KR20180095194A - 폴리도파민으로 코팅된 투명 원반형 마이크로입자 - Google Patents

폴리도파민으로 코팅된 투명 원반형 마이크로입자 Download PDF

Info

Publication number
KR20180095194A
KR20180095194A KR1020170021375A KR20170021375A KR20180095194A KR 20180095194 A KR20180095194 A KR 20180095194A KR 1020170021375 A KR1020170021375 A KR 1020170021375A KR 20170021375 A KR20170021375 A KR 20170021375A KR 20180095194 A KR20180095194 A KR 20180095194A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
microparticles
group
cells
photo
polydodamine
Prior art date
Application number
KR1020170021375A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101941361B1 (ko
Inventor
오동인
김성현
박욱
이은아
Original Assignee
경희대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경희대학교 산학협력단 filed Critical 경희대학교 산학협력단
Priority to KR1020170021375A priority Critical patent/KR101941361B1/ko
Priority to PCT/KR2018/000652 priority patent/WO2018151423A1/ko
Priority to US16/486,600 priority patent/US11447733B2/en
Publication of KR20180095194A publication Critical patent/KR20180095194A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101941361B1 publication Critical patent/KR101941361B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2537/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by physical or chemical treatment
    • C12N2537/10—Cross-linking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 폴리도파민으로 표면 개질된 투명 원반형 마이크로입자 및 이를 이용한 세포 배양에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폴리도파민으로 코팅된 원반형 마이크로입자를 이용하여 세포를 배양하면 세포 부착성이 우수하고, 도립 현미경(inverted microscope)으로 세포를 관찰할 수 있어 기존의 구 형태의 마이크로입자에 비해 큰 장점을 가진다.

Description

폴리도파민으로 코팅된 투명 원반형 마이크로입자{TRANSPARENT DISK TYPE MICROPARTICLES COATED WITH POLYDOPAMINE}
본 발명은 폴리도파민으로 표면 개질된 투명 원반형 마이크로입자 및 이를 이용한 세포 배양에 관한 것이다.
동물세포(animal cells)를 배양하는 목적은 크게 두 가지로 효소, 호르몬, 백신, 면역 조절인자, 항암제 등 여러 종류의 의료용 치료 단백질을 생산하는 것과 질병 치료용 세포치료제를 생산하는 것이다.
동물세포 배양이란 체외(in vitro)에서 인공적으로 체내(in vivo)와 유사한 조건을 제공하여 세포를 대량 증식시키는 방법이다. 이때 동물세포는 현탁 (suspension) 상태나 단층부착(monolayer attachment) 상태로 성장한다. 이러한 동물세포 배양은 미생물이나 식물세포의 배양에 비하여 더 까다롭다.
이러한 동물세포는 부착의존성이기 때문에 산업적 세포 대량배양을 위해서는 단위부피당 세포농도를 증가시키기 위하여 지지물질(support material)의 단위부피당 표면적이 큰 새로운 배양 방법이 필요하다. 이에 단위부피당 표면적을 더 크게 하기 위해 마이크로 캐리어(microcarrier), 실관(hollow fiber), 세라믹 매트릭스(ceramic matrix) 등을 이용한 시스템이 개발되었다.
그 중 마이크로 캐리어를 이용한 방법과 관련하여, 재생의학적 치료를 위한 부착성 줄기세포/전구세포의 대량 확장 과정에서 기존 2차원 배양의 한계를 극복하기 위하여 표면 효율을 증가시킬 수 있는 구 형태의 마이크로 캐리어가 개발되어 3차원적 확장 배양에 이용되고 있다. 그러나 구 형태의 마이크로 캐리어는 배양 과정 중 세포 밀집도 판단을 위한 관찰이 용이하지 않고 세포의 형태를 확인하기가 어려운 단점이 있다.
본 발명자들은 표면 효율을 증가시킬 수 있는 3차원 배양의 장점과 관찰을 용이하게 하는 2차원 배양의 장점을 모두 구현하는 배양 방법을 개발하기 위하여 광경화성 물질 및 광경화성 물질과 중합 가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커를 혼합한 혼합물을 이용하여 원반형 마이크로 입자를 제조하고 폴리도파민으로 표면을 코팅하여 세포 부착성이 우수하고 관찰이 용이한 세포 배양용 원반형 마이크로 입자를 완성하였다.
대한민국등록특허공보 제10-0871652호 (2008.11.26), “세포 배양용 3차원 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포의 3차원 부유 배양법” 일본공개특허공보 제2014-064572호 (2014.04.17), “간세포 기반 응용을 위한 생물 활성 표면” 일본공개특허공보 제2011-115604호 (2011.06.16), “배양 치근막 세포 시트, 제조방법 및 그 이용 방법”
본 발명의 목적은 광경화성 물질의 중합반응을 통해 2차원적 평면을 갖고 표면에 폴리도파민층을 포함하도록 형성되어, 3차원 배양이 가능하면서 부착된 세포의 형태와 증식 관찰이 용이한 마이크로입자를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로입자의 표면에 형성된 폴리도파민층을 포함하고, 상기 마이크로입자는 아크릴레이트 작용기를 구비한 광경화성 물질 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커의 광경화성 중합반응을 통해 형성된 세포 배양용 원반형 마이크로입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 광경화성 물질, 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커의 혼합물을 광경화성 중합반응시켜 마이크로입자를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 마이크로입자에 도파민 염산염 용액을 첨가하여 교반하는 단계를 포함하는 표면이 폴리도파민으로 코팅된 세포 배양용 원반형 마이크로입자를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 마이크로입자는 코드화된 고분자 마이크로입자 코어 및 실리카 쉘을 포함하고, 상기 실리카 쉘은 표면에 카르복실기 또는 아민기가 도입된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마이크로입자는 세포 배양 시 세포 부착성이 향상된 것을 특징으로 할 수 있고, 세포 배양 시 도립 현미경(inverted microscope)으로 세포 관찰이 가능하여 관찰이 용이한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 40분 내지 80분 동안 교반하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리도파민으로 코팅된 원반형 마이크로입자를 이용하여 세포를 배양하면 세포 부착성이 우수하고, 도립 현미경(inverted microscope)으로 세포를 관찰할 수 있어 기존의 구 형태의 마이크로입자에 비해 큰 장점을 가진다.
도 1은 광경화를 통한 투명 원반형 마이크로입자의 폴리도파민 표면 개질 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 폴리도파민이 코팅된 마이크로입자의 세포 부착성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 폴리도파민이 코팅된 마이크로입자 표면에 부착된 세포의 형태를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 폴리도파민이 코팅된 마이크로입자 표면에 부착된 세포의 형태 및 밀집도를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 폴리도파민이 코팅된 마이크로입자에 부착된 세포를 메틸바이올렛을 이용하여 광학적 세포 형태를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 공초점 현미경을 이용하여 폴리도파민이 코팅된 마이크로입자 표면에 부착된 세포에서 발현된 GFP를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명은 폴리도파민으로 표면 개질된 투명 원반형 마이크로입자 및 이를 이용한 세포 배양에 관한 것으로, 본 발명의 실시예에 따른 원반형 마이크로입자는 부착성 세포를 대량 배양하기 위해서 마이크로미터(micro meter) 단위를 갖는 미소한 입자에 세포를 부착시켜 배양하는 마이크로 캐리어 배양법(microcarrier culture)에 이용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 원반형 마이크로입자는 마이크로입자(microparticle) 및 상기 마이크로입자의 표면에 형성된 폴리도파민층(polydopamine layer)을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 원반형 마이크로입자는 마이크로입자의 표면이 폴리도파민으로 표면 개질(surface modification)된 것을 특징으로 한다.
원반형 마이크로입자는 둥근 쟁반모양으로 상면이 평탄한 원반형태(disk type)를 가지며, 투명할 수 있다.
구체적으로, 원반형 마이크로입자는 구의 형태를 가지는 기존의 마이크로 캐리어와 달리 원반형태를 가짐으로써 입자 내에 2개의 2차원적 평면을 포함하고 있으며, 입자의 투명성으로 인해 2차원적 배양에 이용되는 모든 관찰 및 분석 방법의 적용이 가능하다.
원반형 마이크로입자는 광경화성 물질(photocurable material) 및 링커(linker)를 혼합한 혼합물을 이용한 광경화성 중합반응을 통해 형성되고, 상기 광경화성 물질은 아크릴레이트 작용기를 포함할 수 있으며, 상기 링커는 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 포함할 수 있다.
광경화성 물질은 빛을 조사하였을 때 물질의 경화특성이 일어나는 것을 말한다. 광경화성 물질은 빛을 조사하였을 때 특히 구조적 변화가 나타나게 되며, 교차결합(cross-linking)을 통한 물질 경화가 대표적인 특성변화의 예이다.
광경화성 물질은 예를 들어, 에톡시화 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 메틸메타크릴레이트, 아크릴아마이드, 알릴아민, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리우레탄아크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴레이트 및 이들의 조합이 이용될 수 있다.
다양한 광경화성 물질 중 아크릴레이트 계열의 광경화 물질은 광반응에 의한 중합개시제의 라디칼 형성을 시작으로 아크릴레이트에 알켄기와 반응을 통한 연속적인 자유 라디칼 개시중합으로 경화반응이 일어난다. 아크릴레이트 계열의 광경화 물질은 경화 속도가 빠르고 올리고머의 종류 및 아크릴레이트기 수에 따라 물리적 특성을 다양하게 조절할 수 있어 용도가 광범위하다.
광경화성 물질의 라디칼 중합에 이용가능한 작용기는 예를 들어, 비닐클로라이드, 비닐브로마이드, 비닐알코올, 비닐에스터, 비닐아세테트, 비닐에폭사이드, 비닐아마드, 비닐시아나이드 등의 비닐기 기반 작용기 및 이들의 조합이 사용될 수 있다.
비닐기 기반 작용기를 사용할 경우, 비닐기 알파탄소에 붙어있는 작용기의 극성에 따라 베타탄소에 전자밀도가 달라지게 되고 광경화성 물질의 라디칼 중합의 반응성의 차이가 발생하며 광경화 결과에서 다양한 물리적 특성을 보인다.
예를 들어, 비닐에스터의 경우, 작용기에 카보닐 그룹의 강한 극성으로 일반적으로 전자가 풍부한 비닐기의 전자를 당기고 전자가 부족한 베타탄소를 발생시키며 광경화 물질의 중합을 촉진시킨다. 이러한 친전자성의 증가로 아크릴레이트와 결합 가능한 싸이올기, 아민기 등과의 반응성을 높여줄 수 있다.
알콕시실릴기는 실란에 1개 내지 3개의 산소원자를 링커로 알킬기가 결합된 작용기로서, 산소원자의 개수에 따라 1개의 경우 알콕시, 2개의 경우 디알콕시, 3개의 경우 트리알콕시실릴로 명명한다.
알콕시실릴기는 아크릴레이트에 광경화 과정에서 공기 중 산소 분자의 영향을 막아 줄 수 있는 보호기(protection group)로 작용하며, 하이드록시기 또는 알콕시실릴기 등과 가수분해 및 축합반응을 통해 실리콘-옥사이드 결합형성 및 하이드록시기와 에스터교환 반응을 통해 교차결합을 형성할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 세포 배양용 원반형 마이크로입자는 코드화된 고분자 마이크로입자 코어(encoded polymeric microparticle) 및 상기 코어를 둘러싼 실리카 쉘(silica shell)을 포함할 수 있다.
고분자 마이크로입자 코어는 공지된 다양한 방식으로 코드화될 수 있고 예를 들어, 그래피컬 코드(graphical code), 형광 코드 또는 컬러 코드를 구비할 수 있다. 한편, 고분자 마이크로입자 코어를 이루는 상기 고분자는 광학적 리소그래피에 의해 다양하게 패터닝될 수 있다는 면에서 광경화성 고분자인 것이 바람직하다.
광경화성 고분자는 아크릴계 광경화성 물질을 주로 함유할 수 있다. 광경화성 고분자는 아크릴계 광경화성 물질 외에도 상기 광경화성 물질과 반응 및 광경화 가능한 작용기와 실리카 형성이 가능한 작용기를 동시에 구비한 링커 물질이 혼합될 수 있다.
광경화에 의해 만들어진 고분자 마이크로입자 코어의 형태는 원반형일 수 있고, 코어의 크기는 수 ㎛ 내지 수 ㎜의 범위를 가질 수 있다. 예를 들어, 고분자 마이크로입자 코어의 두께는 수 ㎛ 내지 수백 ㎛ 범위로 제조가 가능하며, 코어의 지름은 수십 ㎛ 내지 수 ㎜의 범위로 제조가 가능하다.
실리카 쉘은 고분자 마이크로입자 코어를 둘러싸며 보호하고, 탐지를 원하는 외부 물질이 미세입자 코어의 고분자 내로 흡수되어 분석 오류가 발생하는 것을 방지할 수 있다. 실리카 쉘은 코드화된 고분자 마이크로입자의 화학적 및 기계적 안정성을 부여하여 미세입자가 다양한 환경 및 용액에서 이용될 수 있도록 도와줄 수 있다.
코드화된 고분자 마이크로입자 코어와 실리카 쉘은 -Si-O-Si- 결합으로 연결될 수 있어, 코어와 쉘 사이의 견고한 화학결합에 의해 안정한 구조가 형성될 수 있다. 실리카 쉘의 존재에 의해 고분자 마이크로입자의 표면은 불특정 물질의 결합성이 낮으며 바이오 물질과의 결합 특성이 향상될 수 있다.
또한, 실리카 쉘 표면에 카르복실기(carboxyl group) 또는 아민기(amine group)와 같은 작용기가 도입될 수 있다. 상기 작용기의 도입에 의해 실리카 쉘 표면이 개질되어 세포 배양용으로 사용할 수 있고, 즉 본 발명에서는 마이크로입자의 실리카 쉘 표면을 카르복실기 또는 아민기로 개질하여 세포 부착성이 우수하며, 도립 현미경으로 세포를 관찰할 수 있는 마이크로 입자를 제공할 수 있다.
나아가, 상기 실리카 쉘 표면에 카르복실기 또는 아민기를 도입하여 생물 의학분야나 임상진단 분야에서 광범위하게 사용되는 다양한 생체분자들과 공유결합시킬 수 있다. 예를 들어, 실리카 쉘 표면을 카르복실기 또는 아민기로 개질시킬 경우, 항원, 항체, DNA, RNA 및 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 바이오 물질이 본 발명에 따른 마이크로입자에 도입될 수 있다.
본 발명에 있어서, 링커는 광경화성 물질과 반응하여 공중합체를 형성하면서 마이크로입자의 골격을 이루는 동시에 상기 코드화된 고분자 마이크로입자 코어의 표면에 알콕시실릴기가 그라프트되도록 할 수 있다.
광경화성 물질로만 마이크로입자를 제조할 경우, 이후 실리카 코팅을 통한 실리카 쉘의 형성이 용이하지 않다. 반면, 광경화성 물질과 중합 가능한 작용기와 알콕시실릴기를 동시에 구비한 링커를 상기 광경화성 물질과 섞어 혼합물을 만들어 이를 경화시키면 고분자 마이크로입자 코어의 표면에 그라프트된 알콕시실릴기를 통해 실리카 쉘을 코팅하는 것이 가능해진다.
상기 링커는 예를 들어, 하기 화학식 1로 표현되는 화합물일 수 있다.
(화학식 1)
Figure pat00001
상기 화학식 1에서 R1은 수소, 메틸 또는 에틸이고, R2는 C1 내지 C8의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬일 수 있다. 또한 L은 C1 내지 C12를 갖는 알킬렌 또는 아릴렌이거나 상기 알킬렌과 상기 아릴렌이 임의로 연결된 구조일 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 1은 3-(트리메톡시실릴)프로필아크릴레이트(TMSPA)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 폴리도파민층은 마이크로입자의 표면에 형성되어, 마이크로입자의 표면을 개질시킨다. 폴리도파민층은 폴리도파민(polydopamine, PDA)으로 이루어지고, 도파민은 하기 화학식 2로 표현된다.
(화학식 2)
Figure pat00002
본 발명의 실시예에 따른 폴리도파민으로 표면 개질된 원반형 마이크로입자는 세포 배양 시 세포 부착성이 우수한 장점을 가진다. 구체적으로, 광경화를 통해 형성한 마이크로입자를 3차원적 세포 배양에 적용하기 위하여, 표면에 세포의 부착이 용이하도록 폴리도파민을 이용하여 마이크로입자의 표면 개질을 수행할 수 있다.
도 1은 광경화를 통한 투명 원반형 마이크로입자의 폴리도파민 표면 개질 과정을 나타낸 것이다.
도 1을 참조하여 광경화를 통한 원반형 마이크로입자의 폴리도파민 표면 개질 방법을 설명하면, 다음과 같다.
도파민 염산염 전구체를 10mM 농도 Trizma hydrochloric acid (Tris HCl) 버퍼용액(pH=8.5)에 녹인 후 그 용액에 투명 원반형 마이크로입자를 넣는다. 이어서, 마이크로입자가 들어있는 용액을 상온(RT)에서 교반한다.
도파민은 도파민의 카테콜기가 갖는 환원성(산화중합개시제 역할)을 바탕으로 자체적 산화성 중합을 통해 마이크로입자 표면에서 폴리도파민을 형성하게 된다. 버퍼용액 내에 존재하는 트리스(히드록시메틸)아미노메테인과 도파민의 상호작용 또한 산화 중합의 촉매로 작용하게 된다. 도파민의 수산화기는 원반형 마이크로입자의 친수성기와 상호작용을 하여 표면 부착성을 갖게 된다.
구체적으로, 도파민의 산화과정에서 산화를 통해 도파민퀴논이 만들어지고, 도파민이 갖는 아민기의 친핵성 고리형성 반응을 통해 5,6-디하이드록시인돌을 형성하게 된다. 산화과정에서 형성된 5,6-디하이드록시인돌의 공유결합성 중합 및 물리적 상호작용을 통해 폴리도파민을 형성하여 마이크로입자의 표면을 폴리도파민으로 개질하게 된다.
즉, 홍합접착단백질 유래 성분인 폴리도파민은 세포 적합성을 가지며 수용액 상에서도 강한 표면 부착성을 갖는다. 따라서 폴리도파민을 이용한 마이크로입자의 표면 개질의 결과, 배양액 내에서 원반형 마이크로입자 표면에서 세포 배양을 함에 있어 세포 부착성을 증대시켜주는 효과를 보여준다.
한편, 세포가 부착하여 확장 배양하는 과정에서 세포의 성장 정도를 판단하여 계대 시점을 확인하기 위하여, 세포의 밀도와 형태를 관찰할 필요가 있다. 3차원적 배양에 이용되는 기존 구 형태의 마이크로입자(마이크로 캐리어)는 3차원적 형태로 인해 세포의 밀도와 형태 관찰이 어려우나, 본 발명의 실시예에 따른 폴리도파민으로 표면 개질된 원반형 마이크로입자는 도립 현미경(inverted microscope)으로 세포를 관찰할 수 있어, 세포의 상태와 기능성에 대한 모니터링 및 분석까지 가능하다는 점에서 기존의 구 형태의 마이크로입자에 비해 큰 장점을 가진다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 광경화를 통한 마이크로입자의 제조 및 폴리도파민을 이용한 마이크로입자의 표면 개질
광경화성 물질, 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기, 알콕시 및 실릴기를 함께 구비한 링커를 혼합한 혼합물을 이용하여 마이크로입자의 기본 골격구조를 제조하였다.
마이크로입자의 제조는 기판 위에 높이를 조절하기 위한 스페이서를 놓고 상기 혼합물을 주입한 후, 투명한 기판으로 덮어주고 조립된 기판이 분리되지 않도록 단단히 고정하였다. 이 때 하이드로젤 입자의 높이는 스페이서의 높이에 의해 결정되고, 원하는 모양으로 디자인된 마스크를 투명한 기판 면 위에 놓고 평행한 광을 조사하여 광이 선택적으로 투과되어 원하는 모양의 마이크로입자가 만들어지게 된다. 마이크로입자의 두께는 5~300㎛ 범위로 제조가 가능하며, 입자의 지름은 50~3,000㎛의 범위로 제조가 가능하다.
실시예에 따라, 광경화성 물질로서 에톡시트리메틸올프로판 트리아크릴레이트 630㎖와 링커로서 3-(트리메톡시실릴)프로필아크릴레이트 270㎖를 7:3의 부피비로 혼합한 용액에, 개시제로서 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논 100㎖를 10부피%가 되도록 첨가한 용액을 마이크로입자 제조에 사용하였다.
광경화성 물질의 양 말단에 존재하는 아크릴레이트 작용기는 자유라디칼 중합반응에 의해 가교되어 액체에서 고체로 변화되면서 3차원적 형태를 가지는 하이드로젤을 형성하였다. 광경화성 중합반응을 통해 두께(높이)가 300㎛이며 지름 500㎛와 1,000㎛를 가지는 두 가지 크기의 마이크로입자를 제조하였다.
광경화성 중합반응을 통해 합성한 마이크로입자를 50㎖ Trizma hydrochloric acid (Tris/HCl) 버퍼 용액(pH=8.5)에 넣고 0.6 ㎎/㎖의 도파민 염산염(dopamine hydrochloride (DA/HCl)) 용액을 첨가한 뒤, 혼합 용액을 각각 실온에서 15분, 30분, 1시간, 1시간 30분 및 2시간 동안 교반하며 반응이 진행되도록 하고, 반응 후에는 무수에탄올(absolute ethanol)로 세척하여 반응을 중단시키고 에탄올에 담아 실온에 보관하였다.
폴리도파민 코팅 시간이 증가함에 따라 마이크로입자 표면이 암갈색으로 변하므로, 코팅에 의한 착색을 감소시키기 위하여 폴리도파민으로 1시간 이상 표면 개질하여 암갈색으로 변한 그룹에 대하여 코팅 후 세척(washing)한 그룹을 추가하여 제조하고 세포의 부착 정도와 관찰의 용이성을 평가하였다.
실시예 2: 표면 개질된 마이크로입자를 이용한 세포 배양
폴리도파민으로 표면이 개질된 정도가 다른 여러 조건의 마이크로입자를 48웰(well) 플레이트에 서로 겹치지 않게 넣고, 마이크로입자 표면 중 대략 75%가 세포로 덮이도록 웰 당 2x104개의 세포를 넣고 하룻밤(16시간) 동안 배양하였다.
16시간 배양 후 배지를 교환하여 부착되지 않은 세포를 제거한 뒤 단위면적 당 일반 2차원 배양용 48웰 플레이트에 부착된 세포의 수와 비교하여 마이크로입자 표면에 세포가 부착된 정도를 평가하였다.
도 2는 폴리도파민이 코팅된 마이크로입자의 세포 부착성을 평가한 결과를 나타낸 것이다. 도 2를 참조하면, 폴리도파민 코팅 시간에 의한 표면 개질 조건(surface modification condition)에 따른 2차원 배양표면 대비 세포 부착성을 확인할 수 있다.
도 2에 나타난 바와 같이, 폴리도파민 코팅 시간이 짧았던 15분 및 30분으로 처리한 그룹의 마이크로입자는 각각 2차원 배양표면과 비교하여 50%, 72% 정도의 세포가 부착되어 있었으며, 1시간 이상 처리한 그룹에서는 2차원 배양표면에 부착된 정도와 유사한 수준으로 세포 부착성이 향상됨을 확인하였다.
도 3은 폴리도파민이 코팅된 마이크로입자 표면에 부착된 세포의 형태를 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 도 3을 참조하면, 폴리도파민 코팅 시간에 의한 표면 개질 조건에 따른 폴리도파민이 코팅된 마이크로입자 표면에 부착된 세포의 형태를 확인할 수 있다.
도 2 및 도 3을 참조하면, 폴리도파민 코팅 시간이 길어질수록 세포 부착성은 증가하나(도 2), 마이크로입자의 색깔이 어두워지면서 세포의 형태 관찰이 용이하지 않다는 단점이 있었다(도 3). 이에 따라, 폴리도파민 코팅 후 세척 과정을 거쳐 마이크로입자의 투명성을 확보하면서 세포 부착 정도를 향상시킬 수 있는지를 비교한 결과, 폴리도파민 코팅 후 세척된 마이크로입자(60W, 90W 및 120W)는 세포 부착성이 낮아짐을 확인하였다(도 2). 결론적으로, 세포 부착성과 마이크로입자의 투명성을 고려하여 1시간 동안 폴리도파민을 코팅하는 것이 최적의 조건임을 확인하였다.
실시예 3: 표면 개질된 마이크로입자에서 배양한 세포의 광학적 분석
도 4는 폴리도파민이 코팅된 마이크로입자 표면에 부착된 세포의 형태 및 밀집도를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 세포를 부착한 후 배양 중인 원반형 마이크로입자를 배양용기에서 샘플링하여, 배양 중인 세포를 2차원 배양방법과 동일하게 도립 현미경(inverted microscope)을 이용하여 부착된 세포의 밀도와 형태의 확인이 가능하였다.
도 5는 폴리도파민이 코팅된 마이크로입자에 부착된 세포를 메틸바이올렛을 이용하여 광학적 세포 형태를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 광학적 분석이 가능한지를 확인하기 위하여 메틸바이올렛(methyl violet)을 이용하여 마이크로입자를 통째로 염색을 수행한 결과, 세포 형태 관찰이 용이함을 확인하였다.
실시예 4: 표면 개질된 마이크로입자에서 배양한 세포의 형광 분석
기존의 3차원 배양에 이용되는 마이크로입자를 이용하는 경우에는 세포의 기능성 또는 특성분석을 수행하기 위하여 트립신을 처리하여 부착된 세포들을 떼어내고 2차원적 관찰을 위한 슬라이드 또는 커버슬립(coverslip)에 다시 부착시켜 염색을 수행하게 된다.
본 발명에서 이용된 원반형 마이크로입자에 붙은 세포의 경우에는 마이크로입자를 통째로 염색을 하여 형광을 포함한 다양한 염색법을 이용한 관찰이 가능한지를 확인하기 위하여 세포에서 발현되는 GFP(Green Fluorescent Protein, 녹색 형광 단백질)의 발현을 형광으로 확인하였다.
도 6은 공초점 현미경을 이용하여 폴리도파민이 코팅된 마이크로입자 표면에 부착된 세포에서 발현된 GFP를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 세포 배양에 이용된 마이크로입자는 형광 검출을 방해하지 않았고, 이에 따라 본 발명의 실시예에 따른 표면 개질된 마이크로입자는 트립신 처리에 의해 떼어 분리하지 않고 세포의 특성분석이 가능한 것을 확인하였다.
이상에서 본 발명의 다양한 구현예들에 대해 상세히 기술하였지만, 해당 기술분야에 있어서 통상의 지식을 가진 사람이라면, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명을 여러 가지로 변형하여 실시할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (7)

  1. 마이크로입자의 표면에 형성된 폴리도파민층을 포함하고,
    상기 마이크로입자는 아크릴레이트 작용기를 구비한 광경화성 물질, 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커의 광경화성 중합반응을 통해 형성된 세포 배양용 원반형 마이크로입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로입자는 코드화된 고분자 마이크로입자 코어 및 실리카 쉘을 포함하고,
    상기 실리카 쉘은 표면에 카르복실기 또는 아민기가 도입된 것을 특징으로 하는 세포 배양용 원반형 마이크로입자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로입자는 세포 배양 시 세포 부착성이 향상된 것을 특징으로 하는 세포 배양용 원반형 마이크로입자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로입자는 세포 배양 시 도립 현미경으로 세포 관찰이 가능한 것을 특징으로 하는 세포 배양용 원반형 마이크로입자.
  5. (a) 광경화성 물질, 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커의 혼합물을 광경화성 중합반응시켜 마이크로입자를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 마이크로입자에 도파민 염산염 용액을 첨가하여 교반하는 단계
    를 포함하는 표면이 폴리도파민으로 코팅된 세포 배양용 원반형 마이크로입자를 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 마이크로입자는 코드화된 고분자 마이크로입자 코어 및 실리카 쉘을 포함하고,
    상기 실리카 쉘은 표면에 카르복실기 또는 아민기가 도입된 것을 특징으로 하는 표면이 폴리도파민으로 코팅된 세포 배양용 원반형 마이크로입자를 제조하는 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 40분 내지 80분 동안 교반하는 것을 특징으로 하는 표면이 폴리도파민으로 코팅된 세포 배양용 원반형 마이크로입자를 제조하는 방법.
KR1020170021375A 2017-02-17 2017-02-17 폴리도파민으로 코팅된 투명 원반형 마이크로입자 KR101941361B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170021375A KR101941361B1 (ko) 2017-02-17 2017-02-17 폴리도파민으로 코팅된 투명 원반형 마이크로입자
PCT/KR2018/000652 WO2018151423A1 (ko) 2017-02-17 2018-01-15 폴리도파민으로 코팅된 투명 원반형 마이크로입자
US16/486,600 US11447733B2 (en) 2017-02-17 2018-01-15 Transparent disc-shaped microparticles coated with polydopamine

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170021375A KR101941361B1 (ko) 2017-02-17 2017-02-17 폴리도파민으로 코팅된 투명 원반형 마이크로입자

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180095194A true KR20180095194A (ko) 2018-08-27
KR101941361B1 KR101941361B1 (ko) 2019-01-22

Family

ID=63170669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170021375A KR101941361B1 (ko) 2017-02-17 2017-02-17 폴리도파민으로 코팅된 투명 원반형 마이크로입자

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11447733B2 (ko)
KR (1) KR101941361B1 (ko)
WO (1) WO2018151423A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114807108B (zh) * 2021-01-18 2024-04-02 上海交通大学医学院附属仁济医院 基于多巴胺聚合的活细胞表面功能化及应用
WO2022177539A1 (en) * 2021-02-22 2022-08-25 Sabanci Universitesi A polymeric hybrid material with photothermal properties and production method thereof
CN114848904B (zh) * 2022-05-26 2023-02-03 山东丝琳医药科技有限公司 导电微载体凝胶及其制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100871652B1 (ko) 2007-07-30 2008-12-02 한양대학교 산학협력단 세포 배양용 3차원 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및이를 이용한 세포의 3차원 부유 배양법
JP2011115604A (ja) 2004-04-25 2011-06-16 Cellseed Inc 培養歯根膜細胞シート、製造方法及びその利用方法
KR20110134790A (ko) * 2010-06-09 2011-12-15 한국과학기술원 표면 개질된 세포부착용 기질 및 그 제조방법
JP2014064572A (ja) 2006-05-24 2014-04-17 Agency For Science Technology & Research 肝細胞ベースの応用のための生物活性表面
KR20140063480A (ko) * 2012-11-16 2014-05-27 서울대학교산학협력단 코드화된 고분자 미세입자
KR20150118248A (ko) * 2014-04-11 2015-10-22 가톨릭대학교 산학협력단 폴리도파민이 코팅된 폴리디메틸실록세인 마이크로스피어의 제조
US20160346217A1 (en) * 2015-05-26 2016-12-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Polydopamine-coated capsules

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5573934A (en) * 1992-04-20 1996-11-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Gels for encapsulation of biological materials
CN101966441A (zh) * 2010-09-09 2011-02-09 天津大学 聚多巴胺微囊和制备方法
US9437871B2 (en) * 2014-02-05 2016-09-06 GM Global Technology Operations LLC Sulfur based active material for a positive electrode

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011115604A (ja) 2004-04-25 2011-06-16 Cellseed Inc 培養歯根膜細胞シート、製造方法及びその利用方法
JP2014064572A (ja) 2006-05-24 2014-04-17 Agency For Science Technology & Research 肝細胞ベースの応用のための生物活性表面
KR100871652B1 (ko) 2007-07-30 2008-12-02 한양대학교 산학협력단 세포 배양용 3차원 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및이를 이용한 세포의 3차원 부유 배양법
KR20110134790A (ko) * 2010-06-09 2011-12-15 한국과학기술원 표면 개질된 세포부착용 기질 및 그 제조방법
KR20140063480A (ko) * 2012-11-16 2014-05-27 서울대학교산학협력단 코드화된 고분자 미세입자
KR20150141165A (ko) * 2012-11-16 2015-12-17 서울대학교산학협력단 코드화된 고분자 미세입자
KR20150118248A (ko) * 2014-04-11 2015-10-22 가톨릭대학교 산학협력단 폴리도파민이 코팅된 폴리디메틸실록세인 마이크로스피어의 제조
US20160346217A1 (en) * 2015-05-26 2016-12-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Polydopamine-coated capsules

Also Published As

Publication number Publication date
KR101941361B1 (ko) 2019-01-22
WO2018151423A1 (ko) 2018-08-23
US11447733B2 (en) 2022-09-20
US20200231919A1 (en) 2020-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3129465B1 (en) Hydrogel compositions for use in cell expansion and differentiation
Nagase et al. Temperature-responsive intelligent interfaces for biomolecular separation and cell sheet engineering
US20100184182A1 (en) Method for preparing biological tissue
KR101941361B1 (ko) 폴리도파민으로 코팅된 투명 원반형 마이크로입자
US9206391B2 (en) Method for preparing biological tissue
US9440004B2 (en) Method for preparing biological tissue
US20190023844A1 (en) Cross-Linked Poly-E-Lysine Non-Particulate Support
JP6202621B2 (ja) 細胞培養用基材及びその製造方法
JPWO2016208777A1 (ja) 細胞培養器
WO2010134606A1 (ja) 胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法
Wang et al. Facile functionalization and assembly of live cells with microcontact-printed polymeric biomaterials
JP5030036B2 (ja) 生体成分固定化ポリマー組成物および三次元架橋体
Kumai et al. A novel method for polyacrylamide gel preparation using N-hydroxysuccinimide-acrylamide ester to study cell-extracellular matrix mechanical interactions
Li et al. Creating “living” polymer surfaces to pattern biomolecules and cells on common plastics
JP6704197B2 (ja) 細胞構造体の製造方法
Wang et al. Smart adhesive peptide nanofibers for cell capture and release
CN116121174A (zh) 一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法
Wang et al. Thermoresponsive poly (2-propyl-2-oxazoline) surfaces of glass for nonenzymatic cell harvesting
KR20080084432A (ko) 포토리소그래피를 이용한 다공성 생체적합 고분자 하이드로겔과 이를 이용한 효소반응기
Ishihara et al. Preparation of magnetic hydrogel microparticles with cationic surfaces and their cell-assembling performance
KR101815771B1 (ko) 줄기세포 증식 또는 분화용 지지체 및 이의 제조방법
JP7323182B2 (ja) 細胞接着性の親水性改質細胞培養基材
WO2023180373A1 (en) A polymer assembly for growing cells
Alge et al. Thiol‐X Reactions in Tissue Engineering
JP2023178108A (ja) 細胞培養基材

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant