JP2008541144A - レーザ走査型顕微鏡のピンホール開口およびピンホール位置を高い再現精度で調整するための装置および方法 - Google Patents

レーザ走査型顕微鏡のピンホール開口およびピンホール位置を高い再現精度で調整するための装置および方法 Download PDF

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Abstract

レーザ・スキャン顕微鏡(LSM)の1つのピンホールの位置および/またはサイズを調整するための装置であって、1つの別体の光源またはLSMレーザによってピンホールの照射が行われ、光軸を横切るピンホールの変位が、1つの受像器において最大輝度が生じるまで行われ、かつピンホール位置の検出が行われ、この検出が複数の交換可能な光学部品の付属データとともに記憶される。

Description

本発明は、レーザ走査型顕微鏡のピンホール開口およびピンホール位置を高い再現精度で調整するための装置および方法に関する。
2μm以上のピンホール・サイズの調整、およびピンホール位置の2μmの再現精度での調整を可能にする、レーザ走査型顕微鏡検査用のピンホールは既に知られている(DE...)。それにより、現在広く一般に用いられるLSMピンホールに対して、5倍のピンホール調整値が達成されるという。2μmの再現精度誤差は、そこに記載されるステッピング・モータ・スピンドル・ドライブおよびその発明による参照方法に起因して生じるものである。このステッピング・モータ・ドライブの解像度は、0.3μmである(ピッチ50μmの基準ねじ山、および1/8マイクロステップ動作のステッピング・モータ)。
サイズ2μmのピンホールは、ピンホール位置が約0.5μmの再現精度で調整できる場合には、有意に利用できる。
ピンホール位置の調整が2μmの再現精度誤差しかない場合は、小さなピンホール開口に当たる光により、かなりの口径食が発生することがある。
本発明の目的は、ピンホール位置の再現精度を大幅に、有利には0.5μm未満に改善することにある。
従来のスピンドル・ドライブによって直線運動の再現精度0.5μmを達成できるようにするには、一般には高解像度の位置測定システムが必要となるが、しかし、これは余りにも高価であり、またその測定ヘッドはピンホール装置にとっては大き過ぎるものとなっている。このため、測定システムなしで、0.5μmの再現精度でのピンホール位置の調整を達成することを可能にする解決策が求められている。
本発明は、ピンホール開口の意味のあるそれぞれの位置を、仮想「xyポインタ」により正確にマーキングすることにある。
この仮想ポインタの位置決定は、レーザ走査型顕微鏡に取り付けられる1つのCCDカメラによって行われるのが有利である。この仮想ポインタの、たとえばCCDチップの1つの角のところにX軸とY軸の原点を有する座標系に関する位置が、電子メモリに保存され、マーキングされたそれぞれのピンホール位置をいつでも任意の回数だけ0.5μmの再現精度で検索するために利用される。そのために、0.3μmの解像度をもつ複数のステッピング・モータ・ドライブが、1つの制御ループ内で動作され、この制御ループにより、CCDカメラによって確認されたピンホール開口の実際の位置が仮想ポインタと比較され、偏差が補正されるようになっている。
この提案の解決策はさらに、ピンホール開口を光学的に拡大してCCDカメラの高解像度の1つのチップ上に投影し、ピンホール開口の位置およびサイズを画像の評価によって決定し、その実際値を記憶されているピンホールの元の位置および元のサイズと比較し、高解像度のステッピング・モータ制御装置により、残留偏差が0.5μmとなるまで偏差を補正することにある。
もう1つの解決手段は、ピンホール上に集束されるレーザビームに類似して、1つのまたは複数の光ポインタを発生し、ピンホールからステッピング・モータ・ドライブおよび光電倍増管または受光器を利用して、それを捕捉することにある。
この場合は、ピンホール開口が、光ポインタの光の輝度が、したがってレーザ焦点の光の輝度も、最大となる点に位置することになる。
光電倍増管または受光器は、局所的な解像度をもたないフラットパネル検出器であるため、この解決策の場合は、ピンホール開口のサイズの決定および制御を断念しなければならない。しかし、それによって決定的な不都合がもたらされることはない。というのも、サイズ2μmから50μmまでの小さなピンホール開口の高い再現精度での調整が参照方法(参照は、ピンホールが正に開いており、光が光電倍増管に当たる場合に行われる)によって保証され、50μmから1,000μmまでの大きなピンホール開口の高い再現精度での調整が、高解像度のステッピング・モータ・ドライブによって保証されるからである。
補助光源を備える上述の各解決策の本質的な長所は、ピンホールの位置調整中に、レーザLをオフにすることができるため、試料Pが光負荷にさらされる必要がないことにある。
1.本発明による装置および本発明による方法
1.1 光学装置(図1、2および3)
マーキング工程のために、ピンホールは、倍率が10倍のレンズVOにより、約10×10mm大のCCDチップの面上に投影される。
PCまたはマイクロ・コントローラにより、このCCD受像面上のピンホール開口の輝度重心が計算され、そのxy座標が仮想矢印として記憶される。
XY座標系の原点としては、たとえばCCD面の左下角が利用される。マーキング工程のためには、ピンホール開口の適切な照明が実現されなければならない。照射は、3つのカラー・ダイオード(赤、緑、青)からなる1つの白色光LEDによって行われるのが有利であり、その結果、使用されるダイクロイック・ミラーの種類に関係なく、照射が保証されるようになる。マーキング工程のためには、有利には1つのIR−LED(900nm)をも使用することができる。その場合は、ダイクロイック・ミラーおよびフィルタが、IRを透過するように構成されるべきである。以下で説明する、CCD受像器を備える光学装置の例はすべて、レーザ・スキャン工程に影響を与えるものではなく、またその際に試料から発する光の損失をもたらすことも皆無である。
光路内に旋回されるダイクロイック・ビームスプリッタまたはその他の交換可能な光学部品のそれぞれごとに、最適ピンホール位置が1回だけ検出されて記憶され、通常のLSM動作中に当該構成素子が光路内に旋回される際に、この位置が再びもたらされるようになっている。
この最適ピンホール位置は、その都度、マーキング工程の際にPMT(光電倍増管)における輝度測定によって決定される。
LEDによるピンホール開口の表側の照明(図1)
レーザ・スキャン顕微鏡は、試料Pを照射する1つの照射レーザL、1つの対物レンズO、1つのピンホール・レンズPO、光軸に対して垂直に調整可能な1つのピンホールPH、これに後置される1つの光電倍増管PMT、励起光路と検出光路とを分離する1つのダイクロイック・ミラーSPにより、模式的に示されている。1つのサブ・カラー・スプリッタにより、第2の波長をもつ蛍光を同時に照射できるようになっている。
このレーザ走査型顕微鏡の1つの補助光学アーム内に配置された1つのLEDまたはハロゲンランプにより、1つのコリメータKOおよびダイクロニック・ミラーSPを介して、ピンホール開口の表側が照射される。光電倍増管PMTが、スペース上の理由から、マーキング工程においてはレーザ走査型顕微鏡の光路外に旋回され、ピンホールPHの後方に、1つの拡大レンズVOと1つのCCD面が配置されるのが有利である。この場合は、レーザ・スキャン工程において、LEDがオフにされる。
LEDによるピンホール開口の裏側の照明(図2)
光電倍増管PMTとピンホールPHとの間に配置される1つのLEDまたはハロゲンランプにより、1つのコンデンサKOを介して、ピンホールPHの裏側が、同様に3色またはIRで照射される。ピンホール開口は、少なくとも1つの補助ミラーSP1(ここでは2つのミラーSP1およびSP2)を介し、レーザ走査型顕微鏡内に配置された1つの光学アーム(レンズPO1およびVO)を経由してCCD上に投影される。レーザ走査型顕微鏡の光路内に配置される少なくとも1つの補助ミラーは、レーザ・スキャン工程のためには光路外に旋回可能であり、マーキング工程のためには光路内に精密に旋回可能であるように構成される。レーザ・スキャン工程においては、LEDがオフにされ光路外に旋回される。光電倍増管は、光路外へ旋回させる必要はない。図1、2において、ピンホール位置の調整のために、LEDの代わりにレーザおよびCCDを使用することも可能であるが、いずれにせよ試料には負荷がかかることになる。
この装置の長所は、マーキング工程においてダイクロイック・ミラーの誤差が検出される点にある。
レーザおよびリング・ミラーによる検出器ピンホールの照明(図3)
ピンホールの照明は、表側については、レーザと、レーザ走査型顕微鏡の内部のテレセントリック光線域に、この場合は対物レンズOとミラーSPとの間に配置された、1つのリング・ミラーRSによって行われ、このリング・ミラーは、ダイクロイック・ミラーSPのコーティングが施されていない周縁部領域で、レーザ光をピンホールPHに向かって反射するようになっている。光電倍増管は、マーキング工程においてはレーザ走査型顕微鏡の光路外に旋回される。リング・ミラーRSは、レーザ・スキャン工程において、レーザ光が光路内に旋回されたフィルタ(不図示)によって遮断され、フォト・マルチプライヤには到達し得ないため、光路外にリング・ミラーRSを旋回させる必要はない。
この装置においても、マーキング工程においてはダイクロイック・ミラーの誤差が同時に検出されるようになっている。
ピンホール開口のレーザ・マーキングおよび制御(図4および5)
PCまたはマイクロ・コントローラは、CCD信号を評価し、ピンホール開口の輝度重心を決定し、ピンホール開口のマーキングされるべき位置のxy座標を記憶する。CCDのピクセル・サイズは約6μmである。ここではCCDカメラの光学倍率が10倍であるので、再現精度に対する要求は0.5μmから5μmへと緩和される。
この方法によれば、ピンホール開口のサイズも、決定し制御することができる。ピンホール開口の重心に代わり、CCDチップ上に投影されたそれぞれのピンホール・エッジの位置が評価される。
ピンホール開口は、ここには簡略に円形として示されている。ピンホール開口が正方形または長方形である場合は、CCD上でその時々のbエッジ位置を容易に決定することができる。
ピンホール開口のマーキングされた位置を、高い再現精度で再び見つけ出すことができるようにするために、レーザ走査型顕微鏡は、ピンホール位置のマーキングのときと同様に調整される(LEDまたはミラーが光路内に旋回され、場合により光電倍増管が光路外に旋回される)。マイクロ・コントローラは、CCDチップ上のピンホール開口の実際の位置と、記憶されている仮想ポインタが同じxy座標をもつように、両方のステッピング・モータ・ドライブMおよびMを制御する。このときピンホール開口は、CCDチップ上にマーキングされた点を最大で0.5μm上回る偏差を有する位置になる。
ピンホール開口のサイズは、この方法に類似して、同様に0.5μmの再現精度で検出し調整することができる。
ピンホールの開口率および位置は、本発明による装置および本発明による方法により、任意の回数だけ、あらゆる地点において、0.5μmの再現精度で決定し調整することができる。しかし、いずれにせよ、標準器として利用されるCCDカメラは、長期的にもレーザ走査型顕微鏡の光路に対して位置変化が許されることはない。
LSMの例示的実施形態(図6)
図6には、カールツァイスLSM510用の、図2に示された本発明による装置の例示的実施形態が示されている。4つのピンホールの裏側が、光路内に旋回する、直列に接続された複数のLED、およびそれぞれにつき1つのコンデンサによって照射される。光路内に精密に旋回可能な1つの補助ミラーSP3により、ピンホールから来る光がCCDチップに偏向され、その信号が評価される。4つのピンホール全てのマーキングおよび調整のために、レーザ走査型顕微鏡において必要とされるCCDカメラが1台だけであること、および、メイン・ダイクロイック・ミラーに起因して生じるマーキング誤差についても検出されることが、有利である。
図7、8、9および10には、ピンホール位置の別の有利な調整方法に関する、解決策の様々な変形例が示されている。
図7においては、レーザビームと同じ位置を有するはずの1つの軸方向の光ポインタが、複数の補助光学素子によって発生される。
複数のステッピング・モータにより、光電倍増管が最大の光信号を検出するように、ピンホールの位置が調整される。この場合は、光ポインタが正確にピンホール開口に当たることになる。したがって、ピンホール位置は、レーザ・スキャン工程にとって最適な位置に調整される。
LEDによって照射される開口絞り板LBが、ピンホール平面に投影される。この開口絞り板のパターンが、光ポインタとして利用され、これが、ピンホール、光電倍増管、およびステッピング・モータ・ドライブを用いて捕捉される。
ピンホール位置の初回キャリブレーション、および、x座標とy座標の記憶は、レーザを用いた検索アルゴリズムによって行われる。開口絞り板は、LEDの焦点がレーザ焦点と一致するように、位置調整される。
キャリブレーションの後に、LSMによる測定時に、記憶されているピンホール位置に基づいて、ピンホール位置の調整が行われる。それに続き、LEDの焦点を基準として微細修正が行われるが、その際に、レーザがオフにされるので、試料には光の負荷がかからず、有利である。
図8においては、複数の補助素子により、レーザビームに対して傾斜した1つの光ポインタが発生され、これがもう1つの基準ピンホールRPHに当たる。
この傾斜姿勢の調整は、LSMの初回キャリブレーションの際に、ピンホールを検索アルゴリズムによりレーザ焦点に合わせて調整し、続いて、LED焦点が基準ピンホールを通り抜け、その後方に位置する光検出器PEが最大輝度を有するように、開口絞り板を位置調整することによって行われる。
キャリブレーションの後に、LSMによる測定の際に、図7に基づき説明したように、記憶されているピンホール位置に基づくピンホール位置の調整、およびレーザ焦点を用いた微細修正が行われる。基準ピンホールには、波長900nmのLEDを使用することが可能であり、有利である。
この波長では、PMTが不感となるため、LSMを用いた測定の前または測定中にも、光検出器における高い量子効率でIR−LEDによるピンホール位置の制御を行うことができる。
ピンホール位置の調整は、基準ピンホールを介して行われる。ピンホールと基準ピンホールは、機械的に互いに連結される。光電倍増管の代わりに、検出器として別体の光検出器PEが使用されるのが有利である。
開口絞り板は、基準ピンホールの平面内に投影される。
PMTおよびレーザは、この調整には不要である。
図9においては、1つの絞りDPのピンホール平面内への光学投影により、1×1mm大のピンホール調整域に100×100=10個の光ポインタからなる1つの面積基準が作成される。ピンホールおよび光電倍増管は、高解像度のステッピング・モータ・ドライブにより、任意のどの光ポインタをも高い再現精度で捕捉し、それから出発して、任意のピンホール位置を10×10μm大の1つの正方形内で調整することができる。この絞りは、複数の貫通穴(直径5μm、間隔10μm)がマトリックス状に設けられた、サイズ1×1mmの1つのクロム・マスクまたはクロス・グリッドである。
ピンホール平面内の各絞り焦点の位置は、LSMの初回キャリブレーションの際に、検索アルゴリズムにより、レーザ焦点も、また(たとえば平均的な)絞りの焦点も、ピンホール(座標原点)を通り抜けるように、絞りが位置調整されることによって、決定される。それ以外のピンホール位置はすべて、この座標原点および焦点マトリックスのその他の光学ピクセルを基準として決定され記憶される。
LSMによる測定の際には、ピンホール位置の調整が、記憶されている絞り焦点および各焦点間のモータ駆動による補間によって行われる。このときレーザがオフであるが有利である。
図9の絞りの代わりに、1つのマイクロレンズ・アレイを使用することもできる。それぞれのマイクロレンズの直径は、一般に50μmである。この場合は、サイズ5×5mm大の1つのアレイによって、やはり100×100=10個の光ポインタが発生されるが、これらの光ポインタは、倍率1:10で光学的に縮小されてピンホール平面内に投影されなければならない。
図10においては、ピンホール平面内に、複数のマイクロレンズによって構成される、やはり複数の光ポインタからなるマトリックスである、1つの四重極素子QPの回折パターンが発生される。1つのハニカム型の瞳PWにより、干渉を起こすフレネル回折が防止される。
原理:四重極素子は、4つのマイクロレンズによって構成され、それぞれの焦点に、フレネル回折を回避するためにハニカム型の瞳が配置される。ピンホール平面内の四重極素子の回折パターンは、複数の光ポインタからなるマトリックスであり、これが基準面として利用される。ピンホールは、高解像度のステッピング・モータ・ドライブおよび光電倍増管により、任意のどの光ポインタに対しても、高い再現精度で調整することができる。
次の各パラメータ
f=150mm 投影レンズLの焦点距離
d= 10mm 四重極素子の各マイクロレンズ間の距離
λ=630nm 赤色レーザ・ダイオード
および次の回折式
g=λ・f/d
から、
g=9.5μm
のピンホールの、ピンホール平面内のマトリックス状の各光ポインタ間の距離が求められ、光電倍増管は、高解像度のステッピング・モータ・ドライブにより、任意のどの光ポインタをも高い再現精度で捕捉することが可能であり、それから出発して、任意のピンホール位置を9.5×9.5μm大の正方形内で調整することができる。
次に、もう1つの非常に簡単なピンホール位置調整方法について追記する。この提案は、レーザ走査型顕微鏡の平行な光路中に、1つのレトロ・フォイル(図11)または1つのトリプル・プリズム(図12)を、この光路の内外に押し出せるように配置することにある。光路内に押し出されたこの光学素子により、レーザ焦点がピンホール平面内に投影され、さらに、位置調整の際に、試料にレーザ光の負荷がかかり、フェーディングが生じるのを防止している。光路外に押し出された光学素子により、試料は自由に観察できる状態に切り換えられる。押し出し機構に対しては、レトロ・フォイルまたはトリプル・プリズムの角度が不変なため、特段の要求が課せられることはない。今や、最小の面積で開口しているに過ぎないピンホール開口を、レーザ光が正確にこのピンホール開口を通り抜け、光検出器により最大のレーザ光が受光されるまで、位置調整することが可能である。ピンホール開口の開口率が最小であるため、光検出器が眩惑されることはない。1回だけのアライメント調整工程において値を求めることができるレーザ焦点(最大偏差値2μm)の付近に、ピンホール開口をモータ駆動によって事前調整することにより、約5μm×5μm大の領域内でのピンホール系のxyドライブの小さなスキャン運動による焦点の自動検索が容易となる。
1.利点
−本方法により、ピンホール開口をレーザ焦点に対し0.3μmよりも良好に位置合わせすることができる。
−押し込まれた光学素子(レトロ・フォイルまたはトリプル・プリズム)により、試料は、レーザ負荷を受けず、フェードし得ないので、試料調査中にもピンホールの位置調整を実行することができる。
−たとえばサイズ3μmの小さなピンホール開口を、位置測定システムを使用しなくても、0.3μmに正確に位置調整することができる。
2.注意
−ピンホールにおけるこの位置調整のために、レーザ光の全輝度を利用できるようにするためには、光路内に配置されるカラー・フィルタを可能な限りゼロとすること。
−もう1つの本発明の提案では、スプリット・ミラーおよびカラー・フィルタの切り換え時に、いかにしてレーザビームの角度誤差を回避できるかが記述される。
−(ミラーは3点接触方式)。
−この方法は、図3に示されるリング・ミラー法に似ているが、位置調整の際に、試料にレーザ光による負荷がかかり、リング・ミラーの光軸に対して垂直な正確な位置合わせを前提とする。
ピンホール開口の位置マーキングおよび高い再現精度での調整のための、CCDおよびLEDを備えるレーザ走査型顕微鏡(照明はピンホールの表側)を示す図。 ピンホール開口の位置マーキングおよび高い再現精度での調整のための、CCDおよびLEDを備えるレーザ走査型顕微鏡(照明はピンホールの裏側)を示す図。 ピンホール開口の位置マーキングおよび高い再現精度での調整のための、CCDおよびリング・ミラーを具備したレーザ走査型顕微鏡を示す図。 ピンホール開口の位置決定方法を示す図。 ピンホール開口の位置制御方法を示す図。 図2に示すLSM−510用の、各1つのLED、および各1つのコンデンサ、および1つのCCD評価カメラによって4つのピンホールが裏側から照明される、本発明による例示的実施形態を示す図。 ピンホール位置の高い再現精度での調整のための、軸方向の光ポインタを備えるレーザ走査型顕微鏡を示す図。 ピンホール位置の高い再現精度での調整のための、基準ピンホールおよび傾斜した光ポインタを備えるレーザ走査型顕微鏡を示す図。 ピンホール位置の高い再現精度での調整のための、開口絞りを備えるレーザ走査型顕微鏡を示す図。 ピンホール位置の高い再現精度での調整のための、四重極素子を備えるレーザ走査型顕微鏡を示す図(2つの光路のみ図示)。 レーザ焦点のくびれ部にピンホールを位置調整するための、光路内に押し込むことができるレトロ・フォイルを備える、レーザ走査型顕微鏡。 レーザ焦点のくびれ部にピンホールを位置調整するための、光路内に押し込むことができるトリプル・プリズムを備える、レーザ走査型顕微鏡。

Claims (21)

  1. レーザ・スキャン顕微鏡(LSM)のピンホールの位置および/またはサイズを調整するための装置であって、
    1つの別体の光源またはLSMレーザによって該ピンホールの照射が行われ、光軸を横切るピンホールの変位が、1つの受像器に最大強度が生じるまで行われる、装置。
  2. 前記ピンホール位置の検出が、1つの受像器によって行われ、該ピンホール位置が、複数の交換可能な光学素子に属するデータとともに記憶される、請求項1に記載の装置。
  3. 前記受像器が局所的な解像度をもつ、請求項1または2に記載の装置。
  4. 前記ピンホールを通過する光線の照射重心が検出される、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の装置。
  5. ピンホール開口が光学的に拡大されて前記局所的な解像度をもつ受像器に投影される、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の装置。
  6. 少なくとも1つの開口絞り板の前記ピンホール上への投影が行われる、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の装置。
  7. 前記ピンホールの照射が検出光の光方向に行われる、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の装置。
  8. 1つの別体の検出器が照射方向で前記ピンホールの後側に設けられる、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の装置。
  9. 1つの別体の検出器が、照射方向で前記ピンホールの後側に設けられ、また該ピンホールと強固に結合された1つの基準ピンホール(図8)が設けられる、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の装置。
  10. 前記LSM検出器が検出のために利用される、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の装置。
  11. 前記ピンホールの照射が前記検出器側から行われる、請求項1乃至10のいずれか1項に記載の装置。
  12. 複数の個別光源の前記ピンホールに向かう光を、前記局所的な解像度をもつ受像器に向けて伝送するための、旋回可能な少なくとも1つの補助ミラーがLSM光路内に設けられる、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の装置。
  13. 1つの光ポインタまたは1つの開口絞り板が前記ピンホール平面内に投影される、請求項1乃至12のいずれか1項に記載の装置。
  14. 複数の穴からなる1つの穴あきマスクが前記ピンホール平面内に投影される、請求項1乃至13のいずれか1項に記載の装置。
  15. 1つのマイクロレンズ・アレイが前記開口絞り板平面、ピンホール平面に投影される、請求項1乃至14のいずれか1項に記載の装置。
  16. 前記ピンホール照射が多色またはIRで行われる、請求項1乃至15のいずれか1項に記載の装置。
  17. 前記ピンホールの照射が1つのLSM照射レーザによって行われる、請求項1乃至16のいずれか1項に記載の装置。
  18. 1つの平行な光路内の1つのリフレクタにより、前記ピンホール平面内に1つの照射焦点が発生される、請求項1乃至17のいずれか1項に記載の装置。
  19. 試料に向かって1つのリング・ミラーが設けられ、このリング・ミラーが前記照射光の一部を前記ピンホールに向けて反射する、請求項1乃至18のいずれか1項に記載の装置。
  20. 1つのレトロ・フォイルまたは1つのトリプル・プリズムが、前記光路内に押し出し可能または旋回可能である、請求項1乃至19のいずれか1項に記載の装置。
  21. 請求項1乃至20の少なくともいずれか1項に記載のレーザ・スキャン顕微鏡の動作方法。
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