる集光光の集光位置を正確に把握することが可能になる。

（２）絞り部９は、集光レンズ８の光軸に直交するｘｙ平面内におけるｘ方向とｘ方向と直交するｙ方向とに移動可能な第１絞り部９１と、ピンホール９０の大きさを変化させるように第１絞り部９１に対してｘ方向とｙ方向とに移動する第２絞り部９２と、を有する。これにより、絞り部９のｘｙ平面上での移動と、ピンホール９０の大きさの変更とが可能になる。

（３）ピンホール９０は矩形であり、移動制御において、ピンホール９０のｘ方向に交差する矩形の第１辺において端部の近傍でｘ方向に沿って第２領域に対する集光光の相対移動を行い、ピンホール９０のｙ方向に交差する矩形の第２辺において端部の近傍でｙ方向に沿って第２領域に対する集光光の相対移動を行う。このとき、計測部１１３は、ピンホール９０のｘ方向に交差する矩形の第１辺の端部に対して集光光をｘ方向に横切って相対移動を行い、ピンホール９０のｙ方向に交差する矩形の第２辺の端部に対して集光光をｙ方向に横切って相対移動を行う。これにより、ピンホール９０の端部で相対移動する集光光の光検出器１０における検出強度が変化する。この検出強度の変化（例えば変曲点の値Ｔｈ、または最大値と最小値との中間値）に基づいて集光光の集光光中心ＡＸを検出することができる。

（４）計測部１１３は、算出制御において、検出強度の変化とピンホール９０の大きさとに基づいて、ピンホール９０に対する集光光の相対的位置を算出する。これにより、集光光の集光光中心ＡＸとピンホール９０の中心Ｃとが一致させるための絞り部９の正確な位置を取得できる。

（５）メモリ５０は、計測部１１３により算出された相対的位置を示す位置情報を記憶する。計測部１１３は、照明光Ｌｉの複数の異なる波長ごとに算出した位置情報を、照明光Ｌｉの波長と関連付けて記憶する。これにより、検査準備処理にて、検査処理時に使用する照明光Ｌｉに応じた位置情報を参照することにより、ピンホール９０の中心Ｃが集光光中心ＡＸと一致するように、絞り部９の位置を設定することができる。

（６）絞り制御部１１５は、メモリ５０に記憶された位置情報の位置に、絞り部９のピンホール９０の中心Ｃの位置を変位させる。これにより、ピンホール９０の中心Ｃと集光光中心ＡＸとを一致させて試料１６の検査を行うことができる。

　次のような変形も本発明の範囲内であり、変形例の一つ、もしくは複数を上述の実施形態と組み合わせることも可能である。
（変形例１）
　調整工程において、計測部１１３は、絞り部９を移動させながら検出強度の変化に基づいて相対位置を算出する例に代えて、集光レンズ８をｘｙ平面上で移動させて、ピンホール９０に対する集光光の相対位置を算出してもよい。または、計測部１１３は、絞り部１０と対物レンズ５とをｘｙ平面上で移動させながら検出強度の変化に基づいて相対位置を算出してもよい。

（変形例２）
　実施の形態または変形例１の顕微鏡１００が有する集光レンズ８が光軸方向（すなわちｚ方向）に沿って移動可能に構成されてもよい。この場合、顕微鏡１００は、集光レンズ８をｚ方向に移動させる移動部をさらに備え、制御部１１が移動部を制御して集光レンズ８を移動させる。これにより、軸上色収差によりｚ方向に集光位置が変化する場合に、光検出器１０の検出面上に試料１６の検査面の照射点の像を結像することができる。

（変形例３）
　上記実施の形態の説明では、光源１からの励起光による試料１６からの蛍光による光検出器１０上での集光点の位置計測として説明したが、蛍光に限らずダイクロイックミラーの透過・反射特性に応じて光源１からの照明光による集光点の位置計測とすることもできる。実施の形態にて示した反射顕微鏡である場合には、ステージ６面状に実際の試料１６に代えて適宜反射部材をテスト用試料として配置すればよい。そして、テスト用試料で反射された測定光が光検出器１０上で集光する集光位置が求められれば、実際に計測される試料１６からの蛍光の集光位置を換算により求めて、絞り位置を蛍光の集光位置に最適化することが可能である。これによって、試料１６を載置する以前に顕微鏡１００のキャリブレーションを完了することが可能となる。

　上記では、種々の実施の形態および変形例を説明したが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。

１…光源
４…走査部
５…対物レンズ
８…集光レンズ
９…絞り部
１０…光検出器
１１…制御部
５０…メモリ
９０…ピンホール
９１…第１絞り部
９２…第２絞り部
１００…顕微鏡
１１１…走査制御部
１１２…開口制御部
１１３…計測部
１１５…絞り制御部

Claims

　照明光を供給する光源装置と、
　前記照明光を被検物に集光する対物光学系と、
　前記集光された照明光を前記被検物上で走査する走査部と、
　前記集光された照明光により前記被検物から生ずる光を集光する結像光学系と、
　前記結像光学系による集光光を検出する検出器と、
　前記検出器の受光領域を設定する開口部を形成する絞り部と、
　前記絞り部の前記開口部の大きさを第１領域と、前記第１領域より大きな開口の第２領域とに設定する開口制御部と、
　前記第２領域の開口部と前記集光光との相対的位置を計測する計測制御部と、を備え、　前記計測制御部は、
　　前記第２領域において前記開口部の端部に対して前記集光光を相対的に移動させる移動制御と、
　　前記検出器に前記第２領域における光強度の変化を検出させる検出制御と、
　　前記光強度の変化に基づいて、前記第２領域における前記集光光の相対的位置を算出する算出制御と、を行う、走査型共焦点顕微鏡。
　請求項１に記載の走査型共焦点顕微鏡において、
　前記絞り部は、前記結像光学系の光軸に直交する平面内における第１方向と前記第１方向と直交する第２方向とに移動可能な第１絞り部と、前記開口部の大きさを変化させるように前記第１絞り部に対して前記第１方向と前記第２方向とに移動する第２絞り部と、を有する、走査型共焦点顕微鏡。
　請求項２に記載の走査型共焦点顕微鏡において、
　前記開口部は矩形であり、
　前記移動制御において、前記開口部の前記第１方向に交差する前記矩形の第１辺において前記第１方向に沿って前記第２領域に対する前記集光光の相対移動を行い、前記開口部の前記第２方向に交差する前記矩形の第２辺において前記第２方向に沿って前記第２領域に対する前記集光光の相対移動を行う、走査型共焦点顕微鏡。
　請求項１から３までのいずれか一項に記載の走査型共焦点顕微鏡において、
　前記計測制御部は、前記算出制御において、前記光強度の変化と前記開口部の大きさとに基づいて、前記開口部に対する前記集光光の相対的位置を算出する、走査型共焦点顕微鏡。
　請求項１から４までのいずれか一項に記載の走査型共焦点顕微鏡において、
　前記計測制御部は、前記結像光学系の光軸に直交する平面における前記開口部と前記集光光との相対的位置を算出する、走査型共焦点顕微鏡。
　請求項１から５までのいずれか一項に記載の走査型共焦点顕微鏡において、
　前記計測制御部は、前記移動制御において、前記結像光学系と前記開口部との少なくとも一方を移動する、走査型共焦点顕微鏡。
　請求項１から６までのいずれか一項に記載の走査型共焦点顕微鏡において、
　前記計測制御部により算出された前記相対的位置を記憶する記憶部を備える、走査型共焦点顕微鏡。
　請求項７に記載の走査型共焦点顕微鏡において、
　前記光源装置は複数の異なる波長を供給し、
　前記計測制御部は、前記照明光の複数の異なる波長ごとに前記相対的位置を算出し、　前記記憶部は、前記計測制御部により算出された複数の異なる波長ごとの前記相対的位置と、波長とを関連付けて記憶する、走査型共焦点顕微鏡。
　請求項７または８に記載の走査型共焦点顕微鏡において、
　前記記憶部に記憶された前記相対的位置に前記絞り部の前記開口部の中心位置を変位させる絞り制御部を備える、走査型共焦点顕微鏡。
　照明光を供給することと、
　対物光学系により前記照明光を集光することと、
　前記集光された照明光を被検物上で走査することと、
　前記集光された照明光により前記被検物から生ずる光を結像光学系により集光することと、
　前記結像光学系による集光光を検出器により検出することと、
　前記検出器の受光領域を設定する開口部を有する絞り部に対して、前記開口部の大きさを第１領域と、前記第１領域よりも大きな開口の第２領域とに設定することと、
　前記第２領域において前記開口部の端部に対して前記集光光を相対的に移動することと、
　前記検出器により前記第２領域における光強度の変化を検出することと、
　前記光強度の変化に基づいて、前記第２領域における前記集光光の相対的位置を算出することと、を備える、走査型共焦点顕微鏡の調整方法。
　請求項１０に記載の走査型共焦点顕微鏡の調整方法において、
　前記絞り部は、前記結像光学系の光軸に直交する平面内における第１方向と前記第１方向と直交する第２方向とに移動可能な第１絞り部と、前記開口部の大きさを変化させるように前記第１絞り部に対して前記第１方向と前記第２方向とに移動可能な第２絞り部と、を有して、矩形の前記開口部を形成し、
　前記開口部の前記第１方向に交差する前記矩形の第１辺の前記端部の近傍で前記第１方向に沿って前記第２領域に対する前記集光光の相対移動を行い、前記開口部の前記第２方向に交差する前記矩形の前記端部の近傍で前記第２方向に沿って前記第２領域に対する前記集光光の相対移動を行う、走査型共焦点顕微鏡の調整方法。
　請求項１０または１１に記載の走査型共焦点顕微鏡の調整方法において、
　前記光強度の変化と前記開口部の大きさとに基づいて、前記結像光学系の光軸に直交する平面における前記開口部に対する前記集光光の相対的位置を算出する、走査型共焦点顕微鏡の調整方法。
　請求項１０から１２までのいずれか一項に記載の走査型共焦点顕微鏡の調整方法において、
　前記照明光の波長が選択されるごとに前記相対的位置を算出する、走査型共焦点顕微鏡の調整方法。
　請求項１０から１３までのいずれか一項に記載の走査型共焦点顕微鏡の調整方法において、
　前記対物光学系が交換されると、前記相対的位置を算出する、走査型共焦点顕微鏡の調整方法。
　請求項１０から１４までのいずれか一項に記載の走査型共焦点顕微鏡の調整方法において、
　算出された前記相対的位置に前記絞り部の前記開口部の中心位置を変位させる、走査型共焦点顕微鏡の調整方法。