JP2010532163A - ウイルス感染を処置するためのｄｓＲＮＡ - Google Patents

Abstract

本発明はホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＰＩ４Ｋ）、特にヒトホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ）またはヒトホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的アルファポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ）の遺伝子発現を標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）ならびにプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染を処置するためのその使用に関する。それぞれのｄｓＲＮＡは３０ヌクレオチド長未満、一般的に１９−２５ヌクレオチド長であり、そして実質的にＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡ標的ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である核酸配列を有するアンチセンス鎖を含む。複数のこのようなｄｓＲＮＡは治療利益を提供するために使用され得る。本発明は、また、ｄｓＲＮＡを薬学的に許容される担体と共に含み、そして送達モダリティー、例えば、完全にカプセル化されたリポソームまたは脂質複合体を含む医薬組成物に関する。

Description

技術分野
本発明はヒトホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、特にヒトホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ；ＮＭ＿００２６５１）および／またはヒトホスファチジルイノシトール４−キナーゼアルファポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ；ＮＭ＿００２６５０）を標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）ならびにプラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染が介在する病理過程を処置するためのその使用（ＲＮＡ干渉を介する）に関する。

ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプラス鎖ＲＮＡウイルスは、多数の異なるサブファミリーからの大型スーパーファミリーのウイルスを構成する。これらのウイルスは、軽度の表現型から重度の衰弱性疾患の範囲である病状を引き起こす植物および動物分野両方にわたる。プラス鎖ＲＮＡウイルスポリメラーゼスーパーグループの組成物は下記のとおりである。Ｉ．ピコルナ−（ＨＡＶ、ポリオ、コクサッキー）、ノダ−、コモ−、ネポ−、ポティ−、ビモ−、ソベモウイルスおよびルテオウイルス（黄化、黄萎および葉巻ウイルス）。ＩＩ．カーモ−、トンブス−、ダイアンソウイルス、ペスチウイルス、トガ−、エコー−、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、フラビウイルス。ＩＩＩ．トバモ−、トブラ−、ホルデイ−、トリコーナ−、アルファ、ルビ−、フロウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ポテクス−、カーラ−、ティモウイルスおよびリンゴクロロティックリーフスポットウイルス。プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムはこの種間のウイルスに保存されているモチーフを含むウイルスタンパク質のみであるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする。この種のウイルスが系統発生的に重要な多様性を含むため、この保存は重要であり、ウイルスが細胞に感染し、安定な複製を維持する多数の方法が予測される。多数の差異に加えて、この種の全てのウイルスはＲＮＡ依存性プラス鎖ＲＮＡ転写の基本的な一工程に依存している。この段階がウイルスライフサイクルに必須であるため、このウイルスはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を開始および維持するために多数の宿主タンパク質を使用する。宿主因子の相互作用なしで、該ウイルスは生存することはできない。したがって、ウイルス感染を抑制するための可能な治療的介入はウイルス宿主相互作用をブロックすることである。ウイルスにとって必須であるが宿主にとって必須でない宿主因子を扱うことができるとき、ウイルス感染をブロックする能力を得ることができる。標的宿主タンパク質は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、天然痘ウイルスなどのウイルス感染および複製を妨害するために有効なアプローチであることがすでに証明されている。

プラス鎖ＲＮＡウイルスの重要な点はヒトの健康および生存への影響である。いくつかのプラス鎖ＲＮＡウイルスはヒトに感染し、多くの場合、衰弱性疾患および／または死亡となる。ヒトの健康に特に重荷であるいくつかのウイルスはデング熱ウイルス（出血熱）、ＨＣＶ（慢性肝臓疾患、肝不全、線維症および癌）およびＨＥＶ（劇症肝不全）である。これらのウイルスにより引き起こされる肝臓および血液疾患は世界中で数百万人もの死を引き起こし、肝臓関連の病気の医療産業に数十億ドルかけられている。ウイルス感染を抑制するための治療を発見する重要性は顕著であり、世界中のヒトの健康を改善する。

ＨＣＶおよび他のプラス鎖ＲＮＡウイルス（上記）により引き起こされる感染の有効な処置に対する満たされていない要求それ自体が残っている。

本明細書は、また、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）に関する。ｄｓＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている高度に保存された調節機構における遺伝子発現をブロックすることが示されている。ＷＯ９９／３２６１９（Fire et al.）はシー・エレガンスの遺伝子発現を抑制するための少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用を記載している。ｄｓＲＮＡは、また、植物（例えば、ＷＯ９９／５３０５０、Waterhouse et al.；およびＷＯ９９／６１６３１、Heifetz et al., 参照）、ショウジョウバエ（例えば、Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200、参照）および哺乳動物（ＷＯ００／４４８９５、Ｌｉｍｍｅｒ；およびＤＥ１０１００５８６．５、Kreutzer et al., 参照）を含む他の生物の標的ＲＮＡを分解することが示されている。この自然メカニズムが、現在、遺伝子の異常なまたは不要な調節により引き起こされる障害を処置するための新規クラスの医薬の開発の焦点となっている。

ＰＣＴ出願ＷＯ２００３０１６５７２、ＷＯ２００３０７０７５０およびＷＯ２００５０２８６５０はＨＣＶ感染により引き起こされる疾患を処置するための核酸ベースＲＮＡｉ医薬を開発するためのこれまでの試みを記載している。ＰＣＴ出願ＷＯ２００６０７４３４６はＲＮＡｉ医薬を使用してＲＳＶ感染を処置するためのこれまでの試みを記載している。

ＲＮＡｉの分野における飛躍的な進歩およびウイルス感染が介在する病理過程の処置における進歩にもかかわらず、ウイルス感染の進行を抑制することができ、ウイルス感染と関連する疾患を処置することができる薬物の必要性が残っている。本発明はこのニーズに合い、さらに他の利益を提供する化合物、組成物および方法を記載している。

発明の概要
本発明はヒト宿主因子ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ；ＮＭ＿００２６５１）、および／または細胞のホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的アルファポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ；ＮＭ＿００２６５０）の濃度または活性を減少することにより、プラス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、ＨＣＶ、ＨＰＶ、デング熱ウイルスおよびポリオウイルス）（このようなウイルスは、例えば、肝臓で複製する）による感染を処置するための組成物および方法を提供する。

プラス鎖ＲＮＡウイルスの増殖がそれらの増殖のために必要であるヒト宿主細胞遺伝子ＰＩＫ４ＣＢおよび／またはＰＩＫ４ＣＡの発現をサイレンス化するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を使用することにより抑制され得ることを本出願は記載している。

本発明は特に：
細胞におけるホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＰＩ４Ｋ）濃度または活性の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここで、互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第１の配列を含み、そしてアンチセンス鎖は、実質的にＰＩ４ＫをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含む第２の配列を含み、ここで、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、そして、該ＰＩ４Ｋ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩ４Ｋ遺伝子の発現を阻害する、ｄｓＲＮＡを含む複数の態様を提供する。このようなｄｓＲＮＡは化学修飾を有し得、他の部分に結合し得る。加えて、このようなｄｓＲＮＡは医薬組成物を提供し得る。

具体化された方法は、細胞におけるホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ）遺伝子またはホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ）遺伝子の発現を阻害するための方法であって：
（ａ）細胞に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入し、ここで、互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第１の配列を含み、そしてアンチセンス鎖は、実質的にＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含む第２の配列を含み、ここで、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満である；そして、
（ｂ）工程（ａ）で製造される細胞をＰＩＫ４ＣＢ遺伝子（または選択されるときＰＩＫ４ＣＡ）のｍＲＮＡ転写の分解を達するために十分な時間維持し、それにより細胞におけるＰＩＫ４ＣＢ（または選択されるときＰＩＫ４ＣＡ）の発現または活性を抑制する、
ことを含む方法である。

あるいは、本発明は本発明のｄｓＲＮＡを処置を必要とする患者に投与することを含むプラス鎖ＲＮＡウイルス感染が介在する病理過程を処置するための方法を包含する。プラス鎖ＲＮＡウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）およびデング熱ウイルスから選択され得る。

別の態様は細胞におけるＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡの発現を阻害するためのベクター；およびこのようなベクターを含む細胞を含む。

別の態様は治療有効量の本発明のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を処置を必要とする患者に投与することを含むＨＣＶ感染を処置するための方法を含む。

ＨＣＶ構築物の構造。Ａ．完全なＨＣＶゲノム。Ｂ．クローンＡ（サブゲノムレプリコン）細胞のために使用されるサブゲノムＨＣＶレプリコン。構造タンパク質は５’ＵＴＲの下流をネオマイシン耐性遺伝子およびホタルルシフェラーゼレポーターで置換されている。Ｃ．クローンＡｒ（サブゲノムレプリコンを欠く細胞）細胞のために使用されるＨＣＶタンパク質を除去したレポーター構築物。 ｓｉＲＮＡヒットの表現型確認。再分析された大規模キノームｓｉＲＮＡスクリーンからのヒット。Ａ．個々の二本鎖ＰＩＫ４ＣＡ１−ＰＩＫ４ＣＡ４（列１−４）、ＰＩＫ４ＣＡ Ｓｍａｒｔ Ｐｏｏｌ（列５）、個々の二本鎖ＰＩＫ４ＣＢ１−ＰＩＫ４ＣＢ４（列６−９）またはＰＩＫ４ＣＢ Ｓｍａｒｔ Ｐｏｏｌ（列１０）のｄｓＲＮＡ試験結果。結果はＧＡＰＤＨ（対照；列１１）と比較して測定し、アッセイはクローンＡ細胞を使用してウェルあたり２５ｎＭのｄｓＲＮＡを使用して実施する；Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ活性はトランスフェクション７２時間後に測定する。ＧＡＰＤＨを標的とするｄｓＲＮＡ（列１１）は陰性対照として、ｐＧＬ２を標的とするｄｓＲＮＡ（列１２）は陽性対照として使用した。 ＰＩＫ４ＣＡおよびＰＩＫ４ＣＢのＲＴＰＣＲ。Ｈｕｈ７レプリコン細胞は７２時間でｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、ｍＲＮＡを単離し、ＲＴＰＣＲをＴａｑｍａｎにより分析した。結果はＧＡＰＤＨトランスフェクト細胞に対して標準化した。Ａ．ＰＩＫ４ＣＡｓｉＲＮＡのトランスフェクション、ＰＩＫ４ＣＡプライマーを使用するＴａｑ ｍａｎ ＲＴＰＣＲ。Ｂ．ＰＩＫ４ＣＡｓｉＲＮＡのトランスフェクション、ＰＩＫ４ＣＢプライマーを使用するＴａｑ ｍａｎ ＲＴＰＣＲ。Ｃ．ＰＩＫ４ＣＢｓｉＲＮＡのトランスフェクション、ＰＩＫ４ＣＢプライマーを使用するＴａｑ ｍａｎＲＴＰＣＲ。Ｄ．ＰＩＫ４ＣＢｓｉＲＮＡのトランスフェクション、ＰＩＫ４ＣＡプライマーを使用するＴａｑ ｍａｎ ＲＴＰＣＲ。ＧＯＩ＝興味ある遺伝子。ＰＩＫ４ＣＡｓｐ＝ＰＩＫ４ＣＡ Ｓｍａｒｔ Ｐｏｏｌ；ＰＩＫ４ＣＢｓｐ＝ＰＩＫ４ＣＢ Ｓｍａｒｔ Ｐｏｏｌ。 Ａ）ＰＩＫ４ＣＡを標的とする示されているｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）による処理後のＰＩＫ４ＣＡ（明色の棒）またはＰＩＫ４ＣＢ（暗色の棒）のｍＲＮＡ発現。Ｂ）ＰＩＫ４ＣＢを標的とする示されているｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）による処理後のＰＩＫ４ＣＡ（明色の棒）またはＰＩＫ４ＣＢ（暗色の棒）のｍＲＮＡ発現。 ＰＩ４ＫＡｓｉＲＮＡ（列１−列３は表２；ＰＩ４ＫＡ１；ＰＩＫ４Ａ２およびＰＩＫ４Ａ３各々に対応する）；またはＰＩ４ＫＢｓｉＲＮＡ（列４−列６は表１；ＰＩ４ＫＢ１；ＰＩＫ４Ｂ２およびＰＩＫ４Ｂ３各々に対応する）の処置後のＰＩ４ＫＢ、ＮＳ３またはアクチン（示されている）のタンパク質発現レベルを証明するウエスタンブロット法結果。ＧＡＰＤＨｓｉＲＮＡ処理は対照として示される。 ＰＩＫ４ＣＡおよびＰＩＫ４ＣＢを標的とするｓｈＲＮＡ配列。Ａ）ＣｌｏｎｅＡ細胞の示されているｓｈＲＮＡ構築物での処理の結果。明色の棒はルシフェラーゼ活性を示し；暗色の棒は細胞生存を示す。すべての結果は対照ＧＡＰＤＨ標的細胞と比較する：Ｂ）ＰＩ４ＫＡ発現における示されているｓｈＲＮＡでの処理の効果（ＧＦＰ標準）；Ｃ）ＰＩ４ＫＢ発現における示されているｓｈＲＮＡでの処理の効果（ＧＦＰ標準）； Ｄ）ＰＩ４ＫＡを標的とするｓｈＲＮＡ（列１−列５はｓｈＡ１−ｓｈＡ５にそれぞれ対応する）；またはＰＩ４ＫＢを標的とするｓｈＲＮＡ（列６−列１０はｓｈＢ１−ｓｈＢ５にそれぞれ対応する）での処理後のＰＩ４ＫＢ、ＮＳ３またはアクチン（示されている）のタンパク質発現レベルを証明するウエスタンブロット法結果。ＧＦＰｓｈＲＮＡ処理は対照として示され、すべての結果は示されているｓｈＲＮＡでの処理９６時間後にとる；Ｅ）ｓｈＲＮＡ形質導入の３週間後のタンパク質発現におけるｓｈＡ２およびｓｈＢ１の効果を測定するウエスタンブロット法（ＧＦＰ対照）。 ＨＣＶ複製の阻害（生ウイルス）。示されているｓｉＲＮＡによる処置におけるＨＣＶ複製の用量依存性。ＨＣＶ感染前、細胞をＰＩＫ４ＣＡまたはＰＩＫ４ＣＢのいずれかに対する示されているｓｉＲＮＡで処理する。Ａ）２５ｎＭ（灰色の棒）；１．５ｎＭ（白色の棒）；０．１ｎＭ（暗色の棒）。結果はＧＡＰＤＨｓｉＲＮＡ処理でＨＣＶ複製を標準化させる。ウミシイタケｓｉＲＮＡは陽性対照である。Ｂ）感染細胞における標的ｍＲＮＡの発現。 ＨＣＶ複製の阻害（生ウイルス）。示されているｓｉＲＮＡによる処置におけるＨＣＶ複製の用量依存性。ＨＣＶ感染後、細胞をＰＩＫ４ＣＡまたはＰＩＫ４ＣＢのいずれかに対する示されているｓｉＲＮＡで処理する。Ａ）示されているｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）での処置の２４時間後のウイルス複製における効果。暗色の棒−ウイルスルシフェラーゼ（活性）；明色の棒−細胞生存。結果はＧＡＰＤＨｓｉＲＮＡ処理でＨＣＶ複製を標準化させる。ウミシイタケｓｉＲＮＡは陽性対照である。Ｂ）示されているｓｉＲＮＡでの処理後のＨＣＶ複製の時間依存性。暗色（１番目）棒−２４時間；明色（２番目）棒−４８時間；白色（３番目）棒−７２時間；灰色（４番目）棒−９６時間。

発明の詳細な説明
本発明はこのようなウイルスが複製する細胞におけるヒト宿主因子ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ；ＮＭ＿００２６５１）、および／またはホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的アルファポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ；ＮＭ＿００２６５０）のレベルを減少させることにより、プラス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、ＨＣＶ、ＨＰＶ、デング熱ウイルスおよびポリオ）による感染と関連する疾患の処置の問題に対する解決策を提供する。プラス鎖ＲＮＡウイルスの増殖がこれらの増殖のために必要であるヒト宿主細胞遺伝子ＰＩＫ４ＣＢおよび／またはＰＩＫ４ＣＡの発現をサイレンス化するために二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を使用することにより抑制することができることを本出願に記載している。

加えて、これらのｄｓＲＮＡの選択された化学修飾が驚くべきことに毒性の低下、免疫原性の低下、薬理学的応答の改善および他の利益を提供する非常に好ましい態様であることを初めて本出願に記載している。

本発明は二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）ならびにｄｓＲＮＡを使用して細胞または哺乳動物におけるプラス鎖ＲＮＡウイルスの増殖を抑制するための組成物、医薬組成物および方法を提供する。本発明は、また、ｄｓＲＮＡを使用してプラス鎖ＲＮＡウイルスの感染により引き起こされる哺乳動物における病的状態および疾患を処置するための組成物および方法を提供する。

本発明のｄｓＲＮＡは３０ヌクレオチド長未満、一般的に１９−２４ヌクレオチド長である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、実質的にヒトホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータサブユニットポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ；ＮＭ＿００２６５１、および／またはヒトホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的アルファポリペプチドＰＩＫ４ＣＡ；ＮＭ＿００２６５０）の遺伝子産物（前駆体ｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡ）転写物の少なくとも一部に相補的である。これらのｄｓＲＮＡの使用は哺乳動物におけるプラス鎖ＲＮＡ感染の複製および／または維持と関連する遺伝子のｍＲＮＡの標的分解または不活性化を可能にする。細胞ベースおよび動物アッセイを使用して、本発明者らは、非常に低用量のこれらのｄｓＲＮＡが特異的にかつ効果的にＲＮＡｉを介在し、複製および感染の有意な阻害ができることを証明した。したがって、これらのｄｓＲＮＡを含む本発明の方法および組成物はプラス鎖ＲＮＡウイルス感染が介在する病理過程を処置するために有用である。

ヒトホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータサブユニットポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ；ＮＭ＿００２６５１；ときどきＰＩ４ＫＢ；ＰＩＫ４Ｂ；ｐｉ４Ｋ９２；ＰＩ４Ｋベータ；ＰＩ４Ｋ−ＢＥＴＡ；ＰＩ４ＫＩＩＩベータとも呼ばれる）およびヒトホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的アルファポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ；ＮＭ＿００２６５０；ときどきＰＩ４ＫＡ；ＰＩＫ４Ａ；ｐｉ４Ｋ２３０；ＦＬＪ１６５５６；およびＰＩ４Ｋ−ＡＬＰＨＡとも呼ばれる）はホスファチジルイノシトール４−キナーゼである。あるいはホスファチジルイノシトール４−キナーゼは文献においてＰＩ４Ｋ、ＰＩ４−キナーゼまたはＰＩＫ４として知られている。この明細書では特に選択の指示がない限りこのような用語を互換的に使用する。哺乳動物細胞には４個のＰＩ４Ｋ酵素があり、これらは２つの種類に分類される。第１は酵母菌からヒトで保存されている、ＰＩＫ４ＣＡおよびＰＩＫ４ＣＢを含むＩＩＩ型ＰＩ４Ｋである。酵母菌オルソログＳｔｔ４ｐおよびＰｉｋ１ｐはそれぞれ両方とも非オーバーラップ機能を有する必須の遺伝子である。ＩＩ型ＰＩ４Ｋ、ＰＩ４ＫＩＩαおよびＰＩ４ＫＩＩβはＩＩＩ型酵素と異なり、また、非必須の遺伝子である酵母菌ホモログＬＳＢ６を有する。ＰＩＫ４ＣＢはゴルジに局在する非常に特徴付けられた哺乳動物遺伝子であり、低分子量ＧＴＰａｓｅＡＤＰ−リボシル化因子（ＡＲＦ）との複合体で機能し、ゴルジから細胞膜分泌へを調節すると考えられている。クラスＩＩαおよびβ酵素は、また、ゴルジ／トランス−ゴルジ輸送に関与することが示されている。ＩＩＩ型αアイソフォームは細胞膜およびＥＲで役割を果たすが、ゴルジでは役割を果たさないようである。

加えて、ＰＩ４Ｋは細胞内局在によってそれぞれの区画で独特の機能の酵素である。ＰＩＫ４ＣＢはＰｔｄＩｎｓ４ＰおよびＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２プールの産生に関与し、スフィンゴミエリン合成を引き起こすＥＲからゴルジへのセラミドの調節された輸送はＡＰ−１機構のドッキングを可能にするＰＩ（４）Ｐ−リッチドメインを維持することによりゴルジの構造的完全性に関与する。ＰＩＫ４ＣＢの崩壊はゴルジ複合体の構造の変化を引き起こし、極性細胞の分泌欠損を引き起こし、細胞膜へのタンパク質輸送を抑制する。

クラスＩＩおよびＩＩＩのＰＩ４Ｋαおよびβ酵素はいくつかの調節ホスホイノシチドの前駆体であるＰｔｄｌｎｓ４−ホスフェートを産生する。これらのホスホイノシチドは、組織的なシグナル伝達複合体に調節タンパク質を導入することにより、種々の細胞内シグナル伝達および輸送過程を調節する。ＰｔｄＩｎｓからのＰｔｄＩｎｓ４−ホスフェート［ＰｔｄＩｎｓ４Ｐ］の産生、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２およびＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３の形成が最初の工程。ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２はホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）酵素の主な基質であり、Ｃａ^２＋シグナル伝達に関与するイノシトール１，４，５−トリスリン酸［Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３］およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生じる。ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２は、また、いくつかの型のイオンチャネルおよび酵素、例えば、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）を調節し、膜とアクチン細胞骨格３および５を結合するタンパク質と相互作用する。クラスＩのＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼによりＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２から産生されるＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３は、種々の過程、例えば、セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔを介する細胞代謝および抗アポトーシス経路を調節し、チロシンキナーゼ、例えば、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質に関するＢｔｋおよびグアニン交換因子も調節する。これらのシグナル伝達ホスホイノシチドの産生はこれらの合成酵素の活性およびこれらの前駆体の供給の両方に依存しており、したがって、ＰｔｄＩｎｓ４−キナーゼは細胞調節の役割を有する。

複製をヒトＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡに依存しているプラス鎖ＲＮＡウイルスは下記のものを含むと考えられている：Ｉ．ピコルナ−（ＨＡＶ、ポリオ、コクサッキー）、ノダ−、コモ−、ネポ−、ポティ−、ビモ−、ソベモウイルスおよびルテオウイルス（黄化、黄萎および葉巻ウイルス）。ＩＩ．カーモ−、トンブス−、ダイアンソウイルス、ペスチウイルス、トガ−、エコー−、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、フラビウイルス。ＩＩＩ．トバモ−、トブラ−、ホルデイ−、トリコーナ−、アルファ、ルビ−、フロウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ポテクス−、カーラ−、ティモウイルスおよびリンゴクロロティックリーフスポットウイルス。

下記詳細な説明はｄｓＲＮＡの製造方法および使用方法およびプラス鎖ＲＮＡウイルスの発現を抑制するためのｄｓＲＮＡを含む組成物、ならびにプラス鎖ＲＮＡウイルス感染により引き起こされる疾患および障害、例えば、肝臓疾患、肝不全、線維症、癌、肺疾患およびその合併症（さらに下記のもの）を処置するための組成物および方法を記載している。本発明の医薬組成物は３０ヌクレオチド長未満、一般的に１９−２４ヌクレオチド長であり、実質的にＰＩＫ４ＣＢおよび／またはＰＩＫ４ＣＡのＲＮＡ転写の少なくとも一部に相補的である相補性領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを薬学的に許容される担体と共に含む。本発明の態様は組合せ、医薬における所望によりＰＩＫ４ＣＢおよび／またはＰＩＫ４ＣＡＲＮＡ転写の異なるセグメントを標的とする１つ以上のｄｓＲＮＡの使用である。

したがって、本発明の１つの局面は本発明のｄｓＲＮＡを薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物、ＰＩＫ４ＣＢおよび／またはＰＩＫ４ＣＡの発現を抑制する組成物を使用する方法ならびにプラス鎖ＲＮＡウイルス感染により引き起こされる疾患を処置するための医薬組成物を使用する方法を提供する。

定義
便宜上、明細書、実施例および特許請求の範囲で使用する特定の用語およびフレーズの意味を以下に提供する。本明細書の他の部の用語の使用とこのセクションで提供される定義に明らかな違いがあるとき、このセクションの定義を優先する。

“Ｇ”、“Ｃ”、“Ａ”および“Ｕ”はそれぞれ一般的に塩基としてグアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを含むヌクレオチドを意味する。しかしながら、“リボヌクレオチド”または“ヌクレオチド”なる用語は、また、以下の詳細のとおり修飾ヌクレオチドまたは代替置換部分を意味することができると理解すべきである。当業者は、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルがこのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対特性を実質的に変化することなく他の部分により置換され得ることをよく知っている。例えば、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドはアデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと対を形成し得るが、それに限定はされない。したがって、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含むヌクレオチドは、本発明の核酸配列を、例えば、イノシンを含むヌクレオチドにより置換され得る。このような置換部分を含む配列は本発明の態様である。

本明細書で使用する“標的配列”は一次転写産物のＲＮＡプロセッシング産物であるｍＲＮＡを含む、ＰＩＫ４ＣＢの転写中に形成されるｍＲＮＡ分子の核酸配列の隣接部分を意味する。

本明細書で使用する“配列を含む鎖”なる用語は標準ヌクレオチド命名を使用して称される配列により表されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを意味する。

他に記載のない限り、本明細書で使用する“相補的”なる用語は、第２の核酸配列との関連で第１の核酸配列を表すために使用するとき、当業者により理解されているとおり、第１の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが特定の条件下で第２の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を意味する。このような条件は、例えば、ストリンジェント条件であり得、ここで、ストリンジェント条件は：４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃、１２−１６時間、次に洗浄を含み得る。他の条件、例えば、生物内部で起こり得るような生理学的に適切な条件が利用できる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用にしたがって、２個の配列の相補性の試験のためにもっとも適当な一連の条件を決定することができる。

これは、第１および第２の核酸配列の全長にわたって、第１の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと第２の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基対を含む。このような配列は本明細書において互いに“完全に相補的”と表すことができる。しかしながら、本明細書において第１の配列が第２の配列に対して“実質的に相補的”と表されるとき、２個の配列が完全に相補的であるか、または、１個以上であるが一般的に最高で４、３または２個のミスマッチ塩基対をハイブリダイゼーションで形成し得、それらの最終的な適用に最も適当な条件下でハイブリダイズする能力を保持している。しかしながら、２個のオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションで１個以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されたとき、このようなオーバーハングは相補性の決定に関してミスマッチと見なしてはならない。例えば、長いオリゴヌクレオチドは短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含む、一方にオリゴヌクレオチド２１ヌクレオチド長および他方にオリゴヌクレオチド２３ヌクレオチド長を含むｄｓＲＮＡは、本発明の目的のために、なお“完全に相補的”と見なされ得る。

本明細書で使用する“相補的”配列は、また、それらがハイブリダイズする能力に対する上記必要条件を満たす限り、非ワトソン−クリック塩基対および／または非天然および改変されたヌクレオチドから形成された塩基対を含むか、またはこれらから完全に形成され得る。

本明細書において“相補的”、“完全に相補的”および“実質的に相補的”なる用語は、これらの使用において理解されるとき、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列間の塩基マッチングに対して使用され得る。

本明細書で使用する“実質的に”メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）“の少なくとも一部に相補的である”ポリヌクレオチドは実質的に興味ある（例えば、ＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡ）ｍＲＮＡの隣接部分に相補的であるポリヌクレオチドを意味する。例えば、配列が実質的にＰＩＫ４ＣＢをコードするｍＲＮＡの連続した部分に相補的であるとき、ポリヌクレオチドはＰＩＫ４ＣＢｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。配列が実質的にＰＩＫ４ＣＡをコードするｍＲＮＡの連続した部分に相補的であるとき、同様にポリヌクレオチドはＰＩＫ４ＣＡｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。

本明細書で使用する“二本鎖ＲＮＡ”または“ｄｓＲＮＡ”なる用語は２個の逆平行かつ上記定義の実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を意味する。二本鎖構造を形成する２個の鎖は１個の大型ＲＮＡ分子の異なる部分であり得るか、または、それらは別々のＲＮＡ分子であり得る。別々のＲＮＡ分子であるとき、このようなｄｓＲＮＡはしばしばｓｉＲＮＡ（“短干渉性ＲＮＡ”）として文献に言及されている。２個の鎖が１個の大型分子の一部であり、したがって二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端からそれぞれの他の鎖の５’末端のヌクレオチドの連続した鎖により結合しているとき、結合しているＲＮＡ鎖は“ヘアピンループ”、“ショートヘアピンＲＮＡ”または“ｓｈＲＮＡ”として称される。２個の鎖が二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端からそれぞれの他方の鎖の５’末端のヌクレオチドの連続した鎖以外の中央で共有結合しているとき、結合している構造は“リンカー”と称される。ＲＮＡ鎖は同じか、または異なっているヌクレオチドの数を有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最短の鎖におけるヌクレオチドの数から二本鎖に存在するすべてのオーバーハングの数を引いた数である。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは１個以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。加えて、本明細書で使用するとき、“ｄｓＲＮＡ”は、複数のヌクレオチドでの実質的な修飾および本明細書に記載されているか、または当分野で既知のすべての型の修飾を含む、リボヌクレオチドへの化学修飾、ヌクレオシド間結合、末端基、キャップおよび結合分子を含み得る。ｓｉＲＮＡ型分子で使用されるとき、すべてのこのような修飾は本明細書および特許請求の範囲の目的のために“ｄｓＲＮＡ”により包含される。

本明細書で使用する“ヌクレオチドオーバーハング”は、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を逸脱するとき（逆もまた同様）、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突き出ている非対合ヌクレオチドを意味する。“平滑”または“平滑末端”はｄｓＲＮＡの末端に非対合ヌクレオチドが存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングではないことを意味する。“平滑末端化した”ｄｓＲＮＡは全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子の末端のいずれかでヌクレオチドオーバーハングではないｄｓＲＮＡである。明確にするために、ｓｉＲＮＡの３’末端または５’末端に結合する化学キャップまたは非ヌクレオチド化学分子はｓｉＲＮＡがオーバーハングを有するか、または平滑末端であるかどうかの決定に考慮されない。

“アンチセンス鎖”なる用語は実質的に標的配列に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡ鎖を意味する。この鎖は、また、“ガイド”配列として既知であり、開裂のために正確なｍＲＮＡに複合体をガイドするために機能的ＲＩＳＣ複合体で使用される。本明細書で使用する、“相補性領域”なる用語は実質的に配列、例えば、本明細書に定義の標的配列に相補的であるアンチセンス鎖の領域を意味する。相補性領域が標的配列に完全に相補的でないとき、存在するときミスマッチは末端領域および一般的に、例えば、５’および／または３’末端の６、５、４、３または２個のヌクレオチド以内の末端領域において特に許容される。ＲＮＡ化合物に関するため、“アンチセンス”のこの使用は、核酸治療の関連分野ではあるがアンチセンスＤＮＡ化合物とは異なっている。

本明細書で使用する“センス鎖”なる用語は実質的にアンチセンス鎖の領域に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡ鎖を意味する。この鎖は、また、標的配列と同じヌクレオチド配列を含むため、“抗ガイド”配列として既知であり、したがって特異的にガイド配列に結合する。

ｄｓＲＮＡに関するとき“細胞に導入”は、当業者により理解されるとおり、細胞への容易な取り込みまたは吸収を意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは自発的拡散または能動細胞過程を介して、または補助剤または補助装置により起こすことができる。この用語の意味はインビトロでの細胞に限定されず；ｄｓＲＮＡは、また、生きている生物の部分である“細胞に導入”され得る。このような例において、細胞への導入は生物への送達を含む。例えば、インビボでの送達のためにｄｓＲＮＡを組織部位に注射するか、または全身に投与することができる。インビトロでの細胞への導入は当分野で既知の方法、例えば、エレクトロポレーションおよびリポフェクションを含む。

ＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡに言及する限り、“サイレンス”および“の発現を抑制”なる用語は、本明細書において、正常（未処理）細胞と比較して転写されるか、または得られるｍＲＮＡの量の減少により示されるような、ＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡを標的とするｄｓＲＮＡで処理された細胞におけるＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡの発現の少なくとも部分的な抑制を意味する。この測定は、このように処理されていない第１の細胞または細胞群（対照細胞）と実質的に同一である第２の細胞または細胞群と比較して、処理された細胞（ＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡの発現を抑制するように処置された第１の細胞または細胞群から単離され得る）におけるｍＲＮＡレベルを比較することにより測定し得る。阻害の程度は、通常、下記式で表される。

あるいは、阻害の程度は、機能的に遺伝子転写と関連しているパラメーター、例えば、ポリペプチドの量または特定の表現型を示す細胞数、例えば、特異的にＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡと関連するキナーゼ活性または感染の感受性の減少の点で得ることができる。原則として、遺伝子サイレンシングは、構造的にまたは遺伝子工学的のいずれかにより、および適当なアッセイにより、興味ある遺伝子を発現するすべての細胞において測定することができる。しかしながら、参考として与えられるｄｓＲＮＡがＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡの発現をどの程度抑制するかどうか、したがって本発明により包含されるかどうかを決定するために必要であるとき、下記実施例で提供されるアッセイはこのような参考のために使用される。

例えば、場合によっては、ＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡ遺伝子の発現は本発明の二本鎖ＲＮＡの投与により少なくとも約２０％、２５％、３５％または５０％抑制される。いくつかの態様において、ＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡ遺伝子は本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により少なくとも約６０％、７０％または８０％抑制される。いくつかの態様において、ＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡ遺伝子は本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により少なくとも約８５％、９０％または９５％抑制される。図２の結果はＰＩＫ４ＣＢ（またはＰＩＫ４ＣＡ）を標的とする試験したそれぞれのｄｓＲＮＡがＨＣＶレプリコンアッセイにおいて発現産物の相対レベルを１０％から９０％減少させるために有効であることを証明する。図３の結果はＰＩＫ４ＣＢ（またはＰＩＫ４ＣＡ）を標的とする試験したそれぞれのｄｓＲＮＡが細胞のＰＩＫ４ＣＢ（またはＰＩＫ４ＣＡ）ｍＲＮＡレベルを１０％から９０％減少させるために有効であることを証明する。

本明細書で使用するプラス鎖ＲＮＡウイルス感染の内容において、“処置”、“処置する”などの用語はプラス鎖ＲＮＡウイルス感染が介在する病理過程の軽減または緩和を意味する。このような記載はプラス鎖ＲＮＡウイルス感染の防止または予防およびプラス鎖ＲＮＡウイルス感染により引き起こされる症状または病状の軽減のための本発明の治療剤の使用を含む。本発明の内容において、それが下記の他の状態（プラス鎖ＲＮＡウイルス感染が介在する病理過程以外）のいずれかに関する場合、“処置”、“処置する”などの用語はこのような状態と関連する少なくとも１種の症状を除去または緩和するか、またはこのような状態の進行を遅延または逆転することを意味する。

本明細書で使用する“治療有効量”および“予防有効量”なるフレーズはプラス鎖ＲＮＡウイルス感染が介在する病理過程またはプラス鎖ＲＮＡウイルス感染が介在する病理過程の明白な症状の処置、予防または管理における治療利益を提供する量を意味する。治療有効である特定の量は通常の医師により容易に決定することができ、当分野で既知の因子、例えば、プラス鎖ＲＮＡウイルス感染が介在する病理過程の型、患者の履歴および年齢、プラス鎖ＲＮＡウイルス感染が介在する病理過程の段階および他の抗病理学的薬物の投与に依存して変化し得る。

本明細書で使用する“医薬組成物”は薬理学的に有効量のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する“薬理学的に有効量”、“治療有効量”または単に“有効量”は意図される薬理学的、治療的または予防的結果を得るために有効なｄｓＲＮＡの量を意味する。例えば、与えられた臨床的処理が、疾患または障害と関連する測定可能なパラメーターにおいて少なくとも２５％減少であるとき有効であると考慮されるとき、疾患または障害の処置のための薬物の治療有効量はパラメーターの少なくとも２５％減少を引き起こすために必要な量である。

“薬学的に許容される担体”なる用語は治療剤の投与のための担体を意味する。このような担体は塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。該用語は特に細胞培養培地を考慮しない。経口投与用薬物のための薬学的に許容される担体は薬学的に許容される賦形剤、例えば、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、平滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤および防腐剤を含むが、これらに限定されない。適当な不活性希釈剤は炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウムおよびラクトースを含み、コーンデンプンおよびアルギン酸は適当な崩壊剤である。結合剤はデンプンおよびゼラチンを含み得、存在するとき平滑剤は一般的にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。所望により、錠剤は胃腸管での吸収を遅延させるために、物質、例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルで被覆してもよい。

本明細書で使用する“形質転換細胞”はｄｓＲＮＡ分子を発現し得るベクターを導入した細胞である。

二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
１つの態様において、本発明は、細胞または哺乳動物におけるＰＩＫ４ＣＢおよび／またはＰＩＫ４ＣＡの発現を阻害し、それによりプラス鎖ＲＮＡウイルス複製または増殖を抑制する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子であって、ここで、ＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡの発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含むアンチセンス鎖を含み、ここで、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満、一般的に１９−２４ヌクレオチド長であり、そして、該ＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡ遺伝子の発現を少なくとも１０％、２５％または４０％抑制するｄｓＲＮＡを提供する。

ｄｓＲＮＡは二本鎖構造を形成するためにハイブリダイズするために十分に相補的である２個のＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は実質的にＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡ遺伝子の遺伝子産物の配列から生じる標的配列に相補的、一般的にこれに完全に相補的である相補性領域を含み、他方の鎖（センス鎖）は適当な条件下で混合したとき、２個の鎖がハイブリダイズし、二本鎖構造を形成するようなアンチセンス鎖に相補的である領域を含む。一般的に、二本鎖構造は１５から３０塩基対長、より一般的には１８から２５塩基対長、さらにより一般的には１９から２４塩基対長、より一般的には１９から２１塩基対長である。同様に、標的配列に対する相補性領域は１５から３０ヌクレオチド長、より一般的には１８から２５ヌクレオチド長、さらにより一般的には１９から２４ヌクレオチド長、より一般的には１９から２１ヌクレオチド長である。本発明のｄｓＲＮＡは平滑末端であるか（例えば、いずれかの鎖におけるそれぞれのヌクレオチドが他方の鎖における塩基対に対して適当なヌクレオチドを有するとき）、または、一般的に３’末端において１個以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。ｄｓＲＮＡは以下に記載のような当分野で既知の標準方法、例えば、Biosearch, Applied Biosystems, Incから販売されている自動ＤＮＡ合成装置の使用により合成することができる。

特定の態様において、ｄｓＲＮＡはＰＩＫ４ＣＢを標的とするための表１のセンス配列から選択される鎖および表１のアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列を含む。ＰＩＫ４ＣＢ標的配列の他の場所、例えば、表１で同定される薬物が標的とするわずかに上流または下流を標的とする別の薬物は、表１に記載されている配列およびＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿００２６５１で見いだせる隣接ｍＲＮＡまたはゲノム配列を使用して容易に同定することができる。

特定の態様において、ｄｓＲＮＡはＰＩＫ４ＣＡを標的とするための表２のセンス配列から選択される鎖および第２のアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列を含む。ＰＩＫ４ＣＡ標的配列の他の場所、例えば、表２で同定される薬物が標的とするわずかに上流または下流を標的とする別の薬物は、表２に記載されている配列およびＮＣＢＩ受入番号：ＮＭ＿００２６５０で見いだせる隣接ｍＲＮＡまたはゲノム配列を使用して容易に同定することができる。

さらなる態様において、ｄｓＲＮＡは表１または表２から提供される二本鎖配列から選択される少なくとも１個の二本鎖配列を含む。他の態様において、治療剤は表１および／または表２から選択される２個以上の二本鎖配列を含み得る。一般的に、それぞれのｄｓＲＮＡは２個のオリゴヌクレオチド鎖を含み、ここで、第１のオリゴヌクレオチドは表のセンス鎖として記載されており、そして第２のオリゴヌクレオチドは同じ表のアンチセンス鎖として記載されている。それぞれの表はそれぞれの好ましいｄｓＲＮＡに対する二本鎖名を提供する。ヌクレオチド塩基は標準ヌクレオチド表記を使用して示されている。

表１−ＰＩＫ４ＣＢを標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）

表２−ＰＩＫ４ＣＡを標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）

２０から２３塩基対、特に２１塩基対の二本鎖構造を含むｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の誘導において特に有効であると認められていることを、当業者はよく知っている（Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888）。しかしながら、そのほかに、より短いまたはより長いｄｓＲＮＡが同様に有効であり得ることが見いだされている。上記の態様において、表１または表２で提供されるオリゴ核酸配列の性質のため、本発明のｄｓＲＮＡは最小２１ｎｔ長の少なくとも一本鎖を含むことができる。表１または表２の配列の１つから一方または両方の末端のほんの数ヌクレオチドを引いたものを含むより短いｄｓＲＮＡが上記ｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であり得ることはかなり期待することができる。したがって、表１または表２の配列の１つから少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の隣接ヌクレオチドの部分的な配列を含み、そして完全配列を含むｄｓＲＮＡと、ＦＡＣＳアッセイまたは本明細書に記載されている他のアッセイにおいてＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡ遺伝子の発現を抑制する能力において最高で５、１０、１５、２０、２５または３０％阻害するｄｓＲＮＡは、本発明に考慮される。表１または表２で提供される標的配列内を開裂するさらなるｄｓＲＮＡは提供される参照配列および標的配列を使用して容易に製造することができる。

加えて、表１または表２で提供されるＲＮＡｉ薬物はＲＮＡｉに基づく開裂に特に感受性であるＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡｍＲＮＡの有用な部位を同定する。本発明は、さらに本発明の薬物の１個により標的とされる配列内を標的にするＲＮＡｉ薬物それ自体を含む。第２のＲＮＡｉ薬物が第１のＲＮＡｉ薬物のアンチセンス鎖に相補的であるｍＲＮＡ内のいずれかのメッセージを開裂するとき、本明細書で使用するとき、第２のＲＮＡｉ薬物は第１のＲＮＡｉ薬物の配列内を標的とする薬物である。このような第２の薬物は、一般的に標的遺伝子の選択された配列に対する隣接領域から取られたさらなる核酸配列と結合した表１または表２で提供される配列の１個からの少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドからなる。例えば、ＰＩＫ４ＣＢ遺伝子の次の６個のヌクレオチドと結合した配列番号５の最後の１５個のヌクレオチドは、表１で提供される配列の１個に基づく２１個のヌクレオチドの一本鎖薬物を示す。この一本鎖に基づいて、相補的センス鎖は容易に製造することができる。それは、元の配列番号５二本鎖と同じ感受性領域で標的ｍＲＮＡを開裂させる。同じことが表２で提供される配列に基づくＰＩＫ４ＣＡに対しても扱うことができる。

本発明のｄｓＲＮＡは標的配列に１個以上のミスマッチを含むことができる。好ましい態様において、本発明のｄｓＲＮＡは最大３個のミスマッチを含む。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列にミスマッチを含むとき、ミスマッチの領域が相補性領域の中央に位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列にミスマッチを含むとき、ミスマッチがいずれかの末端から５個のヌクレオチド、例えば、相補性領域の５’または３’末端のいずれかの５、４、３、２または１個のヌクレオチドに限定されていることが好ましい。例えば、ＰＩＫ４ＣＢ標的遺伝子の領域に相補的である２３個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖に関して、ｄｓＲＮＡは一般的に中央の１３個のヌクレオチド内に何らかのミスマッチを含まない。本発明内に記載されている方法は標的配列にミスマッチを含むｄｓＲＮＡが細胞におけるＰＩＫ４ＣＢの発現の減少に有効であるかどうかを決定するために使用することができる。とりわけＰＩＫ４ＣＢの特定の相補性領域がヒトにおいて多型配列変異を有することが既知であるとき、ＰＩＫ４ＣＢの発現の抑制におけるミスマッチを有するｄｓＲＮＡの効力の研究は重要である。同じ分析がＰＩＫ４ＣＡを標的とするｄｓＲＮＡに対して使用することができる。

１つの態様において、少なくとも１個のｄｓＲＮＡの末端は１から４個、一般的に１または２個のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１個のヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは平滑末端対照物よりも予想外により優れた阻害特性を有する。さらに、１個だけのヌクレオチドオーバーハングの存在は全体的な安定性に影響せずｄｓＲＮＡの干渉活性を強化する。１個だけのオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、インビボで、ならびに種々の細胞、細胞培養培地、血液および血清において特に安定かつ有効であることが証明されている。一般的に、一本鎖オーバーハングはアンチセンス鎖の３’末端、あるいは、センス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、また、一般的にアンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端を有し得る。このようなｄｓＲＮＡは改善された安定性および阻害活性を有し、したがって、低用量、すなわち、５ｍｇ／ｋｇ受容体の体重／日未満で投与することができる。一般的に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は３’末端でヌクレオチドオーバーハングを有する。他の態様において、オーバーハングにおける１個以上のヌクレオチドはヌクレオシドチオホスフェートで置換されている。

表１および表２において、ＲＮＡ鎖のマッチペアは３’末端に２個のチミジンＤＮＡヌクレオチドを有することを示している。ｓｉＲＮＡに対する安定性または他の所望の特性を与える傾向にある一般的に使用されるモチーフであるため、このＴ−Ｔモチーフを例示する。したがって、Ｔ−Ｔは本発明の適当な態様である。それにもかかわらず、所望により修飾されたヌクレオシド間結合、化学修飾または保護キャップを有するヌクレオチドの他の配置がｓｉＲＮＡ鎖の３’末端に使用され得ることは当業者によく知られている。当業者は、ｍＲＮＡの標的配列が同じ配列を維持しているため、このような修飾が改善された機能的に同等の分子となるが、変化したオーバーハングヌクレオチドは好都合に他の薬理学的応答に影響し得ることを知っている。

さらに他の態様において、ｄｓＲＮＡは安定性を高めるか、または他の治療利益を提供するために化学的に修飾されている。本発明の核酸は当分野で確立されている方法、例えば、“Current protocols in nucleic acid chemistry”, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA（これは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されているものにより合成および／または修飾され得る。化学修飾は２’修飾、オリゴヌクレオチドの糖または塩基の他の部位の修飾、非天然塩基のオリゴヌクレオチド鎖への導入、リガンドまたは化学部分への共有結合およびヌクレオチド間ホスフェート結合の他の結合、例えば、チオホスフェートでの置換を含み得るが、これらに限定されない。２個以上のこのような修飾が使用され得る。

２個の別々のｄｓＲＮＡ鎖の化学結合は種々のよく知られた技術のいずれかにより、例えば、共有、イオンまたは水素結合；疎水性相互作用、ファンデルワールスまたはスタッキング相互作用を導入することにより；金属イオン配位の手段またはプリン類似体の使用を介する手段により達成され得る。一般的に、ｄｓＲＮＡを修飾するために使用することができる化学基はメチレンブルー；二官能基、一般的にビス−（２−クロロエチル）アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキサルベンゾイル）シスタミン；４−チオウラシル；およびソラーレンを含むが、これらに限定されない。１つの態様において、リンカーはヘキサ−エチレングリコールリンカーである。この場合、ｄｓＲＮＡは固相合成により生産され、ヘキサ−エチレングリコールリンカーは標準方法にしたがって組み込まれる（例えば、Williams, D.J., and K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670）。特定の態様において、アンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端はヘキサエチレングリコールリンカーにより化学的に結合している。他の態様において、ｄｓＲＮＡの少なくとも１個のヌクレオチドはホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡ末端の化学結合は一般的にトリプルヘリックス結合により形成される。表１および表２はこれらの技術にしたがって修飾され得るｄｓＲＮＡ配列の例を提供する。

さらに他の態様において、２個の一本鎖の一方または両方のヌクレオチドは細胞酵素、例えば、限定はしないが特定のヌクレアーゼの分解活性を防止または抑制するために修飾され得る。核酸に対する細胞酵素の分解活性を抑制するための技術は、２’−アミノ修飾、２’−アミノ糖修飾、２’−Ｆ糖修飾、２’−Ｆ修飾、２’−アルキル糖修飾、非荷電骨格修飾、モルホリノ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾およびホスホロアミダートを含むことが当分野で既知であるが、これらに限定されない（例えば、Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8、参照）。したがって、ｄｓＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも１個の２’−ヒドロキシル基は化学基、一般的に２’−アミノまたは２’−メチル基により置換されている。また、少なくとも１個のヌクレオチドはロックされたヌクレオチドを形成するために修飾され得る。このようなロックされたヌクレオチドは、リボースの２’−酸素とリボースの４’−炭素を結合するメチレン架橋を含む。ロックされたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドはKoshkin, A.A., et al., Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630)およびObika, S. et al., Tetrahedron Lett. (1998), 39: 5401-5404)に記載されている。オリゴヌクレオチドへのロックされたヌクレオチドの導入は相補的配列に対する親和力を改善し、融点が数度上がる（Braasch, D.A. and D.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7）。

ｄｓＲＮＡにリガンドが結合すると、その細胞吸収ならびに特定の組織への標的化または特定の型の細胞による取り込みを強化することができる。場合によっては、疎水性リガンドが細胞膜の直接の透過を容易にするためにｄｓＲＮＡに結合している。あるいは、ｄｓＲＮＡに結合しているリガンドは受容体介在エンドサイトーシスの基質である。これらのアプローチはアンチセンスオリゴヌクレオチドならびにｄｓＲＮＡ薬物の細胞透過性を促進するために使用されている。例えば、コレステロールは種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合しており、それらの非結合類似物と比較して実質的により活性である化合物となる。M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103、参照。オリゴヌクレオチドに結合している他の親油性化合物は、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロールおよびメントールを含む。受容体介在エンドサイトーシスに関するリガンドの１つの例は葉酸である。葉酸は葉酸受容体介在エンドサイトーシスにより細胞に入る。葉酸を有するｄｓＲＮＡ化合物は葉酸受容体介在エンドサイトーシスを介して細胞に効果的に輸送される。Ｌｉおよび共同物は、オリゴヌクレオチドの３’末端への葉酸の結合がオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを８倍に増加したことを報告している。Li, S.; Deshmukh, H. M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540。オリゴヌクレオチドに結合している他のリガンドはポリエチレングリコール、炭水化物クラスター、架橋剤、ポルフィリン複合体および送達ペプチドを含む。

場合によっては、カチオンリガンドのオリゴヌクレオチドへの結合はヌクレアーゼに対する耐性を改善する。カチオンリガンドの代表的な例はプロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムである。興味深いことに、カチオンリガンドがオリゴヌクレオチド中に散在しているとき、アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡに対するそれらの高い結合親和力を維持することが報告された。M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103、参照かつ本明細書に引用する。

リガンド結合した本発明のｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡへの結合分子の結合から誘導されるような、ペンダント(pendant)反応機能性を有するｄｓＲＮＡの使用により合成され得る。この反応性オリゴヌクレオチドは市販のリガンド、種々の何らかの保護基を有する合成されたリガンドまたはそれに結合する結合部分を有するリガンドと直接反応し得る。いくつかの好ましい態様において、本発明の方法は、適当にリガンドと結合しており、さらに固体支持材に結合していてもよいヌクレオシドモノマーの使用によりリガンド結合のｄｓＲＮＡの合成を容易にする。所望により固体支持材に結合しているこのようなリガンド−ヌクレオシド複合体は、選択された血清結合リガンドとヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’位に位置する結合部分の反応を介して、本発明の方法のいくつかの好ましい態様にしたがって製造される。場合によっては、ｄｓＲＮＡの３’末端に結合しているアラルキルリガンドを有するｄｓＲＮＡは、最初にモノマー構成要素を多孔性ガラス支持体に長鎖アミノアルキル基を介して共有結合させることにより製造される。次に、ヌクレオチドは標準固相合成技術を介して固体支持体に結合したモノマー構成要素に結合している。モノマー構成要素はヌクレオシドまたは固相合成に適合する他の有機化合物であり得る。

本発明の複合体で使用されるｄｓＲＮＡは固相合成のよく知られている技術を介して都合良くかつ日常的に製造され得る。このような合成のための装置は、例えば、Applied Biosystems(Foster City, CA)を含むいくつかのメーカーにより販売されている。当分野で既知のこのような合成のための任意の他の方法がさらに、またはあるいは使用され得る。他のオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体を製造するための同様の技術を使用することも知られている。

特定の修飾されたオリゴヌクレオチドの合成に関する技術が下記米国特許で見出すことができる：米国特許第５，１３８，０４５および５，２１８，１０５号、ポリアミン結合オリゴヌクレオチド；米国特許第５，２１２，２９５号、キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの製造のためのモノマー；米国特許第５，３７８，８２５および５，５４１，３０７号、修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチド；米国特許第５，３８６，０２３号、骨格修飾オリゴヌクレオチドおよび還元カップリングを介するその製造；米国特許第５，４５７，１９１号、３−デアザプリン環系に基づく修飾された核酸塩基およびその合成方法；米国特許第５，４５９，２５５号、Ｎ−２置換プリンに基づく修飾された核酸塩基；米国特許第５，５２１，３０２号、キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドを製造方法；米国特許第５，５３９，０８２号、ペプチド核酸；米国特許第５，５５４，７４６号、β−ラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチド；米国特許第５，５７１，９０２号、オリゴヌクレオチドの合成のための方法および物質；米国特許第５，５７８，７１８号、アルキルチオ基を有するヌクレオシド、ここで、このような基はヌクレオシドの種々の任意の位置で結合している他の部分にリンカーとして使用され得る；米国特許第５，５８７，３６１および５，５９９，７９７号、キラル高純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド；米国特許第５，５０６，３５１号、２’−Ｏ−アルキルグアノシンおよび２，６−ジアミノプリン化合物を含む関連化合物の製造方法；米国特許第５，５８７，４６９号、Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチド；米国特許第５，５８７，４７０号、３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチド；米国特許第５，２２３，１６８号および米国特許第５，６０８，０４６号、結合４’−デスメチルヌクレオシド類似物；米国特許第５，６０２，２４０および５，６１０，２８９号、骨格修飾オリゴヌクレオチド類似物；米国特許第６，２６２，２４１および５，４５９，２５５号、とりわけ、２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法。他の好ましい修飾はＵＳ６６７０４８６、ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００３０８２２５５およびＷＯ２００５０２１７４９に示されている。

本発明の配列特異的結合ヌクレオシドを有するリガンド結合ｄｓＲＮＡおよびリガンド分子において、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは標準ヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体、または、すでに結合部分を有するヌクレオチドもしくはヌクレオシド結合前駆体、すでにリガンド分子を有するリガンド−ヌクレオチドもしくはヌクレオシド複合体前駆体、または、構成要素を有する非ヌクレオシドリガンドを使用して適当なＤＮＡ合成装置で構築され得る。

すでに結合部分を有するヌクレオチド結合前駆体を使用して、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が一般的に完了するとき、次にリガンド分子は結合部分と反応させ、リガンド結合オリゴヌクレオチドを形成する。種々の分子、例えば、ステロイド、ビタミン、脂質およびレポーター分子を有するオリゴヌクレオチド複合体はすでに記載されている（Manoharan et al., ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７８８３、参照）。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドは、市販されており、オリゴヌクレオチド合成において日常的に使用される標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシド複合体からのホスホラミダイトを使用する自動合成装置により合成される。

オリゴヌクレオチドのヌクレオシドにおける２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−アミノアルキル、２’−Ｏ−メトキシエトキシまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ基の混入はオリゴヌクレオチドの治療特性の増強、例えば、ハイブリダイゼーション速度の増進を提供し得る。さらに、ホスホロチオエート骨格を含むオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ安定性を増強した。したがって、本発明の機能性結合ヌクレオシドはホスホロチオエート骨格または２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アミノアルキル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−メトキシエトキシもしくは２’−デオキシ−２’−フルオロ基のいずれか、または両方を含むものに拡大することができる。当分野で既知のいくつかのオリゴヌクレオチド修飾の要約した表が、例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ２００３７０９１８で見出せる。

いくつかの態様において、５’末端にアミノ基を有する本発明の機能性ヌクレオシド配列はＤＮＡ合成装置を使用して製造され、次に選択されたリガンドの活性エステル誘導体と反応させる。活性エステル誘導体は当業者によく知られている。代表的な活性エステルはＮ−ヒドロスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステルおよびペンタクロロフェノールエステルを含む。アミノ基および活性エステルの反応で選択されたリガンドが結合基を介して５’位に結合しているオリゴヌクレオチドを生じる。５’末端のアミノ基は５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６薬物を使用して製造することができる。１つの態様において、リガンド分子は、リンカーを直接または間接的に介して５’−ヒドロキシ基と結合しているリガンド−ヌクレオシドホスホラミダイトの使用により５’位でオリゴヌクレオチドに結合し得る。このようなリガンド−ヌクレオシドホスホラミダイトは一般的に５’末端にリガンドを有するリガンド結合オリゴヌクレオチドを提供するための自動合成方法の最後に使用する。

修飾されたヌクレオシド間結合または骨格の例は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィナート、３’−アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよび通常３’−５’結合を有するボラノホスフェート、２’−５’結合のこれらの類似物および反転させた極性を有するものを含み、ここで、ヌクレオシド単位の隣接ペアは３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’が関連している。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。

上記リン原子含有結合の製造に関する代表的な米国特許は、米国特許第３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９６；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３０６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；５，６２５，０５０；および５，６９７，２４８号を含むが、これらに限定されない（これらそれぞれは出典明示により本明細書に包含させる）。

そこにリン原子を含まない修飾されたヌクレオシド間結合または骨格（すなわち、オリゴヌクレオシド）の例は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキル糖間結合または１個以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖間結合により形成される骨格である。これらはモルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部から離れて形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ_２成分を含む他のものを有するものを含む。表１および表２に示すとおり、ｄＴ−ｄＴペアはｄｓＲＮＡのいずれかの（または両方の）鎖の３’末端に加えられ得る。これらの置換で加えられたｄＴ−ｄＴペアは通常、標的配列に相補的ではない。ホスホロチオエート（硫黄）ヌクレオシド間結合を含み得るこれらのｄＴ−ｄＴペアは安定性を強化するために加えられる。

上記オリゴヌクレオシドの製造に関する代表的な米国特許は、米国特許第５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；および５，６７７，４３９を含むが、これらに限定されない（これらそれぞれは出典明示により本明細書に包含させる）。

場合によっては、オリゴヌクレオチドは非リガンド基により修飾され得る。多くの非リガンド分子は活性、オリゴヌクレオチドの細胞分布または細胞取り込みを増強するためにオリゴヌクレオチドに結合しており、このような結合を行うための方法は科学文献から得られる。このような非リガンド部分は脂質部分、例えば、コレステロール（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleosides, 1995, 14:969）またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229）またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923）を含む。このようなオリゴヌクレオチド結合の製造を教示する代表的な米国特許は上記されている。典型的な結合プロトコールは配列の１個以上の位置にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成を含む。次にアミノ基を適当なカップリング剤または活性化剤を使用して結合する分子と反応させる。結合反応は、まだ固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドまたは溶液相におけるオリゴヌクレオチドの下記開裂のいずれかで実施され得る。ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチド複合体の精製により一般的に純粋な複合体を得る。このような部分がプラス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、ＨＣＶ）感染の原発部位である標的肝臓細胞を増加することができるため、コレステロール複合体の使用は特に好ましい。

本明細書はＰＩＫ４ＣＢ発現をサイレンスし、したがってプラス鎖ＲＮＡウイルス増殖を防止し、関連障害を処置するために有用であるｄｓＲＮＡの種々の態様を記載している。特定の治療剤の設計は種々の形態を取ることができるが、特定の機能特性はｄｓＲＮＡの好ましい組合せをｄｓＲＮＡの他の組合せと区別する。特に、当業者によりすべて測定可能な特性、例えば、良い血清安定性、高力価、引き起こされる免疫応答がないおよび良い薬物様行動は、好ましい本発明のｄｓＲＮＡを同定するために試験される。場合によっては、すべてこれらの機能面が好ましいｄｓＲＮＡ組合せに存在するとは限らない。しかし、当業者は好ましい本発明の化合物を選択するためにこれらの変化および他のものを最適化することができる。

本発明者は有意に改善された薬理学的、免疫学的および究極的な治療利益を提供する傾向にある化学修飾の型を知っている。これらの型を選択される標的配列にかかわらずｓｉＲＮＡを改良するために観察する。表３は表１または表２に示されている二本鎖ｄｓＲＮＡを使用するために好ましい化学修飾の型を示す。これらの型は相互排他的ではない。
表３−ｓｉＲＮＡの好ましい化学修飾

ｓ＝ホスホロチオエート結合
ｄＴ＝デオキシリボチミジン
２’ＯＭｅ＝ＲＮＡの２’−Ｏ−メチル修飾
Ｐｙ＝ピリミジンヌクレオチド
Ｃｈｏｌ＝コレステロール。“ｅｘｏ”は３’末端結合を意味する；“ｅｎｄｏ”は内部ヌクレオシドへの結合を意味する。
ｕＡまたはｃＡ＝ＵＡまたはＣＡ ＲＮＡ配列を示し、ＵまたはＣは示された修飾を受ける。同じことをｕＧおよびｕＵに適用する。

ＲＮＡｉ薬物をコードするベクター
本発明のｄｓＲＮＡは、また、インビボで組換えウイルスベクターから細胞内に発現することができる。本発明の組換えウイルスベクターは本発明のｄｓＲＮＡをコードする配列およびｄｓＲＮＡ配列を発現するための任意の適当なプロモーターを含む。適当なプロモーターは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ プロモーター配列およびサイトメガロ・ウイルスプロモーターを含む。他の適当なプロモーターの選択は当業者ができる。本発明の組換えウイルスベクターは、また、特定の組織または特定の細胞内環境においてｄｓＲＮＡの発現のための誘導可能なまたは調節可能なプロモーターを含むことができる。インビボで本発明のｄｓＲＮＡを細胞に送達するための組換えウイルスベクターの使用は以下により詳細に記載している。

本発明のｄｓＲＮＡは２個の別々の相補的ＲＮＡ分子または２個の相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子のいずれかとして組換えウイルスベクターから発現され得る。

発現させるｄｓＲＮＡ分子をコードする配列を受け入れることができるすべてのウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルスなど由来のベクターを使用することができる。ウイルスベクターの親和性は他のウイルスのエンベロープタンパク質または他の表面抗原を有するベクターを偽型化(pseudotyping)することにより、または、必要に応じて異なるウイルスカプシドタンパク質と置き換えることにより修飾することができる。

例えば、本発明のレンチウイルスベクターは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質で偽型化(pseudotyped)することができる。本発明のＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するためのベクターを設計することにより異なる細胞を標的とさせることができる。例えば、血清型２ゲノムで血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターはＡＡＶ２／２と称する。ＡＡＶ２／２ベクターのこの血清型２カプシド遺伝子は血清型５カプシド遺伝子により置き換え、ＡＡＶ２／５ベクターを製造できる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は当業者に既知である；例えば、Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801（これらの全体の記載を出典明示により本明細書に包含させる）、参照。

本発明で使用するために適当な組換えウイルスベクターの選択、ｄｓＲＮＡを発現するための核酸配列をベクターに挿入するための方法およびウイルスベクターを興味ある細胞へ送達するための方法は当業者に既知である。例えば、Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310；Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614；Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1:5-14； Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30；およびRubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406（これらの全体の記載を出典明示により本明細書に包含させる）、参照。

好ましいウイルスベクターはＡＶおよびＡＡＶ由来のものである。特に好ましい態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、例えば、Ｕ６もしくはＨ１ ＲＮＡプロモーターまたはサイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを含む組換えＡＡＶベクターから２つの別々の相補的一本鎖ＲＮＡ分子として発現する。

本発明のｄｓＲＮＡを発現するための適当なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法およびベクターを標的細胞へ送達するための方法はXia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010に記載されている。

本発明のｄｓＲＮＡを発現するための適当なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法およびベクターを標的細胞へ送達するための方法はSamulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101；Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532；Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願ＷＯ９４／１３７８８；および国際特許出願ＷＯ９３／２４６４１（これらの全体の記載を出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。

ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物
１つの態様において、本発明は本明細書に記載されているｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。他の態様において、本発明はｄｓＲＮＡおよび他の活性成分の組合せを含む。ｄｓＲＮＡおよび活性成分の組合せを含む医薬組成物はプラス鎖ＲＮＡウイルス感染が介在する病理過程と関連する疾患または障害を処置するために有用である。

本発明の医薬組成物はＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡ遺伝子の発現または活性を抑制するために十分な用量で投与される。本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物が驚くべきことに低用量で投与することができることを本発明者は決定した。５ｍｇのｄｓＲＮＡ／キログラム受容体の体重／日の用量がＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡ遺伝子を阻止または抑制するために十分である。

一般的に、組合せにおけるそれぞれのｄｓＲＮＡの適当な用量は０．０１から５．０ミリグラム／キログラム受容体の体重／日の範囲、一般的に１マイクログラムから１ｍｇ／キログラム体重／日の範囲である。医薬組成物は１日１回で投与されるか、またはｄｓＲＮＡは放出制御製剤によって持続注入または送達を使用して１日以上にわたって適当な間隔で２、３またはそれ以上の分割用量で投与され得る。その場合、それぞれの分割用量を含むｄｓＲＮＡは全１日用量を達成するために対応してより少なくしなければならない。投与単位は、また、例えば、数日間にわたってｄｓＲＮＡの持続放出を提供する慣用の持続放出製剤を使用して、数日間にわたって送達するために合成することができる。この態様において、投与単位は対応する複数の１日用量を含む。

疾患または障害の重症度、これまでの治療、対象の一般的な健康状態および／または年齢、および他の疾患の存在、これらに限定されないがこれらを含む、特定の因子が対象を有効に処置するために必要である用量および時間(timing)に影響し得ることを当業者は理解している。さらに、治療有効量の組成物での対象の処理は１回の処理または一連の処理を含むことができる。本発明に包含される個々のｄｓＲＮＡの有効量およびインビボでの半減期の評価は、慣用の方法を使用して、または本明細書の他のところに記載されているとおりの適当な動物モデルを使用するインビボ試験に基づいて行うことができる。

種々の理由のため、２個以上のｄｓＲＮＡの組合せでプラス鎖ＲＮＡウイルス感染を処置することが望ましいかもしれないことを、発明者は認識している。一方のｄｓＲＮＡが本発明のｄｓＲＮＡから選択され、他方のｄｓＲＮＡがプラス鎖ＲＮＡウイルスそれ自体を標的とする既知のｄｓＲＮＡから選択される。ＨＣＶまたはＨＰＶまたは他のプラス鎖ＲＮＡウイルスを標的とするｄｓＲＮＡは先行技術の文献から確認することができる。ｄｓＲＮＡの１個以上の型を含む本発明の医薬組成物は本明細書に記載されている個々のｄｓＲＮＡの用量を含むことが予期される。

ｄｓＲＮＡの組合せは単一の投与形態の医薬組成物と一緒に提供され得る。あるいは、組合せｄｓＲＮＡは別々の投与形態で提供され得、この場合、それらは同じ時または異なる時で恐らく異なる手段により投与され得る。したがって、本発明は本発明のｄｓＲＮＡの所望の組合せを含む医薬組成物を考慮し；また、組合せレジメンの一部として提供されることを意図する単一のｄｓＲＮＡの医薬組成物を考慮する。後記の場合、組合せ治療発明は、それにより、組成物の内容よりむしろ投与方法である。

マウス遺伝の利点は種々のヒト疾患、例えば、ＨＣＶ感染が介在する病理過程の試験のための多くのマウスモデルが生産されていることである。このようなモデルはインビボでｄｓＲＮＡを試験するため、ならびに治療有効量および好ましいｄｓＲＮＡの組合せを決定するために使用される。

すべての方法は本発明のｄｓＲＮＡをＨＣＶに感染した細胞を含む哺乳動物に投与するために使用することができる。例えば、投与は局所（例えば、膣内、経皮など）；経口；または非経口（例えば、皮下、心室内、筋肉内もしくは腹腔内注射または静脈内点滴により）であり得る。投与は（例えば、注射により）迅速であるか、または（例えば、ゆっくりな注入によりまたは持続放出製剤の投与により）長時間で行うことができる。

局所投与のために、ｄｓＲＮＡは組成物、例えば、滅菌および非滅菌水溶液、一般的な溶媒、例えば、アルコールの非水溶液または液体または固体油性溶液中で製剤化することができる。このような溶液は、また、バッファー、希釈剤および他の適当な添加剤を含むことができる。局所投与のための組成物は経皮貼布、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴、坐剤、スプレー、液体および粉末の形態で製剤化することができる。ゲルおよびクリームは当分野で既知のポリマーおよび透過剤を使用して製剤化することができる。

非経口、くも膜下または脳室内投与のために、ｄｓＲＮＡ分子は組成物、例えば、滅菌水溶液中で（バッファー、希釈剤および他の適当な添加剤（例えば、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体）も含むことができる）製剤化することができる。

加えて、本発明のｄｓＲＮＡ分子は非ウイルス方法、例えば、米国特許第６，２７１，３５９号に記載されている、例えば、生物的または非生物的方法を使用して、プラス鎖ＲＮＡウイルス感染細胞を含む哺乳動物に投与することができる。非生物的送達は、（１）リポソームに本明細書で提供されるｄｓＲＮＡ酸分子を負荷するか；（２）核酸−脂質または核酸−リポソーム複合体と形成するためにｄｓＲＮＡ分子を脂質またはリポソームと複合体化するか；または（３）ポリマー、ナノ粒子またはナノエマルジョンによる治療送達系を提供することを含むが、これらに限定されない種々の方法により達成することができる。これらの技術は他の状況で一般的に当分野でよく知られている。簡潔な記載を以下にする。

リポソームまたは脂質複合体はインビトロで細胞をトランスフェクトするために一般的に使用される陽イオン性および中性脂質から構成され得る。陽イオン性脂質は負に帯電した核酸と複合体化し（例えば、電荷関連）、リポソームを形成することができる。カチオン性リポソームの例はリポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェクターセおよびＤＯＴＡＰを含むが、これらに限定されない。リポソームを形成するための方法は当分野でよく知られている。リポソーム組成物は、例えば、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成することができる。リポフェクチン．ＲＴＭ．(Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.)およびエフェクテン．ＴＭ．(Qiagen, Valencia, Calif.)を含む多数の親油性剤は市販されている。加えて、全身送達方法は市販の陽イオン性脂質、例えば、ＤＤＡＢまたはＤＯＴＡＰを使用して最適化することができ、これらそれぞれは中性脂質、例えば、ＤＯＰＥまたはコレステロールと混合することができる。いくつかの場合、リポソーム、例えば、Templeton et al. (Nature Biotechnology, 15: 647-652 (1997))により記載されているものを使用することができる。いくつかの態様において、投与形態はリポソーム、例えば、Morrissey et al. Nat Biotechnol. 2005 Aug;23(8):1002-7. Epub 2005 Jul 24に記載されているＳＮＡＬＰで完全にカプセル化されている。Wheeler, J.J. et al. 1999. Gene Ther. 6, 271-281も参照。他の態様において、ポリカチオン、例えば、ポリエチレンイミンはインビボおよびエキソビボ送達を達成するために使用することができる（Boletta et al., J. Am Soc. Nephrol. 7: 1728 (1996)）。核酸を送達するためのリポソームの使用に関するさらなる情報は米国特許第６，２７１，３５９号、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／４０９６４およびMorrissey, D. et al. 2005. Nat Biotechnol. 23(8):1002-7において見出すことができる。

生物的送達はウイルスベクターの使用を含むが、これらに限定されない種々の方法により達成することができる。例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスベクター）はｄｓＲＮＡ分子を皮膚細胞および生存細胞に送達するために使用することができる。標準分子生物学技術は、本明細書で提供される１個以上のｄｓＲＮＡを、核酸を細胞に送達するためにこれまでに開発された異なる多数のウイルスベクターの１つに導入するために使用することができる。これらの得られるウイルスベクターは、例えば、感染により１個以上のｄｓＲＮＡを細胞に送達するために使用することができる。

本発明のｄｓＲＮＡは薬学的に許容される担体または希釈剤中で製剤することができる。“薬学的に許容される担体”（本明細書において“賦形剤”とも称される）は薬学的に許容される溶媒、懸濁剤または他のすべての薬理学的に不活性なビヒクルである。薬学的に許容される担体は液体または固体であり得、所望の容量、一貫性および他の適切な輸送および化学的特性を提供するように考慮して投与の計画された方法で選択され得る。典型的な薬学的に許容される担体は、例として：水；塩溶液；結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、ゼラチンまたは硫酸カルシウム）；滑剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコールまたは酢酸ナトリウム）；崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を含むが、これらに限定されない。

加えて、ＰＩＫ４ＣＢ遺伝子発現を標的とするｄｓＲＮＡは分子（小分子治療剤を含む）、分子構築物、または核酸の混合物と混合された、カプセル化された、結合した、または他の関連したｄｓＲＮＡを含む組成物に製剤化することができる。例えば、本発明の１個以上のｄｓＲＮＡ薬物を含む組成物は他の治療剤、例えば、抗炎症剤（例えば、非ステロイド性抗炎症剤およびコルチコステロイド）および抗ウイルス剤（例えば、リビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビル）を含むことができる。

このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死ぬ量）およびＥＤ５０（集団の５０％が治療有効な量）を決定するために、細胞培養または実験動物を標準医薬処理することにより決定することができる。毒性と治療効果の用量比は治療指数であり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として示すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。

細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータからヒトにおける使用において種々の用量の製剤で使用することができる。本発明の組成物の用量は一般的にほんのわずかな毒性であるか、または毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。該用量は使用される投与形態および利用できる投与経路に依存する範囲内で変化し得る。本発明の方法で使用される任意の化合物に対して、治療有効量は最初に細胞培養アッセイから概算することができる。用量は細胞培養において決定されるとおりのＩＣ５０（すなわち、症状の阻害の最大半量を達成する試験化合物の濃度）を含む化合物、または、適当なとき、標的配列のポリペプチド産物（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を達成する）の循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで調整され得る。このような情報はヒトにおいて有効な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。

上記単回、または複数回投与に加えて、本発明のｄｓＲＮＡはＨＣＶ感染が介在する病理過程の処置において有効であると既知の他の薬物と組み合わせて投与することができる。いずれにせよ、投与する医師は当分野で有効であると既知の、または本明細書に記載されている標準測定を使用して観察された結果に基づいてｄｓＲＮＡ投与の量および時間を調節することができる。

ｄｓＲＮＡの組合せは、好ましい単一のｄｓＲＮＡの同定に使用される同じ方法を使用して、インビトロおよびインビボで試験することができる。このような組合せは単にバイオインフォマティクス理論に基づいて選択することができる。あるいは、このような組合せは単一のｄｓＲＮＡ薬物に対して本明細書に記載されているものにしたがうインビトロまたはインビボ評価に基づいて選択され得る。ｄｓＲＮＡの組合せを試験するための好ましいアッセイは下記実施例に記載のアッセイである。

プラス鎖ＲＮＡウイルス感染により引き起こされる疾患を処置するための方法
本明細書に記載されている方法および組成物は、臨床または無症状感染の結果であり得るプラス鎖ＲＮＡウイルス感染（例えば、ＨＣＶ）により引き起こされる疾患および状態を処置するために使用することができる。

全体像として、プラス鎖ＲＮＡウイルスによる感染を処置する方法はホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＰＩ４Ｋ）の活性を選択的に抑制する化合物を必要とする患者に投与することを含む。このような化合物は前記のものをコードする小分子、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡアンチセンスＤＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡベクターから選択することができる。肝臓のＰＩＫ４ＣＢおよび／またはＰＩＫ４ＣＡに選択的である小分子薬物はプラス鎖ＲＮＡウイルスによる感染の処置における治療目的のために非常に関心がある。

このような疾患および状態は、本明細書においてときどき“プラス鎖ＲＮＡウイルス感染が介在する病理過程”と呼ばれる。ＨＣＶ感染の主な肝臓病学的結果は肝硬変症および出血、肝不全および肝細胞癌腫を含むその合併症である。線維症は肝臓構造を変形させ、微小循環および肝臓機能を妨害する細胞外マトリックス成分の沈着を引き起こす慢性炎症の結果である。肝硬変症が進行し、線維性組織が構築されるため、重度の壊死性炎症活性が起こり、脂肪症が始まる。脂肪症は糖尿病、タンパク質栄養不良、高血圧、細胞毒素(cell toxins)、肥満および無酸素症を含む肝外病状を引き起こす。線維症および脂肪症が重症化するため、肝臓が最終的に機能しなくなり、肝臓移植を必要とする。

本明細書において、“処置する方法”または“処置方法”は、示される疾患、障害または状態を処置、予防、それらに対して防止する、またはそれらの１種以上の有意な症状を（目標または対象レベルで）減少させる方法を意味することを意図する。

他に定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は本発明に属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および物質は本発明の実施または試験において使用することができるが、適当な方法および物質は以下のとおりである。本明細書に記載のすべての刊行物、特許出願、特許および他の文献はそれらの内容を出典明示により包含させる。不一致の場合、定義を含む本明細書がコントロールする。加えて、物質、方法および実施例は説明のためであり、限定を意図しない。

実施例
実施例１：ｄｓＲＮＡ合成
試薬の源
試薬源が具体的に本明細書に挙げられていないとき、このような試薬は分子生物学の試薬の何らかの提供源から分子生物学の適用のための標準の質／純度で得ることができる。

ｓｉＲＮＡ合成
一本鎖ＲＮＡをＥｘｐｅｄｉｔｅ８９０９合成装置（Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Germany）および固体支持体として制御化多孔性ガラス（CPG, 500Å, Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany）を使用することにより１μｍｏｌｅの規模での固相合成により製造した。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むＲＮＡはそれぞれ対応するホスホラミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホラミダイトを使用して固相合成により製造した（Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany）。これらの構成要素は、例えば、Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されている標準ヌクレオシドホスホラミダイト化学を使用してオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択された部位に組み込まれた。ホスホロチオエート結合はヨウ素酸化剤溶液をアセトニトリル（１％）中のビューケージ試薬の溶液（Chruachem Ltd, Glasgow, UK）で置き換えることにより導入した。さらなる補助的試薬はＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Griesheim, Germany）から得た。

陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製は確立されている方法にしたがって実施した。収率および濃度は分光光度計（DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleibheim, Germany）を使用して２６０ｎｍの波長でのそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸収により測定した。二本鎖ＲＮＡはアニーリングバッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭの塩化ナトリウム）中で相補鎖の等モル溶液を混合し、３分８５−９０℃で水浴で加熱し、３−４時間室温に冷却することにより製造した。アニール化ＲＮＡ溶液は使用するまで−２０℃で保存した。

３’−コレステロール−結合ｓｉＲＮＡ（本明細書において−Ｃｈｏｌ−３’として称する）の合成のために、適当に修飾された固体支持体をＲＮＡ合成のために使用した。修飾された固体支持体を下記のとおりに製造した：
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート ＡＡ

水酸化ナトリウムの４．７Ｍの水溶液（５０ｍＬ）を水（５０ｍＬ）中のグリシンエチル塩酸塩（３２．１９ｇ、０．２３モル）の撹拌した氷冷溶液に加えた。次に、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３モル）を加え、混合物を反応完了がＴＬＣにより確認されるまで室温で撹拌した。１９時間後、溶液をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で分配した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を蒸留し、ＡＡを得た（２８．８ｇ、６１％）。

３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステル ＡＢ

Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷で冷却した。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に加えた。次にジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温にし、さらに６時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣにより確認した。反応混合物を真空下濃縮し、酢酸エチルを沈殿ジイソプロピルウレアに加えた。懸濁液を濾過した。濾液を５％塩酸、５％重炭酸ナトリウムおよび水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、粗生成物を得、これをカラムクロマトグラフィー（５０％ ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）により精製し、１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを得た。

３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステル ＡＣ

３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステル ＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を０℃でジメチルホルムアミド中の２０％のピペリジンに溶解した。溶液を１時間撹拌を続けた。反応混合物を真空下濃縮し、水を残渣に加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。粗生成物をその塩酸塩への変換により精製した。

３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステル ＡＤ

３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステル ＡＣ（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）の塩酸塩をジクロロメタンに取った。懸濁液を氷上で０℃に冷却した。懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液にクロロギ酸コレステリル（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（１０．３ｇ、９２％）。

１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステル ＡＥ

カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの乾燥トルエン中でスラリーにした。混合物を０℃に氷で冷却し、５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステル ＡＤを撹拌しながら２０分以内にゆっくり加えた。温度は添加中、５℃以下を維持した。撹拌を３０分０℃で続け、１ｍＬの氷酢酸、次に即座に４０ｍＬの水中の４ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏを加えた。得られた混合物をそれぞれ１００ｍＬのジクロロメタンで２回抽出し、合わせた有機抽出物をそれぞれ１０ｍＬのリン酸バッファーで２回洗浄し、乾燥させ、蒸発乾燥させた。残渣を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃に冷却し、５０ｍＬごとの冷ｐＨ９．５の炭酸バッファーで３回抽出した。水性抽出物をリン酸でｐＨ３に調節し、４０ｍＬごとのクロロホルムで５回抽出し、これを合わせ、乾燥させ、蒸発乾燥させた。残渣を２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製し、１．９ｇのｂ−ケトエステル（３９％）を得た。

［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル ＡＦ

テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のｂ−ケトエステル ＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）および水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）の混合物を還流しながら、メタノール（２ｍＬ）を１時間にわたって滴下した。撹拌を還流温度で１時間続けた。室温に冷却後、１ＮのＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を加え、混合物を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下濃縮し、生成物を得、これをカラムクロマトグラフィーにより精製した（１０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３）（８９％）。

（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル ＡＧ

ジオール ＡＦ（１．２５ｇ、１．９９４ｍｍｏｌ）を真空下でピリジン（２×５ｍＬ）と蒸発することにより乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら加えた。反応を室温で一晩行った。反応をメタノールの添加によりクエンチした。反応混合物を真空下濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を加えた。有機層を１Ｍの重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残ったピリジンをトルエンで蒸発させることにより除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した（２％のＭｅＯＨ／クロロホルム、５％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３中でＲｆ＝０．５）（１．７５ｇ、９５％）。

コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステル ＡＨ

化合物 ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）をコハク酸無水物（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、真空下で４０℃で一晩乾燥させた。混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温でアルゴン雰囲気下で１６時間撹拌した。次にジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５ｗｔ％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥濃縮した。残渣を次の工程のためにそのまま使用した。

コレステロール誘導体化ＣＰＧ ＡＩ

コハク酸エステル ＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル（３：２、３ｍＬ）の混合物に溶解した。その溶液にアセトニトリル（１．２５ｍＬ）中のＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中の２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を連続して加えた。得られた溶液にアセトニトリル（０．６ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物が明橙色になった。溶液をｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ ｓｈａｋｅｒを使用して簡単に撹拌した（５分）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を加えた。懸濁液を２時間撹拌した。ＣＰＧを焼結式漏斗を介して濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびエーテルで連続して洗浄した。未反応アミノ基を酢酸無水物／ピリジンを使用してマスクした。ＣＰＧの達成された負荷をＵＶ測定を取ることにより測定した（３７ｍＭ／ｇ）。

５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書で“５’−Ｃ３２−”と称される）または５’−コレステリル誘導体基（本明細書で“５’−Ｃｈｏｌ−”と称される）を有するｓｉＲＮＡの合成を、コレステリル誘導体のために酸化工程が核酸オリゴマーの５’末端にホスホロチオエート結合を挿入するためにＢｅａｕｃａｇｅ試薬を使用して行うことを除いて、ＷＯ２００４／０６５６０１に記載されているとおりに行った。

実施例２：ｄｓＲＮＡ発現ベクター
本発明の他の局面において、ＰＩＫ４ＣＢ発現活性またはＰＩＫ４ＣＡ発現活性を調節するｄｓＲＮＡ分子はＤＮＡまたはＲＮＡベクターへ挿入された転写単位から発現する（例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., 国際ＰＣＴ出願ＷＯ００／２２１１３、Ｃｏｎｒａｄ、国際ＰＣＴ出願００／２２１１４およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号、参照）。これらの導入遺伝子は、宿主ゲノムに組み込まれる導入遺伝子を組み込め受け継がれる、直線構築物、環状プラスミドまたはウイルスベクターに導入することができる。導入遺伝子は、また、それを染色体外プラスミドとして受け継ぐことができるように構築することができる（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。

ｄｓＲＮＡの個々の鎖は２個の別々の発現ベクターのプロモーターにより転写され、標的細胞に共トランスフェクトされ得る。あるいはｄｓＲＮＡのそれぞれの個々の鎖は両方とも同じ発現プラスミドに位置するプロモーターにより転写され得る。好ましい態様において、ｄｓＲＮＡはｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するようなリンカーポリ核酸配列によって結合される逆方向反復として発現する。

組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは一般的にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡ発現ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（概説のため、Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)、参照）；アデノウイルス（例えば、Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434)およびRosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)、参照）；またはアルファ・ウイルスならびに当分野で既知の他のものに基づいて構築することができるが、これらに限定されない。レトロウイルスはインビトロおよび／またはインビボで種々の遺伝子を上皮細胞を含む多数の異なる細胞型に導入するために使用されている（例えば、Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. NatI. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:7640-19 ; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３、参照）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を形質導入し、発現することができる組換えレトロウイルスベクターは組換えレトロウイルスゲノムを適当なパッケージング細胞系、例えば、ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰにトランスフェクトすることにより製造することができる（Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349）。組換えアデノウイルスベクターは感受性の宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌおよびチンパンジー）の種々の細胞および組織に感染させるために使用することができ（Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769）、また、感染のために分裂に活発な細胞を必要としない利点を有する。

本発明のＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターのいずれかのｄｓＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは、真核ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ早期プロモーターまたはアクチンプロモーターまたはＵ１ｓｎＲＮＡプロモーター）または一般的にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６ｓｎＲＮＡまたは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）または原核プロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターであり得るが、ただし、発現プラスミドが、また、Ｔ７プロモーターからの転写のために必要であるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする。プロモーターは、また、膵臓に導入遺伝子発現を指示することができる（例えば、膵臓のインスリン調節配列（Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)、参照）。

加えて、導入遺伝子の発現は、例えば、誘導可能な調節配列および発現系、例えば、特定の生理学的レギュレーター、例えば、循環グルコース濃度またはホルモンに感受性である調節配列を使用することにより、正確に制御することができる（Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24）。細胞または哺乳動物における導入遺伝子発現の制御のために適当なこのような誘導可能な発現系は、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘導物質およびイソプロピル−ベータ−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節を含む。当業者はｄｓＲＮＡ導入遺伝子の意図する使用に基づいて適当な調節／プロモーター配列を選択することができる。

一般的に、ｄｓＲＮＡ分子を発現することができる組換えベクターは本明細書に記載されているとおりに送達され、標的細胞で維持する。あるいは、ウイルスベクターはｄｓＲＮＡ分子の短寿命物発現を提供するために使用することができる。このようなベクターは必要なとき繰り返し投与することができる。発現すると、ｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの送達は、例えば、静脈内または筋肉内投与により、患者から外植された標的細胞に投与し、次に患者へ再導入することにより、または所望の標的細胞に導入することができる任意の他の手段により、全身的にすることができる。

ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは一般的に陽イオン性脂質担体（例えば、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）または非陽イオン性脂質ベース担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ^ＴＭ）との複合体として標的細胞にトランスフェクトされる。１週間以上にわたってＰＩＫ４ＣＢ遺伝子の異なる領域を標的とするｄｓＲＮＡ介在ノックダウンのための複数の脂質トランスフェクションは、また、本発明に考慮される。本発明のベクターの宿主細胞への成功した導入は種々の既知の方法を使用してモニタリングすることができる。例えば、短寿命物トランスフェクションはレポーター、例えば、蛍光マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で示すことができる。エキソビボでの細胞の安定なトランスフェクションは、特異的環境因子（例えば、抗生物質および薬物）耐性、例えば、ハイグロマイシンＢ耐性を有するトランスフェクト細胞を提供するマーカーを使用して保証することができる。

ＰＩＫ４ＣＢおよびＰＩＫ４ＣＡ特異的ｄｓＲＮＡ分子は、また、ベクターに挿入し、ヒト患者に対して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許５，３２８，４７０、参照）または定位注射（例えば、Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057、参照）により対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬は許容される希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含むことができ、また、遺伝子送達ビヒクルが組み込まれている持続放出マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから無傷で製造することができるとき、医薬は遺伝子送達系を生じる１個以上の細胞を含むことができる。

実施例３：ＨＣＶ感染に対して必須の宿主標的としてのＰＩＫ４ＣＢおよびＰＩＫ４ＣＡの同定
大規模トランスフェクションベースｓｉＲＮＡ送達系はＰＩ４ＫＣＢおよびＰＩ４ＫＣＡ標的を同定するために使用した。この系はこれまでに記載されている（Borawski J, Lindeman A, Buxton F, Labow M, Gaither LA. Optimization procedure for small interfering RNA transfection in a 384 well format. J Biomol Screen. 2007 Jun;12(4):546-59. Epub 2007 Apr 13）（出典明示により本明細書に包含させる）。

簡単な場合、該系はＨＣＶ複製に必須の宿主タンパク質を同定するために設計されたＨＣＶサブゲノムレプリコン系を使用した。Ｈｕｈ７サブゲノムレプリコン細胞系（Lohmann, V., et. al. (1999) Science. 285:110により記載されている）をキノーム（すなわちヒトゲノムの既知のキナーゼ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ （Ｂｏｕｌｄｅｒ ＣＯ））ｓｉＲＮＡライブラリーを使用してスクリーニングした。ＨＣＶサブゲノムレプリコン系は、構造タンパク質を欠いている修飾されたＨＣＶゲノムで安定に形質転換されたヒト肝細胞癌細胞（Ｈｕｈ７）を使用して、インビトロおよびインビボで試験するためにＨＣＶ複製を可能にする。ＨＣＶサブゲノムレプリコンはネオマイシン選択マーカー下でシスにおいてルシフェラーゼレポーターを有する非構造タンパク質を含む。この構築物はインビトロでＨＣＶレプリコンＲＮＡレベルおよびレプリコン活性の安定な測定のために設計された。この試験の目的はＨｕｈ７細胞のサブゲノムＨＣＶレプリコンを抑制する新規宿主タンパク質を同定するためのツールとしてｓｉＲＮＡスクリーニング技術を使用するためであった。

この目的のために、キノームを標的とする７７９個のｓｉＲＮＡ ｓｍａｒｔ ｐｏｏｌのセットをスクリーニングし、ＨＣＶレプリコンの新規レギュレーターが発見され、立証された（Ｓｍａｒｔ ｐｏｏｌは混合物を細胞に加える前に等モル濃度の４個の個々のｓｉＲＮＡを混合することを言う）。ＰＩＫ４ＣＢ（ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド）またはＰＩＫ４ＣＡ（（ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的アルファポリペプチド）に対するｓｉＲＮＡが高力価でウイルスレプリコンからルシフェラーゼの蓄積を抑制することを確認した。これらのデータはこの細胞タンパク質がＨＣＶ複製の阻害のための薬物標的として使用することができることを確認させる。

Ｈｕｈ７サブゲノムレプリコン細胞系（本明細書でクローンＡ細胞とも称する）の構築物はＨＣＶゲノムに基づく。全長ＨＣＶゲノムは図１Ａで説明される。９．６ｋｂのゲノムは４個の構造タンパク質および６個の非構造タンパク質を有するプラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。レプリコンの特徴は効果的なレプリコン活性のために必要である５’および３’ＵＴＲである。このウイルスはインビトロで複製することができ、感染性ウイルスを作るが、特別な育成および設備が必要である（Thomson BJ, Finch RG. Hepatitis C virus infection. Clin Microbiol Infect. 2005 Feb;11(2):86-94.）。したがって、感染性ウイルスは感染粒子を作る傾向がなくインビトロで複製することができる最小ウイルスゲノムを作るために変化した。構築物を図１Ｂに示す、クローンＡ細胞を作るために使用されるＨＣＶサブゲノムレプリコン（Lohmann V, Korner F, Koch J, Herian U, Theilmann L, Bartenschlager R. Relication of subgenomic hepatitis virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 1999 Jul 2;285(5424):110-3）。このウイルスをヒト肝細胞においてインビトロでＨＣＶレプリコン活性を獲得するために高度に最適化した。感染ウイルス粒子を作ることはできないが、細胞質で自己複製することができ、細胞培養試験ならびにハイスループット・スクリーニングに分析することができる。構造タンパク質を、レプリコン活性を測定するために、ネオマイシン耐性遺伝子およびホタルルシフェラーゼレポーターと置き換えた。クローンＡｒ構築物はサブゲノムウイルスとして同じ骨格を構成するが、構造タンパク質が除去されている（図１Ｃ）。ｓｉＲＮＡがルシフェラーゼ活性または発現を非特異的に抑制することができるとき、この細胞系を試験するために使用した。

７７９個の系統発生的に関連するキナーゼに指示されるｓｉＲＮＡｓｍａｒｔ ｐｏｏｌをクローンＡ（ＨＣＶサブゲノムレプリコン）細胞にトランスフェクトした。ｐＧＬ２ルシフェラーゼに対して指向するｓｉＲＮＡ二本鎖をルシフェラーゼ活性を抑制する陽性対照として使用した。細胞を７２時間でトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイを使用して測定した（Borawski J, Lindeman A, Buxton F, Labow M, Gaither LA. Optimization procedure for small interfering RNA transfection in a 384-well format. J Biomol Screen. 2007 Jun;12(4):546-59. Epub 2007 Apr 13）。

いくつかのｓｉＲＮＡがＰＩＫ４ＣＢ（ＮＭ＿００２６５１）およびＰＩＫ４ＣＡ（ＮＭ＿００２６５０）を標的とするこれらのプールを含むルシフェラーゼ活性の強力な阻害剤であることを見出した。

実施例４：ＰＩＫ４ＣＢおよびＰＩＫ４ＣＡｓｉＲＮＡ活性の確認および測定
スクリーニングからのｓｉＲＮＡヒットの確認を、複数の非依存性遺伝子特異的ｓｉＲＮＡならびに表現型が活性なｓｉＲＮＡとｍＲＮＡノックダウンの効率の相関関係の分析を含む、一連の工程で達成した。ｓｉＲＮＡヒットの特異性を確認するために最初に、複数の配列非依存性ｓｉＲＮＡがルシフェラーゼ活性を抑制する能力があり、細胞生存に影響する能力がないことを試験した。ｓｉＲＮＡヒットを、また、ｓｉＲＮＡがレプリコンタンパク質を特異的に標的とし、レプリコン非依存性方法でルシフェラーゼ活性（または発現）を抑制しないことを確認するため、クローンＡｒ（図１ｃのとおり構造タンパク質を欠いているがクローンＡと同様に）細胞において試験した。

次の工程は表現型およびＲＴＰＣＲ確認であった。ＰＩＫ４ＣＢに対する４個の非依存性ｓｉＲＮＡおよびＰＩＫ４ＣＡに対する４個の非依存性ｓｉＲＮＡをレプリコン活性をノックダウンする能力、細胞生存の効果および標的遺伝子ｍＲＮＡレベルをノックダウンする能力について分析した。
この実施例において使用されるｓｉＲＮＡは表１および表２に示した。

図２はクローンＡアッセイにおけるＰＩＫ４ＣＢおよびＰＩＫ４ＣＡを標的とするｄｓＲＮＡの結果を示す。個々の二本鎖ＰＩＫ４ＣＡ１−ＰＩＫ４ＣＡ４（カラム１−４）、ＰＩＫ４ＣＡ Ｓｍａｒｔ Ｐｏｏｌ（カラム５）、個々の二本鎖ＰＩＫ４ＣＢ１−ＰＩＫ４ＣＢ４（カラム６−９）またはＰＩＫ４ＣＢ Ｓｍａｒｔ Ｐｏｏｌ（カラム１０）のｄｓＲＮＡの試験結果。細胞を７２時間でトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイを使用して測定した（Borawski J, Lindeman A, Buxton F, Labow M, Gaither LA. Optimization procedure for small interfering RNA transfection in a 384-well format. J Biomol Screen. 2007 Jun;12(4):546-59. Epub 2007 Apr 13）。結果はＧＡＰＤＨ（対照；カラム１１）と相対的に測定され、アッセイをクローンＡ細胞を使用してウェルあたり２５ｎＭのｄｓＲＮＡを使用して実施し；Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ活性をトランスフェクション７２時間後に測定する。ＧＡＰＤＨを標的とするｄｓＲＮＡ（カラム１１）は陰性対照として使用し、ｐＧＬ２を標的とするｄｓＲＮＡ（カラム１２）は陽性対照として使用した。

図２の結果は、ＧＡＰＤＨと比較して、ＰＩＫ４ＣＢまたはＰＩＫ４ＣＡに指示するｄｓＲＮＡがクローンＡ細胞におけるＨＣＶレプリコンの発現（ルシフェラーゼ発現により測定）を少なくとも２０％かつ約９０％まで減少させることができることを示す。種々の中間体活性を同定する。さらなるデータによって、このアッセイのｄｓＲＮＡが細胞生存を妨げず、クローンＡｒアッセイにおいて細胞の有意な非特異的効果を示さないことが確認される（データは示していない）。

図３Ａおよび３Ｂによって、ＰＩＫ４ＣＡ標的ｄｓＲＮＡはＰＩＫ４ＣＡに対して特異的であるが、ＰＩＫ４ＣＢに対して特異的でないことが確認される；図３Ｃおよび３Ｄによって、ＰＩＫ４ＣＢ標的ｄｓＲＮＡはＰＩＫ４ＣＢに対して特異的であるが、ＰＩＫ４ＣＡに対して特異的でないことが確認される。

図３の結果はＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲを使用して作成した。この方法において、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた２個のウェルを一緒に貯め、ｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ９６キットを使用して単離した（Qiagen #74182）。製造物はそれぞれ１５分間で２回処理されたＤＮＡｓｅ１であった。ｃＤＮＡをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅキットを使用して製造し（Applied Biosystems #4322171）、ＲＮＡをＯｌｉｇｏ ｄＴ２５を使用して準備した（Sigma Genosys）。ＰＣＲバッファー（Roche #1699105)を下記のとおりＭｇＣｌ２（Ambion #9530g）で補った；全量１００μｌに対して、１０×バッファー １０μｌ、１ＭのＭｇＣｌ２ ０．５５μｌ、５０ｕＭのｏｌｉｇｏ ｄＴ２５、１００ｍＭのｄＮＴＰ ４μｌ、ＲＮａｓＩｎ ２０Ｕ／μｌ １μｌ、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ ５０Ｕ／μｌ ５μｌ、水 １２．４５μｌおよびＲＮＡ ６６μｌ。ｃＤＮＡを社内で設計したプライマーであるＰＩＫ４ＣＡ（ＮＭ＿００２６５０）を使用して定量した。
Ｆｗｄ：ＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧＴ、配列番号：４１７
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＴＴＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＣＴＧＣＡＴＣ、配列番号：４１８
１６６２で：１６９０でイントロン３００６ｂｐと交差する １７７４で ｒｅｖｅｒｓｅｄ：１６９０でイントロン３００６ｂｐと交差する；
ＰＩＫ４ＣＢはＰＩＫ４ＣＢ（ＮＭ＿００２６５１）に対して社内で設計されたプライマーを使用して製造した。
Ｆｗｄ：ＡＴＧＧＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴ、配列番号：４１９
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＡＴＧＴＧＧ、配列番号：４２０
２３３４から２４５２：２３７４でイントロン９８１ｂｐと交差する；（Sigma Genosys） Ｓｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｏｎ ａｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ（Applied Biosystems #4329001）を使用する。図３において、ラベル“ｓｐ”はＳＭＡＲＴｐｏｏｌなる用語を意味する。それは混合物を細胞に加える前に等モル濃度の４個の個々のｓｉＲＮＡを混合することを意味する。Ｓｍａｒｔ Ｐｏｏｌにおいて、４個の個々のｓｉＲＮＡをより低い相対濃度（すなわち、５０ｎＭ等モル濃度とはＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ中のそれぞれの個々のｓｉＲＮＡに対して１２．５ｎＭ濃度である）で加える。

標的のさらなる確認をＰＩＫ４ＣＡ（NM_002650, Dharmacon #D-006776）およびＰＩＫ４ＣＢ（NM_002651, Dharmacon #D-006777）に対する３個の個々の二本鎖のさらなるセットを使用して達成した。ｓｉＲＮＡは表１および表２で示されているものを使用した。

それぞれのｓｉＲＮＡを貯蔵濃度２０μＭにｓｉＲＮＡバッファー（Dharmacon, #B-002000-UB-015）に再懸濁した。２．５μＬのそれぞれの貯蔵溶液を２５０ｎＭのワーキングスタンプ(working stamp)を作るために９６ウェルＰＣＲプレート（ABgene, #AB-1000）中の１９７．５μＬのＯｐｔｉ−Ｍｅｍに希釈した。１０μＬのＯｐｔｉ−Ｍｅｍで希釈した０．２０μＬのＤｈａｒｍａｆｅｃｔ１トランスフェクション試薬（Dharmacon, #T2001-03）を９６ウェル組織培養プレート（Costar, #3917）のそれぞれのウェルに加えた。１０μＬのそれぞれのｓｉＲＮＡスタンプをＤｈａｒｍａｆｅｃｔ１を含む９６ウェルプレートに加え、複合体を形成させるために２０分インキュベートした。インキュベーション後、８０μＬのアッセイ培地中の６０００個のＨｕｈ７ ＨＣＶサブゲノムレプリコン細胞をウェルごとに加えた。細胞を７２時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性および細胞生存をアッセイした（図２であらかじめ記載したとおり）。

図４において、それぞれのｓｉＲＮＡを製造業者の指示に従ってＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（Applied Biosystems）を使用して確認した。ｓｉＲＮＡを上記９６ウェルフォーマット中のＨｕｈ７ ＨＣＶサブゲノムレプリコン細胞にトランスフェクトした。ｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ９６ Ｋｉｔ（Qiagen, #74182）を使用して単離した。デュプリケートウェルのｍＲＮＡを一緒に貯め、ｃＤＮＡをＳｐｒｉｎｔ Ｐｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅｐｒｉｍｅｄ ９６ Ｐｌａｔｅ Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）（Clontech Laboratories, #639557）を使用して製造した。ｃＤＮＡを３８４ウェルフォーマット中でＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの、ＰＩＫ４ＣＡ（NM_002650, Applied Biosystems #Hs01021073_m1）ＰＩＫ４ＣＢ（NM_002651, Applied Biosystems #Hs00356327_m1）のプレミックスＴａｑｍａｎプローブおよびプライマーを使用して定量した。ウェルあたり４．８μＬのｃＤＮＡを３８４ウェルＰＣＲプレート（Applied Biosystems, #4309849）に加えた。０．６μＬの興味ある遺伝子（ＧＯＩ）に対するＴａｑｍａｎプローブ、０．６μＬのβ−アクチン対照プローブ（Applied Biosystems, #4310881E）および６μＬの２× ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Applied Biosystems, #4304437）をウェルごとにｃＤＮＡに加えた。反応はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Applied Biosystems, #4329001）で実施した。

図４Ａにおいて、細胞をＰＩ４ＫＡｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ｍＲＮＡをＰＩ４ＫＡおよびＰＩ４ＫＢの両方のＲＴＰＣＲ Ｔａｑ ｍａｎプローブを使用して測定した。図４Ｂにおいて、細胞をＰＩ４ＫＢｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ｍＲＮＡをＰＩ４ＫＡおよびＰＩ４ＫＢの両方のＲＴＰＣＲ Ｔａｑ ｍａｎプローブを使用して測定した。図により証明されるとおり、ｓｉＲＮＡはそれらの示す標的を特異的にノックダウンし、他のＰＩ４ＫｍＲＮＡ転写または対照（ＧＡＰＤＨ）と交差反応および抑制しない。

実施例５：宿主およびウイルスタンパク質発現の阻害
図５において、全細胞溶解物をｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｕｈ７ ＨＣＶサブゲノムレプリコン細胞または未処理細胞単独から製造した。図５の結果のために使用したｓｉＲＮＡを表１および表２のとおりに命名する。

細胞を、１０ｍｌの溶解バッファーにつき１個のプロテアーゼカクテル阻害剤錠剤（Roche, #04693116001）を含む放射性免疫沈降法バッファー（ＲＩＰＡ）（Boston Bioproducts, #BP-115）に熔解した。溶解物を製造業者の指示に従ってＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce Biotechnology, #23227）を使用して定量した。等量の溶解物を１５％のＴｒｉｓ−ＨＣＬゲル（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, #345-0019）に負荷し、１時間２００Ｖを流す。ゲルをニトロセルロース膜（Bio-Rad Laboratories, #162-0232）に１時間１００Ｖで移した。膜を５％のミルク（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, #162-0232）、ＴＢＳ−０．１％のＴｗｅｅｎ（Bio-Rad Laboratories, #170-6435, #161-0787）で１時間ブロックした。ブロットを、ブロッキングバッファーで１：１０００に希釈した、ＰＩＫ４ＣＢに対するマウスモノクローナル抗体（BD Biosciences, #611817)またはＨＣＶタンパク質ＮＳ３に対するマウスモノクローナル抗体（Virostat, #1828）および負荷対照としてβ−アクチンに対するマウスモノクローナル抗体（Sigma, St. Louis, MO, #A-5441）で１時間で調べた（ＰＩＫ４ＣＡに対する抗体は利用しなかった）。ＴＢＳ−０．１％のＴｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）で３回連続希釈後、ブロッキングバッファーで１：５０００に希釈したマウスＩｇＧに対するＨＲＰ−結合二次抗体（Sigma, #A4416）を１時間で加えた。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、免疫反応性バンドをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ化学発光基質（Pierce, #34096）を使用して視覚化した。ＰＩ４ＫＡ抗体を利用しなかったため、ＰＩ４ＫＢタンパク質のみが図５で検出された。

図５の結果は、ＰＩ４ＫＡｓｉＲＮＡがＰＩ４ＫＢタンパク質レベルに対して効果がないが、ＰＩ４ＫＢｓｉＲＮＡはＨｕｈ７細胞におけるＰＩ４ＫＢタンパク質を除去することを示す。試験されたそれぞれのｓｉＲＮＡは、また、対照と比較してＮＳ３（ウイルス）タンパク質生産において測定可能な減少を示し、したがって、ウイルス複製能力に対して直接作用する。タンパク質ノックダウンと関連しているこれらのｓｉＲＮＡを使用するｍＲＮＡレベルの減少を示すこれらのヒトタンパク質はＨＣＶ複製のために必要である。

実施例６：ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用の確認
図６において、ＰＩＫ４ＣＡ（ＮＭ＿００２６５０）およびＰＩＫ４ＣＢ（ＮＭ＿００２６５１）を標的とするショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を５個の個々のＳｉｇｍａ ＭＩＳＳＩＯＮ^ＴＭ ｓｈＲＮＡとして整理した。ＣＤ３δ（ＮＭ＿０００７３２）、ＣＤ２８（ＮＭ＿００６１３９）、ＣＤ２９（ＮＭ＿０３３６６６）およびＧＦＰ（Ｕ７６５６１）を標的とするｓｈＲＮＡをＨＣＶ複製を抑制するための陰性対照として使用した（ＧＦＰデータのみ示す）。すべてのｓｈＲＮＡ配列をヒトライブラリーＭＩＳＳＩＯＮ^ＴＭ ＴＲＣ−Ｈｓ １．０．（Ｈｕｍａｎ）などで構築した（Moffat J. et al., A Lentivirus RNAi Library for Human and Mouse Genes Applied to an Arrayed Virus High-Content Screen. Cell, 124, 1283-1298. 2006.; Stewart, S.A., et al., Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells., RNA, 9, 493-501 (2003); Zufferey R, et al., Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo., Nat. Biotechnol. 15, 871-85 (1997).; Zufferey R, et al., Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery., J Virol., 72, 9873-80 (1998)。

該ｓｈＲＮＡ配列は前記実験で報告されたｓｉＲＮＡと異なる非依存性配列であった。表４は発現ＲＮＡ鎖に対応するＤＮＡ配列を記載している。
表４

ｓｈＲＮＡを試験するために、６０００ Ｈｕｈ７ ＨＣＶサブゲノムレプリコン細胞を９６ウェル組織培養プレートに置いた。次の日、培地を最終濃度８ｕｇ／ｍｌのポリブレン（sigma H9268）および最終濃度１０ｍＭのヘペス（Invitrogen, # 15630080）を有するアッセイ培地を含む形質導入培地で置き換えた。１μＬのｓｈＲＮＡウイルスをウェルごとに加え、細胞を２１００ｒｐｍｓで９０分室温で遠心した。細胞を２４時間インキュベートし、最終濃度２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Sigma, #P9620）を加えることにより選択した。次に細胞を最低７２時間インキュベートし、表現型をアッセイし、ＷｅｓｔｅｒｎおよびＲＴ−ＰＣＲにより分析するか、または、長期ノックダウン試験のために増殖させた。図６Ａにおいて、ＨＣＶレプリコン発現をルシフェラーゼ活性により測定し、ＧＡＰＤＨｓｈＲＮＡ形質導入細胞で標準化する。ＲＴＰＣＲのためにＰＩ４ＫＡ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ（図６Ｂ）またはＰＩ４ＫＢ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ（図６Ｃ）を使用してｓｈＲＮＡ形質導入後、ＰＩ４ＫＡおよびＰＩ４ＫＢｍＲＮＡレベルをＨｕｈ７細胞で測定した。ＰＩ４ＫＢタンパク質およびＮＳ３タンパク質レベルを実施例５と同様のウエスタンブロット法を使用して測定した。タンパク質レベルをｓｈＲＮＡ形質導入の９６時間（図６Ｄ）および３週間（図６Ｅ）後、測定した。

図６Ａの結果は、ＰＩ４ＫＡまたはＰＩ４ＫＢｓｈＲＮＡに指示するｓｈＲＮＡがルシフェラーゼ活性により測定され、ＧＡＰＤＨｓｈＲＮＡ形質導入細胞で標準化されるとおり、ＨＣＶレプリコン活性を減少させることができることを示す。図６Ｂは処理後のＰＩ４ＫＡｍＲＮＡの相対レベルを示す。ＰＩ４ＫＡに指示するｓｈＲＮＡは実質的なノックダウンを示すが、ＰＩ４ＫＢを標的とするものの１個のみがＰＩ４ＫＡレベルに影響している（恐らく、高コピー数によるＰＩ４ＫＡとの低い交差反応）。図６Ｃは、ＰＩ４ＫＡに指示するｓｈＲＮＡがＰＩ４ＫＢｍＲＮＡレベルに影響しないが、ＰＩ４ＫＢを標的とするｓｈＲＮＡの多数が有意なＰＩ４ＫＢのノックダウンに影響することを示す。図６Ｄは、処理９６時間後にＰＩ４ＫＡまたはＰＩ４ＫＢのいずれかに指示するｓｈＲＮＡはうまくＮＳ３ウイルスタンパク質生産を低下させることを示す（そして、ＰＩ４ＫＡｓｈＲＮＡはＰＩ４ＫＢタンパク質レベルを下方制御しない）。図６Ｅの結果はウイルスタンパク質生産のノックダウンが少なくとも３週間持続できることを示す。結論として、ＰＩ４ＫＡｍＲＮＡ減少と細胞のウイルス負荷を抑制することを示すＮＳ３タンパク質レベル間に明らかな相関関係があった。ＰＩ４ＫＢｍＲＮＡおよびタンパク質減少と細胞のウイルス負荷を抑制することを示すＮＳ３タンパク質レベル間に明らかな相関関係があった。

実施例７：生ウイルス感染前または感染後の処理
この実施例において、ＨＣＶ複製の有効な阻害は、ＨＣＶ感染前にＰＩＫ４ＣＡまたはＰＩＫ４ＣＢのいずれかに対するｓｉＲＮＡで細胞を処理すること（図７）、またはＨＣＶ感染後に細胞を処理すること（図８）により達成される。この実施例は、また、ｍＲＮＡノックダウンの用量依存性を証明する。

この実験のために、ＰＩＫ４ＣＡおよびＰＩＫ４ＣＢに対するｓｉＲＮＡ（表１および表２に設計されているとおり）を２０μＭの貯蔵濃度にｓｉＲＮＡバッファー（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、＃Ｂ−００２０００−ＵＢ−０１５）に再懸濁した。３μＬのそれぞれの貯蔵溶液を、３００ｎＭのワーキングスタンプを作るため、９６ウェルＰＣＲプレート（ＡＢｇｅｎｅ、＃ＡＢ−１０００）中で１９７μＬのＯｐｔｉ−Ｍｅｍで希釈した。ｓｉＲＮＡを１０×ストックとしてＯｐｔｉｍｅｍ（Invitrogen Cat # 51985-034）に希釈し、最終濃度２５ｎＭ、１．５ｎＭおよび０．１ｎＭに完全細胞培養培地に加えた。１０μＬのＯｐｔｉ−Ｍｅｍで希釈した０．２０μＬのＤｈａｒｍａｆｅｃｔ１ トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、＃Ｔ２００１−０３）を９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、＃３９１７）のそれぞれのウェルに加えた。１０μＬのそれぞれのｓｉＲＮＡスタンプをＤｈａｒｍａｆｅｃｔ１を含む９６ウェルプレートに加え、複合体を形成するために２０分インキュベートした。インキュベーション後、１００μＬのアッセイ培地中の１００００個のＨｕｈ７．５細胞をウェルごとに加えた。細胞を２４時間インキュベートし、次にウミシイタケレポーターを含むＪＦＨ−１感染ＨＣＶ遺伝子型２ウイルスで感染させた。ウミシイタケに対するｓｉＲＮＡをウミシイタケルシフェラーゼを抑制する陽性対照として使用した。ｓｉＲＮＡを生ウイルス感染前（図７Ａ）またはウイルス感染後（図８Ａ）にトランスフェクトして、ｓｉＲＮＡがＨＣＶウイルスの取り込みおよび複製の両方をブロックすることができることを証明した。ウイルス上清を、未処理細胞の再感染パーセントで測定するため、細胞から分泌された生ウイルスを測定するために経時変化で回収した（図８Ｂ）。Ｈｕｈ７細胞のｍＲＮＡのノックダウンパーセントをＲＴＰＣＲにより測定した（図７Ｂ）。

我々は最適のレプリコン駆動ルシフェラーゼ活性のために必要ないくつかの新規宿主因子を同定するＨｕｈ７ ＨＣＶレプリコンｓｉＲＮＡスクリーンを使用した。このスクリーニングを本発見を確認するために使用した。このスクリーニングはウイルス複製を直接測定しないが、ルシフェラーゼ発現レベルがウイルスレプリコンのコピー数により直接決定されることと仮定する。図７および図８で説明される実験は、本明細書に記載されている活性なｓｉＲＮＡが確かにウイルスＲＮＡ生産を減少させることを示す。

ｓｍａｒｔ ｐｏｏｌ キノームスクリーニングから、ＰＩＫ４ＣＢおよびＰＩＫ４ＣＡがＨＣＶおよび他のプラス鎖ＲＮＡウイルス複製のために必須の宿主因子として同定された。遺伝子を標的とする複数の非依存性ｓｉＲＮＡは有意にルシフェラーゼレベルを減少させることができるが、レプリコン細胞の細胞生存に影響しない。ルシフェラーゼレベルを減少させるｓｉＲＮＡは、また、それぞれの標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを抑制した。したがって、我々は、この試験に使用したｓｉＲＮＡが的確であり、標的細胞遺伝子の減少を介してＨＣＶ複製を有意に調節すると結論づけることができる。

我々の発見を説明するための何らかの特定の作用メカニズムと関連があることは望ましくなく、これらの発見の有意性が数倍であることは明白である。ＰＩＫ４酵素はＥＲおよびゴルジ区画のＰｔｄＩｎｓ４Ｐの生産のために必要である。ＰｔｄＩｎｓ４Ｐの生産はゴルジ完全性を維持し、ゴルジおよびＥＲ膜から小胞を出芽し、中間体Ｉｎｓ（４，５）Ｐ_２を介して必須のシグナル伝達分子であるＩｎｓ（１，４，５）Ｐ_３の生産を調節するために必要である（Godi A, Pertile P, Meyers R, Marra P, Di Tulliog, Iurisci C, Luini A, Corda D, De Matteis MA. ARF mediates recruitment of PtdIns-4-OH kinase-beta and stimulates synthesis of PtdIns(4,5)P2 on the Golgi complex. Nat Cell Biol. 1999 Sep;1(5):280-7）。本発見に関して何らかの特異的作用メカニズムと関連があることは望ましくないが、ＰＩＫ４酵素活性がＨＣＶ複製複合体の位置に基づいてＨＣＶ複製と関連がある可能性がある。複製複合体が無傷のゴルジおよびＥＲ膜を必要とするとき、ＰＩＫ４酵素の崩壊およびＰｔｄＩｎｓ４Ｐ生産はコンピテント複製環境の形成をブロックするであろう。さらに、ＰＩＫ４酵素は、ゴルジおよびＥＲ膜を介してセラミドおよびコレステロールの輸送を制御し、脂質ラフトの形成に役立つことが知られている（Toth B, Balla A, Ma H, Knight ZA, Shokat KM, Balla T. Phosphatidylinositol 4-kinase IIIbeta regulates the transport of ceramide between the endoplasmic reticulum and Golgi. J Biol Chem. 2006 Nov 24;281(47):36369-77）。ＨＣＶ複製複合体が有効な活性のために脂質ラフトを必要とする可能性が高い。ＰＩＫ４ノックダウンが、また、コレステロールおよびセラミド輸送を乱すとき、ＨＣＶ複製の阻害とも関連する（Ridsdale A, Denis M, Gougeon PY, Ngsee JK, Presley JF, Zha X. Cholesterol is required for efficient endoplasmic reticulum-to-Golgi transport of secretory membrane proteins. Mol Biol Cell. 2006 Apr;17(4):1593-605）。最後に、多くのタンパク質がＰＩＰ（４，５）特異的ＰＨドメインを含むことが確認され、このようなタンパク質の局在がＰＩＫ４酵素により調節されているようである。したがって、ＰＩＫ４の役割は、また、複製部位への細胞またはウイルスタンパク質の再指向を含み得る。

結論として、我々は、ＰＩＫ４ＣＢおよびＰＩＫ４ＣＡがＨＣＶ複製のために必要であるヒト宿主因子酵素であり、そして、これらの遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡがＨＣＶおよび他のプラス鎖ウイルス感染を処理するための適当な治療標的であることを確認した。

当業者は、下記の特許請求の範囲の全範囲にわたって本発明が実施することが可能である、本明細書に具体的に記載しているものに加えて方法および組成物をよく知っている。

Claims (63)

1. 細胞におけるホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＰＩ４Ｋ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここで、互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第１の配列を含み、そしてアンチセンス鎖は、実質的にＰＩ４ＫをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含む第２の配列を含み、ここで、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、そして、該ＰＩ４Ｋ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩ４Ｋ遺伝子の発現を阻害する、ｄｓＲＮＡ。
2. 該第２の配列が実質的にヒトホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ）をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である配列を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
3. 該第１の配列および該第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
4. 該ｄｓＲＮＡが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
5. 該ｄｓＲＮＡが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ。
6. 該修飾ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドおよびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基と結合している末端ヌクレオチドの群から選択される、請求項４または５に記載のｄｓＲＮＡ。
7. 該修飾ヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、非塩基性(abasic)ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダートおよび非天然塩基を含むヌクレオチドの群から選択される、請求項４または５に記載のｄｓＲＮＡ。
8. 該第１の配列が表１からなる群から選択され、そして該第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項４または５に記載のｄｓＲＮＡ。
9. 該アンチセンス鎖が実質的にヒトホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的アルファポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ）をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である配列を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
10. 該第１の配列および該第２の配列が表２からなる群から選択される、請求項９に記載のｄｓＲＮＡ。
11. 該ｄｓＲＮＡが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項９に記載のｄｓＲＮＡ。
12. 該ｄｓＲＮＡが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のｄｓＲＮＡ。
13. 該修飾ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドおよびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基と結合している末端ヌクレオチドの群から選択される、請求項１１または１２に記載のｄｓＲＮＡ。
14. 該修飾ヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダートおよび非天然塩基を含むヌクレオチドの群から選択される、請求項１１または１２に記載のｄｓＲＮＡ。
15. 該第１の配列が表２からなる群から選択され、そして該第２の配列が表２からなる群から選択される、請求項１１または１２に記載のｄｓＲＮＡ。
16. 請求項１または９に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
17. ｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む生物におけるホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ）遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、ここで、該ｄｓＲＮＡは互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第１の配列を含み、そしてアンチセンス鎖は、実質的にＰＩ４ＫＣＢをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含む第２の配列を含み、ここで、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、そして、該ＰＩ４ＫＣＢ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩＫ４ＣＢの発現を少なくとも１０％阻害する医薬組成物。
18. 該ｄｓＲＮＡの該第１の配列が表１からなる群から選択され、そして該ｄｓＲＮＡの該第２の配列が表１からなる群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 該ｄｓＲＮＡが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. ｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む生物におけるホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的アルファポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ）遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、ここで、該ｄｓＲＮＡは互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第１の配列を含み、そしてアンチセンス鎖は、実質的にＰＩＫ４ＣＡをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含む第２の配列を含み、ここで、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、そして、該ＰＩＫ４ＣＡ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩＫ４ＣＡの発現を少なくとも１０％阻害する医薬組成物。
21. 該ｄｓＲＮＡの該第１の配列が表２からなる群から選択され、そして該ｄｓＲＮＡの該第２の配列が表２からなる群から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
22. 該ｄｓＲＮＡが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
23. 細胞におけるホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ）遺伝子の発現を阻害するための方法であって：
    （ａ）細胞に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入し、ここで、互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第１の配列を含み、そしてアンチセンス鎖は、実質的にＰＩＫ４ＣＢをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含む第２の配列を含み、ここで、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、そして、該ＰＩＫ４ＣＢ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩＫ４ＣＢの発現を少なくとも４０％阻害する；そして、
    （ｂ）工程（ａ）で製造される細胞をＰＩＫ４ＣＢ遺伝子のｍＲＮＡ転写の分解を達するために十分な時間維持し、それにより細胞におけるＰＩＫ４ＣＢ遺伝子の発現を抑制する、
    ことを含む方法。
24. 細胞におけるホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ）遺伝子の発現を阻害するための方法であって：
    （ａ）細胞に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入し、ここで、互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第１の配列を含み、そしてアンチセンス鎖は、実質的にＰＩＫ４ＣＡをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含む第２の配列を含み、ここで、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、そして、該ＰＩＫ４ＣＡ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩＫ４ＣＡの発現を少なくとも４０％阻害する；そして、
    （ｂ）工程（ａ）で製造される細胞をＰＩＫ４ＣＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写の分解を達するために十分な時間維持し、それにより細胞におけるＰＩＫ４ＣＡ遺伝子の発現を抑制する、
    ことを含む方法。
25. 治療または予防有効量のｄｓＲＮＡを処置、予防または管理を必要とする患者に投与することを含むプラス鎖ＲＮＡウイルス感染が介在する病理過程を処置するための方法であって、ここで、該ｄｓＲＮＡは互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第１の配列を含み、そしてアンチセンス鎖は、実質的にホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ）をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含む第２の配列を含み、ここで、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、そして、ＰＩＫ４ＣＢ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩＫ４ＣＢの発現を阻害する方法。
26. 該プラス鎖ＲＮＡウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）およびデング熱ウイルスから選択される、請求項２５に記載の方法。
27. 治療または予防有効量のｄｓＲＮＡを処置、予防または管理を必要とする患者に投与することを含むプラス鎖ＲＮＡウイルス感染が介在する病理過程を処置するための方法であって、ここで、該ｄｓＲＮＡは互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第１の配列を含み、そしてアンチセンス鎖は、実質的にホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的アルファポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ）をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含む第２の配列を含み、ここで、該相補性領域は３０ヌクレオチド長未満であり、そして、ＰＩＫ４ＣＡ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩＫ４ＣＡの発現を阻害する方法。
28. 該プラス鎖ＲＮＡウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）およびデング熱ウイルスから選択される、請求項２７に記載の方法。
29. 細胞におけるホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ）遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、該ベクターはｄｓＲＮＡの少なくとも一本鎖をコードする核酸配列と作動可能に結合している調節配列を含み、ここで、該ｄｓＲＮＡの鎖の１個は実質的にＰＩＫ４ＣＢをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、ここで、該ｄｓＲＮＡは３０塩基対長未満であり、そして、ＰＩＫ４ＣＢ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩＫ４ＣＢの発現を抑制するベクター。
30. 請求項２９に記載のベクターを含む細胞。
31. 細胞におけるホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的アルファポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ）遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、該ベクターはｄｓＲＮＡの少なくとも一本鎖をコードする核酸配列と作動可能に結合している調節配列を含み、ここで、該ｄｓＲＮＡの鎖の１個は実質的にＰＩＫ４ＣＡをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、ここで、該ｄｓＲＮＡは３０塩基対長未満であり、そして、ＰＩＫ４ＣＡ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩＫ４ＣＡの発現を抑制するベクター。
32. 請求項３１に記載のベクターを含む細胞。
33. 細胞におけるホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的ベータポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＢ）遺伝子の発現レベルを減少させるための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここで、互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第１の配列を含み、そしてアンチセンス鎖は、実質的にＰＩＫ４ＣＢをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含む第２の配列を含み、そして、ＰＩＫ４ＣＢ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩＫ４ＣＢの発現レベルを減少させる二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
34. 該接触がＰＩＫ４ＣＢの発現レベルを少なくとも４０％減少させる、請求項３３に記載のｄｓＲＮＡ。
35. 該接触をインビトロで３０ｎＭ以下で行う、請求項３３に記載のｄｓＲＮＡ。
36. 請求項３３に記載のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、生物におけるＰＩＫ４ＣＢの発現レベルを減少させるための医薬組成物。
37. 治療有効量の請求項３３に記載のｄｓＲＮＡを処置を必要とする患者に投与することを含むプラス鎖ＲＮＡウイルス感染を処置するための方法。
38. 該プラス鎖ＲＮＡウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）およびデング熱ウイルスから選択される、請求項３７に記載の方法。
39. 細胞におけるホスファチジルイノシトール４−キナーゼ、触媒的アルファポリペプチド（ＰＩＫ４ＣＡ）遺伝子の発現レベルを減少させるための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここで、互いに相補的である少なくとも２個の配列を含み、ここで、センス鎖は第１の配列を含み、そしてアンチセンス鎖は、実質的にＰＩＫ４ＣＡをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含む第２の配列を含み、そして、ＰＩＫ４ＣＡ遺伝子を発現する細胞と接触すると、該ＰＩＫ４ＣＡの発現レベルを減少させる二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
40. 該接触がＰＩＫ４ＣＡの発現レベルを少なくとも４０％減少させる、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ。
41. 該接触をインビトロで３０ｎＭ以下で行う、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ。
42. 請求項３９に記載のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、生物におけるＰＩＫ４ＣＡの発現レベルを減少させるための医薬組成物。
43. 治療有効量の請求項３９に記載のｄｓＲＮＡを処置を必要とする患者に投与することを含むプラス鎖ＲＮＡウイルス感染を処置するための方法。
44. 該プラス鎖ＲＮＡウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）およびデング熱ウイルスから選択される、請求項４３に記載の方法。
45. 表１に記載されているものから選択されるｄｓＲＮＡ。
46. 請求項４５に記載のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物。
47. 表２に記載されているものから選択されるｄｓＲＮＡ。
48. 請求項４７に記載のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物。
49. 複数のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物であって、ここで、少なくとも１個のｄｓＲＮＡは表１に記載されているものから選択され、そして少なくとも１個のｄｓＲＮＡは実質的にプラス鎖ＲＮＡウイルスをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である領域を有する核酸配列を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡから選択される医薬組成物。
50. 該プラス鎖ＲＮＡウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）およびデング熱ウイルスから選択される、請求項４９に記載の医薬組成物。
51. それぞれのｄｓＲＮＡが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項４９に記載の医薬組成物。
52. 複数のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物であって、ここで、少なくとも１個のｄｓＲＮＡは表２に記載されているものから選択され、そして少なくとも１個のｄｓＲＮＡは実質的にプラス鎖ＲＮＡウイルスをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である領域を有する核酸配列を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡから選択される医薬組成物。
53. 該プラス鎖ＲＮＡウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）およびデング熱ウイルスから選択される、請求項５２に記載の医薬組成物。
54. それぞれのｄｓＲＮＡが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項５２に記載の医薬組成物。
55. ａ）表１および表２に記載されているものから選択される少なくとも１個のｄｓＲＮＡ；およびｂ）ｉ）完全にカプセル化されたリポソーム；ｉｉ）脂質複合体；およびｉｉｉ）ポリマーから選択される送達モダリティー(modality)を含む医薬組成物。
56. それぞれのｄｓＲＮＡが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項５５に記載の医薬組成物。
57. 複数のｄｓＲＮＡ配列が表１および表２に記載の配列から選択されることをさらに含む、請求項５５に記載の医薬組成物。
58. 治療有効量の請求項１７、２０または５５に記載の医薬組成物を処置を必要とする患者に投与することを含むＨＣＶ感染を処置するための方法。
59. ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＰＩ４Ｋ）の活性を選択的に抑制する化合物を処置を必要とする患者に投与することを含むプラス鎖ＲＮＡウイルスによる感染を処置するための方法。
60. 化合物が前記のものをコードするｄｓＲＮＡ、ＤＮＡアンチセンスＤＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡベクターから選択される、請求項５９に記載の方法。
61. 化合物がｄｓＲＮＡである、請求項６０に記載の方法。
62. 化合物が請求項２または請求項９に記載のｄｓＲＮＡである、請求項６１に記載の方法。
63. 化合物が配列番号１から配列番号４１６から選択される配列を有するｄｓＲＮＡである、請求項６２に記載の方法。

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