JP2011115604A - 培養歯根膜細胞シート、製造方法及びその利用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】水に対する上限もしくは下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性ポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上で細胞を特定の条件下で培養し、
(1)培養液温度を上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とし、
(2)培養した培養歯根膜細胞シートをキャリアに密着させ、
(3)そのままキャリアと共に剥離する
ことにより製造された培養歯根膜細胞シートは、靭帯様微小構造を有し、歯根表面への生着性が極めて高く、高密度に標的細胞を移植させられ、積極的な歯周組織の再建をはかれる。さらに、移植する細胞シートの積層化を行い3次元的な極性を持たせることにより、一層効率良く付着器官を再構築させることができ、中等度歯周炎、重度歯周炎、歯肉退縮等の臨床応用が強く期待される。
【選択図】なし
Description
また、本発明は、水に対する上限もしくは下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性ポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上で細胞を特定の条件下で培養し、その後、
(1)培養液温度を上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とし、
(2)培養した歯根膜細胞シートをキャリアに密着させ、
(3)そのままキャリアと共に剥離する
ことを特徴とする高生着性培養歯根膜細胞シートの製造方法を提供する。
加えて、本発明は、歯周組織の一部或いは全部を損傷もしくは欠損した患部を治療するための上記高生着性培養歯根膜細胞シートを提供する。
更に加えて、本発明は、歯周組織の一部或いは全部を損傷もしくは欠損した患部に対し、上記高生着性培養歯根膜細胞シートを移植することを特徴とする治療法を提供する。
(1)キャリアと密着した細胞シートを細胞培養支持体に付着させ、その後培地を加えることでキャリアを細胞シートからはがし、そして更に別のキャリアと密着した細胞シートを付着させることを繰り返すことで細胞シートを重層化させる方法。
(2)キャリアと密着した細胞シートを反転させ細胞培養支持体上でキャリア側で固定させ、細胞シート側に別の細胞シートを付着させ、その後培地を加えることでキャリアを細胞シートからはがし、再び別の細胞シートを付着させる操作を繰り返すことで細胞シートを重層化させる方法。
(3)キャリアと密着した細胞シート同士を細胞シート側で密着させる方法。
(4)キャリアと密着した細胞シートを生体の患部に当て、細胞シートを生体組織に付着させた後、キャリアをはがし、再び別の細胞シートを重ねていく方法。
市販の3.5cmφ培養皿(ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア(Becton Dickinson Labware)社製 ファルコン(FALCON)3001)上に、N−イソプロピルアクリルアミドモノマーを53%(実施例1)、54%(実施例2)になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを0.07ml塗布した。0.25MGyの強度の電子線を照射し、培養皿表面にN−イソプロピルアクリルアミドポリマー(PIPAAm)を固定化した。照射後、イオン交換水により培養皿を洗浄し、残存モノマーおよび培養皿に結合していないPIPAAmを取り除き、クリーンベンチ内で乾燥し、エチレンオキサイドガスで滅菌することで細胞培養支持体材料を得た。基材表面における温度応答性ポリマー量を測定したところ、それぞれ1.8μg/cm2(実施例1)、2.0μg/cm2(実施例2)被覆されていることが分かった。F344系ヌードラットの上顎臼歯部から歯根膜組織を採取し、常法に従い酵素処理することで歯根膜細胞を回収し、それぞれの支持体材料表面上に播種した(1×105cells/3.5cmDish)。培地として、DMEM培地に10%ウシ血清、50μg/mlになるようにアスコルビン酸2リン酸を添加したものを使用した。37℃、5%CO2下で培養した結果、何れの細胞培養支持体材料上の歯根膜細胞においても正常に付着し、増殖した。培養14日後に培養した細胞はコンフルエントの状態となり、さらに7日間培養した細胞の上に直径2mmの円状に切り抜いた直径5mmのポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜から成型したキャリアをかぶせ、培地を静かに吸引し、細胞培養支持体材料ごと20℃で30分インキュベートし冷却することで、何れの細胞培養支持体材料上の細胞もかぶせたキャリアと共に剥離させられた。得られた細胞シートは収縮率5%以下の1枚のシートとして十分に強度を持ったものであった。なお、上記各実施例において、「低温処理」は20℃で30分インキュベートという条件下で行われたが、本発明において「低温処理」はこれらの温度及び時間に限定されない。本発明における「低温処理」として好ましい温度条件は0℃〜30℃であり、好ましい処理時間は2分〜1時間である。実施例2の培養21日後の細胞のようすを図1左図、キャリアを用いずに剥離した際のようすを図1右図に示す。実施例2で得られた培養歯根膜細胞シートを常法に従ってアザン染色、並びにH−E染色した結果を図2に示す。また、実施例2で得られた培養歯根膜細胞シート表面の走査型電子顕微鏡写真を500倍(左図)、10000倍(右図)で観察した結果を示す。細胞シート表面に歯根膜特有の構造が損傷を受けていないことが分かる。さらに、図4では実施例2で得られた培養歯根膜細胞シート表面のF―アクチン、I型コラーゲンを常法により染色した結果を示す。いずれの蛋白質も残存していることが分かり、本発明で得られる培養歯根膜細胞シートは低損傷なものであることが分かる。
上述した市販の3.5cmφ培養皿(FALCON 3001)上に、N−イソプロピルアクリルアミドモノマーを55%になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを0.07ml塗布した以外は実施例2と同様な方法で細胞培養支持体材料を得た。基材表面における温度応答性ポリマー量を測定したところ、2.1μg/cm2被覆されていることが分かった。F344系ヌードラットの上顎臼歯部から歯根膜組織を採取し、常法に従い酵素処理することでセメント芽細胞、骨芽細胞を回収し、それぞれの細胞を別々に支持体材料表面上に播種した(1×105cells/3.5cmDish)。培地として、DMEM培地に10%ウシ血清、50μg/mlになるようにアスコルビン酸2リン酸を添加したものを使用した。37℃、5%CO2下で培養した結果、細胞培養支持体材料上のいずれの細胞においても正常に付着し、増殖した。いずれの細胞も培養14日後にコンフルエントの状態となった。さらに7日間培養した後、まずセメント芽細胞シートを支持体材料上に付着させたままの状態で、実施例2で回収した培養歯根膜細胞シートを積層化した。その後、培養歯根膜細胞シートについているキャリアをはずし、セメント芽細胞シートと培養歯根膜細胞シートが積層化したものを得た。その際、この積層化シートは支持体表面に付着させたままの状態を保たせた。次に、コンフルエントになった骨芽細胞シートを剥離させた。作業は実施例2と同様な方法で行った。得られた骨芽細胞シートは収縮率3%以下の1枚のシートとして十分に強度を持ったものであった。このものをセメント芽細胞シートと培養歯根膜細胞シートが積層化したシートの上に積層し、シート同士を付着させ、培養支持体表面からセメント芽細胞シート、培養歯根膜細胞シート、骨芽細胞シートの順に3層に積層化された細胞シートを得た。最後に、セメント芽細胞シートが付着している細胞培養支持体材料を冷却することで3層に積層化された細胞シートを剥離した。図5に実施例2で得られた培養歯根膜細胞シート(単層状)、実施例3で得られた3層に積層化された細胞シートを常法に従ってアザン染色、並びにH−E染色した結果を示す。積層化することで膜厚が増えていることが分かる。
実施例2で得られた培養歯根膜細胞シートに存在する接着性蛋白質として知られているインテグリンβ1、フィブロネクチンをイムノブロッティング法で常法に従って確認した。得られた結果をそれぞれ図6(図中のT)、図7(図中のT)に示す。いずれの接着性蛋白質も高濃度に残存しており、本発明の細胞シートは高生着性が期待できる。
上述した市販の3.5cmφ培養皿(FALCON 3001、温度応答性ポリマー未被覆)上で、実施例2と同様な方法で歯根膜細胞を培養した。培養21日後、トリプシン−EDTA処理を常法に従って行うことで培養した歯根膜細胞を回収した。得られた結果をそれぞれ図6(図中のE)、図7(図中のE)に示す。いずれの接着性蛋白質も低濃度しか残存していなく、本発明の細胞シートとしては不適当なものであった。
上述した市販の3.5cmφ培養皿(FALCON 3001、温度応答性ポリマー未被覆)上で、実施例2と同様な方法で歯根膜細胞を培養した。培養21日後、培養した歯根膜細胞をラバーブレートによって機械的に剥離回収した。得られた結果をそれぞれ図6(図中のS)、図7(図中のS)に示す。いずれの接着性蛋白質も高濃度に残存しているが、細胞シートが力学的な作用を受け切断されており、本発明の細胞シートとしては不適当なものであった。
免疫不全小動物に歯周組織欠損部を作成し、このものへ実施例2の培養歯根膜細胞シートを移植することを試みた。具体的には、F344系ヌードラットの上顎臼歯部近心歯槽骨に骨欠損を作製し、セメント質を削除、歯根象牙質を露出させ実験的歯周組織欠損を作製した。実施例2の培養歯根膜細胞シート下部を上述した露出象牙質面に被覆し、創傷面を保護することで移植を終えた。術後、1週間後、4週間後に移植部位を採取し、常法に従いホルマリン固定、EDTA脱灰、パラフィン包埋の後、5μm毎の連続切片を作製し、H−E染色を施し、歯周組織の治癒過程を継時的に組織学的に観察した。1週間後の組織の状態の結果を図8(b:組織全体像、d:培養歯根膜細胞シート接着部拡大像)に示す。図8dに示すように培養歯根膜細胞が歯根象牙質に密着していることが分かる。術後4週間後の組織の状態の結果を図9(b:組織全体像、d:培養歯根膜細胞シート接着部拡大像)に示す。図9dに示すように培養歯根膜細胞シートが歯根象牙質に密着、配向しており、靭帯様組織になっていることが分かる。本発明の培養歯根膜細胞シートを移植することで歯周組織を再建できていることが分かる。
実施例5と同様に、F344系ヌードラットの上顎臼歯部近心歯槽骨に骨欠損を作製し、セメント質を削除、歯根象牙質を露出させ実験的歯周組織欠損を作製した。その後、培養歯根膜細胞シートを移植することなく実施例5と同様に組織切片を作製し、歯周組織の治癒過程を継時的に組織学的に観察した。1週間後の組織の状態の結果を図8(a:組織全体像、c:歯周組織欠損部拡大像)に示す。図8cに示すように歯周組織欠損部がそのまま残っており治癒が進行していないことが分かる。術後4週間後の組織の状態の結果を図9(a:組織全体像、c:歯周組織欠損部拡大像)に示す。図9cに示すように術後4週間後においても歯周組織欠損部がそのまま残っており治癒がほとんど進行していないことが分かる。本発明の培養歯根膜細胞シートを移植した実施例5とは明らかに異なる状態であった。
Claims (24)
- キャリアに密着させた、靭帯様微小構造を有する培養歯根膜細胞シート。
- 細胞シートが、歯根膜線維芽細胞、或いはそのものにさらにセメント芽細胞、骨芽細胞、歯肉線維芽細胞、血管内皮細胞の少なくとも1つ以上の細胞が混合されたものであることを特徴とする請求項1記載の培養歯根膜細胞シート。
- 細胞シートが積層化されたものである、請求項1、2のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シート。
- 積層化が請求項2の細胞シートを重ね合わしたものである、請求項3記載の培養歯根膜細胞シート。
- 積層化が請求項2、3のいずれかの細胞シートにセメント芽細胞、骨芽細胞、歯肉線維芽細胞の少なくとも1つ以上の細胞からなる培養細胞シートを重ね合わしたものである、請求項3、4のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シート。
- 積層化が請求項2、3のいずれかの細胞シートの上側及び下側の双方に請求項5記載の細胞シートを重ね合わしたものであるでことを特徴とする請求項4〜5のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シート。
- 積層化が請求項2、3のいずれかの細胞シートの上側に骨芽細胞からなる細胞シートを重ね、下側にセメント芽細胞からなる細胞シートを重ね合わしたものである、請求項4〜6のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シート。
- 積層化が請求項2、3のいずれかの細胞シートの上側に歯肉線維芽細胞からなる細胞シートを重ね、その上にさらに骨芽細胞からなる細胞シートを重ね、下側にセメント芽細胞からなる細胞シートを重ね合わしたものである、請求項4〜6のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シート。
- 蛋白質分解酵素による処理を施されることなく支持体から剥離され、剥離後の細胞シートの収縮率が20%以下に保たれた、請求項1〜8のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シート。
- 剥離する時期が、細胞が支持体表面でコンフルエントになってから21日以内である、請求項1〜9のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シート。
- 歯周組織の一部或いは全部を損傷もしくは欠損した患部を治療するための、請求項1〜10のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シート。
- 治療が培養歯根膜細胞シートを歯根表面に対し被覆することを特徴とする請求項11記載の培養歯根膜細胞シート。
- 治療が培養歯根膜細胞シートの下部側を歯根表面に被覆することを特徴とする請求項11、12のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シート。
- 患部に被覆する際、患部の大きさ、形状に沿って切断された、請求項11〜13のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シート。
- 水に対する上限もしくは下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性ポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上で細胞を培養し、
(1)培養液温度を上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とし、
(2)培養した培養歯根膜細胞シートをキャリアに密着させ、
(3)そのままキャリアと共に剥離する
ことを特徴とする、培養歯根膜細胞シートの製造方法。 - 温度応答性ポリマーが、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である、請求項15記載の培養歯根膜細胞シートの製造方法。
- キャリアの形状が中心部を切り抜いたリング状のものであることを特徴とする、請求項15、16のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シートの製造方法。
- 剥離が蛋白質分解酵素による処理が施されていない、請求項15〜17のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シートの製造方法。
- 歯周組織の一部或いは全部を損傷もしくは欠損した患部に対し、請求項1〜14のいずれか1項記載の培養歯根膜細胞シートを移植することを特徴とする治療法。
- 移植方法が歯根表面に対し被覆することを特徴とする、請求項19記載の治療法。
- 歯根表面に被覆する際、培養歯根膜細胞シートを患部の大きさ、形状に沿って切断することを特徴とする、請求項19、20のいずれか1項記載の治療法。
- 治療対象となる疾患が中等度歯周炎、重度歯周炎、歯肉退縮のいずれかであることを特徴とする、請求項19〜21のいずれか1項に記載の治療法。
- 靭帯様微小構造を有する培養歯根膜細胞シートの製造における温度応答性ポリマーの使用。
- 温度応答性ポリマーが、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である、請求項23記載の使用。
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