JP2009296926A - 高活性カタラーゼ産生微生物及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】精製カタラーゼタンパク質1mg当たり200,000〜300,000 U/mgタンパク質の過酸化水素分解活性を有するカタラーゼ、および該カタラーゼを生産するサイクロバクター属菌。さらに、サブユニットからなるカタラーゼタンパク質をコードするDNA。
【選択図】なし
Description
[1] 精製カタラーゼタンパク質1mg当たり200,000〜300,000 Uの過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを生産する、サイクロバクター属菌。
このサイクロバクター属菌の好適な例は、サイクロバクター・エスピーT-3株(受託番号FERM P-21525)又はその変異株である。
[2] 上記[1]のサイクロバクター属菌由来の、前記カタラーゼを含有する細胞抽出液。
[3] 以下の(a)又は(b)のタンパク質であるカタラーゼサブユニットから構成されるカタラーゼ。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質
このカタラーゼは、精製カタラーゼタンパク質1mg当たり200,000〜300,000 Uの過酸化水素分解活性を有することが好ましい。
[4] 以下の(a)〜(d)のいずれかのカタラーゼサブユニットタンパク質をコードするDNA。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b) 配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質をコードするDNA
(c) 配列番号1に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号1に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質をコードするDNA
[5] 上記[4]のDNAを含む組換えベクター。
[6] 組換え発現ベクターである、上記[5]の組換えベクター。
[7] 上記[4]のDNA、又は上記[6]の組換えベクターを含む形質転換細胞。
[8] 上記[1]のサイクロバクター属菌、上記[2]の細胞抽出液、上記[3]のカタラーゼ、又は上記[7]の形質転換細胞を用いて、過酸化水素を含む液体を処理することを含む、過酸化水素の分解処理方法。
[9] 上記[1]のサイクロバクター属菌又は上記[7]の形質転換細胞を培養し、カタラーゼを生産させることを含む、カタラーゼの製造方法。
1.本発明に係るサイクロバクター属菌
本発明は、高い過酸化水素分解活性を示すサイクロバクター属(Psychrobacter)の細菌(サイクロバクター属菌)に関する。
グラム染色:陰性
芽胞:無し
運動性:無し
菌形:桿菌
色調:白
形:円形
表面:平滑
主要なイソプレノイドキノン:ユビキノン-8 (Q-8)
DNAのG+C含量(mol%):44.6%
オキシダーゼ試験:陽性
カタラーゼ試験:陽性
尿素分解:弱陽性
ONPG試験:陰性
硫化水素産生:陽性
メチルレッド試験:陽性
VP試験:陰性
インドール試験:陰性
フェニルアラニンのデアミナーゼ試験:陰性
硝酸塩の還元:弱陽性
Na+要求性:陰性
デンプン分解:陰性
ゼラチン分解:陰性
カゼイン分解:陰性
アルギン酸分解:陰性
エスクリン分解:陰性
Tween 20の分解:陽性
Tween 40の分解:陽性
Tween 60の分解:陽性
Tween 80の分解:陽性
-1℃:+
4℃:+
30℃:+
40℃:−
以下の基質から酸を産生する:
L-アラビノース、D-マンノース、メリビオース、ガラクトース、ラムノース、ラクトース、セロビオース
以下の基質から酸を産生しない:
フルクトース、マルトース、シュークロース、ラフィノース、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、グリセロール。
カゼインペプトン 8 g
酵母エキス 3 g
塩化ナトリウム 5 g
コハク酸ナトリウム 5 g
蒸留水 1 L
(pH 7.0)
本発明のサイクロバクター属菌(特に好ましくは、サイクロバクター・エスピーT-3株)は、カタラーゼを生産し、通常はそれを菌体内に蓄積する。本発明のサイクロバクター属菌を培養し、その培養物に超音波処理やフレンチプレス等の物理的処理又は化学的処理を施すことにより培養物中の菌体を破壊して破砕液とし、さらに必要に応じて、その破砕液から未破壊の菌体を遠心分離等により取り除くことにより、細胞抽出液を調製することができる。細胞抽出液は、無細胞抽出液とも呼ばれる。本発明に係るサイクロバクター属菌から調製した細胞抽出液(サイクロバクター属菌由来の細胞抽出液)は、比活性(ここでは、菌体タンパク質1mg当たりの過酸化水素分解活性)及び総カタラーゼ活性値が非常に高い。サイクロバクター属菌由来の細胞抽出液には、好ましくは、このサイクロバクター属菌が生産した高活性のカタラーゼ(サイクロバクター属菌由来カタラーゼ)が大量に含まれる。本発明はこのようなカタラーゼにも関する。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個(好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜6個)のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b) 配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個(好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜6個)のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質をコードするDNA
(c) 配列番号1に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号1に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質をコードするDNA。
本発明に係るサイクロバクター属菌やそれに由来するカタラーゼは、高い過酸化水素分解活性を有することから、過酸化水素を分解する目的で各種用途に用いることができる。
北海道留萌市の食品加工工場から採取した工場排水から、過酸化水素含有培地での生育能および菌体からの細胞抽出液の過酸化水素分解活性を指標に、高い過酸化水素分解活性を有する細菌株を分離した。
実施例1で分離した細菌株(T-3株)は、常法に従って分析したところ、上述の菌学的性質を有していた。
サイクロバクター・エスピーT-3株、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、アエロモナス・ハイドロフィーラ(Aeromonas hydrophila)、アルカリゲネス・フェーカリス(Alcaligenes faecalis)、シュードモナス・フローレッセンス(Pseudomonas fluorescence)、大腸菌(Escherichia coli)、腸炎ビブリオ菌(Vibrio parahemolyticus)を、それぞれ対数期後期から定常期まで同じスケ−ルで培養し、遠心分離(10,000×g、15分)で集菌した。集菌後、加圧型細胞破壊装置(フレンチプレス)で菌体を破壊し、得られた菌体破壊液をさらに遠心分離(10,000×g、15分)することにより未破壊の菌体を取り除いた液を細胞抽出液とした。一方、30 mMの過酸化水素液を50 mMリン酸緩衝液(pH 7.0)中で調製し、この1 mlを1 cm 光透過の石英セルに入れ、反応基質として用いた。
ミクロコッカス・ルテウス 12,341 U/mg タンパク質
黄色ブドウ球菌 1,425 U/mg タンパク質
アエロモナス・ハイドロフィーラ 622 U/mg タンパク質
アルカリゲネス・フェーカリス 540 U/mg タンパク質
シュードモナス・フローレッセンス 290 U/mg タンパク質
大腸菌 44 U/mg タンパク質
腸炎ビブリオ菌 15 U/mg タンパク質
サイクロバクター・エスピーT-3株を培養培地(上記のPYS-3培地)中、27℃で24時間培養した。得られた2リットルの培養物を遠心分離(10,000×g、15分)により菌体を回収し、加圧型細胞破壊装置(フレンチプレス)で菌体を破壊し、得られた菌体破壊液をさらに遠心分離(10,000×g、15分)することにより未破壊の菌体を取り除いて得られた無細胞抽出液を細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィー(DEAE-Toyopaerl、東ソー)にかけ、溶出させたカタラーゼ画分を次に疎水性相互作用クロマトグラフィー(Phenyl Sepharose、GEヘルスケアーサイエンス)にかけて精製を行った。
サイクロバクター・エスピーT-3株は実施例4と同様の条件で培養した。得られた20リットルの培養物を遠心分離(10,000×g、15分)して80gの菌体を回収し、これをさらに加圧型細胞破壊装置(フレンチプレス)にかけて菌体を破壊し、得られた菌体破壊液をさらに遠心分離(10,000×g、15分)して未破壊の菌体を取り除いて細胞抽出液とした。この細胞抽出液を陰イオン交換樹脂(DEAE-Toyopearl)に一度かけたところ、カタラーゼ8.8 gを含む、167,000 U/mgタンパク質の過酸化水素分解活性を示す粗酵素標品を回収することができた。カタラーゼのこの活性は、牛肝臓カタラーゼの精製標品の約2倍に相当していた。この結果は、サイクロバクター・エスピーT-3株の細胞抽出物由来の酵素精製物が、非常に高いカタラーゼ含量及びカタラーゼ活性を有することを示していた。
Claims (11)
- 精製カタラーゼタンパク質1mg当たり200,000〜300,000 Uの過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを生産する、サイクロバクター属菌。
- サイクロバクター・エスピーT-3株(受託番号FERM P-21525)又はその変異株である、請求項1に記載のサイクロバクター属菌。
- 請求項1又は2に記載のサイクロバクター属菌由来の、前記カタラーゼを含有する細胞抽出液。
- 以下の(a)又は(b)のタンパク質であるカタラーゼサブユニットから構成されるカタラーゼ。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質 - 精製カタラーゼタンパク質1mg当たり200,000〜300,000 Uの過酸化水素分解活性を有する、請求項4に記載のカタラーゼ。
- 以下の(a)〜(d)のいずれかのカタラーゼサブユニットタンパク質をコードするDNA。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b) 配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質をコードするDNA
(c) 配列番号1に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号1に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質をコードするDNA - 請求項6に記載のDNAを含む組換えベクター。
- 組換え発現ベクターである、請求項7に記載の組換えベクター。
- 請求項6に記載のDNA、又は請求項8に記載の組換えベクターを含む形質転換細胞。
- 請求項1若しくは2に記載のサイクロバクター属菌、請求項3に記載の細胞抽出液、請求項4若しくは5に記載のカタラーゼ、又は請求項9に記載の形質転換細胞を用いて、過酸化水素を含む液体を処理することを含む、過酸化水素の分解処理方法。
- 請求項1に記載のサイクロバクター属菌又は請求項9に記載の形質転換細胞を培養し、カタラーゼを生産させることを含む、カタラーゼの製造方法。
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JPH05292996A (ja) * | 1992-04-16 | 1993-11-09 | Tokai Carbon Co Ltd | 微生物の汚染度検知具 |
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