JP2010533500A - ヒト胚幹細胞の分化 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2007年4月18日出願の米国特許出願第11/736,908号の一部継続出願である。本願は2006年4月28日出願の米国仮特許出願第60/745,899号、2006年9月30日出願の米国仮特許出願第60/827,695号,及び2006年12月29日出願の米国仮特許出願第60/882,670号の優先権を主張し、これらの全容は参照により本明細書に組み入れられる。
I型糖尿病のための細胞代替療法における進歩と、移植可能なランゲルハウス島の不足により、インスリン産生細胞、又は移植に適した細胞の源を開発することに、興味の焦点が当てられている。一つの手法は、例えば、胚幹細胞等の多能性幹細胞から機能的β細胞を生成することである。
〔発明が解決しようとする課題〕
したがって、膵臓内分泌細胞、ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞に分化する可能性を維持する一方で、現在の臨床上の必要性に対処するよう拡張できる、多能性幹細胞株を樹立するための条件を開発する有意な必要性が今尚存在する。本発明者らは、膵臓内分泌細胞に向かうヒト胚幹細胞の分化の効率を改善する代替的な手法を採用した。
一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞を分化させるための方法を提供し、この方法は:
a.多能性幹細胞を培養する工程と、
b.多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
c.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
d.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む。
a.血清の不在下で、アクチビンAを含有する培地中で多能性幹細胞を培養した後、細胞をアクチビンA及び血清と共に培養し、次に細胞を異なる濃度のアクチビンA及び血清と共に培養し、又は
b.血清の不在下で、アクチビンAを含有する培地中で多能性幹細胞を培養した後、細胞を他の濃度の、血清を有するアクチビンAと共に培養し、又は
c.血清の不在下で、アクチビンA及びWntリガンドを含有する培地中で多能性幹細胞を培養した後、Wntリガンドを除去し、血清を有するアクチビンAと共に細胞を培養し、又は
d.多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養し、また、多能性幹細胞をアクチビンA及びWntリガンドと共に培養し、又は
e.多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養した後、血清を含有する第一の培地中で、多能性幹細胞をアクチビンA及びWntリガンドと共に培養し、次に多能性幹細胞を、血清を含有する第二の培地中で、アクチビンAと共に培養し、又は
f.多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養した後、血清を含有する第一の培地中で、多能性幹細胞をアクチビンA及びWntリガンドと共に培養し、次に多能性幹細胞を、異なる濃度の血清を含有する第二の培地中で、アクチビンA及びWntリガンドと共に培養し、又は
g.B27で補充された、Wntリガンド及びアクチビンAを含有する培地中で多能性幹細胞を培養し、又は
h.B27で補充された、アクチビンAを含有する培地中で、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で多能性幹細胞を培養する。
a.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤で処理した後、繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸、繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含有する培地中で培養し、又は
b.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、レチノイン酸及び少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子で処理し、又は
c.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、レチノイン酸で処理した後、レチノイン酸を除去し、続いて細胞を繊維芽細胞増殖因子の少なくとも1つで処理する。
a.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、DAPT及びエキセンディン4を含有する培地中で培養した後、DAPT及びエキセンディン4を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン1、IGF−1及びHGFを含有する培地中で培養し、又は
b.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、エキセンディン4を含有する培地中で培養した後、エキセンディン4を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン1、IGF−1及びHGFを含有する培地中で培養し、又は
c.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、DAPT及びエキセンディン4を含有する培地中で培養し、又は
d.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、エキセンディン4を含有する培地中で培養し、又は
e.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、Notchシグナル伝達経路を阻害する因子で処理する。
a.多能性幹細胞を培養する工程と、
b.多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
c.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
d.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、β細胞系統の細胞に分化させる工程と、
e.β細胞系統の細胞を患者に移植する工程と、を含む。
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)から様々な細胞系統の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、段階特異的な胚抗原(SSEA)3及び4の1つ以上と、Tra−1−60及びTra−1−81と指定された抗体を使用して検出可能なマーカーとを発現し得る(トムソン(Thomson)ら、サイエンス(Science)282:1145、1998)。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、SSEA−4、Tra−1−60、及びTra−1−81の発現(存在する場合)を消失させ、SSEA−1の発現を増大させる。未分化多能性幹細胞は、一般にアルカリホスファターゼ活性を有し、これは、製造業者(ベクター・ラボラトリーズ(Vector Laboratories)、バーリンゲーム(Burlingame)、カリフォルニア州)により説明されるように、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、基質としてVector Redを使用して展開することにより検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、RT−PCRで検出されるように、一般にOct−4及びTERTも発現する。
使用できる多能性幹細胞の種類は、妊娠後に形成された組織由来の多能性幹細胞の樹立された株を含み、この組織には、前胚組織(例えば胚盤胞)、胚組織、又は妊娠中の任意の時、一般には非限定的に妊娠約10〜12週の前である時に取った胎児組織が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株H1、H7、及びH9(ワイセル(WiCell))等のヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、BG01v(ブレサゲン(BresaGen)、ジョージア州アセンズ)等の変異ヒト胚幹細胞株も好適である。
一実施形態において、多能性幹細胞は、一般にフィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。代替的に、多能性幹細胞は、基本的にフィーダー細胞が存在しないにも関わらず、ほぼ分化を受けないで多能性幹細胞の増殖を支持する培養液システム中で培養される。無フィーダー培養液中での分化なしでの多能性幹細胞の増殖は、以前に他の一細胞型で培養することによって馴化された培地を使用して支持される。代替的に、無フィーダー培養液中での分化なしでの多能性幹細胞の増殖は、合成培地を使用して支持される。一実施形態において、無フィーダー培養液中での分化なしでの多能性幹細胞の増殖は、B27で補充された培地からなる合成培地を使用して支持される。
本発明における使用に好適な多能性幹細胞は、例えばヒト胚幹細胞株H9(NIH code:WA09)、ヒト胚幹細胞株H1(NIH code:WA01)、ヒト胚幹細胞株H7(NIH code:WA07)、及びヒト胚幹細胞株SA002(セラーティス(Cellartis)、スェーデン)を含む。また本発明における使用に好適な細胞は、多能性細胞の特徴を示す以下のマーカーの少なくとも1つを発現している細胞である:ABCG2、cripto、CD9、FoxD3、コネキシン43、コネキシン45、Oct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF−1、ZFP42、SSEA−3、SSEA−4、Tra1−60、Tra1−81。
多能性幹細胞は、当技術分野における任意の方法、又は本発明で提案される任意の方法により、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
a.細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に、多能性幹細胞を播く工程と、
b.多能性幹細胞を、アクチビンA及びWntリガンドと共に培養する工程と、を含む。
本発明の一態様において、多能性幹細胞は、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養及び分化される。細胞外マトリクスは、マウス肉腫細胞から抽出された可溶化基底膜製剤(商品名MATRIGELの下でBDバイオサイエンス(BD Biosciences)から販売されている)であってもよい。代替的に、細胞外マトリクスは、増殖因子減少MATRIGELであってもよい。代替的に、細胞外マトリクスは、フィブロネクチンであってもよい。代替的な実施形態において、多能性幹細胞は、ヒト血清で被覆された組織培養基質上で培養及び分化されてもよい。
単一の培地が使用される際、培地は、十分低い濃度の、例えばインスリン及びIGF等の所定の因子を含有して、多能性幹細胞を胚体内胚葉へ分化させる必要がある(WO2006020919に開示されているように)。このことは、血清濃度を低下させ、又は代替的に、インスリン及びIGFが欠乏した合成培地を使用することにより達成され得る。合成培地の例は、ウイルス(Wiles)ら(Exp Cell Res.1999年2月25日;247(1):241〜8.)に開示されている。
胚体内胚葉系統の細胞への多能性幹細胞の分化は、多能性幹細胞を、2つの培地を使用して、アクチビンA及びWntリガンドと共に培養することにより達成することができる。したがって、多能性幹細胞の分化は、以下のように達成され得る:
a.多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播き、
b.多能性幹細胞を、アクチビンA及びWntリガンドと共に第一の培地中で培養し、
c.多能性幹細胞を、第二の培地中でアクチビンAと共に培養する。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性幹細胞は、一般にそのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
a.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養する工程と、
b.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、レチノイン酸及び少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子で処理する工程と、を含む。
a.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養し、
b.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、レチノイン酸及び少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子で処理し、
c.レチノイン酸を除去した後、細胞を少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子で処理する、ことを含む。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内胚葉系統の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内胚葉系統の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内胚葉系統に特異的なマーカーは、例えば、Hlxb9、PTF−1a、PDX−1、HNF−6、HNF−1β等の1つ以上の転写因子の発現を含む。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
a.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養する工程と、
b.細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理する工程と、を含む。
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内分泌系統の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内分泌系統の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内分泌系統に特異的なマーカーは、1つ以上の、例えばNGN−3、NeuroD、Islet−1等の転写因子の発現を含む。
本発明の一態様において、1型糖尿病に苦しむ、又は1型糖尿病の発症の危険を有する患者を処置する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、この多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系統に分化させ、このβ細胞系統の細胞を患者に埋め込むことを含む。
ヒト胚幹細胞の培養
ヒト胚幹細胞株H1、H7及びH9をウィセル・リサーチ・インスティテュート(WiCell Research Institute, Inc.)(ウィスコンシン州マディソン)から獲得し、供給元の研究所から提供された取扱説明書に従って培養した。手短には、細胞を、20%ノックアウト血清代替、100nM MEM非必須アミノ酸、0.5mM β−メルカプトエタノール、4ng/mLヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)を有する2mM L−グルタミン(全てインビトロジェン(Invitrogen)/GIBCOより)で補充したDMEM/F12(インビトロジェン/GIBCO)からなるES細胞培地中にてマウス胚線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞上で培養した。E13〜13.5マウス胚由来のMEF細胞をチャールズ・リバー(Charles River)から購入した。MEF細胞を、10%FBS(ハイクローン(Hyclone))、2mMグルタミン、及び100mM MEM非必須アミノ酸で補充したDMEM培地中で増殖させた。サブコンフルエントなMEF細胞培養物を10μg/mLマイトマイシンC(シグマ(Sigma)、ミズーリ州セントルイス)により3時間処理して、細胞分割を停止させた後、トリプシン処理し、2×104/cm2で0.1%ウシゼラチン−被覆皿上に播いた。継代2〜4からのMEF細胞をフィーダー層として使用した。MEF細胞フィーダー層上に播いたヒト胚幹細胞を、加湿した組織培養インキュベーター内の5%CO2雰囲気中で37℃で培養した。コンフルエントとなった際(播いてから約5〜7日後)、ヒト胚幹細胞を1mg/mLコラゲナーゼタイプIV(インビトロジェン/GIBCO)により5〜10分間処理し、次に5mLピペットを使用して表面を穏やかに擦り落とした。細胞を900rpmで5分間回転させ、ペレットを再懸濁し、1:3〜1:4の細胞の比で新鮮培地に再び播いた。
胚体内胚葉の形成
胚体内胚葉のマーカーの発現に関するアクチビンAの効果を調べた。アクチビンA(100ng/mL)を、マウス胚線維芽細胞上で培養したヒト胚幹細胞の集団に加えた。細胞をアクチビンAの存在下、連続的に培養し、指定された時間に回収した。胚体内胚葉マーカーの発現のレベルは、PCR(図1)、FACS(結果を表IIにまとめる)、及び免疫組織化学的検査(図2)により検査した。
膵臓内胚葉の形成
ヒト胚幹細胞の膵臓内胚葉への分化を誘発するとして公知の増殖因子を、細胞培養液に加えた。詳細には、膵臓内胚葉の形成を誘発するとして公知のアクチビンA、bFGF、及びレチノイン酸を、細胞培養液に加えた。
膵臓内分泌細胞の形成
ヒト胚幹細胞の培養物を、実施例1に記載した方法に従って、未分化培養物状態で3〜4日間維持した。細胞が50〜60%コンフルエントとなった後、培地を、100ng/mLのアクチビンAを含有する、FBSを有さないDMEM/F12に変更し、この培地中で細胞を1日間培養した。1日培養の後、培地を除去し、100ng/mLアクチビンAを有する0.5%FBSを含有する培地と交換し、細胞を1日間培養した。第二の1日培養の後、培地を除去し、100ng/mLアクチビンAを有する2%FBSを含有する培地と交換し、細胞を1日間培養した。この期間後、細胞を次に、実施例2に概略したように、レチノイン酸とFGFとの組み合わせで6日間処理し、次に培地を除去し、培地を10μMのγ−セクレターゼ阻害剤L−685,458を含有する2%FBSを有するDMEM/F12を含む培地で3日間置き換えた。培養物を回収し、mRNAのサンプルを収集して分析した。アクチビンA単独で5日間処理した細胞からなる対照培養物も含んでいた。
Nkx2.2を発現している膵臓内分泌細胞の形成
実施例2に概略した方法に従って得た胚体内胚葉細胞を、以下のように処理した:細胞を、2%FBS+50ng/mLアクチビンAを有するDMEM/F12、50ng/mL基本FGF及び1μMのレチノイン酸を含有する基本培地中で3〜5日間培養した。細胞を、1μMのレチノイン酸を単独で又はbFGFと共に含む基本培地中で、更に3〜5日間連続して培養した。このプロセスに沿った様々な時間点で、RNAサンプルを細胞から回収して、細胞の指向された分化の評価を補助した。更に、分化プロトコル全体において培地及び因子を定期的に除去し、補充した。アクチビンAの添加は、アクチビンAなしでのサンプルと比較して、Nkx2.2発現の約35倍の増大を示した。培養の最初の3日間アクチビンAで処理されたサンプルは、そのPdx1発現がアクチビンAを全く含まないサンプルと同様のレベルに維持された(図11)。総合すれば、これらのデータは、膵臓内分泌マーカーNkx2.2の発現が、レチノイン酸及びbFGF処理の最初の3日間にアクチビンAを添加することにより更に向上されることを示唆している。
培養液中の膵臓内胚葉細胞の継代及び増殖
この実施例は、本明細書のヒト胚幹細胞から誘導した膵臓内胚葉細胞が細胞培養液中で維持され、更に分化することなく継代され得ることを示す。膵臓内胚葉細胞を、低血清DMEM/F12中、100ng/mLアクチビンAの存在下で分化させた。低血清DMEM/F12は、1日目に0%(v/v)胎児ウシ血清(FBS)、2日目に0.5%(v/v)FBS、及びその後の各日に2%(v/v)FBSを含有していた。分化の4日後、細胞を、2%(v/v)FBS、1μMレチノイン酸及び50ng/mL bFGFを含有する低血清DMEM/F12中で、全体で更に6日間培養した。分化の6日後、細胞を、50ng/mL FGF10の存在下、2%(v/v)FBSを含有する低血清DMEM/F12の培養液中に、全体で6日間維持した。6日間の培養期間中、膵臓内胚葉細胞を2回継代し、細胞集団が2倍になる時間は、この6日間の培養中、約36〜48時間であった。培養の0、3、及び6日目に、Q−PCRを用いて、膵臓内胚葉を示すマーカー遺伝子の発現を測定した。図12に、50ng/mL FGF10の存在下で増殖した細胞が、膵臓内胚葉マーカーPdx1の発現を、その誘導後の6日間の培養期間中に維持したことを示す。
ヒト胚幹細胞からの肝細胞の誘導
ヒト胚幹細胞の培養物を、実施例1に記載した方法に従って、2〜3日間未分化培養物状態に維持した。細胞が70〜80%コンフルエントとなった後、培地を、100ng/mLのアクチビンAを含有する2%FBSを有するDMEM/F12に変え、細胞をアクチビンAの存在下で7日間培養した。アクチビンAによる7日間の処理後、細胞を次に図13に示す条件で5日間処理した。この時間の後、細胞を回収し、mRNAのサンプルを収集して分析した。
H9ヒト胚幹細胞株の特徴付け
未分化ES細胞により発現される数個のマーカーの発現を評価することにより、H9細胞の品質をある時間に亘って監視した(カーペンター(Carpenter)ら、2001;リュービノフ(Reubinoff)ら、2000;トムソン(Thomson)ら、1998a)。H9細胞は、段階特異的な胚抗原の相反的な発現を示した(表III)。H9細胞は、SSEA−3、SSEA−4、Tra−1−60、Tra−1−81、AP及びCD9抗原に対して強力な免疫反応性を示し、これらは全て未分化ヒト胚幹細胞の特徴である。
蛍光活性化細胞選別(FACS)分析
接着した細胞を、TrypLE(商標)Express溶液(インビトロジェン、カリフォルニア州)との5分間のインキュベーションにより培養液プレートから除去した。解放された細胞をヒト胚幹細胞培地中に再懸濁し、遠心分離により回収した後、洗浄して、細胞を、PBS中の2% BSA、0.05%アジ化ナトリウムからなる染色緩衝液(シグマ社(Sigma)、ミズーリ州)中に再懸濁した。適切な場合、細胞は、0.1%γ−グロブリン(シグマ社)溶液を使用して、Fc−受容体を15分間ブロックされた。アリコート(約105細胞)を、表Iに示すようにフィコエリトリン(phycoerythirin)(PE)又はアロフィコシアニン(APC)結合モノクローナル抗体(5μL抗体/106細胞)のいずれかと共に、又は非結合一次抗体と共にインキュベートした。対照は、適切なアイソタイプ一致抗体、非染色細胞、及び二次結合抗体のみで染色した細胞を含んでいた。抗体を用いた全インキュベーションは、4℃で30分間行い、その後細胞を洗浄緩衝液で洗浄した。非結合一次抗体で染色したサンプルを、二次結合PE又は−APCラベル抗体と共に、更に4℃で30分間インキュベートした。使用した二次抗体のリストに関して表Iを参照されたい。洗浄した細胞をペレット化し、染色緩衝液中に再懸濁し、少なくとも10,000事象を収集することにより、細胞表面分子をFACSアレイ(BDバイオサイエンス)機器を使用して同定した。
免疫細胞化学
0.1%Matrigel(BD)被覆皿上に播種した細胞を、4%パラホルムアルデヒドにより室温で20分間固定した。固定した細胞を、PBS/0.1%BSA/10%正常ヒヨコ血清/0.5%トリトンX−100により室温で1時間ブロックした後、PBS/0.1%BSA/10%正常ヒヨコ血清中の一次抗体と共に4℃で一夜インキュベートした。一次抗体及びそれらの作用希釈物のリストを、表IBに示す。PBS/0.1%BSA中で3回洗浄した後、PBS中で1:100希釈した蛍光二次抗体を、細胞と共に室温で1時間インキュベートして結合させた。対照サンプルは、一次抗体が省略され、又は一次抗体が、その一次抗体と同一濃度の対応する負の対応対照免疫グロブリンで代替された反応物を含んでいた。染色サンプルを濯ぎ;ジアミジノ−2−フェニルインドール,二塩酸塩(DAPI)を含有するPROLONG(登録商標)(インビトロジェン、カリフォルニア州)の一滴を各サンプルに加えて、核を対比染色し、また抗退色試薬として機能させた。ニコン・コンフォーカル・エクリプス(Nikon Confocal Eclipse)C−1倒立顕微鏡(ニコン、日本)及び10−60X対物レンズを使用して画像を得た。
未分化細胞のPCR分析
RNA抽出、精製、及びcDNA合成。RNAサンプルを、エタノール−含有、高塩濃度緩衝液の存在下、シリカゲル膜(RNeasyミニキット、(キアゲン(Qiagen))、カリフォルニア州)に結合させた後、混入物を洗浄することにより精製した。RNAをTURBO DNA−フリーキット(アンビオン社(Ambion)、INC))を使用して更に精製し、次いで高品質RNAを水中に溶出した。分光光度計のA260及びA280読み取りにより収率及び純度を評価した。ABI(ABI、カリフォルニア州)ハイ・キャパシティcDNAアーカイブ・キット(high capacity cDNA archive kit)を使用して、精製したRNAからcDNAコピーを作製した。
TGGCGCAGCAGATACCA(SEQ ID NO:1)、AGCGCCTTCCACGACTTG(SEQ ID NO:2)及びCCAGCATCTTGCTCAACTCGGCG(SEQ ID NO:3)。最初50℃で2分間、次いで95℃で10分間のインキュベーション後、サンプルを2段階にて40回サイクルした−95℃で15秒間の変性工程と、その後の60℃で1分間のアニーリング/伸長工程。GENEAMP(登録商標)7000配列検出システムソフトウエアを使用して、データ解析を行った。各プライマー/プローブセットに関して、増幅の指数関数領域の中央において蛍光強度が特定の値に到達したサイクル数としてのCt値を決定した。比較Ct法を使用して、相対的な遺伝子発現レベルを計算した。手短には、各cDNAサンプルに関して、内在性対照Ct値を関心対象遺伝子のCtから減算して、Ct値(ΔCt)を得た。標的の正規化した量を2-ΔCtとして計算し、増幅を100%効率と仮定した。最終的なデータを、標準物質サンプルに関して表した。
核型分析
標準的なGバンド核型分析により、H9細胞の核型を決定した。合計100の分裂中期スプレッド(metaphase spread)を評価した(アプライド・ジェネティックス・ラボラトリーズ社(Applied Genetics Laboratories, Inc.))。分析した100細胞において染色体異常は見出されなかった。細胞遺伝学的分析は、細胞が正常数の常染色体と、形式染色体数(modal chromosome number)46を有することを示した。図15に、ヒト胚幹細胞株H9から得られた典型的な核型を示す。
細胞外マトリクスで被覆した組織培養基質上でのヒト胚幹細胞の培養
ヒト胚幹細胞株H1、H7、及びH9をウィセル・リサーチ・インスティテュート(Wicell Research Institute、Inc.)、(ウィスコンシン州マディソン)から獲得し、供給元の研究所により提供された取扱説明書に従って培養した。手短には、細胞を、20%ノックアウト血清代替、100nM MEM非必須アミノ酸、0.5mM β−メルカプトエタノール、4ng/mLヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)を有する2mL−グルタミンで補充したDMEM/F12培地(インビトロジェン/GIBCO)からなるES細胞培地中のマウス胚線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞上で培養した。E13〜13.5マウス胚由来のMEF細胞を、チャールズ・リバー(Charles River)から購入した。MEF細胞を、10%FBS(ハイクローン(Hyclone))、2mMグルタミン、及び100mM MEM非必須アミノ酸で補充したDMEM培地中で増殖させた。サブコンフルエントなMEF細胞培養物を10μg/mLマイトマイシンC(シグマ(Sigma)、ミズーリ州セントルイス)で3時間処理して、細胞分割を停止させた後、トリプシン処理して、2×104/cm2にて0.1%ウシゼラチン−被覆皿上に播いた。継代2〜4からのMEF細胞をフィーダー層として使用した。MEF細胞フィーダー層上に播いたヒト胚幹細胞を、加湿した組織培養インキュベーター内にて5%CO2の雰囲気中で37℃で培養した。コンフルエントとなった際(播いた後、約5〜7日)、ヒト胚幹細胞を1mg/mLコラゲナーゼタイプIV(インビトロジェン/GIBCO)で5〜10分間処理し、次いで5mLガラスピペットを使用して表面から穏やかに擦り落とした。細胞を900rpmで5分間遠心分離し、ペレットを再懸濁し、1:30希釈の増殖因子減少MATRIGEL(商標)(BDバイオサイエンス)で被覆したプレート上に細胞を1:3〜1:4の比で再び播いた。続いて、細胞を8ng/mL bFGF及びコラゲナーゼで補充したMEF−条件培地中で培養し、MATRIGEL被覆プレート上で少なくとも5代継代した。MATRIGEL(商標)上で培養した細胞を、コラゲナーゼIV(インビトロジェン/GIBCO)、ディスパーゼ(BDバイオサイエンス)又はリベラーゼ酵素(ロシュ(Roche)、インディアナ州)と共にルーチン的に継代させた。
細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養されたヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化
胚幹細胞の胚体内胚葉への分化は、以前にネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)23巻、1534〜1541頁(2005年12月)に記載されたように行った。手短には、約60〜70%コンフルエンシーのH9培養物を、0.5%FBS及び100ng/mLアクチビンAで補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS及び100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。H9細胞を、1:30〜1:10希釈の増殖因子減少MATRIGEL、又は1:30〜1:10希釈の通常のMATRIGELで被覆したプレート上で培養した。プレートをMATRIGELで室温にて1時間被覆した。
胚体内胚葉形成後の胚幹細胞内の遺伝子発現における変化のマイクロアレイ分析
RNeasyミニキット(キアゲン(Qiagen))を使用して、以下のヒト胚幹細胞培養物から、全RNAを単離した:MATRIGEL−被覆プレート上で培養され、0.5%FBS及び100ng/mLアクチビンAで補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS及び100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理したH9P83細胞;MEF上で培養され、0.5%FBS及び100ng/mLアクチビンAで補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS及び100ng/mLアクチビンAで補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理したH9P44細胞。各グループの対照は、MATRIGEL−被覆皿上に播かれ、MEF−条件培地中で培養された細胞、又はMEF上に播かれ、ES培地中で培養された細胞を含んでいた。
MATRIGEL(商標)で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化
胚幹細胞の胚体内胚葉への分化は、以前にネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)23巻、1534〜1541頁(2005年12月)に記載されたように行った。手短には、増殖因子減少MATRIGEL(商標)(1:30希釈)培養液上に播種された約60〜70%コンフルエンシーのH9、H7、又はH1細胞を、0.5%FBS及び100ng/mLアクチビンA(R&Dシステムズ(R&D Systems)、ミネソタ州))で補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS及び100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。続く全ての実施例において、特に断らない限り、この処理レジメンは、胚胎(definite)内胚葉(DE)プロトコルと称される。並行して、MEFフィーダー上で培養したH9、H7、又はH1細胞も、上記に概略したものと同一のDEプロトコルに暴露した。
MATRIGEL(商標)で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉(DE)への分化−Wntリガンドの役割
H7P44及びH9P46胚幹細胞をMATRIGEL(商標)(1:10希釈)被覆皿上で培養し、0.5%FBS、及び100ng/mLアクチビンA(R&Dシステムズ、ミネソタ州)で補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS及び100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。いくつかの培養液に、20ng/mL Wnt−3a(カタログ#1324−WN−002、R&Dシステムズ、ミネソタ州)、20ng/mL Wnt−5a(カタログ#654−WN−010、R&Dシステムズ、ミネソタ州)、25ng/mL Wnt−7a(カタログ#3008−WN−025、R&Dシステムズ、ミネソタ州)、又は25ng/mL Wnt−5b(カタログ#3006−WN−025、R&Dシステムズ、ミネソタ州)を、5日間の処理を通して加えた。図24に、高濃度の(a)AA又は(b)AA+20ng/mL Wnt−3aの存在下でのH9P46胚体内胚葉培養物の位相差画像を示す。図25に、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)上で培養し、DEプロトコル+Wnt−3a(図25、パネルb及びd)及び−Wnt−3a(図25、パネルa及びc)に暴露したH7P44、及びH9P46株における、FACSによる5日目のCXCR4の発現を示す。DE培養液中のWnt−3aの存在は、低血清+高濃度のAAで処理したDE培養液と比較して、CXCR4(CD184)の強固な発現をもたらした。図26に、低血清+AA+/−Wntリガンドで処理したa)H7及びb)H9培養物のリアルタイムPCRデータを示す。両方のH−株に関して、WNT−3aの添加は、胚体内胚葉マーカーの有意な上方調節をもたらした。対照的に、Wnt5a、Wnt−5b及びWnt−7aは、胚体内胚葉マーカーの発現に最小の影響を有した。
MATRIGEL(商標)で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化:Wnt−3aの有効用量
H9P46胚幹細胞を、MATRIGEL(商標)−被覆皿(1:10希釈)上で培養し、0.5%FBS、100ng/mLアクチビンA(AA)、及び10〜50ng/mL WNt−3a(R&Dシステムズ、ミネソタ州)で補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS、100ng/mLアクチビンA(AA)、及び10〜50ng/mL Wnt−3aで補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。対照培養物は、Wnt−3aで処理しなかった。図27にて、パネルaはWnt−3aの不在下、b)10ng/mL Wnt−3a、c)20ng/mL Wnt−3a及びd)50ng/mL Wnt−3aの5日目のFACSによるCXCR4の発現を示す。Wnt−3aの不在下において、CXCR4の発現は非常に低かった。対照的に、10〜50ng/mLのWnt−3aの添加は、CXCR4陽性細胞の数を有意に増大させた。更に、10ng/mLのWnt−3aの添加は、50ng/mLのWnt−3aの添加と同様に有効であった。リアルタイムPCR結果(図28、パネルa)も、この発見を確かなものとした。
MATRIGEL(商標)で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉(DE)への分化−GSK−3B阻害剤の効果
Wnt−3aの効果が、Wnt経路を介したものであったことを確認するために、GSK−3阻害剤を使用して、例えばβカテニン等のWntの下流標的を活性化させた。H9P46−P48胚幹細胞を、MATRIGEL(商標)被覆皿(1:10希釈)上で培養し、0.5%FBS、100ng/mLアクチビンA(AA)、及び10−1000nM GSK−3B阻害剤IX(カタログ#361550、カルビオケム(Calbiochem)、カリフォルニア州)で補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS、100ng/mLアクチビンA(AA)、及び0〜1000nM GSK−3B阻害剤IX(カタログ#361550、カルビオケム、カリフォルニア州)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。対照培養液は、低血清+高用量のアクチビンA+/−Wnt−3aで処理した。図29にて、パネルaは、Wnt−3a又はGSK−3B阻害剤の不在下、b)+20ng/mL Wnt−3a、c)+1000nM GSK−3B阻害剤IX、d)+500nM GSK−3B阻害剤IX、e)+100nM GSK−3B阻害剤IX、f)+10nM GSK−3B阻害剤IX、g)1〜2日目に+100nM GSK−3B阻害剤IX、及びH)1〜2日目に+10nM GSK−3B阻害剤IXの、5日目におけるFACSによるCXCR4の発現を示す。
MATRIGEL(商標)で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉(DE)への分化−GSK−3B阻害剤又はWnt−3Aの存在下でのアクチビンAの有効用量
H9P49及びH1P46胚幹細胞をMATRIGEL(商標)被覆皿(1:10希釈)上で培養し、0.5%FBS、10〜100ng/mLアクチビンA(AA)、及び100nM GSK−3B阻害剤IX(カタログ#361550、カルビオケム、カリフォルニア州)又は20ng/mL Wnt−3aで補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS、10〜100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。対照培養液を、低血清+100ng/mLのアクチビンAで処理した。図31に、H9P49及びH1P46に関する5日目におけるFACSによるCXCR4の発現を示し、ここでa)10ng/mLアクチビンAで全5日間+20ng/mLのWnt−3aで最初の2日間、b)100ng/mLアクチビンAで全5日間+20ng/mLのWnt−3aで最初の2日間c)100ng/mLアクチビンAで全5日間+100nMのGSK−3B阻害剤IXで最初の2日間d)10ng/mLアクチビンAで全5日間+100nMのGSK−3B阻害剤IXで最初の2日間、e)100ng/mLアクチビンAで全5日間+20ng/mLのWnt−3aで最初の2日間、及びf)10ng/mLアクチビンAで全5日間+20ng/mLのWnt−3aで最初の2日間である。図31にて、パネルa〜dは、H9P49細胞に関し、パネルe〜fは、H1P46細胞に関する。図32に、10、50、又は100ng/mLのアクチビンA+20ng/mLのWnt−3aで処理したH9P49培養物に関する胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す:パネルa:AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF−3B、及びPOU5F(Oct−4)、パネルb:SOX−17及びGATA4の発現。これはつじつまが合わない−図番による問題、又はカットアンドペーストの問題であると思われる。胚体内胚葉マーカーの強固な発現は、50ng/mLのAA+20ng/mLのWnt−3A又は100nM GSK−3B阻害剤IXを使用して得ることができると思われる。より低い用量のアクチビンAは、胚体外内胚葉の形成を導く。
MATRIGEL(商標)で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉(DE)への分化−Wnt−3aとGSK−3B阻害剤との組み合わせ
H9P53胚幹細胞を、MATRIGEL(商標)被覆皿(1:30希釈)上で培養し、0.5%FBS、100ng/mLアクチビンA(AA)、及び100nM GSK−3B阻害剤IX(カタログ#361550、カルビオケム、カリフォルニア州)+/−20ng/mL Wnt−3aで補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS、10〜100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。並行して、H9P53培養物を、25ng/mL BMP−4(カタログ#314−BP−010、R&Dシステムズ、ミネソタ州)+/−20ng/mL Wnt−3A+/−100ng/mLアクチビンAで処理した。対照培養液を、低血清+100ng/mLのアクチビンAで処理した。図33に、5日目のFACSによるCXCR4の発現を示し、ここでa)100ng/mLアクチビンAで全5日間+20ng/mLのWnt−3aで最初の2日間及び25ng/mLBMP−4で3〜5日目、b)100ng/mLアクチビンAで全5日間+20ng/mLのWnt−3aで最初の2日間c)100ng/mLアクチビンAで全5日間+100nMのGSK−3B阻害剤IXで最初の2日間d)20ng/mL Wnt−3a+25ng/mL BMP−4で全5日間、e)100ng/mLアクチビンAで全5日間+20ng/mLのWnt−3A+100nm GSK−3B阻害剤IXで最初の2日間、及びf)100ng/mLアクチビンA+25ng/mL BMP−4で全5日間である。図34に、10又は100ng/mLのアクチビンA+20ng/mLのWnt−3a又は100nM GSK−3B阻害剤で処理した、継代46におけるヒト胚幹細胞株H1の培養物に関して、リアルタイムPCRで測定した胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す:パネル(a):AFP、Bry、CXCR4、GSC、及びPOU5F(Oct−4)、パネル(b):SOX−17、HNF−3B、及びGATA4の発現。結果は、未処理の細胞に対する倍増値(fold increase)として表される。図35に、50又は100ng/mLのアクチビンA+10又は100nM GSK−3B阻害剤で処理した、継代49におけるヒト胚幹細胞株H9の培養物に関して、リアルタイムPCRで測定した胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す:パネル(a):AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF−3B、及びPOU5F(Oct−4)、パネル(b):SOX−17及びGATA4の発現。結果は、未処理の細胞に対する倍増として表される。図36に、アクチビンA、Wnt−3a、GSK−3阻害剤、及びBMP−4の組み合わせで処理したH9P53培養物に関する、胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す:a)AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF−3B、及びSOX7、b)SOX−17、HNF−3B及びGATA4の発現。BMP−4のDEプロトコルへの添加は、中胚葉マーカーBRYの形成を誘発し、Wnt−3AとGSK−4B阻害剤の組み合わせは、アクチビンAの存在下での各薬剤のみの添加と比較して、胚体内胚葉マーカーの有意な上方調節を導かないと思われる。
MEF上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉(DE)への分化−低血清中のWnt−3a、アクチビンA、Wnt−5a、BMP−2、BMP−4、BMP−6、BMP−7、IL−4、及びSDF−1の組み合わせ
H9P44細胞を、以前にマイトマイシン処理マウス胚線維芽細胞(MEF)で被覆した6ウェルプレート上に播いた。細胞を、20%ノックアウト血清代替、100nM MEM非必須アミノ酸、0.5mM β−メルカプトエタノール、2mM L−グルタミン(全てインビトロジェン/GIBCOより)及び8ng/mLヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)(R&Dシステムズ)で補充したDMEM/F12(インビトロジェン/GIBCO)培地からなるES細胞培地中で、70〜80%コンフルエンシーまで増殖させた。
0日目:DMEM/F12中0%FBS
1日目:DMEM/F12中0.5%FBS。
2日目:DMEM/F12中2%FBS。
3日目:細胞をFACS分析及びRT−PCRのために回収した。
1.対照−増殖因子を全く添加しない
2.アクチビンA(100ng/mL)
3.アクチビンA(100ng/mL)+Wnt−3a(10ng/mL)+Wnt5a(10ng/mL)
4.アクチビンA(100ng/mL)+Wnt−3a(10ng/mL)+Wnt5a(10ng/mL)+BMP2(100ng/mL)
5.アクチビンA(100ng/mL)+BMP−4(100ng/mL)
6.アクチビンA(100ng/mL)+BMP−6(100ng/mL)
7.アクチビンA(100ng/mL)+BMP−7(100ng/mL)
8.アクチビンA(100ng/mL)+BMP−4(100ng/mL)+BMP−6(100ng/mL)+BMP−7(100ng/mL)
9.IL−4(10ng/mL)
10.SDF1a(20ng/mL)
11.アクチビンA(100ng/mL)+IL−4(10ng/mL)+SDF1a(20ng/mL)
12.BMP2(100ng/mL)+BMP−4(100ng.mL)+BMP−6(100ng/mL)+BMP−7(100ng/mL)
13.アクチビンA(100ng/mL)+BMP−2(100ng/mL)+BMP−4(100ng.mL)+BMP−6(100ng/mL)+BMP−7(100ng/mL)
14.アクチビンA(100ng/mL)+IL−4(10ng/mL)
15.アクチビンA(100ng/mL)+SDF1a(20ng/mL)
16.アクチビンA(100ng/mL)+Wnt−3a(10ng/mL)+Wnt−5a(10ng/mL)+Wnt−7a(10ng/mL)
17.アクチビンA(100ng/mL)+IL−4(10ng/mL)+SDF1a(20ng/mL)+BMP−4(100ng/mL)
細胞をDEプロトコル処理の3日目に回収した。分析のために、処理した細胞のアリコートをRT−PCR用のRNA製剤に使用し、残りの細胞をFACS分析用に使用した。CXCR4の頻度(%)を図37に示す。増殖因子(1つ又は複数)の添加は、低血清中の100ng/mL AAでの処理を越えてCXCR4の発現を向上させなかった。
MATRIGEL(商標)又はヒトフィブロネクチンで被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉(DE)への分化
H9P55細胞を、ヒトフィブロネクチン又は通常の増殖因子MATRIGEL(商標)(BDバイオサイエンス(BD Biosciences))上で増殖及び分化させた。1ug/mLのヒトフィブロネクチン(R&Dシステムズ、ミネソタ州)を含有する1mLのDMEM/F12(インビトロジェン/GIBCO)を、6ウェルの組織培養液処理皿の各ウェルに加えた。代替的に、通常の増殖因子MATRIGEL(商標)をDMEM/F12中で1:10に希釈し、1mLの希釈MATRIGEL(商標)を、6ウェルの組織培養処理皿の各ウェルに加えた。細胞をコラゲナーゼと共に通過させた。細胞が80%コンフルエンシーに到達した後、それらを以下のように処理した:10ng/mLマウス組み換えWnt3a(R&D)及び100ng/mLアクチビンA(R&D)を含有する0.5%FBSで2日間。その後、2%FBS+100ng/mLアクチビンAで3日間。図38にて、パネルa〜bは、各々、フィブロネクチン及びMATRIGEL上で培養した胚幹細胞によるCXCR4の発現を示す。リアルタイムPCR結果(図39)は、胚体内胚葉の形成が、フィブロネクチン被覆プレートとMATRIGEL(商標)被覆プレートにおいて等価であったことを確認する。
様々な濃度のMATRIGEL(商標)で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化
約60〜70%コンフルエンシーのH9培養物を、0.5%FBS、20ng/mL Wnt−3a及び100ng/mLアクチビンAで補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS、20ng/mL Wnt−3a及び100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。H9細胞を、1:60〜1:10希釈の通常のMATRIGELで被覆したプレート上で培養した。プレートをMATRIGELで室温にて1時間被覆した。
細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養され、続いてMEFS上で培養され、胚体内胚葉に分化されたヒト胚幹細胞の分化−Wnt−3aの役割
MATRIGEL(商標)上で少なくとも5継代培養したヒト胚幹細胞株H9からの細胞を、ES培地中のMEFフィーダー上に播種した。細胞が60〜70%コンフルエンシーに到達した時、それらを0.5%FBS及び100ng/mLアクチビンAで補充したDMEM/F12培地に2日間暴露し、その後2%FBS及び100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。追加の処理グループは、20ng/mLのWnt−3aで全5日間+10〜100ng/mLのアクチビンAを含む。
阻害剤−DKK−1で処理した後の、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化
Wnt−3aの添加が分化を増大させるか否かを測定するために、培養液にWnt−3シグナル伝達の阻害剤を加えた。約60〜70%コンフルエンシーのH9培養物を、0.5%FBS、20ng/mL Wnt−3a、100ng/mL Dikkopf−1(DKK−1)及び100ng/mLアクチビンAで補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS及び100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。H9細胞を、1:30希釈の増殖因子減少MATRIGELで被覆されたプレート上で培養した。プレートは、MATRIGELで室温にて1時間被覆された。
組織培養基質被覆MATRIGEL上で培養され、低血清+アクチビンA及び+/−Wnt−3a中で分化されたH9胚幹細胞に関するDEマーカーの免疫蛍光染色
5日目に、H9細胞のDE培養物を、実施例10に従ってSOX−17、HNF−3B、GATA−4、N−カドヘリン及びE−カドヘリンに関して染色した。全ての核をDAPIで対比染色した。20ng/mL Wnt−3aは、Wnt−3aの不在下で分化された培養物と比較して、SOX−17、HNF−3β及びGATA−4に関して陽性に染色された有意に多数の核を生じた。更に、Wnt−3aの添加はe−カドヘリンの発現を有意に消失させ、N−カドヘリンの発現を高めた(図43、パネルa及び図43、パネルb)。
MEF及びMATRIGEL(商標)上での胚体内胚葉の形成後の胚幹細胞内の遺伝子発現における変化のマイクロアレイ分析
RNeasyミニキット(キアゲン(Qiagen))を使用して、以下の胚幹細胞培養物から全RNAを単離した:A)MATRIGEL(商標)−被覆プレート(1:30希釈)上で培養し、0.5%FBS及び100ng/mLアクチビンAで補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS及び100ng/mLアクチビンA(AA)で更に3日間処理したH9P33細胞;B)MEF上で培養し、0.5%FBS及び100ng/mLアクチビンAで補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS及び100ng/mLアクチビンAで更に3日間処理したH9P44細胞、並びにC)MATRIGEL(商標)−被覆プレート(1:30希釈)上で培養し、0.5%FBS及び100ng/mLアクチビンA+20ng/mL Wnt−3Aで補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS及び100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理したH9P48細胞。各グループの対照は、MATRIGEL−被覆皿上に播かれ、MEF−条件培地中で培養された細胞、又はMEF上に播かれES培地中で培養された細胞を含んでいた。全グループは3つの生物学的複製物を含み、各生物学的複製物は2つの別個の遺伝子チップ上で反復された。
MATRIGEL(商標)で被覆した組織培養基質上で培養したSA002ES株の胚体内胚葉(DE)への分化
以前にMATRIGEL−被覆プレート(1:30希釈)上で8ng/mLのbFGFで補充したMEF−CM中で少なくとも3継代培養したSA002P38細胞(セラーティス(Cellartis)、スウェーデン)を、0.5%FBS、及び100ng/mLアクチビンA(R&Dシステムズ、ミネソタ州)+/−20ng/mLのWnt−3a又は100nmGSK−3BIX阻害剤で補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS及び100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。リアルタイムPCR結果を、図44、パネルa及びbに示す。H1、H7、及びH9株と同様、SA002株も、DEマーカーの強固な発現のために、Wnt−3Aの添加を必要とした。CXCR4の発現を、図45に示す:a)AA処理 b)AA+Wnt−3a c)AA+GSK−3B阻害剤。
ヒト血清で被覆した組織培養基質上で培養した、ヒト胚幹細胞の胚体内胚葉(DE)への分化
継代55におけるヒト胚幹細胞株H1の培養物を、ヒト血清(シグマ、#H1388、ミズーリ州)被覆プレート上で増殖及び分化させた。0.5mLのヒト血清を6ウェル組織培養液処理プレートの各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートし、ヒト胚幹細胞を加える前に吸引した。細胞が80%コンフルエンシーに到達した後、それらを以下のように処理した:10ng/mLマウス組み換えWnt3a(R&D)又は100nM GSK−3B阻害剤IX(カタログ#361550、カルビオケム、カリフォルニア州)及び100ng/mLアクチビンA(R&D)を含有する0.5%FBSで2日間。その後、2%FBS+100ng/mLアクチビンAで3日間。次に、培養物をリアルタイムPCRで分析した(図46、パネルa及びb)。アクチビンAのみで処理した細胞と比較して、アクチビンA+GSK−3B阻害剤又はWnt−3Aで処理した細胞において胚体内胚葉マーカーの強固な発現が注目された。これらの発見は、MATRIGEL(商標)又はヒトフィブロネクチン被覆プレート上で培養したヒト胚幹細胞における本発明者らの発見と同様である。
MATRIGEL(商標)で被覆した組織培養基質上で培養した、ヒト胚幹細胞の胚体内胚葉(DE)への分化−様々なGSK−3B阻害剤の評価
商業的に入手可能な多数のGSK−3B阻害剤の効果を、ヒト胚幹細胞からのDEの形成において評価した。以下のGSK−3B阻害剤を100nMにて評価した:GSK−3B阻害剤VIII(カタログ#361549、カルビオケム、カリフォルニア州)、GSK−3B阻害剤IX(カタログ#361550、カルビオケム、カリフォルニア州)、GSK−3B阻害剤XI(カタログ#361553、カルビオケム、カリフォルニア州)、GSK−3B阻害剤XII(カタログ#361554、カルビオケム、カリフォルニア州)。H1P54 ES細胞をMATRIGEL(商標)被覆皿(1:30希釈)上で培養し、0.5%FBS、100ng/mLアクチビンA(AA)+/−様々なGSK−3B阻害剤で補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS、100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。対照培養物を、低血清+高用量のAAで処理した。図47にて、パネルa及びパネルbは、5日目の胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す。GSK−3B阻害剤IX及びXIは、両方とも、GSK−3B阻害剤VIII及びXIIと比較して、DE形成の誘発に効果的であった。
無フィーダー条件下で培養したヒト胚幹細胞による膵臓内胚葉の形成:−レチノイン酸類似体の評価
H9P49胚幹細胞をMATRIGEL(商標)(1:30希釈)被覆皿上で培養し、0.5%FBS、20ng/mL Wnt−3a(カタログ#1324−WN−002、R&Dシステムズ、ミネソタ州)、及び100ng/mLアクチビンA(R&Dシステムズ、ミネソタ州)で補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS及び100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。5日目、細胞を収集してFACS及びリアルタイムPCRにより評価した。以前の実施例で指摘したように、このプロトコルはCXCR4及びSOX−17等の胚体内胚葉マーカーの強固な上方調節をもたらした。得られた5日目の胚体内胚葉細胞を以下の培地条件に暴露して、膵臓内胚葉形成を誘発した:2%FBS及び1μM全トランス型レチノイン酸(RA)(カタログ#R2625、シグマ、ミズーリ州)、又は0.1〜10μM AM−580(4−[(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレニル)カルボキサミド]安息香酸、カタログ#A8843、シグマ、ミズーリ州)、又は0.1〜1μM TTNPB(4−[(E)−2−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレニル)−1−プロペニル]安息香酸アロチノイド酸、カタログ#T3757、シグマ、ミズーリ州)で補充したDMEM/F12培地中で3日間培養する。AM−580及びTTNPBはレチノイン酸類似体であり、レチノイン酸受容体に対する親和性を有する。RA処理の後、2%FBS及び20〜50ng/mL bFGF(カタログ#F0291、シグマ、ミズーリ州)で補充したDMEM/F12培地中で更に3日間処理した。培養物を回収し、mRNAのサンプルを収集して分析した。
ヒト胚幹細胞におけるサイトカイン発現上のWnt−3a処理の効果
Wnt−3a処理がサイトカイン発現上に有する効果を、タンパク質アレイを使用して分析した。ヒト胚幹細胞株H9の細胞を、実施例15に記載した方法に従って培養した。継代54において、細胞を、0.5%FBS DMEM/F12中で100ng/mLアクチビンA+/−10ng/mL Wnt3aの存在下で2日間分化させた。続いて細胞を、100ng/mLアクチビンA及び2%FBS DMEM/F12中で更に3日間培養した。5日目の終わりに、各処理グループに関してCXCR4発現をFACSにより測定した。アクチビンAのみで処理した細胞は、CXCR4を発現している細胞1%を有した。アクチビンA及びWnt3aで処理した細胞は、CXCR4発現が陽性の細胞73%を有した。
MATRIGEL(商標)で被覆された組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化:Wnt1の役割
H1P55ES細胞をMATRIGEL(商標)(1:30希釈)被覆皿上で培養し、0.5%FBS、及び100ng/mLアクチビンA+/−10〜20ng/mLのWNT−1(レプロテック(PeproTech)、ニュージャージー州、カタログ#120−17)で補充したDMEM/F12培地に2日間暴露した後、2%FBS、100ng/mLアクチビンA(AA)及び+/−10又は20ng/mLのWNT−1で補充したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。WNT1+AAの以下の組み合わせを試験した:
a)1〜2日目に0.5%FBS+DM−F12中20ng/mLのWNT1+100ng/mL AA、次いで3日目に2%FBS+DM−F12+100ng/mL AA、b)1〜2日目に0.5%FBS+DM−F12中20ng/mLのWNT1+100ng/mL AA、次いで3〜5日目に2%FBS+DM−F12+100ng/mL AA、c)1〜2日目に0.5%FBS+DM−F12中10ng/mLのWNT1+100ng/mL AA、次いで3日目に2%FBS+DM−F12+100ng/mL AA、d)1〜2日目に0.5%FBS+DM−F12中10ng/mLのWNT1+100ng/mL AA、次いで3〜5日目に2%FBS+DM−F12+100ng/mL AA、e)1〜2日目に0.5%FBS+DM−F12中20ng/mLのWNT1+100ng/mL AA、次いで3日目に2%FBS+DM−F12+100ng/mLAA+20ng/mLのWNT1、f)1〜2日目に0.5%FBS+DM−F12中20ng/mLのWNT1+100ng/mL AA、次いで3〜5日目に2%FBS+DM−F12+100ng/mL AA+20ng/mLのWNT1。図49にて、パネルa及びパネルbは、H1細胞を低血清、AA及びWnt−1で処理した後の胚体内胚葉マーカーに関するリアルタイムPCRデータを示す。100ng/mLのAAの存在下での20ng/mLのWnt1の添加は、胚体内胚葉マーカー(Bry、CXCR4、GSC、SOX17、HNF−3B、及びGATA−4)の有意な上方調節をもたらした。
合成培地中にて組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化
低酸素条件(約3%O2)下で培養され、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)被覆皿上に播かれたH1胚幹細胞を、MEF−条件培地中で約60〜70%コンフルエンシーまで培養した後、0.5%FBS、20ng/mL WNT−3a(カタログ#1324−WN−002、R&Dシステムズ、ミネソタ州)、及び100ng/mLアクチビンA(R&Dシステムズ、ミネソタ州)で補充したDMEM/F12培地に2日間暴露し、その後、2%FBS及び100ng/mLアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3〜4日間処理した。並行して、MATRIGEL上で培養したH1細胞を、0.5〜1%B27(インビトロジェン、カリフォルニア州)+20ng/mL WNT−3a+100ng/mLアクチビンA+/−GSK−3B阻害剤IX(カタログ#361550、カルビオケム、カリフォルニア州)で補充したDMEM−F12又はDMEM−LGに4〜5日間暴露した。いくつかの培養液では、1%B27の代わりに1%N2補充物(インビトロジェン、カリフォルニア州)を使用した。
合成培地中にてMEFS上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉への分化
H1細胞を、以前にマイトマイシン処理マウス胚線維芽細胞(MEF)を播種した6ウェルプレート上に播いた。細胞を、20%ノックアウト血清代替、100nM MEM非必須アミノ酸、0.5mM β−メルカプトエタノール、2mM L−グルタミン(全てインビトロジェン/GIBCOより)及び8ng/mLヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)(R&Dシステムズ)で補充したDMEM/F12培地(インビトロジェン/GIBCO)からなるES細胞培地中で、70〜80%まで増殖させた。
0日目:DMEM−LG又はRPMI中の0%FBS又は1%B27
1日目:DMEM/F12又はRPMI中の0.5%FBS又は1%B27
2〜5日目:DMEM/F12又はRPMI中の2%FBS又は1%B27
代替的に、細胞を、HESGro培地(ケミコン、カリフォルニア州)+100nM LY−化合物(EMD、カリフォルニア州)+100ng/mLのAAで1〜5日間処理した。
(1) 多能性幹細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法であって:
a.前記多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性幹細胞をB27で補充された培地を含む合成培地中で培養し、前記多能性幹細胞をアクチビンAで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、少なくとも1つの線維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも1つの線維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
d.前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、γセクレターゼ阻害剤で処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
(2) 前記B27が濃度約0.5%〜約1%で使用される、実施態様1に記載の方法。
(3) 前記B27が濃度約1%で使用される、実施態様1に記載の方法。
(4) 前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が:
a.前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
b.前記多能性幹細胞を、B27で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、を含む方法により達成される、実施態様1に記載の方法。
(5) 前記B27が濃度約0.5%〜約1%で使用される、実施態様1に記載の方法。
(6) 前記B27が濃度約1%で使用される、実施態様1に記載の方法。
(7) 前記B27が濃度約0.5%〜約1%で使用される、実施態様4に記載の方法。
(8) 前記B27が濃度約1%で使用される、実施態様4に記載の方法。
(9) 前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が:
a.前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
b.前記多能性幹細胞を、アクチビンA及びWntリガンドと共に第一の培地中で培養する工程と、
c.前記多能性幹細胞を、第二の培地中でアクチビンAと共に培養する工程と、を含む方法により達成される、実施態様1に記載の方法。
(10) 前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、実施態様1に記載の方法。
(11) 前記多能性幹細胞が、B27、Wntリガンド及びアクチビンAで補充されたDMEM−F12を含む合成培地中で培養される、実施態様4に記載の方法。
(12) 前記多能性幹細胞が、B27、Wntリガンド及びアクチビンAで補充されたDMEM−LGを含む合成培地中で培養される、実施態様4に記載の方法。
(13) 多能性幹細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法であって:
a.前記多能性幹細胞を、B27で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、
b.前記多能性細胞をアクチビンAで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、少なくとも1つの線維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも1つの線維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
(14) 前記B27が濃度約0.5%〜約1%で使用される、実施態様13に記載の方法。
(15) 前記B27が濃度約1%で使用される、実施態様13に記載の方法。
(16) 前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、実施態様13に記載の方法。
(17) 多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法であって:
a.前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
b.前記多能性幹細胞を、B27で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、を含む、方法。
(18) 前記B27が濃度約0.5%〜約1%で使用される、実施態様17に記載の方法。
(19) 前記B27が濃度約1%で使用される、実施態様17に記載の方法。
(20) 前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、実施態様17に記載の方法。
(21) 前記多能性幹細胞が、B27、Wntリガンド及びアクチビンAで補充されたDMEM−F12を含む合成培地中で培養される、実施態様17に記載の方法。
(22) 前記B27が濃度約0.5%〜約1%である、実施態様21に記載の方法。
(23) 前記B27が濃度約1%である、実施態様21に記載の方法。
(24) 前記多能性幹細胞が、B27、Wntリガンド及びアクチビンAで補充されたDMEM−LGを含む合成培地中で培養される、実施態様17に記載の方法。
(25) 前記B27が濃度約0.5%〜約1%である、実施態様24に記載の方法。
(26) 前記B27が濃度約1%である、実施態様24に記載の方法。
(27) 前記多能性幹細胞が、B27及びアクチビンAで補充されたDMEM−F12を含む合成培地中で培養される、実施態様1に記載の方法。
(28) 前記B27が濃度約0.5%〜約1%である、実施態様27に記載の方法。
(29) 前記B27が濃度約1%である、実施態様27に記載の方法。
(30) 前記多能性幹細胞が、B27及びアクチビンAで補充されたDMEM−F12を含む合成培地中で培養される、実施態様1に記載の方法。
(31) 前記B27が濃度約0.5%〜約1%である、実施態様30に記載の方法。
(32) 前記B27が濃度約1%である、実施態様30に記載の方法。
Claims (32)
- 多能性幹細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法であって:
a.前記多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性幹細胞をB27で補充された培地を含む合成培地中で培養し、前記多能性幹細胞をアクチビンAで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、少なくとも1つの線維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも1つの線維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
d.前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、γセクレターゼ阻害剤で処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む、方法。 - 前記B27が濃度約0.5%〜約1%で使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記B27が濃度約1%で使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が:
a.前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
b.前記多能性幹細胞を、B27で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、を含む方法により達成される、請求項1に記載の方法。 - 前記B27が濃度約0.5%〜約1%で使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記B27が濃度約1%で使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記B27が濃度約0.5%〜約1%で使用される、請求項4に記載の方法。
- 前記B27が濃度約1%で使用される、請求項4に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が:
a.前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
b.前記多能性幹細胞を、アクチビンA及びWntリガンドと共に第一の培地中で培養する工程と、
c.前記多能性幹細胞を、第二の培地中でアクチビンAと共に培養する工程と、を含む方法により達成される、請求項1に記載の方法。 - 前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、B27、Wntリガンド及びアクチビンAで補充されたDMEM−F12を含む合成培地中で培養される、請求項4に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、B27、Wntリガンド及びアクチビンAで補充されたDMEM−LGを含む合成培地中で培養される、請求項4に記載の方法。
- 多能性幹細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法であって:
a.前記多能性幹細胞を、B27で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、
b.前記多能性細胞をアクチビンAで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、少なくとも1つの線維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも1つの線維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む、方法。 - 前記B27が濃度約0.5%〜約1%で使用される、請求項13に記載の方法。
- 前記B27が濃度約1%で使用される、請求項13に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、請求項13に記載の方法。
- 多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる方法であって:
a.前記多能性幹細胞を、細胞外マトリクスで被覆された組織培養基質上に播く工程と、
b.前記多能性幹細胞を、B27で補充された培地を含む合成培地中で培養する工程と、を含む、方法。 - 前記B27が濃度約0.5%〜約1%で使用される、請求項17に記載の方法。
- 前記B27が濃度約1%で使用される、請求項17に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる前記工程が、前記多能性幹細胞を線維芽細胞フィーダー層上に播く工程を更に含む方法により達成される、請求項17に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、B27、Wntリガンド及びアクチビンAで補充されたDMEM−F12を含む合成培地中で培養される、請求項17に記載の方法。
- 前記B27が濃度約0.5%〜約1%である、請求項21に記載の方法。
- 前記B27が濃度約1%である、請求項21に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、B27、Wntリガンド及びアクチビンAで補充されたDMEM−LGを含む合成培地中で培養される、請求項17に記載の方法。
- 前記B27が濃度約0.5%〜約1%である、請求項24に記載の方法。
- 前記B27が濃度約1%である、請求項24に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、B27及びアクチビンAで補充されたDMEM−F12を含む合成培地中で培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記B27が濃度約0.5%〜約1%である、請求項27に記載の方法。
- 前記B27が濃度約1%である、請求項27に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、B27及びアクチビンAで補充されたDMEM−F12を含む合成培地中で培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記B27が濃度約0.5%〜約1%である、請求項30に記載の方法。
- 前記B27が濃度約1%である、請求項30に記載の方法。
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