EP1877842A2 - Einrichtung und verfahren zur reproduzierbaren einstellung der pinholeöffnung und pinholelage in laserscanmikroskopen - Google Patents

Einrichtung und verfahren zur reproduzierbaren einstellung der pinholeöffnung und pinholelage in laserscanmikroskopen

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Publication number
EP1877842A2
EP1877842A2 EP06753460A EP06753460A EP1877842A2 EP 1877842 A2 EP1877842 A2 EP 1877842A2 EP 06753460 A EP06753460 A EP 06753460A EP 06753460 A EP06753460 A EP 06753460A EP 1877842 A2 EP1877842 A2 EP 1877842A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
pinhole
illumination
light
laser
lsm
Prior art date
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Ceased
Application number
EP06753460A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heinrich Klose
Karlheinz Bartzke
Jürgen HEISE
Ralf Wolleschensky
Matthias Burkhardt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jenoptik AG
Original Assignee
Carl Zeiss Jena GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Jena GmbH filed Critical Carl Zeiss Jena GmbH
Priority to EP20090008144 priority Critical patent/EP2098892A1/de
Publication of EP1877842A2 publication Critical patent/EP1877842A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes

Definitions

  • Adjustment of the pinhole size from 2 ⁇ m and the setting of the pinhole position with a reproducibility of 2 ⁇ m should allow. This should improve the Pinholeeinstellmoi compared to currently standard LSM pinhole by a factor of 5 can be achieved.
  • the reproducibility error of 2 ⁇ m is caused by the described stepper motor spindle drive and the inventive referencing method.
  • the resolution of the stepper motor drive is 0.3 ⁇ m (differential thread with 50 ⁇ m pitch and stepper motor in 1/8-microstep operation).
  • a pinhole of 2 ⁇ m size can be used meaningfully if the pinhole position can be adjusted with a reproducibility of about 0.5 ⁇ m.
  • the setting of the pinhole position has a reproducibility error of only 2 ⁇ m, the light striking the small pinhole opening can be significantly vignetted.
  • the invention is therefore based on the object, the reproducibility of the pinhole significantly, advantageously to less than 0.5 microns to improve.
  • the invention consists in accurately marking significant positions of the pinhole opening by virtual "xy" hands.
  • the determination of the virtual pointer is advantageously carried out by a CCD camera to be mounted on the laser scanning microscope.
  • the virtual pointer based on a coordinate system having, for example, a zero point for an X and Y axis at a corner of the CCD chip, is stored in an electronic memory and serves each marked pinhole position at any time and any number of times with a reproducibility of To find 0.5 ⁇ m.
  • the stepper motor drives, the resolution of 0.3 microns operated, operated in a control loop, which compares the determined by the CCD camera current position of Pinholeöffhung with the virtual pointer and corrects deviations.
  • the proposed solution further consists of optically magnifying the pinhole opening onto a high-resolution chip of a CCD camera, determining the position and size of the pinhole opening by image evaluation, comparing the current values with the stored original position and original size of the pinhole and deviations by a high-resolution Stepper motor control to correct to a residual deviation of 0.5 microns.
  • Another solution is to generate one or more light pointers analogous to the focused on the pinhole laser beam and capture from the pinhole using the stepper motor drives and the Photomulitpliers or a light receiver. Then the Pinholeöffhung is located at the point of maximum light intensity of the light pointer and thus the laser focus.
  • the pinhole is imaged with a tenfold magnifying optic VO on the approximately 10x 10 mm 2 area of the CCD chip.
  • a PC or ⁇ -controller calculates the optical center of gravity of the pinhole opening on the CCD receiver surface, whose xy coordinates are stored as a virtual arrow.
  • the zero point of the X / Y coordinate system for example, is the lower left corner of the CCD area.
  • a suitable illumination of the pinhole opening is to be realized.
  • a lighting via a white light LED which consists of three colored diodes (red, green, blue), so that a lighting is guaranteed regardless of the type of dichrotic mirror used.
  • an IR LED (900nm) can be used for the marking process.
  • the dichroic mirrors and filters should then be IR transmissive. All CCD receiver optical arrangement examples described below do not affect the laser scanning process and cause no loss in the light exiting from the sample.
  • Components is once the optimal pinhole position recorded and stored and the
  • the optimum pinhole position is determined by intensity measurement at the PMT
  • a laser scanning microscope is schematically illuminated by a sample P illuminating
  • Illumination laser L Illumination laser L, a lens O, a pinhole optic PO, a perpendicular to the optical
  • Axis adjustable pinhole PH which is followed by a photomultiplier PMT, a dichroic mirror SP for the separation of excitation and detection beam path shown.
  • An auxiliary color divider allows the simultaneous illumination of a second
  • the photomultiplier PMT is advantageous swung out of space for the sake of space during the marking process from the beam path of the laser scanning microscope and behind the pinhole PH magnifying optics VO and a CCD surface arranged. During laser scanning, the LED is then switched off.
  • the pinhole opening is imaged onto the CCD via at least one additional mirror SP1 (here two mirrors SP1 and SP2 via an optical arm (optics PO1 and V0) arranged in the laser scanning microscope.)
  • the additional mirror arranged in the beam path of the laser scanning microscope can be swung out for the laser scanning process and for In the laser scanning process, the LED is switched off and swung out of the beam path.
  • the photomultiplier does not need to be swiveled out.
  • the laser and the CCD can be used instead of the LED, but under Load of the sample.
  • the advantage of the arrangement is that the errors of the dichroic mirror are detected during the marking process.
  • Illumination of the detector pinhole by the laser and a ring mirror (Fig. 3)
  • the pinhole is illuminated on the front by the laser and a ring mirror RS arranged in the laser scanning microscope in the telecentric beam area, here between the objective O and the mirror SP, in an uncoated border area of the dichroic mirror SP reflects the laser light in the direction of the pinhole PH.
  • the photomultiplier is swung out of the beam path of the laser scanning microscope during the marking process.
  • the ring mirror RS does not need to be swung out of the beam path during the laser scanning process, because the laser light is blocked by a pivotable filter (not shown) and can not reach the photomultiplier.
  • a PC or ⁇ controller evaluates the CCD signals, determines the optical center of gravity of the pinhole opening and stores the xy coordinates of the position to be marked
  • the pixel size of the CCD is approx. 6 ⁇ m. Due to the tenfold optical magnification of the CCD camera, the reproducibility requirement is reduced from 0.5 ⁇ m to 5 ⁇ m.
  • the size of the Pinholeöffhung can be determined and controlled by this method. Instead of the center of gravity of the Pinholeöffhung the position of the Pinholekanten shown on the CCD chip is evaluated.
  • the Pinholeöffhung is shown here schematically as a circle. If it is square or rectangular, the respective b edge position on the CCD can be easily determined.
  • the laser scanning microscope is set as in the marking of the pinhole position (LED or mirror swiveled in, photomultiplier possibly swung out).
  • the ⁇ -controller controls the two stepper motor drives M x and M y so that the current position of Pinholeöffhung on the CCD chip and the stored virtual pointer have the same xy coordinates.
  • the Pinholeöffhung is now with a deviation of at most 0.5 microns above the point marked on the CCD chip.
  • the size of the Pinholeöffhung can be analogous to this method also detect and adjust with a reproducibility of 0.5 microns.
  • Opening and position of the pinhole can be determined and adjusted as often as desired and at any point with a reproducibility of 0.5 .mu.m with the inventive arrangement and the method according to the invention.
  • the CCD serving as a normal may not undergo long-term changes in position to the beam path of the laser scanning microscope.
  • Figure 6 shows an exemplary embodiment of the arrangement according to the invention according to Figure 2 for a ZEISS LSM 510.
  • the four pinholes are illuminated on the back by swiveling and serially switched LEDs and one condenser each.
  • a precisely collapsible additional mirror SP3 redirects the light coming from the pinhole to the CCD chip whose signals are being evaluated. It is advantageous that for the marking and the setting of all four pinholes only a CCD camera on the laser scanning microscope is needed and that also detected by the dichroic mirror primary mark errors are detected.
  • the pinhole is controlled by the stepper motors in its position so that the
  • Photomultiplier detected a maximum light signal. Then the light pointer hits the Pinholeöfmung exactly. The pinhole position is thus optimally set for the laser scanning process.
  • a pinhole LB illuminated by the LED is imaged in the pinhole plane.
  • the image of the pinhole serves as an optical pointer, by means of pinhole, photomultiplier and
  • Stepper motor drives is captured.
  • the initial calibration of the pinhole positions and storage of the x- and y-coordinates is done by search algorithms with the laser.
  • the pinhole is adjusted so that the LED
  • the pinhole positions are adjusted using the stored pinhole positions.
  • a subsequent fine correction takes place after the LED focus, wherein advantageously the sample is not loaded with the light, because the laser is switched off.
  • additional elements create a laser pointer with an oblique light pointer, which hits an additional reference pinhole RPH.
  • the skew is set at the initial calibration of the LSM by the search pinhole on the laser focus is set and then the pinhole is adjusted so that the LED focus passes through the reference pinhole and behind it photoreceptor PE has maximum intensity.
  • Wavelength can be used.
  • the PMT is insensitive at this wavelength, it can be used before - or during
  • the pinhole position is set via the reference pinhole. Pinhole and reference pinhole are mechanically coupled together.
  • a separate photoreceiver PE is used as the detector.
  • the pinhole is imaged in the plane of the reference pinhole. The PMT and the laser are not needed for the adjustment.
  • Pinhole and Photomultip lier can catch any light pointer with high reproducibility by means of the high-resolution stepper motor drives and set therefrom arbitrary Pinholelagen in a square of lOxlO ⁇ m.
  • the diaphragm is a matrix mask of holes (5 ⁇ m diameter, 10 ⁇ m distance) interspersed chromium mask or a cross lattice of Ix lmm size.
  • the loading of the diaphragm jaw in the pinhole plane is determined by first-time calibration of the LSM by search algorithms by adjusting the diaphragm so that both the laser focus and a focus of the diaphragm (e.g., the middle) pass through the pinhole (origin of origin). All further pinholed layers are determined and stored based on this coordinate origin and the other optical pixels of the focus matrix.
  • the pinhole position is set by adjusting the stored diaphragm focus and motor interpolation between the foci.
  • the laser is advantageously turned off.
  • the diffraction pattern of a quadrupole element QP consisting of microlenses is formed in the pinhole plane, which also represents a matrix of optical pointers.
  • a honeycomb pupil PW prevents annoying Fresnel diffraction.
  • the quadrupole element consists of 4 microlenses, in their focal points for
  • the Diffraction image of the quadrupole element in the pinhole plane is a matrix optical pointer that serves as a surface scale.
  • the pinhole can be reproducibly adjusted to any optical pointer by means of the high-resolution stepper motor drives and the photomultiplier.
  • Pinhole and photomultipliers can capture any light pointer with high reproducibility by means of the high-resolution stepping motor drives and set arbitrary pinhole positions in a square of 9,5x9,5 ⁇ m.
  • the proposal consists in the parallel beam path of Laserscanmikroskopes a retrofilm ( Figure 11) or a triple prism ( Figure 12) in and out of the beam path slidably.
  • optical element of the laser focus is imaged in the Pinholeebene and additionally prevents the sample is loaded during adjustment by laser light and faded.
  • the optical element pushed out of the beam path releases the sample for observation. Due to the angular invariance of retroflex or triple prism, no special requirements are placed on the sliding mechanism.
  • the only slightly opened Pinholeöffhung can now be adjusted so that the laser light passes through exactly and is received by the photoreceiver maximum.
  • the photoreceiver is only minimal because of the opened Pinholeöffhung not dazzled.
  • a motor pre-setting of the pinhole opening close to the laser focus (max 2 ⁇ m filing), whose values can be found in a one-time adjustment, facilitates the automatic search for the focus by small scanning movements of the xy-drives of the pinhole system in an area of about 5 ⁇ mx5 ⁇ m.
  • the pinhole opening can be aligned better than 0, 3 ⁇ m to the laser focus according to this method.
  • the pinhole adjustment can also be performed during a sample examination, because the sample does not undergo laser loading due to the inserted optical elements (retrofilm or triple prism) and can not fade.
  • the small Pinholeöffhungen of z. B. 3 ⁇ m size can be adjusted to 0.3 microns without measuring systems.

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Abstract

Vorrichtung zur Einstellung der Lage und/oder Größe eines Pinholes in einem Laser Scanning Mikroskop( LSM), wobei über eine separate Lichtquelle oder den LSM - Laser eine Beleuchtung des Pinholes erfolgt und eine Verschiebung des Pinholes quer zur optischen Achse erfolgt, bis ein Intensitätsmaximum auf einem Empfänger vorliegt und eine Erfassung der Pinholelage erfolgt und diese gemeinsam mit zu auswechselbaren optischen Komponenten gehörigen Daten abgespeichert wird.

Description

Einrichtung und Verfahren zur reproduzierbaren Einstellung der Pinholeöffnung und Pinholelage in Laserscanmikroskopen
Es wurde bereits ein Pinhole für die Laserscanmikroskopie vorgeschlagen (DE ), das die
Einstellung der Pinholegröße ab 2μm und die Einstellung der Pinholelage mit einer Reproduzierbarkeit von 2μm gestatten soll. Damit soll eine Verbesserung der Pinholeeinstellwerte gegenüber derzeit üblicher LSM-Pinhole um den Faktor 5 erzielt werden. Der Reproduzierbarkeitsfehler von 2μm wird durch den beschriebenen Schrittmotor- Spindelantrieb und das erfindungsgemäße Referenzierungsverfahren verursacht. Die Auflösung des Schrittmotorantriebes beträgt 0,3 μm (Differenzgewinde mit 50μm Steigung und Schrittmotor im 1/8-Mikroschrittbetrieb).
Ein Pinhole von 2μm Größe kann dann sinnvoll genutzt werden, wenn sich die Pinholelage mit einer Reproduzierbarkeit von etwa 0,5 μm einstellen läßt.
Weist die Einstellung der Pinholelage einen Reproduzierbarkeitsfehler von nur 2μm auf, kann das auf die kleine Pinholeöffnung treffende Licht erheblich vignettiert werden.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, die Reproduzierbarkeit der Pinholelage erheblich, vorteilhaft auf unter 0,5 μm, zu verbessern.
Um Reproduzierbarkeiten einer Linearbewegung von 0,5 μm durch herkömmliche Spindelantriebe erzielen zu können, werden im allgemeinen hochauflösende Wegmeßsysteme benötigt, die aber zu teuer und deren Meßköpfe für eine Pinholeeinrichtung zu groß sind. Es ist deshalb eine Lösung gesucht, die es gestattet, ohne Meßsysteme eine auf 0,5 μm reproduzierbare Einstellung der Pinholelage zu erzielen.
Die Erfindung besteht darin, signifikante Lagen der Pinholeöffnung durch virtuelle „xy- Zeiger" genau zu markieren.
Die Ermittlung der virtuellen Zeiger erfolgt vorteilhaft durch eine am Laserscanmikroskop anzubringende CCD-Kamera. Der virtuelle Zeiger, bezogen auf ein Koordinatensystem, das beispielsweise einen Nullpunkt für eine X- und Y-Achse an einer Ecke des CCD Chips aufweist, wird in einem elektronischen Speicher abgelegt und dient dazu, jede markierte Pinholelage jederzeit und beliebig oft mit einer Reproduzierbarkeit von 0,5 μm wiederzufinden. Hierzu werden die Schrittmotorantriebe, die eine Auflösung von 0,3 μm aufweisen, in einem Regelkreis betrieben, der die von der CCD-Kamera ermittelte aktuelle Lage der Pinholeöffhung mit dem virtuellen Zeiger vergleicht und Abweichungen korrigiert. Die vorgeschlagene Lösung besteht weiterhin darin, die Pinholeöffhung optisch vergrößert auf einen hochauflösenden Chip einer CCD-Kamera abzubilden, die Lage und Größe der Pinholeöffhung durch Bildauswertung zu ermitteln, die aktuellen Werte mit der abgespeicherten Ursprungslage und Ursprungsgröße des Pinholes zu vergleichen und Abweichungen durch eine hochauflösende Schrittmotorsteuerung bis auf eine Restabweichung von 0,5 μm zu korrigieren.
Eine weitere Lösung besteht darin, analog zu dem auf das Pinhole fokussiertem Laserstrahl einen oder mehrere Lichtzeiger zu erzeugen und vom Pinhole unter Nutzung der Schrittmotorantriebe und des Photomulitpliers oder einem Lichtempfänger einzufangen. Dann befindet sich die Pinholeöffhung an der Stelle maximaler Lichtintensität des Lichtzeigers und damit auch des Laserfokus.
Da der Photomultiplier oder Lichtempfänger ein Flächendetektor ohne Ortsauflösung ist, muß bei dieser Lösung auf die Ermittlung und Steuerung der Größe der Pinholeöffhung verzichtet werden. Das bewirkt aber keinen entscheidenden Nachteil, weil die reproduzierbare Einstellung kleiner Pinholeöffhungen von 2μm bis 50μm Größe durch ein Referenzierungsverfahren (Referenzierung erfolgt dann, wenn sich das Pinhole gerade öffnet und Licht auf den Photomultiplier fällt) und die reproduzierbare Einstellung großer Pinholeöffhungen von 50μm bis lOOOμm durch einen hochauflösenden Schrittmotorantrieb gesichert sind.
Ein wesentlicher Vorteil der Lösungen mit zusätzlicher Lichtquelle besteht darin, dass die Probe P während der Pinholejustage keiner Lichtbelastung ausgesetzt werden braucht, da der Laser L abgeschaltet werden kann. 1. Erfindungsgemäße Einrichtung und erfindungsgemäßes Verfahren
1.1 optische Anordnung (Bilder 1, 2 und 3)
Für den Markierungsvorgang wird das Pinhole mit einer zehnfach vergrößernden Optik VO auf die ca. 1Ox 10mm2 großen Fläche des CCD-Chips abgebildet.
Ein PC oder μ-Controller berechnet den optischen Schwerpunkt der Pinholeöffnung auf der CCD-Empfängerfiäche, dessen xy-Koordinaten als virtueller Pfeil abgespeichert werden. Als Nullpunkt des X/Y-Koordinatensystems dient beispielsweise die linke untere Ecke der CCD Fläche. Für den Markierungsvorgang ist eine geeignete Ausleuchtung der Pinholeöffhung zu realisieren. Vorteilhaft erfolgt eine Beleuchtung über eine Weißlicht LED, die aus drei farbigen Dioden (rot, grün, blau) besteht, so dass eine Beleuchtung unabhängig von der Art des verwendeten dichrioitischen Spiegels gewährleistet ist. Vorteilhaft kann für den Markierungsvorgang auch eine IR-LED (900nm) eingesetzt werden. Die dichroitischen Spiegel und Filter sollten dann IR durchlässig ausgebildet sein. Alle im folgenden beschriebenen optischen Anordnungsbeispiele mit CCD Empfänger beeinflussen nicht den Laserscanvorgang und verursachen dabei keinen Verlust an dem von der Probe austretendem Licht.
Für jeden eingeschwenkten dichroitischen Teilerspiegel oder andere auswechselbare optische
Komponenten wird einmalig die optimale Pinholelage erfasst und abgespeichert und beim
Einschwenken des betreffenden Bauelementes während des normalen LSM Betriebes wieder hergestellt.
Die optimale Pinholelage wird jeweils durch Intensitätsmessung am PMT beim
Markierungsvorgang ermittelt.
Vorderseitige Ausleuchtung der Pinholeöffhung durch eine LED (Bild 1)
Ein Laser Scanning Mikroskop ist schematisch durch einen eine Probe P beleuchtenden
Beleuchtungslaser L, ein Objektiv O, eine Pinholeoptik PO, ein senkrecht zur optischen
Achse verstellbares Pinhole PH, dem ein Photomultiplier PMT nachgeordnet ist, einen dichroitischen Spiegel SP zur Trennung von Anregungs- und Detektionsstrahlengang dargestellt. Ein Nebenfarbteiler ermöglicht die simultane Beleuchtung einer zweiten
Wellenlänge des Fluoreszenzlichtes.
Eine in einem zusätzlichem optischen Arm des Laserscanmikroskopes angeordnete LED oder
Halogenlampe beleuchtet über einen Kollimator KO und den dichroitischen Spiegel SP vorderseitig die Pinholeöffhung. Der Photomultiplier PMT wird vorteilhaft aus Platzgründen beim Markierungsvorgang aus dem Strahlengang des Laserscanmikroskopes ausgeschwenkt und hinter dem Pinhole PH eine Vergrößerungsoptik VO und eine CCD Fläche angeordnet. Beim Laserscanvorgang wird dann die LED abgeschaltet.
Rückseitige Ausleuchtung der Pinholeöffhung durch eine LED (Bild 2) Eine zwischen Photomultiplier PMT und Pinhole PH angeordnete LED oder Hologenlampe beleuchtet über einen Kondensor KO das Pinhole PH rückseitig ebenfalls dreifarbig oder im LR. Die Pinholeöffhung wird über mindestens einen zusätzlichen Spiegel SPl (hier zwei Spiegel SPl und SP2 über einen im Laserscanmikroskop angeordneten optischen Arm (Optik POl und VO) auf die CCD abgebildet. Der oder die im Strahlengang des Laserscanmikroskopes angeordnete Zusatzspiegel sind für den Laserscanvorgang ausschwenkbar und für den Markierungsvorgang präzise einschwenkbar ausgebildet. Beim Laserscanvorgang wird die LED abgeschaltet und aus dem Strahlengang ausgeschwenkt. Der Photomultiplier braucht nicht ausgeschwenkt zu werden. Für die Einstellung der Pinholelage nach Bild 1, 2 ist statt der LED auch der Laser und die CCD einsetzbar, allerdings unter Belastung der Probe.
Der Vorteil der Anordnung besteht darin, daß die Fehler des dichroitischen Spiegels beim Markierungsvorgang erfaßt werden.
Ausleuchtung des Detektorpinholes durch den Laser und einen Ringspiegel (Bild 3) Die Ausleuchtung des Pinholes erfolgt vorderseitig durch den Laser und einen im Laserscanmikroskop im telezentrischen Strahlbereich, hier zwischen Objektiv O und Spiegel SP, angeordneten Ringspiegel RS, der in einem unbeschichteten Randbereich des dichroitischen Spiegels SP das Laserlicht in Richtung des Pinholes PH reflektiert. Der Photomultiplier wird beim Markierungsvorgang aus dem Strahlengang des Laserscanmikroskopes ausgeschwenkt. Der Ringspiegel RS braucht beim Laserscanvorgang nicht aus dem Strahlengang ausgeschwenkt zu werden, weil das Laserlicht durch einschwenkbare Filter (nicht dargestellt) abgeblockt wird und nicht auf den Photomultiplier gelangen kann.
Auch bei dieser Anordnung werden die Fehler des dichroitischen . Spiegels beim Markierungsvorgang mit erfaßt. Lagemarkierung und Steuerung der Pinholeöffhung (Bild 4 und 5)
Ein PC oder μ-Controller wertet die CCD-Signale aus, ermittelt den optischen Schwerpunkt der Pinholeöffhung und speichert die xy-Koordinaten der zu markierenden Lage der
Pinholeöffhung ab. Die Pixelgröße der CCD beträgt ca. 6μm. Wegen der hier zehnfachen optischen Vergrößerung der CCD Kamera entschärft sich die Reproduzierbarkeitsforderung von 0,5μm auf 5μm.
Auch die Größe der Pinholeöffhung kann nach diesem Verfahren ermittelt und gesteuert werden. Statt des Schwerpunktes der Pinholeöffhung wird die Lage der auf dem CCD-Chip abgebildeten Pinholekanten ausgewertet.
Die Pinholeöffhung ist hier schematisch als Kreis dargestellt. Ist sie quadratisch oder rechteckig, lässt sich die jeweilige b Kantenlage auf der CCD leicht ermitteln.
Um eine markierte Lage der Pinholeöffhung wieder reproduzierbar auffinden zu können, wird das Laserscanmikroskop wie bei der Markierung der Pinholelage eingestellt (LED oder Spiegel eingeschwenkt, Photomultiplier eventuell ausgeschwenkt). Der μ-Controller steuert die beiden Schrittmotorantriebe Mx und My so, daß die aktuelle Lage der Pinholeöffhung auf dem CCD-Chip und der abgespeicherte virtuelle Zeiger die selben xy-Koordinaten aufweisen. Die Pinholeöffhung befindet sich nun mit einer Abweichung von höchstens 0,5 μm über dem auf dem CCD-Chip markierten Punkt.
Die Größe der Pinholeöffhung läßt sich analog zu diesem Verfahren ebenfalls mit einer Reproduzierbarkeit von 0,5 μm erfassen und einstellen.
Öffnung und Lage des Pinholes können mit der erfindungsgemäßen Anordnung und dem erfindungsgemäßen Verfahren beliebig oft und an jeder Stelle mit einer Reproduzierbarkeit von 0,5 μm ermittelt und eingestellt werden. Die als Normal dienende CCD darf allerdings auch langzeitig keine Lageänderungen zum Strahlengang des Laserscanmikroskopes erfahren.
Ausführungsbeispiel LSM (Bild 6)
In Bild 6 ist ein Ausfuhrungsbeispiel der erfindungsgemäßen Anordnung nach Bild 2 für ein ZEISS LSM 510 dargestellt. Die vier Pinholes werden rückseitig durch einschwenkbare und seriell einzuschaltende LED's und je einen Kondensor beleuchtet. Ein präzis einschwenkbarer Zusatzspiegel SP3 lenkt das vom Pinhole kommende Licht auf den CCD-Chip um, dessen Signale ausgewertet werden. Vorteilhaft ist, daß für die Markierung und die Einstellung aller vier Pinholes nur eine CCD-Kamera am Laserscanmikroskop benötigt wird und das auch die vom dichroitischen Hauptspiegel verursachten Markierungsfehler erfaßt werden.
In den Bildern 7, 8, 9 und 10 sind Lösungsvarianten zu einem weiteren vorteilhaften Einstellverfahren der Pinholelage dargestellt.
In Bild 7 wird ein axialer Lichtzeiger, der die gleiche Lage wie der Laserstrahl haben soll, durch zusätzliche optische Elemente erzeugt.
Das Pinhole wird mittels der Schrittmotoren so in seiner Lage gesteuert, daß der
Photomultiplier ein maximales Lichtsignal detektiert. Dann trifft der Lichtzeiger genau auf die Pinholeöfmung. Die Pinholelage ist somit optimal für den Laserscanvorgang eingestellt.
Eine von der LED beleuchtete Lochblende LB wird in die Pinholeebene abgebildet. Das Bild der Lochblende dient als optischer Zeiger, der mittels Pinhole, Photomultiplier und
Schrittmotorantrieben eingefangen wird.
Die erstmalige Kalibrierung der Pinholelagen und Speicherung der x- und y-Koordinaten erfolgt durch Suchalgorithmen mit dem Laser. Die Lochblende wird so justiert dass der LED
Fokus mit dem Laserfokus übereinstimmt.
Nach der Kalibrierung erfolgt beim Messen mit dem LSM die Einstellung der Pinholelagen anhand der abgespeicherten Pinholelagen. Eine sich anschließende Feinkorrektur erfolgt nach dem LED Fokus, wobei vorteilhaft die Probe nicht mit dem Licht belastet wird, weil der Laser abgeschaltet wird.
In Bild 8 wird durch zusätzliche Elemente ein zum Laserstrahl schräger Lichtzeiger erzeugt, der auf ein zusätzliches Referenzpinhole RPH trifft.
Die Schräglage wird bei der erstmaligen Kalibrierung des LSM eingestellt, indem das Pinhole durch Suchalgorithmen auf den Laserfokus eingestellt wird und anschließend die Lochblende so justiert wird, dass der LED— Fokus durch das Referenzpinhole tritt und der dahinter befindliche Fotoempfänger PE maximale Intensität aufweist.
Nach der Kalibrierung erfolgt beim Messen mit dem LSM die Einstellung der Pinholelagen anhand der abgespeicherten Pinholelagen und Feinkorrekturen mit dem Laserfokus wie anhand Bild 7 beschrieben. Vorteilhaft kann für das Referenzpinhole eine LED mit 900nm
Wellenlänge verwendet werden.
Weil bei dieser Wellenlänge der PMT unempfindlich ist, kann vor — oder auch während der
Messungen mit dem LSM die Steuerung der Pinholelage mit der IR LED bei hoher
Quanteneffizienz am Pfotoempfänger erfolgen. Die Einstellung der Pinholelage erfolgt über das Referenzpinhole. Pinhole und Referenzpinhole sind mechanisch miteinander gekoppelt. Vorteilhaft wird statt des Photomultipliers ein separater Photoempfänger PE als Detektor verwendet. Die Lochblende wird in die Ebene des Referenzpinholes abgebildet. Der PMT und der Laser werden nicht für die Einstellung benötigt.
In Bild 9 wird durch die optische Abbildung eines Diaphragmas DP in die Pinholeebene ein aus 10OxIOO=IO4 Lichtzeigern bestehender Flächenmaßstab im Pinholeeinstellbereich von Ix lmm erzeugt. Pinhole und Photomultip lier können mittels der hochauflösenden Schrittmotorantriebe jeden beliebigen Lichtzeiger mit hoher Reproduzierbarkeit einfangen und hiervon ausgehend beliebige Pinholelagen in einem Quadrat von lOxlOμm einstellen. Das Diaphragma ist eine matrixförmig von Löchern (5μm Durchmesser, lOμm Abstand) durchsetzte Chrommaske oder ein Kreuzgitter von Ix lmm Größe.
Die Lade der Diaphragmafoki in der Pinholeebene wird bei der erstmaligen Kalibrierung des LSM durch Suchalgorithmen bestimmt , indem das Diaphragma so justiert wird, dass sowohl der Laserfokus als auch ein Foki des Diaphragmas (z.B. der mittlere) durch das Pinhole treten (Koordinatenursprung). Alle weiteren Pinholedlagen werden bezogen auf diesen Koordinatenursprung und die anderen optischen Pixel der Fokimatrix ermittelt und abgespeichert.
Beim Messen mit dem LSM erfolgt die Einstellung der Pinholelage durch Einstellung auf den abgespeicherten Diaphragmafokus und motorischer Interpolation zwischen den Foki. Der Laser ist hierbei vorteilhaft abgeschaltet.
Anstelle des Diaphragmas in Bild 9 kann auch ein Mikrolinsenarray verwendet werden. Üblich sind Mikrolinsen von 50μm Durchmesser. Ein Array von 5x5mm Größe würde dann ebenfalls 10OxIOO=IO4 Lichtzeiger erzeugen, die aber um den Maßstab 1:10 optisch verkleinert in die Pinholeebene abgebildet werden müssen.
In Bild 10 entsteht in der Pinholeebene das Beugungsbild eines aus Mikrolinsen bestehenden Quadrupolelementes QP, das ebenfalls eine Matrix optischer Zeiger darstellt. Eine Wabenpupille PW verhindert störende Fresnelbeugung.
Prinzip: Das Quadrupolelement besteht aus 4 Mikrolinsen, in deren Brennpunkten zur
Vermeidung der Fresnelbeugung sich die Wabenpupille befindet. Das Beugungsbild des Quadrupolelementes in der Pinholebene ist eine Matrix optischer Zeiger, die als Flächenmaßstab dient. Das Pinhole kann mittels der hochauflösenden Schrittmotorantriebe und des Photomultiplier auf jeden beliebigen optischen Zeiger reproduzierbar eingestellt werden.
Mit den Parametern
f = 150 mm Brennweite der Abbildungslinse L d = 10 mm Abstand der Mikrolinsen des Quadrupolelementes λ = 630 nm rote Laserdiode
und der Beugungsgleichung
g = λ * f/ d
ergibt sich ein Abstand der matrixfδrmigen Lichtzeiger in der Pinholeebene von
g = 9,5 μm.
Pinhole und Photomultiplier können mittels der hochauflösenden Schrittmotorantriebe jeden beliebigen Lichtzeiger mit hoher Reproduzierbarkeit einfangen und hiervon ausgehend beliebige Pinholelagen in einem Quadrat von 9,5x9,5μm einstellen.
Ein weiteres besonders einfaches Verfahren zur Pinholejustierung soll hinzugefügt werden. Der Vorschlag besteht darin, in den parallelen Strahlengang des Laserscanmikroskopes eine Retrofolie (Bild 11) oder ein Tripelprisma (Bild 12) in und aus dem Strahlengang schiebbar anzuordnen. Durch das in den Strahlengang geschobene optische Element wird der Laserfokus in die Pinholeebene abgebildet und zusätzlich verhindert, daß die Probe beim Justieren durch Laserlicht belastet und ausgeblichen wird. Durch das aus den Strahlengang geschobene optische Element wird die Probe für die Beobachtung frei geschaltet. An den Schiebemechanismus werden auf Grund der Winkelinvarianz von Retrofolie oder Tripelprisma keine besonderen Anforderungen gestellt. Die nur minimal geöffnete Pinholeöffhung kann nun so justiert werden, bis das Laserlicht genau hindurch tritt und vom Photoempfänger maximal empfangen wird. Der Photoempfänger wird wegen der nur minimal geöffneten Pinholeöffhung nicht geblendet. Eine motorische Voreinstellung der Pinholeöffhung in die Nähe des Laserfokus (max. 2μm Ablage), deren Werte in einen einmaligen Justiervorgang zu finden sind, erleichtert die automatische Suche nach dem Fokus durch kleine Scanbewegungen der xy- Antriebe des Pinholesystems in einem Gebiet von etwa 5μmx5μm.
1. Vorteile
Die Pinholeöffhung kann nach diesem Verfahren besser als 0, 3μm zum Laserfokus ausgerichtet werden.
Die Pinholejustierung kann auch während einer Probenuntersuchung vorgenommen werden, weil die Probe durch die eingeschobenen optischen Elemente (Retrofolie oder Tripelprisam) keine Laserbelastung erfährt und nicht verbleichen kann. - Die kleinen Pinholeöffhungen von z. B. 3μm Größe können auch ohne Wegmeßsysteme auf 0,3μm genau justiert werden.
2. Hinweise
Um die volle Intensität des Laserlichtes für diese Justierung am Pinhole zur Verfugung zu haben, sollten sich möglichst keine Farbfilter im Strahlengang befinden.
In einem weiteren Erfindungsvorschlag wird beschrieben, wie Winkelfehler des
Laserstrahles beim Schalten der Teilerspiegel und Farbfilter vermieden werden können
( 3 Punktanlage der Spiegel).
Dieses Verfahren ähnelt dem Ringspiegelverfahren nach Bild 3, bei dem jedoch die Probe durch Laserlicht beim Justieren belastet wird und das eine genaue Ausrichtung des
Ringspiegels senkrecht zur optischen Achse voraussetzt.

Claims

Patentansprüche 1.
Vorrichtung zur Einstellung der Lage und/oder Größe eines Pinholes in einem Laser Scanning
Mikroskop( LSM), wobei über eine separate Lichtquelle oder den LSM - Laser eine Beleuchtung des Pinholes erfolgt und eine Verschiebung des Pinholes quer zur optischen Achse erfolgt, bis ein
Intensitätsmaximum auf einem Empfänger vorliegt
2.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei eine Erfassung der Pinholelage über einen Empfänger erfolgt und diese gemeinsam mit zu auswechselbaren optischen Komponenten gehörigen
Daten abgespeichert wird.
3.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Empfänger ortsaufiösend ist.
4.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Beleuchtungsschwerpunkt der durch das Pinhole gehenden Strahlung erfasst wird.
5.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Pinholeöffhung optisch vergrößert auf den ortsauflösenden Empfänger abgebildet wird.
6.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Abbildung mindestens einer Lochblende auf das Pinhole erfolgt.
7.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Beleuchtung des Pinholes in Lichtrichtung des Detektionslichtes erfolgt.
8.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein separater Detektor in Beleuchtungsrichtung nach dem Pinhole vorgesehen ist.
9.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein separater Detektor in Beleuchtungsrichtung nach dem Pinhole und ein mit dem
Pinhole starr verbundenes Referenzpinhole (Bild 8) vorgesehen sind.
10.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der LSM Detektor zur Erfassung genutzt wird.
11.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Beleuchtung des Pinholes von der Detektorseite aus erfolgt.
12.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens ein einschwenkbarer Zusatzspiegel im LSM - Strahlengang zur
Übertragung des Lichtes separater Lichtquellen in Richtung des Pinholes in Richtung des ortsauflösenden Empfängers vorgesehen sind.
13.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Lichtzeiger oder eine Lochblende in die Pinholebene abgebildet wird.
14.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine aus mehreren Löchern bestehende Lochmaske in die Pinholeebene abgebildet wird.
15.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Mikrolinsenarray in die Lochblendenebene Pinholeebene abgebildet wird.
16.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Pinholebeleuchtung mehrfarbig oder im IR erfolgt.
17.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Beleuchtung des Pinholes durch einen LSM Beleuchtungslaser erfolgt
18.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mittels eines Reflektors in einem parallelen Strahlengang ein Beleuchtungsfokus in der
Pinholeebene erzeugt wird
19.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei in Richtung der Probe ein Ringspiegel vorgesehen ist der einen Teil des
Beleuchtungslichtes in Richtung des Pinholes reflektiert
20.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Retrofolie oder ein Tripelprisma in den Strahlengang einschiebbar oder einschwenkbar sind
21.
Verfahren zum Betrieb eines Lase-Scanning-Mikroskopes nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche.
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