CN102453712B - PI4KB siRNA及其在制备抑制SARS-CoV感染的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及PI4KB siRNA及其在制备抑制SARS-CoV感染的药物中的用途。特别地，本发明涉及针对PI4KB的siRNA、表达针对PI4KB的siRNA的表达载体、包含该表达载体的宿主细胞、活性成分为所述针对PI4KB的siRNA或所述表达载体的组合物。本发明还涉及一种用于预防和/或治疗SARS-CoV感染的试剂盒，其含有所述针对PI4KB的siRNA或所述表达载体。本发明还涉及所述针对PI4KB的siRNA或所述表达载体在制备预防和/或治疗SARS-CoV感染的药物中的用途以及PI4KB作为SARS-CoV感染的治疗靶点的用途。本发明为SARS-CoV的感染提供了一种有治疗前景的作用靶点及一类有治疗前景的药物候选物。

Description

PI4KB siRNA及其在制备抑制SARS-CoV感染的药物中的用途

技术领域

本发明涉及PI4KB siRNA、表达针对PI4KB的siRNA的表达载体、包含该表达载体的宿主细胞、活性成分为所述针对PI4KB的siRNA或所述表达载体的组合物。本发明还涉及一种用于预防和/或治疗SARS-CoV感染的试剂盒，其含有所述针对PI4KB的siRNA或所述表达载体。本发明还涉及所述针对PI4KB的siRNA或所述表达载体在制备预防和/或治疗SARS-CoV感染的药物中的用途以及PI4KB作为SARS-CoV感染的治疗靶点的用途。 

背景技术

导致严重急性呼吸综合征(SARS)世界性爆发流行的病原体是一种新型的冠状病毒：SARS冠状病毒(SARS-CoV)[1]。SARS最早在2002-2003冬季爆发于亚洲，迅速蔓延至世界多个国家。截止到2003年7月31日，大规模流行的末期，全世界26个国家诊断为SARS的8096名病例中，有774人死亡[2]，致死率达到近10％。 

SARS冠状病毒是一种有包膜的RNA病毒，为单链正义RNA。其基因组全长29kb，包括13到15个开放阅读框(ORF)。编码4个主要结构蛋白，即Spike(S)、Envelope(E)、Membrane(M)、Nucleocapsid(N)蛋白。其中最为重要的是SARS-CoV的刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)，它主要介导病毒与宿主细胞受体的结合，并介导病毒与宿主细胞膜的融合[3]。Spike蛋白作为I型病毒膜蛋白，与很多有包膜病毒的跨膜糖蛋白类似。SARS Spike蛋白已经被证实可以诱导VeroE6细胞凋亡。 

SARS-CoV受体的发现对于研究该致命性病毒进入宿主细胞具有划时代的意义。2003年，Li[4]进行的S蛋白S1亚基与VeroE6细胞的体外免疫共沉淀实验首次证实了ACE2(血管紧张素转换酶2)是SARS-CoV的功能性受体。而这进一步被SARS-CoV的体外重组S蛋白以及ACE2基因敲除小鼠模型的体内实验所证实[5]。2004年，DC-SIGN以及与其 同源性的分子L-SIGN也被证实是SARS-CoV的受体。不过，与ACE2这个主要受体相比，其介导病毒进入细胞的效率比较低[6，7]。 

目前，已有大量研究报道了SARS-CoV进入宿主细胞的方式。首先有学者提出SARS-CoV是通过直接膜融合方式进入细胞[8，9，10]。后来Yang等人[11]报道SARS-CoV进入细胞是pH依赖性，升高胞内酸性小体pH的药物可以阻断SARS-CoV进入细胞。Simmons G等人[12]发现一种pH依赖的蛋白酶内体蛋白酶-组织蛋白酶L(Cathepsin L)的抑制剂能够抑制SARS-CoV的进入。这些都提示SARS-CoV可以通过内吞方式进入宿主细胞。Wang等人[13]进一步发现SARS-CoV可以通过内吞进入宿主细胞，并且病毒侵入宿主细胞VeroE6的过程不依赖于网格蛋白(clathrin)与胞膜窖(caveolea)结构。脂筏，这种细胞表面重要的脂质微区在病毒进入细胞的过程中起重要作用。 

基于对SARS-CoV的进入以及进入后在宿主细胞内生活周期的大量研究，目前针对SARS-CoV感染的抑制剂也应运而生。主要分为针对病毒进入的抑制剂和针对细胞内生活周期的抑制剂。 

针对SARS-CoV进入的抑制剂主要有：1.以ACE2受体作为靶点：包括可溶性ACE2，ACE2抗体以及针对ACE2催化活性的小分子抑制剂，如NAAE[14，15]。由于ACE2被证实在SARS-CoV感染中可以起到保护肺脏的作用，因此，ACE2受体抑制剂作为抗病毒的策略需要慎重考虑[16，17]。2.针对Spike蛋白的单克隆抗体，如S3.1[18]，CR3022联合CR3014[19，20]。3.针对Spike蛋白S2结构域的膜融合抑制剂，如：七肽重复序列抑制剂[21，22]，环状序列抑制剂[23]。4.小分子抑制剂，如VE607[24]，Cathepsin L(CTSL)抑制剂，如MDL28170。由于Bosch等人[25]发现CTSL可以在位于S1和S2结构域之间的T678处切割SARS-CoV Spike蛋白，由此激活了Spike蛋白的膜融合功能。CTSL可以作为抑制SARS-CoV进入的新靶点。 

针对SARS-CoV细胞内生活周期的抑制剂主要有：1.以SARS-CoV蛋白酶作为靶点，如针对3CLpro的CS11，Cinanserin等[26，27]。2.以E蛋白作为靶点，如Cinnamoylguanidine.[28]3.针对SARS-CoV的RNAi，如针对SARS-CoV ORF 1a的siRNA[29]。4.干扰素[30]。 

目前，SARS-CoV与宿主相互作用机制的研究仍然在继续。研究者 试图寻找更多新的有效的治疗靶点。如泛素蛋白酶系统(UPS)，其在调节细胞内蛋白分选和降解中起到关键作用。通过研究UPS在冠状病毒感染周期中不同步骤的作用发现，UPS与病毒进入，RNA合成以及后续蛋白表达密切相关[31]，提示这也可能成为治疗的靶点。 

已有研究表明，SARS-CoV在大多数受到感染的VeroE6细胞凋亡后建立起持续感染。抑制剂LY294002可以抑制持续性感染的建立。PI3K信号通路(包括AKT)在建立SARS病毒的持续感染中发挥着重要作用。PI3K/Akt信号通路的活化对于在VeroE6细胞死亡之前建立起的SARS-CoV的持续感染是必要的[32，33]。 

PI4K(磷脂酰肌醇4磷酸激酶)与病毒的关系近来逐渐开始出现在报道中。已知的四种PI4K(PI4K-IIα，PI4K-IIβ，PI4K-IIIα和PI4K-IIIβ)具有相同的功能：磷酸化PI提供PI4P。由于其在细胞中的定位不同，因此导致不同的生物结果。 

PI4KB别名为PI4K92，Ptdlns4-kinase β，PI4K-III β。其GeneBank登录号为NM_002651。位于染色体1q21。在酵母的同源物是Pik1p，分子量为92kDa，抑制剂LY294002的IC50为100uM，Wortmannin的IC50为50-300nM，哺乳动物PI4KB定位于高尔基体[34，35]和细胞核内。在MDCK细胞中，PI4KB调节高尔基体到细胞浆膜的运输，并且调节高尔基体内对流感病毒血凝素的传输和疱疹性口腔炎病毒(VSV)G蛋白的基底膜侧运输[36]。激酶失活形式的PI4KB可以抑制VSV-G蛋白在非极化细胞中从高尔基体到细胞浆膜的运输[37]。募集PI4KB到高尔基体被小GTP结合蛋白Arf-1调节，但PI4KB也与NCS-1相互作用并被其调节[38，39]。证据表明，PI4KB对调节胞外分泌非常重要：NCS-1通过升高胰腺β细胞在小泡中的储备以促进葡萄糖诱导的胰岛素分泌，这一过程需要PI4KB的参与[40]。 

PI4KA别名为PI4K230，Ptdlns4-kinase α，PI4KIII α。其GeneBank登录号为NM_058004。位于染色体22q11.21。在酵母的同源物是Stt4p，分子量为230kDa，抑制剂LY294002的IC50为100uM，Wortmannin的IC50为50-300nM，哺乳动物PI4KA主要位于哺乳动物内质网[34]和中心粒周高尔基体以及细胞核内[41]。已有足够的证据显示PI4KA在脊椎动物细胞浆膜上起作用。 

其他两种PI4K，PI4K-IIα和PI4K-IIβ定位于细胞浆膜，内体膜和高尔基体。调节内吞和细胞内的适配器蛋白AP-1货物运输[42]。 

PI4K与病毒的关系目前仅仅集中在对HCV的研究中。为发现具有潜力的治疗靶点，Maud等人[43]对HCV感染细胞的进入途径进行了研究。采用与细胞膜交通和重塑相关的siRNA文库对HCV假病毒感染Huh-7.5.1细胞进行筛查。结果发现，采用siRNA技术敲除PI4K-IIIα和PI4K-IIIβ，不仅可以部分保护细胞免受HCV的感染而且使病毒复制得到抑制。而敲除PI4K-IIα和PI4K-IIβ均不能起到相应的作用。Huh-7.5.1细胞对HCV的易感性需要PI4K-IIIα和PI4K-IIIβ的充分表达。该研究为PI4K-IIIα和PI4K-IIIβ成为HCV治疗的潜在靶点奠定了基础。 

PI4K-IIIβ与病毒复制的作用机制也进一步得到探讨。很多RNA病毒进行细胞内膜体重塑以产生特异位点进行RNA复制。2010年5月发表在Cell上的[44]研究揭示了RNA病毒如何利用细胞分泌路径中的多种因子产生出复制特异的小体(organelles)，这些小体不同于宿主细胞自身的蛋白和磷脂组分。病毒特异蛋白调节被Arf1GTP酶和鸟嘌呤核苷酸交换因子GBF1募集来的效应因子，进而优先募集PI4K-IIIβ至膜衣蛋白，提供PI4P磷脂富集的小体。PI4P富集的磷脂微环境对于肠病毒和黄病毒RNA的复制是必要的。抑制PI4K-IIIβ干扰了这一过程。研究证明，PI4K-IIIβ作为细胞内蛋白起到了关键的作用。 

目前尚无PI4K与SARS-CoV关系的报道。已有HCV的研究结果启发我们探讨PI4K-IIIα和PI4K-IIIβ与SARS-CoV感染进入的关系。二者与SARS-CoV的感染进入是否有一定的关系？选择什么样的系统对这个问题进行研究？由于假病毒通常被用以模仿真正的病毒进入宿主细胞进行研究，例如HCV[45，46]，Ebola和Marburg病毒[47]，ARS-CoV[13]。这是一个研究病毒生命周期中早期事件非常有力的工具。VeroE6细胞表达ACE2受体，是SARS-CoV的自然宿主细胞。在研究中被用以作为SARS-CoV感染的细胞模型。因此，本研究拟采用具有感染力的SARS假病毒感染VeroE6细胞这一有力的系统进行研究。 

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA 高效特异性降解的现象。近来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。设计通常为一RNA短链，21-23nt。该技术在病毒进入感染的研究中也得到广泛应用。 

因此，如果能用RNA干扰技术研究清楚PI4K与SARS-CoV的关系，将会为SARS提供一种有前景的治疗途径。 

发明内容

因此，本发明的技术问题在于获得PI4K与SARS-CoV的相互作用关系。 

因此，本发明的第一方面涉及一种针对PI4KB的siRNA。本领域技术人员公知针对PI4KB的siRNA的获取方法，优选地，所述获取方法为全化学合成或重组表达。优选地，所述针对PI4KB的siRNA选自： 

siRNA1： 

正义链1(5′-3′)5′CAAGGAGCCUGGAGUACAA dTdT 3′(SEQ IDNo.2)， 

反义链1(3′-5′)3′dTdT GUUCCUCGGACCUCAUGUU 5′(SEQ IDNo.3)； 

siRNA2： 

正义链2(5′-3′)5′GGAUCAAGCCAUACAAGAU dTdT 3′(SEQ IDNo.5)， 

反义链2(3′-5′)3′dTdT CCUAGUUCGGUAUGUUCUA 5′(SEQ IDNo.6)； 

siRNA3： 

正义链3(5′-3′)5′GCACCGAGAGUAUUGAUAA dTdT 3′(SEQ IDNo.8)， 

反义链3(3′-5′)3′dTdT CGUGGCUCUCAUAACUAUU 5′(SEQ IDNo.9)。 

3、最优选地，所述siRNA为siRNA2： 

正义链2(5′-3′)5′GGAUCAAGCCAUACAAGAU dTdT 3′(SEQ IDNo.5)， 

反义链2(3′-5′)3′dTdT CCUAGUUCGGUAUGUUCUA 5′(SEQ IDNo.6)。 

本发明的第二方面涉及一种表达如上所述的针对PI4KB的siRNA的表达载体，优选地，所述表达载体为原核表达载体或真核表达载体，更优选地，所述表达载体为真核表达载体，最优选地，所述真核表达载体为腺病毒表达载体。 

本发明的第三方面涉及一种含有如上所述的表达载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，更优选地，所述宿主细胞为真核细胞，更优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，最优选地，所述细胞为VeroE6细胞。 

本发明的第四方面涉及一种活性成分为如上所述的针对PI4KB的siRNA或如上所述的表达载体的组合物。本领域技术人员公知，在制备所述组合物时，考虑到siRNA或表达载体本身的性质以及所要应用的目的，其还可以另外包含抑制RNA降解的试剂、pH调节剂、赋形剂等药学上可接受的辅料。 

本发明的第五方面涉及一种用于预防和/或治疗SARS-CoV感染的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有如上所述的针对PI4KB的siRNA或如上所述的表达载体。本领域技术人员公知，在制备所述试剂盒时，考虑到siRNA或表达载体本身的性质以及所要应用的目的，其还可以另外包含抑制RNA降解的试剂、pH调节剂、赋形剂等药学上可接受的辅料。 

本发明的第六方面涉及如上所述的针对PI4KB的siRNA或如上所述的表达载体在制备预防和/或治疗SARS-CoV感染的药物中的用途。本发明的第七方面涉及一种PI4KB作为SARS-CoV感染的治疗靶点的用途。优选地，所述治疗靶点选自： 

靶序列1：5’CAAGGAGCCTGGAGTACAA 3’(SEQ ID No.1) 

靶序列2：5′GGATCAAGCCATACAAGAT 3’(SEQ ID No.4)，或 

靶序列3：5’GCACCGAGAGTATTGATAA 3’(SEQ ID No.7)。 

换言之，本研究基于对SARS Spike蛋白在细胞凋亡中的作用及其凋亡机制的初步的研究，从发现LY294002可以抑制SARS假病毒感染VeroE6细胞入手，设计针对PI4KA和PI4KB的siRNA。当然，本领域技术人员公知，针对HULC基因可以设计多种siRNA序列，只要这样的siRNA序列可以有效的敲除HULC RNA的表达。这样的siRNA序列也落入本发明的保护范围。通过导入上述的相应siRNA后对VeroE6细胞所受SARS假病毒以及VSVG假病毒的感染情况进行观察。研究发现，在受到有效干扰的VeroE6细胞中，VSVG假病毒的感染程度没有明显变化。而SARS假病毒感染的程度明显不同：干扰VeroE6宿主细胞的PI4KA对SARS假病毒的感染无影响，而干扰宿主细胞的PI4KB则可以显著抑制SARS假病毒的感染，结果具有显著的统计学意义。 

本研究首次发现了PI4KB siRNA可以抑制SARS-CoV的感染，为研究PI4KB与SARS-CoV的关系揭开了新的一页，虽然机制尚待进一步的探讨，但这对发现具有潜力的治疗靶点具有重要的意义。 

附图说明

图1a、图1b：VeroE6转染对照siRNA，PI4KA siRNA以及PI4KBsiRNA 48小时后SARS假病毒感染和VSVG假病毒感染的荧光显微镜图 

VeroE6细胞转染对照siRNA(左)、PI4KA siRNA(中)、PI4KBsiRNA(右)后感染SARS假病毒(图1a)或VSVG假病毒(图1b)。48小时后细胞固定，在100倍荧光显微镜下观察表达绿色荧光蛋白的细胞比例(绿色)。相应细胞核用Hoechst33342进行染色(蓝色)。 

图2：荧光计数统计假病毒感染的结果图 

VeroE6细胞转染对照siRNA，PI4KA siRNA和PI4KB siRNA后，感染SARS假病毒或VSVG假病毒。48小时后将准备荧光观察的细胞先用4％多聚甲醛进行固定，之后用Hoechst33342染核10分钟。在NikonEclipse TE2000-U倒置荧光显微镜下进行观察拍照(同图1)。图像采用Image pro plus软件进行统计分析GFP(绿色荧光蛋白)阳性细胞比例，即假病毒感染比例。每个样本分析的细胞数不少于2000个。 

图3：检测假病毒感染的绿色荧光蛋白表达量的Western图 

VeroE6细胞转染对照siRNA，PI4KA siRNA和PI4KB siRNA后感染假病毒，48小时后收获细胞的裂解液。利用绿色荧光蛋白抗体(EGFP)进行蛋白免疫印记检测。GFP表达量代表相对的假病毒感染强度。其中阴性对照是对照siRNA转染的VeroE6细胞，而空白对照是没有假病毒感染的亲本VeroE6细胞。 

图4a、图4b：VeroE6转染siRNA 48小时后RT-PCR检测目的基因(PI4KA、PI4KB)抑制效率结果图 

A为PI4KB的结果，B为PI4KA的结果。VeroE6转染相应siRNA 48小时后，提取总细胞RNA。利用特异性引物检测相应基因的表达水平。其中阴性对照是转染对照siRNA的VeroE6细胞，而空白则是没有经过siRNA转染的亲本VeroE6细胞。 

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。 

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。 

实施例 

实施例1、研究材料及细胞培养 

1.1本发明所用主要研究材料如下： 

VeroE6，HEK293T细胞购自协和基础所细胞中心； 

细胞培养基DMEM，胎牛血清购自Invitrogen公司； 

lipofectamine 2000，lipofectamine RNAiMAX，Opti-MEM购自invitrogen公司 

Hoechst33342购自sigma公司 

4％多聚甲醛购自联科生物技术有限公司 

actin、GFP抗体购自Santa Cruz公司 

MTT试剂购自Promega公司 

siRNA由广州锐博生物技术有限公司合成 

1.2细胞培养： 

VeroE6，HEK293T用DMEM(含10％胎牛血清)进行传代。37℃，5％CO₂孵箱培养。 

实施例2、假病毒的包装： 

将大小均匀，状态良好的HEK293T细胞约5×10⁶分到10cm培养皿中进行培养。24小时后，进行质粒转染。对于SARS假病毒，PQCXIX、gag/pol、s-ht2三种质粒(PQCXIX购自Clontech Cat.No.631515，gag/pol，s-ht2由Michael Farzan实验室(哈佛医学院AIDS研究中心)提供，gag/pol以小鼠白血病病毒的gag/pol为基础。s-ht2是将SARS病毒的Spike基因插入到pcDNA3.1载体中构建而成)。按照1∶1∶2的比例进行转染，每个培养皿三种质粒总量是10ug。对于VSVG假病毒，PQCXIX、gag/pol、VSVG三种质粒(其中VSVG质粒系将VSVG基因插入到pcDNA3.1载体中构建而成)。按照1∶1∶2的比例进行转染，每个培养皿三种质粒总量是10ug。转染6小时细胞进行换液。48小时后，收获细胞上清，0.45μm滤膜过滤。之后用Beckman SW41转子，45,000转/分钟，4℃离心2小时。将离心到管底部的病毒用少量DMEM重悬，-80℃保存。 

实施例3、siRNA转染以及定量PCR检测基因抑制效率： 

在本研究中所选用的PI4KB的三个RNA干扰靶标及其对应的siRNA详情如下： 

PI4KB01： 

靶序列CAAGGAGCCTGGAGTACAA(SEQ ID No.1) 

正义链(5′-3′)5′CAAGGAGCCUGGAGUACAA dTdT 3′(SEQ IDNo.2) 

反义链(3′-5′)3′dTdT GUUCCUCGGACCUCAUGUU 5′(SEQ IDNo.3) 

PI4KB02： 

靶序列GGATCAAGCCATACAAGAT(SEQ ID No.4) 

正义链(5′-3′)5′GGAUCAAGCCAUACAAGAU dTdT 3′(SEQ IDNo.5) 

反义链(3′-5′)3′dTdT CCUAGUUCGGUAUGUUCUA 5′(SEQ IDNo.6) 

PI4KB03： 

靶序列GCACCGAGAGTATTGATAA(SEQ ID No.7) 

正义链(5′-3′)5′GCACCGAGAGUAUUGAUAA dTdT 3′(SEQ IDNo.8) 

反义链(3′-5′)3′dTdT CGUGGCUCUCAUAACUAUU 5′(SEQ IDNo.9) 

在本研究中所选用的PI4KA的RNA干扰靶标及其对应的siRNA详情如下： 

靶序列：GGATAAAGCTATTCAGAAA(SEQ ID No.10) 

正义链(5′-3′)5’GGAUAAAGCUAUUCAGAAA dTdT3’(SEQ IDNo.11) 

反义链(3′-5′)3’dTdT TTTCTGAATAGCTTTATCC5’(SEQ IDNo.12) 

具体实验步骤如下： 

(1)将大小均匀，状态良好的VeroE6细胞约5×10⁴分到24孔板，24小时后进行转染。转染时按照lipofectamine RNAiMAX转染说明书进行。大体上每孔siRNA终浓度为50nM，lipofectamine RNAiMAX加入1ul。转染6小时后去掉细胞上清，加入新鲜DMEM培养24小时。之后将细胞分到96孔板中，进行假病毒感染实验。感染48小时后进行荧光观察。 

(2)RNA提取及定量PCR： 

Trizol试剂、Superscript II逆转录酶购自invitrogen公司 

仪器：Realtime ABI的7500 

染料sybr-roche faststart Universal SYBR Green Master(ROX)， 

耗材：ABI光学96孔反应板(N8010560)，光学贴膜(4360954)或者8连管。 

在siRNA转染细胞48小时后，细胞内总RNA用trizol试剂进行提取。利用Superscript II逆转录酶将RNA逆转录成cDNA。定量PCR 的检测在ABI7500仪器上进行。GAPDH基因作为内参。 

具体步骤： 

1)引物稀释 

PI4KA 

正向引物：TCCGCAGCACTATCATCAAC 

反向引物：CCTCAAAGTAGCAGAACATTACC 

PI4KB 

正向引物：CCAACTATGACAACGATGATGAG 

反向引物：ACAGGCTCCTTGCTCTCC 

2)样本稀释：提取后的RNA稀释一倍 

3)体系配置：总需要的孔数为样本数*待测基因数*复孔数(3个)。每孔体系为20ul，包括10ul SYBR，1ul模板，正反向引物各1ul，水7ul。配制的时候，按照每个样品所需的量进行(除引物之外的成分)，每个基因配制3.3个孔所需的量也就是66ul。这样保证同一样本内的均一性。计算好所需的量之后，将除引物外的溶液分至EP管内，小心加好混好的引物对。 

4)用移液器混好后瞬离，小心加入专用96孔板。带PE手套覆盖好光学贴膜，用卡片刮平并小心撕去纸边。 

5)96孔板离心机2000转2分钟。 

6)打开ABI7500SDS software，设置为相对定量ddct模式。设定待测基因名称、布局。延伸时间0.34s，体系20ul。运行完毕之后，再测定熔解曲线。以判断引物特异性。 

7)分析结果。 

结果如图4a和图4b所示，VeroE6转染相应siRNA 48小时后，提取总细胞RNA。利用特异性引物检测相应基因的表达水平。其中阴性对照是转染对照siRNA的VeroE6细胞，而空白则是没有经过siRNA转染的亲本VeroE6细胞。RT-PCR结果说明实验所用的siRNA均可以有效抑制目的基因的表达。相应基因PI4KA和PI4KB01，PI4KB02，PI4KB03的mRNA水平下降明显。 

实施例4、假病毒感染转染siRNA细胞的荧光观察及比例统计： 

如图1所示，VeroE6细胞采用上述实施例3的方法进行相应siRNA(即对照siRNA、PI4KA siRNA、PI4KB siRNA)转染后感染方法2制备的SARS假病毒(图1a)或VSVG假病毒(图1b)。48小时后将准备荧光观察的细胞先用4％多聚甲醛进行固定，之后用Hoechst33342染核10分钟。在100倍荧光显微镜下观察表达绿色荧光蛋白的细胞比例(绿色)。相应细胞核Hoechst33342染色呈蓝色。该荧光定性结果证实，VeroE6转染对照siRNA及PI4KA siRNA后对于SARS假病毒的进入影响不大，而在转染PI4KB siRNA后，SARS假病毒的荧光比例明显下降。而VSVG假病毒的荧光比例不受PI4KB siRNA的影响。 

如图2所示，利用Nikon Eclipse TE2000-U倒置荧光显微镜进行观察拍照，图像用Image pro plus软件进行分析，每个样本分析的细胞数不少于2000个。统计感染细胞的荧光比例结果定量证实了SARS假病毒感染受到转染PI4KB siRNA的抑制，具有显著的统计学意义。而VSVG假病毒未受到影响。**P＜0.001。 

实施例5、蛋白免疫印迹检测方法(Western Blotting)： 

将经过假病毒感染的细胞用PBS洗3次，之后用细胞裂解液裂解(含蛋白酶抑制剂)。SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到醋酸纤维素膜上，2％鸡卵清封闭。一抗GFP抗体1∶1000稀释，二抗辣根过氧化物酶标记的抗体结合后，加入底物显色。 

结果如图3所示，VeroE6细胞转染对照siRNA，PI4KA siRNA和PI4KB siRNA后感染假病毒，48小时后收获细胞的裂解液。利用绿色荧光蛋白抗体(EGFP)进行蛋白免疫印记检测。GFP表达量代表假病毒感染强度。其中阴性对照是对照siRNA转染的VeroE6细胞，而空白对照是没有假病毒感染的亲本VeroE6细胞。Western结果显示在转染PI4KB siRNA后，SARS假病毒进入VeroE6的总GFP表达量明显下降，而VSVG假病毒则受影响不大。 

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Claims (5)

1.针对PI4KB的siRNA或表达针对PI4KB的siRNA的表达载体在制备预防和/或治疗SARS-CoV感染的药物中的用途，其中所述针对PI4KB的siRNA选自：

siRNAl：

正义链1(5′-3′)5′CAAGGAGCCUGGAGUACAA dTdT3′(SEQ IDNo.2)，

反义链1(3′-5′)3′dTdT GUUCCUCGGACCUCAUGUU5′(SEQ IDNo.3)；

siRNA2：

正义链2(5′-3′)5′GGAUCAAGCCAUACAAGAU dTdT3′(SEQ IDNo.5)，

反义链2(3′-5′)3′dTdT CCUAGUUCGGUAUGUUCUA5′(SEQ IDNo.6)；

siRNA3：

正义链3(5′-3′)5′GCACCGAGAGUAUUGAUAA dTdT3′(SEQ IDNo.8)，

反义链3(3′-5′)3′dTdT CGUGGCUCUCAUAACUAUU5′(SEQ IDNo.9)。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述针对PI4KB的siRNA为siRNA2：

正义链2(5′-3′)5′GGAUCAAGCCAUACAAGAU dTdT3′(SEQ IDNo.5)，

反义链2(3′-5′)3′dTdT CCUAGUUCGGUAUGUUCUA5′(SEQ IDNo.6)。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述表达针对PI4KB的siRNA的表达载体为原核表达载体或真核表达载体。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述表达针对PI4KB的siRNA的表达载体为真核表达载体。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述表达针对PI4KB的siRNA的表达载体为腺病毒表达载体。

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