JP2009511704A - プラズマ処理を用いるプラスチック基質の製造方法および同方法を用いて製造されるプラスチック基質 - Google Patents

Abstract

自家蛍光がより少なく、特異性がより良好なプラスチック基質の製造方法が提供される。上記方法は、（ａ）５０μｍ×５０μｍ以下の条件下で、Ｒ_ａ３ｎｍ未満またはＲ_ｑ４ｎｍ未満の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）表面粗さを有するプラスチック基質を調製する工程；（ｂ）前記プラスチック基質をプラズマで処理する工程；および（ｃ）前記プラスチック基質を表面修飾モノマーで処理する工程を含む。また、上記方法により製造されるプラスチック基質も提供される。上記プラスチック基質は、自家蛍光が顕著に低く、よって標的生体分子の検出に対するよりよい特異性を示す。このことにより、微小流体構造を含ませる設計がガラス基質に比して容易でありながら、高い自家蛍光のために、マイクロアレイ、バイオチップまたはウェルプレートへの利用が限られていたプラスチック基質を、広範に適用することが可能となる。更に、上記プラスチック基質の製造方法は、プラスチック基質の表面特異性を向上することができ、またプラスチック基質の表面特性を容易に調節することができる。
【選択図】図１

Description

本出願は、韓国特許庁に対してなされた特許文献１（２００５年１０月１４日出願）、特許文献２（２００６年２月１０日出願）および特許文献３（２００６年３月２２日出願）に基づく優先権を主張するものであり、これらの出願における開示内容は、その全体が参照により本願明細書に組み入れられるものとする。

本発明は、標的生体分子（ｔａｒｇｅｔ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）の検出に対し高い特異性を有するプラスチック基質（ｐｌａｓｔｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の製造方法、および同方法を用いて製造されるプラスチック基質に関する。

バイオテクノロジーの進展に伴い、生物の遺伝情報を含むＤＮＡ配列、タンパク質配列等が明らかにされた。そこで、配列決定、疾病診断等のためのバイオチップの開発が活発に行われた。バイオチップは、ＤＮＡ、タンパク質等のプローブ生体分子の高密度マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を基質に付けたツールである。バイオチップは、その製造方法によりフォトリトグラフィックチップ（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ ｃｈｉｐｓ）、ピンスポッティングチップ（ｐｉｎ−ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｃｈｉｐｓ）、インクジェットスポッティングチップ（ｉｎｋｊｅｔ−ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｃｈｉｐｓ）等に分類することができる。

プローブ生体分子の高密度マイクロアレイを固定化したバイオチップは、プローブ生体分子と標的生体分子の間の相補的ベースペアリングの程度を検出することにより、プローブ生体分子に対する標的生体分子の結合親和性の程度を測定するものである。一般に、プローブ生体分子に対する標的生体分子の結合親和性の程度の測定は、光学的手法を用いて達成される。これは、
蛍光物質でラベルした標的生体分子と、プローブ生体分子のハイブリダイゼーションを行う工程、および
前記蛍光物質から発せられる蛍光信号を検出する工程
を含む。

マイクロアレイ法の最も有利な点は、痕跡量の生体分子（ＤＮＡ、タンパク質等）試料を用いて、多くの生物学的情報が得られる点にある。バイオチップ技術は徐々に拡張しており、プローブ生体分子マイクロアレイを単一のチップに固定化し、その単一のチップについて試料の前処理（標的生体分子の分離、精製、増幅を含む）および試料のアッセイを行うＬａｂ−Ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ（ＬＯＣ）技術という概念的思想（ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ ｉｄｅａ）や、緊急事態における迅速な診断を可能にするＰｏｉｎｔ−Ｏｆ−Ｃａｒｅ（ＰＯＣ）技術という概念的思想、更には、情報通信技術と組み合わせることにより、時間や場所に関係なく個人の健康状態を認識または予測できるｅ−ヘルスケア技術という概念的思想にまで至っている。

バイオチップ技術において、基質に生体分子を固定化するための表面修飾は、最も重要な技術である。このためには通常、湿式法を用いる。従来の湿式法では、官能基（エポキシ基、アミノ基、アルデヒド基等）を有するシラン化合物の溶液を溶媒（例えばエタノール）で希釈したものをある塗布方法（例えばディップコーティング法）によりガラス基質に塗布し、１００℃以上で１時間加熱する。このとき溶媒は、エタノールの他、アルコール性溶媒（メタノール、プロパノール、ブタノール等）、メチルエチルケトンおよびジメチルホルムアミドよりなる群から選択しうる。塗布方法は、ディップコーティング法の他、スプレーコーティング法、スピンコーティング法等の塗布方法よりなる群から選択しうる。

ところで、マイクロアレイ基質の製造には、ガラス、シリコーン、プラスチック等、種々の材料が用いられる。特にプラスチック基質は、他の材料に比して、微細構造（ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）を含ませる設計が容易であり、容易に大量生産でき、また費用対効果があるという点において有利である。

韓国特許出願第１０−２００５−００９６９５０号 韓国特許出願第１０−２００６−００１３００７号 韓国特許出願第１０−２００６−００２６０４４号

しかし、部分的に異なる微小スケールの表面修飾を達成することが困難なことが、従来の湿式法における主要な技術的制限である。そのため、従来の湿式法におけるこの技術的制限を克服しうる、新たなプロセス技術が必要とされている。

加えて、プラスチック基質は、自家蛍光（ａｕｔｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）が比較的高いため、標的生体分子の検出に対し低い特異性を示すので、その適用は限られている。

上記問題の解決方法を探索したところ、本発明者らは、所定の粗さを有するように製造したプラスチック基質を表面修飾のためプラズマ処理すると、そのプラスチック基質からの自家蛍光が顕著に減少し、生体分子の検出に対する良好な特異性が確保されることを見出した。

よって本発明は、プラスチック基質からの自家蛍光を減少させ、生体分子の検出に対する特異性を向上し、またプラスチック基質の表面特性を容易に調節することができるプラスチック基質の製造方法を提供するものである。

本発明はまた、自家蛍光がより少なく、生体分子の検出に対する特異性がより良好な、同方法を用いて製造されるプラスチック基質を提供するものである。

本発明の一態様によれば、プラスチック基質の製造方法であって、
（ａ）５０μｍ×５０μｍ以下の条件下で、Ｒ_ａ３ｎｍ未満またはＲ_ｑ４ｎｍ未満の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）表面粗さを有するプラスチック基質を調製する工程；
（ｂ）前記プラスチック基質をプラズマで処理する工程；および
（ｃ）前記プラスチック基質を表面修飾モノマーで処理する工程
を含む製造方法が提供される。

本発明の他の一態様によれば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）表面粗さが、５０μｍ×５０μｍ以下の条件下でＲ_ａ３ｎｍ未満またはＲ_ｑ４ｎｍ未満であり、プラズマおよび表面修飾モノマー（ｓｕｒｆａｃｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｍｏｎｏｍｅｒ）で表面処理されたプラスチック基質が提供される。

本発明のプラスチック基質は、自家蛍光が顕著に低く、よって標的生体分子の検出に対するよりよい特異性を示す。このことにより、微小流体構造（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を含ませる設計がガラス基質に比して容易でありながら、高い自家蛍光のために、マイクロアレイ、バイオチップまたはウェルプレートへの利用が限られていたプラスチック基質を、広範に適用することが可能となる。更に、本発明によれば、基質の表面特異性を向上することができ、また基質の表面特性を容易に調節することができる。
本発明の上記および他の諸特徴は、添付の図面を参照する、本発明の代表的な態様の詳細な記載より明らかになる。

以降、本発明のプラスチック基質の製造方法を、工程ごとにより詳細に記載する。

本発明のプラスチック基質の製造方法は、５０μｍ×５０μｍ以下の条件下で、Ｒ_ａ３ｎｍ未満またはＲ_ｑ４ｎｍ未満の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）表面粗さを有するプラスチック基質を調製する工程を含む。
本発明のプラスチック基質は、ポリスチレン（ＰＳ）、シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）およびポリカーボネート（ＰＣ）よりなる群から選択される透明樹脂、またはポリプロピレン（ＰＰ）およびポリエチレン（ＰＥ）よりなる群から選択される半透明樹脂から製造されていてよい。好ましくは、プラスチック基質は、半透明樹脂から製造されていてよい。プラスチック基質は、化学的耐性および耐熱性を有していなければならない。

後述する本発明の実施例においては、費用対効果、収縮の少なさ、適度な耐熱性を満足するＰＳ樹脂製のプラスチック基質を用いた。プラスチック基質からの自家蛍光は、プロセス中に生じた局所的な熱分解や残存歪み（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｓｔｒｅｓｓ）、金型の表面粗さ、また樹脂や添加剤の固有特性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）に有意に影響を受けることが見出された。

表面粗さの小さなプラスチック基質は、有意に減少した自家蛍光を示す（後述の実施例１を参照）。具体的には、本発明のプラスチック基質は、５０μｍ×５０μｍ以下の条件下で、Ｒ_ａ３ｎｍ未満またはＲ_ｑ４ｎｍ未満のＡＦＭ表面粗さを有する。本明細書において、Ｒ_ａとは算術平均粗さ（ａｖｅｒａｇｅ ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ）であり、Ｒ_ｑとは二乗平均平方根粗さ（ｒｏｏｔ−ｍｅａｎ−ｓｑｕａｒｅ ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ）である。

本発明の表面粗さの小さなプラスチック基質は、例えば射出成形法を用いて製造することができる。即ち、本発明のプラスチック基質を、表面が光学レンズグレードで鏡面仕上げされた金型を用いるプラスチック射出成形法により製造し、その表面粗さを小さくすることができる。

本発明のプラスチック基質の製造方法はまた、プラスチック基質をプラズマで処理する工程を含む。
プラズマは、アルゴンプラズマであってよい。窒素または酸素のプラズマは、プラスチック基質表面において、ラジカルに加え、種々の窒素または酸素化合物が生成するため好ましくない。

プラズマの特性を定義するプラズマのエネルギー密度は、式Ｗ／ＦＭ（式中、Ｗは、プラズマ発生器により印加されるパワー（Ｊ／秒）であり；Ｆは、気体の流速（モル／秒）であり；Ｍは、気体の分子量（ｇ／モル）である）で表される。即ち、分母の単位はｇ／秒（Ｆ×Ｍ）であり、全体の単位はＪ／ｇである。

本発明において、プラズマは、エネルギー密度１０^８Ｊ／Ｋｇ以下の連続プラズマまたはパルスプラズマであってよい。パルスプラズマは連続プラズマに比して、官能基に対し最低限の悪影響しかもたらさない。

本発明においては、プラズマ処理を行うのを１０分以下としてよい。
本発明においては、プラズマの周波数を、マイクロ波周波数である２．４５ＧＨｚまたはラジオ周波数（ＲＦ）である１３．５６ＭＨｚとしてよい。
本発明のプラズマ処理は、通常の方法または装置を用いて行うことができる。図１は、後述する本発明の実施例においてプラズマ処理に用いるプラズマ発生装置の略図である。

本発明において用いるプラズマはコールドプラズマ、真空プラズマのいずれかであり、従ってプラズマ処理中に損傷（例えば熱変形）をもたらすことがほとんどない。よって、本発明のプラズマ処理をプラスチック様材料に適用することができる。即ち、図３−ｂに示すように、微細構造を有する生成物（ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を、プラスチック材料を用いて、ガラスまたはシリコーンに比して容易に、費用対効果のある方法で大量生産できる点を考慮すると、本発明のプラズマ処理は、ガラス基質、シリコーン基質等の無機基質に代えて、プラスチック基質に適用することができるという点において有利である。更に、本発明のプラズマ処理は真空下に乾式法で行われるので、非常に均等な表面処理を達成することができる。マイクロパターン化マスク（ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｍａｓｋ）を用いれば、部分的に異なる表面修飾を達成することもできる。

本発明のプラスチック基質の製造方法はまた、プラスチック基質を表面修飾モノマーで処理する工程を含む。

本発明に８いて、表面修飾モノマーは、エポキシ基含有モノマーよりなる群から選択されるものであってよい。いずれも炭素−炭素二重結合を有するアリルグリシジルエーテル（下記式１で表される）およびメタクリル酸グリシジル（下記式２で表される）が好ましい。よって、プラスチック基質はエポキシ基により表面処理されたものであってよい。プラスチック基質からの自家蛍光減少という観点からは、アリルグリシジルエーテルがより好ましい。

表面修飾モノマーがプラスチック基質を表面修飾するためのアルデヒド基を含む場合、表面修飾モノマーは高沸点の化合物、例えばヘキサナール、オクタナール、ノナナール、デカナール、ドデシルアルデヒド、トランス−２−ペンテナール、トランス−２−ヘキセナール等であってよい。

表面修飾モノマーがプラスチック基質を表面修飾するためのアミノ基を含む場合、表面修飾モノマーは１級アミノ基を含む化合物よりなる群から選択されるもの、例えば３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−（ジエチルアミノ）プロピルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、１−アミノ−２−プロパノール、トリス（２−アミノエチル）アミン、イソブチルアミン、イソペンチルアミン等であってよい。炭素−炭素二重結合を有するアリルアミンおよびエーテル化合物である３−メトキシプロピルアミンがより好ましい。

本発明においては、プラズマ処理および表面修飾モノマーによる処理を引き続いて行うことも、同時に行うこともできる。

図２は、本発明のプラスチック基質の製造方法における、プラズマ処理および表面修飾モノマーとしてアリルグリシジルエーテルを用いる表面修飾を示す略図である。この手順により、プラスチック基質の表面にエポキシ基が組み入れられる。

図２の（ａ）を参照すると、基質をアルゴンプラズマで処理すると、アルゴンプラズマは基質と化学的に反応しないが、基質上にラジカルを発生させる。図２の（ｂ）を参照すると、そのラジカルはモノマーの炭素−炭素二重結合と反応し、ラジカル移動が生じて、種々の構造の化合物の形成に至る。本発明の最も重要な特徴は、プラズマ処理条件の調節を通じて、プラスチック基質の特異性が向上するように、プラスチック基質上に形成される化合物を制御できる点にある。図２の（ｃ）を参照すると、水素の添加によりラジカル停止反応が誘発される。

本発明のプラスチック基質の製造方法は、プラスチック基質中に微小流体構造を形成する工程を更に含んでいてもよい。微小流体構造の形成もまた、プラスチック基質の製造と同時に行ってよい。

本発明はまた、上記の方法により製造されるプラスチック基質を提供するものである。

本発明のプラスチック基質は、ＡＦＭ表面粗さが、５０μｍ×５０μｍ以下の条件下でＲ_ａ３ｎｍ未満またはＲ_ｑ４ｎｍ未満であり、プラズマおよび表面修飾モノマーで表面処理されている。

プラズマは、アルゴンプラズマであってよい。またプラズマは、エネルギー密度１０^８Ｊ／Ｋｇ以下の連続プラズマまたはパルスプラズマであってよい。プラズマ処理を行うのは１０分以下としてよい。プラズマの周波数は、マイクロ波周波数である２．４５ＧＨｚまたはラジオ周波数である１３．５６ＭＨｚであってよい。

好ましくは、プラスチック基質は、ポリスチレン（ＰＳ）、シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）およびポリカーボネート（ＰＣ）よりなる群から選択される透明樹脂、またはポリプロピレン（ＰＰ）およびポリエチレン（ＰＥ）よりなる群から選択される半透明樹脂から製造されるものであってよい。

表面修飾モノマーは、エポキシ基および炭素−炭素二重結合を有するアリルグリシジルエーテルまたはメタクリル酸グリシジルのいずれかであってよい。よって、プラスチック基質はエポキシ基を用いて表面修飾されていてよい。

或いは、表面修飾モノマーは、アルデヒド基を有し沸点が８０℃以上であるヘキサナール、オクタナールおよびノナナールのいずれかであってよい。よって、プラスチック基質はアルデヒド基を用いて表面修飾されていてよい。

更に、表面修飾モノマーは、１級アミノ基および炭素−炭素二重結合を有するアリルアミン、または１級アミノ基を有するエーテル化合物である３−メトキシプロピルアミンであってよい。よって、プラスチック基質はアミノ基を用いて表面修飾されていてよい。

図３−ａは、本発明のプラスチック基質を示す図であり、図３−ｂは、微小流体構造を含む本発明のプラスチック基質を示す略図である。

図４は、本発明のプラスチック基質に固定化したプローブ生体分子と、標的生体分子の間のプローブ−標的ハイブリダイゼーションについての蛍光検出の結果を示す図である。

以下の本発明の実施例においては、従来のガラス基質に固定化したプローブ生体分子と、標的生体分子の間のプローブ−標的ハイブリダイゼーションについての蛍光検出の結果を、本発明の方法で製造したプラスチック基質に固定化したプローブ生体分子と、標的生体分子の間のプローブ−標的ハイブリダイゼーションについての蛍光検出の結果と比較した。蛍光検出の結果によれば、本発明のプラスチック基質における特異性は、従来のガラス基質におけるそれに比して遥かに優れていた。

以降、実施例を参照して本発明をより具体的に記載する。以下の実施例は例証を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１
・表面粗さに対応する自己蛍光の評価
自己蛍光に対するプラスチック基質の表面粗さの影響を測定するため、ＰＳ １５ＮＦＩ樹脂（ＬＧ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｔｄ．、大韓民国）製のプラスチック基質を、表面を一般鏡面仕上げした（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｍｉｒｒｏｒ−ｆｉｎｉｓｈｅｄ）金型と、表面を光学レンズグレードで鏡面仕上げした金型を用いて製造した。

そのようにして製造したプラスチック基質の表面粗さを、ＡＦＭを用いて測定した。表面粗さに関する臨界的な（ｃｒｉｔｉｃａｌ）数値は以下の通りであった。
５０μｍ×５０μｍ以下の条件下で、Ｒ_ａ３ｎｍ未満またはＲ_ｑ４ｎｍ未満

プラスチック基質からの自己蛍光は、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ型スキャナー（Ａｘｏｎ）を用いて測定した。自己蛍光の測定条件は、以下の通りであった。
レーザー強度（ｌａｓｅｒ ｐｏｗｅｒ）：１００％
光電子増倍管（ＰＭＴ）レベル（ＰｈｏｔｏＭｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ （ＰＭＴ） ｌｅｖｅｌ）：６００

実験結果を下記表１に示す。表１に示す通り、５３２ｎｍのレーザー照射では、表面を光学レンズグレードで鏡面仕上げした金型を用いて製造したプラスチック基質からの自己蛍光のレベルは、表面を一般鏡面仕上げした金型を用いて製造したプラスチック基質からのそれに対し約２６％であった。６３５ｎｍのレーザー照射では、表面を光学レンズグレードで鏡面仕上げした金型を用いて製造したプラスチック基質からの自己蛍光のレベルは、表面を一般鏡面仕上げした金型を用いて製造したプラスチック基質からのそれに対し約４４％であった。

上記実験結果から、プラスチック基質の表面粗さを小さくすることにより、プラスチック基質からの自己蛍光を低減させることができることがわかる。

実施例２
・ＰＳ樹脂の種類に対応する自己蛍光の評価
ＰＳ樹脂の種類に対応する自己蛍光のレベルを評価するため、３種の市販ＰＳ樹脂、即ちＬＧ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＰＳ １５ＮＦＩ、ＬＧ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＰＳ ２５ＳＰＩおよびＢＡＳＦ ＰＳ １４７Ｆを用いてプラスチック基質を製造した。このとき、表面を光学レンズグレードで鏡面仕上げした金型を用い、自己蛍光の測定条件は、実施例１と同様にした。

実験結果を下記表２に示す。表２に示す通り、３種のＰＳ樹脂で製造したプラスチック基質からの自己蛍光のレベルは、有意に異なっていた。ＬＧ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＰＳ １５ＮＦＩで製造したプラスチック基質からの自己蛍光のレベルが最も少なかった。ＬＧ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＰＳ １５ＮＦＩで製造したプラスチック基質におけるそのような低自己蛍光は、ＰＳ樹脂に含まれる添加剤と、製造中の局所的熱分解や残存歪みが極めて少ないことの両者に帰するものである可能性がある。特に、添加剤が類似しているＬＧ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＰＳ １５ＮＦＩおよびＬＧ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＰＳ ２５ＳＰＩで製造したプラスチック基質からの自己蛍光を比較すると、ＬＧ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＰＳ １５ＮＦＩで製造したプラスチック基質からの自己蛍光が、ＬＧ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＰＳ ２５ＳＰＩで製造したプラスチック基質からのそれよりも少なかった。これは、ＬＧ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＰＳ ２５ＳＰＩに比して、ＬＧ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＰＳ １５ＮＦＩは低分子量であり、流動性が良好であるため、生じる局所的熱分解や残存歪みが極めて少ないことによるものである。

実施例３
・プラズマ処理時間に対応する自己蛍光の評価
実施例１と同様にして、表面を光学レンズグレードで鏡面仕上げした金型を用いて、ＬＧ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＰＳ １５ＮＦＩ樹脂でプラスチック基質を製造し、プラズマ処理時間に対応する、プラスチック基質からの自己蛍光を測定した。

プラズマ処理に用いるプラズマ発生装置の概略を図１に示す。プラズマ処理は、アルゴン流速３０ｃｃ／分、圧力２０Ｐａ、プラズマパワー１００Ｗで、５分の間隔を置いて最大で３０分間行った。このとき、プラズマのエネルギー密度を１．１２×１０^８Ｊ／Ｋｇとした。自己蛍光の測定条件は、実施例１と同様にした。

実験結果を下記表３に示す。表３に示す通り、プラスチック基質からの自己蛍光のレベルは直線的増分（ｌｉｎｅａｒ ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ）１分あたり約１１０で増加した。

実施例４
・プラズマパワーに対応する自己蛍光の評価
実施例３と同様にしてプラスチック基質を製造し、プラズマパワーに対応する、プラスチック基質からの自己蛍光を測定した。プラズマ処理は、アルゴン流速３０ｃｃ／分、圧力２０Ｐａで、プラズマパワーを増加しながら（５０Ｗ間隔で最大３００Ｗまで）１０分間行った。このとき、プラズマのエネルギー密度を５．６１×１０^７〜３．３６×１０^８Ｊ／Ｋｇとした。自己蛍光の測定条件は、実施例１と同様にした。

実験結果を下記表４に示す。表４に示す通り、プラスチック基質からの自己蛍光のレベルは直線的増分１０Ｗあたり約１１０で増加した。
実施例３および４の結果全てを考慮すると、エネルギー量が同じになる（６ｋＪ）ため、プラズマパワー１００Ｗで１分間プラズマ処理した後の自己蛍光のレベルは、プラズマパワー１０Ｗで１０分間プラズマ処理した後のそれと同じであった。

実施例５
・圧力に対応する自己蛍光の評価
実施例３と同様にしてプラスチック基質を製造し、圧力に対応する、プラスチック基質からの自己蛍光を測定した。プラズマ処理は、アルゴン流速３０ｃｃ／分、プラズマパワー１００Ｗで、圧力を増加しながら（２０Ｐａ間隔で最大１００Ｐａまで）１０分間行った。このとき、プラズマのエネルギー密度を１．１２×１０^８Ｊ／Ｋｇとし、自己蛍光の測定条件は、実施例１と同様にした。

実験結果を下記表５に示す。表５に示す通り、圧力に対応する自己蛍光の増加は有意ではなかった。本発明においては、コールド／真空プラズマを用いても、圧力増加によるプラズマ生成はない。

実施例６
・類似したヌクレオチド配列を有するプローブ生体分子を固定化させたプラスチック基質における特異性の評価
実施例３と同様にしてプラスチック基質を製造し、プラズマ処理を用いてエポキシ基で表面修飾した。

プラズマ処理は２工程に分けた。第１のプラズマ処理では、アルゴン流速２０ｃｃ／分、圧力２０Ｐａ、プラズマパワー１００Ｗ、処理時間１分間の条件でアルゴンプラズマを用いてプラスチック基質にラジカルを取り込ませた。このとき、プラズマのエネルギー密度を１．６８×１０^８Ｊ／Ｋｇとした。

第２のプラズマ処理は、アルゴンとアリルグリシジルエーテルモノマーのプラズマを用いて行った。このとき、アルゴン流速および圧力は第１のプラズマ処理と同じとし、プラズマ処理時間は５分間とした。官能基に対する損傷と自己蛍光の増加を最小限にするため、パワー１００Ｗのプラズマをパルス法で適用した。プラズマのパルスサイクルは、１秒、２秒、５秒および無限大とした。各サイクルにおいて、パルスオン時間（ｐｕｌｓｅ ｏｎ−ｔｉｍｅ）を１００ミリ秒とした。１秒のパルスサイクルにおいては、パルスオフ時間（ｐｕｌｓｅ ｏｆｆ−ｔｉｍｅ）を９００ミリ秒とし、パルスオン時間を１００ミリ秒とした。最後に、水素を用いてラジカル停止反応を行い、エポキシド修飾プラスチック基質を製造した。

エポキシド修飾プラスチック基質に、圧電マイクロアレイヤー（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて２種のプローブ生体分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を固定化させた。これらはヌクレオチド配列が類似しており、識別が困難である。反応条件は次の通りであった。
３×ＳＳＣ緩衝液、０．０１％ＳＤＳ、６０℃、７０％ＲＨ、１６時間
得られたプラスチック基質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ９．０）中、５０℃で３０分間インキュベートし、０．２％ＳＤＳで２分間の洗浄を２回、次いで蒸留水で２分間の洗浄を２回行い、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、乾燥させた。

その一方で、蛍光ラベルしたＰＣＲ産物を標的生体分子として用い、ハイブリダイゼーション溶液（３×ＳＳＣ、０．００１％ＳＳＣ）と混合比１：２０で混合した。反応溶液を５５℃で３０〜６０分間インキュベートし、室温下１×ＳＳＣ緩衝液１リットルで５分間洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣ緩衝液１リットルで２分間洗浄し、室温で乾燥させた。蛍光の測定条件は、実施例１における自己蛍光の測定条件と同様にした。

ヌクレオチド配列が類似しており、識別が困難な２種のプローブ生体分子を固定化させたプラスチック基質における特異性を、下記表６に示す。ここで特異性は、下記式によって与えられる。
特異性＝（プローブＡ１と反応した標的Ａ１の蛍光シグナル）／（プローブＡ１と反応した標的Ａ２の蛍光シグナル）
従来の湿式法で製造した市販のエポキシド修飾ガラス基質を、対照として用いた。

表６に示す通り、プラズマパルスサイクルの増大に伴い、ヌクレオチド配列が類似しており、識別が困難な類似プローブ生体分子を固定化させたプラスチック基質における検出特異性が増加した。

実施例７
・特異性の評価
プローブ生体分子Ｂ、ＣおよびＤ（各々ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を固定化させた、比較的良好な特異性を有する本発明のプラスチック基質における検出特異性を、実施例６と同様にして評価した。本実施例７で用いたプラスチック基質は、プラズマパルスサイクルを３秒とした以外、実施例６と同様に製造した。従来のエポキシド修飾ガラス基質を、対照として用いた。

特異性の結果を下記表７に示す。表７に示す通り、本発明のプラスチック基質における特異性は、従来のガラス基質におけるそれの約２倍高かった。特に、低濃度の標的生体分子に対しては、本発明のプラスチック基質は、従来のガラス基質に比して遥かに高い特異性を示した。

実施例８
・特異性の評価
表面修飾モノマーとしてオクタナールを用い、パルスサイクルを０．５秒とした以外は実施例６と同様にして、アルデヒド基で表面修飾したプラスチック基質を製造した。
対照として、従来のアルデヒド修飾ガラス基質およびアルデヒド修飾プラスチック基質（湿式法で製造、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）を用いた。

アルデヒドを還元するため、アルデヒド修飾基質を０．６２５ｇのＮａＢＨ_４を１２０ｍＬの１００％ＥｔＯＨ＋３７５ｍＬの１×ＰＢＳに溶解した溶液中で１０分間インキュベートした以外は実施例６と同様にして、本発明のアルデヒド修飾プラスチック基質および２種の対照基質に、プローブ生体分子Ｅ、Ｆ、ＧおよびＦ１（各々ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を固定化させた。

特異性の結果を下記表８に示す。表８に示す通り、本発明のプラスチック基質における特異性は、従来のガラス基質におけるそれと同等であり、且つ従来のプラスチック基質に比して遥かに高かった。

標的Ｆに対する特異性（プローブＦと反応した標的Ｆの蛍光シグナルを、プローブＦ１と反応した標的Ｆの蛍光シグナルで除することにより求められる）は、全体に低かった。これは、ヌクレオチド配列が類似しているプローブＦとプローブＦ１の識別が困難なためである。

実施例９
・特異性の評価
表面修飾モノマーとして３−メトキシプロピルアミンを用い、パルスサイクルを５秒とした以外は実施例６と同様にして、アミノ基で表面修飾したプラスチック基質を製造した。対照として、従来のアミノ修飾プラスチック基質（湿式法で製造、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）を用いた。

ＰＣＲ産物をプローブ生体分子として用い、反応温度を８０℃とした以外は実施例６と同様にして、本発明のアルデヒド修飾プラスチック基質および２種の対照基質に、プローブ生体分子Ｈ、ＩおよびＪ（各々ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を固定化させた。用いたプローブ生体分子の特性のため、熱変性が必要であった。この目的で、プローブ生体分子を１００℃の蒸留水で２分間処理した。

特異性の結果を下記表９に示す。表９に示す通り、本発明のプラスチック基質における特異性は、湿式法で製造された従来のプラスチック基質におけるそれと同等であった。

本発明の実施例においてプラズマ処理に用いるプラズマ発生装置を示す略図である。 本発明のプラスチック基質の製造方法における、プラズマ処理およびアリルグリシジルエーテル（表面修飾モノマーとして使用）による表面修飾を示す略図である。 本発明のプラスチック基質を示す図である。 微小流体構造を含む本発明のプラスチック基質を示す略図である。 本発明のプラスチック基質に固定化したプローブ生体分子と、標的生体分子の間のプローブ−標的ハイブリダイゼーションについての蛍光検出の結果を示す図である。

［配列番号１］プローブ
［配列番号２］プローブ
［配列番号３］プローブ
［配列番号４］プローブ
［配列番号５］プローブ
［配列番号６］プローブ
［配列番号７］プローブ
［配列番号８］プローブ
［配列番号９］プローブ
［配列番号１０］プローブ
［配列番号１１］プローブ
［配列番号１２］プローブ

Claims (20)

1. プラスチック基質の製造方法であって、
   （ａ）５０μｍ×５０μｍ以下の条件下で、Ｒ_ａ３ｎｍ未満またはＲ_ｑ４ｎｍ未満の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）表面粗さを有するプラスチック基質を調製する工程；
   （ｂ）前記プラスチック基質をプラズマで処理する工程；および
   （ｃ）前記プラスチック基質を表面修飾モノマーで処理する工程
   を含む製造方法。
2. 前記工程（ｂ）および（ｃ）を同時に行うことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
3. 前記プラズマは、アルゴンプラズマであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
4. 前記プラズマは、エネルギー密度１０^８Ｊ／Ｋｇ以下の連続プラズマまたはパルスプラズマであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
5. 前記工程（ｂ）を１０分以下行うことを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
6. 前記プラズマの周波数は、マイクロ波周波数である２．４５ＧＨｚまたはラジオ周波数である１３．５６ＭＨｚであることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
7. 前記プラスチック基質は、ポリスチレン（ＰＳ）、シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）およびポリカーボネート（ＰＣ）よりなる群から選択される透明樹脂、またはポリプロピレン（ＰＰ）およびポリエチレン（ＰＥ）よりなる群から選択される半透明樹脂から製造されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
8. 前記表面修飾モノマーは、エポキシ基および炭素−炭素二重結合を有するアリルグリシジルエーテルおよびメタクリル酸グリシジルよりなる群から選択され、前記プラスチック基質は、前記エポキシ基を用いて表面修飾されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
9. 前記表面修飾モノマーは、アルデヒド基を有し沸点が８０℃以上であるヘキサナール、オクタナールおよびノナナールよりなる群から選択され、前記プラスチック基質は、前記アルデヒド基を用いて表面修飾されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
10. 前記表面修飾モノマーは、１級アミノ基および炭素−炭素二重結合を有するアリルアミン、または１級アミノ基を有するエーテル化合物である３−メトキシプロピルアミンであり、前記プラスチック基質は、前記アミノ基を用いて表面修飾されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
11. 前記プラスチック基質中に微小流体構造を形成する工程を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
12. 原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）表面粗さが、５０μｍ×５０μｍ以下の条件下でＲ_ａ３ｎｍ未満またはＲ_ｑ４ｎｍ未満であり、プラズマおよび表面修飾モノマーで表面処理されたプラスチック基質。
13. 前記プラズマは、アルゴンプラズマであることを特徴とする請求項１２に記載のプラスチック基質。
14. 前記プラズマは、エネルギー密度１０^８Ｊ／Ｋｇ以下の連続プラズマまたはパルスプラズマであることを特徴とする請求項１２に記載のプラスチック基質。
15. 前記プラズマによる処理を１０分以下行うことを特徴とする請求項１４に記載のプラスチック基質。
16. 前記プラズマの周波数は、マイクロ波周波数である２．４５ＧＨｚまたはラジオ周波数である１３．５６ＭＨｚであることを特徴とする請求項１２に記載のプラスチック基質。
17. ポリスチレン（ＰＳ）、シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）およびポリカーボネート（ＰＣ）よりなる群から選択される透明樹脂、またはポリプロピレン（ＰＰ）およびポリエチレン（ＰＥ）よりなる群から選択される半透明樹脂から製造されることを特徴とする請求項１２に記載のプラスチック基質。
18. 前記表面修飾モノマーは、エポキシ基および炭素−炭素二重結合を有するアリルグリシジルエーテルおよびメタクリル酸グリシジルよりなる群から選択され、前記プラスチック基質は、前記エポキシ基を用いて表面修飾されることを特徴とする請求項１２に記載のプラスチック基質。
19. 前記表面修飾モノマーは、アルデヒド基を有し沸点が８０℃以上であるヘキサナール、オクタナールおよびノナナールよりなる群から選択され、前記プラスチック基質は、前記アルデヒド基を用いて表面修飾されることを特徴とする請求項１２に記載のプラスチック基質。
20. 前記表面修飾モノマーは、１級アミノ基および炭素−炭素二重結合を有するアリルアミン、または１級アミノ基を有するエーテル化合物である３−メトキシプロピルアミンであり、前記プラスチック基質は、前記アミノ基を用いて表面修飾されることを特徴とする請求項１２に記載のプラスチック基質。

Images