JP2608483B2 - 共焦点走査型顕微鏡 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は透過型の共焦点走査型顕微鏡、特に詳細に
は、試料を透過した光束の結像位置が光学系光軸と直角
な方向に位置ずれを起こしても、それによる悪影響が及
ばないようにした共焦点走査型顕微鏡に関するものであ
る。

（従来の技術） 従来より、照明光を微小な光点に収束させ、この光点
を試料上において２次元的に走査させ、その際該試料を
透過した光あるいはそこで反射した光を光検出器で検出
して、試料の拡大像を担持する電気信号を得るようにし
た光学式走査型顕微鏡が公知となっている。

なかでも、照明光を光源から発生させた上で試料上に
おいて光点に結像させる一方、この試料からの光束を再
度点像に結像させてそれを光検出器で検出するように構
成した共焦点走査型顕微鏡は、試料面上にピンホールを
配する必要が無く、実現容易となっている。

この共焦点走査型顕微鏡は基本的に、 照明光を発する光源と、 試料が載置される試料台と、 この照明光を試料上において微小な光点として結像さ
せる送光光学系と、 上記試料からの光束を集光して点像に結像させる受光
光学系と、 この点像の結像位置に微小開口が位置するように配さ
れたピンホール板等の絞り部材と、 この微小開口を介して前記点像を検出する光検出器
と、 上記光点を試料上において２次元的に走査させる走査
機構とから構成されるものである。

なお特開昭62−217218号公報、同62−209510号公報に
は、この共焦点走査型顕微鏡の一例として透過型のもの
が示されている。この透過型の共焦点走査型顕微鏡は、
試料を透過した光束を受光光学系により集光し、その点
像を光検出器によって検出するように構成されたもので
ある。

（発明が解決しようとする課題） ところで、上述のような透過型の共焦点走査型顕微鏡
においては、照明光光源として使用されるレーザ光源の
レーザ放射角が変動したり、あるいは試料の形状や厚さ
が変わると、試料を透過した光束の結像位置が光学系光
軸から外れる方向に位置ずれを起こすことがある。そう
なるとこの点像と、光検出器の前の絞り手段の開口とが
芯ずれの状態となるので、光検出器から得られる画像信
号のS/Nが低下したり、試料を透過した光束を検出する
ことが全く不可能になったり、得られた顕微鏡像の解像
度が低下する等の問題が生じる。

このような問題を防止するために従来より、例えば前
記特開昭62−209510号公報にも示されているように、上
記点像の位置ずれを検出し、その検出された位置ずれ量
に基づいて、光検出器に向かう光束の光路を補正するこ
とが考えられている。

このような補正方法は原理的には確かに有効である
が、例えば上記光路の補正を平行平面板の駆動等によっ
て行なうために、高速応答が困難となっている。この制
御の応答速度を十分に高くすることができない場合は、
試料に対する照明光の走行速度を低く設定せざるを得な
い。顕微鏡で観察される試料としては生物試料も多く、
この生物試料を観察する際に高速走査ができないと、生
物試料の微妙な動きをとらえることが不可能になる。ま
た、このような生物試料に限らなくても、ほぼリアルタ
イムで試料像を撮像したいという要求は広く存在するも
のであり、高速走査が不可能であれば、当然、このよう
な要求に応えることができない。

また上記のような補正を行なう補正制御系を設けれ
ば、当然ながら装置が複雑化して、高価なものになって
しまう。

そこで本発明は、上記点像の位置ずれの補正制御を行
なわなくても、画像信号の劣化等の問題を招かない透過
型の共焦点走査型顕微鏡を提供することを目的とするも
のである。

（課題を解決するための手段） 本発明による共焦点走査型顕微鏡は、先に述べたよう
な試料台と、照明光光源と、送光光学系と、受光光学系
と、絞り手段と、光検出器と、光点の２次元走査機構と
を備えた透過型の共焦点走査型顕微鏡において、 上記照明光のビームプロファイルを、フラットな最大
光強度部分を有する略矩形状とするビーム整形手段が設
けられるとともに、 上記絞り手段の微小開口の径をｄ、上記点像における
フラットな最大光強度部分の径をＤ、該点像の光学系光
軸からの位置ずれ量の想定される最大値をεとしたと
き、送光光学系および受光光学系が、 ｄ＋２εＤ なる関係を満足するように構成されたことを特徴とする
ものである。

（作用） 上記点像におけるビームプロファイルと、絞り手段の
微小開口との関係を第５図に示す。図中ａがビームプロ
ファイルを示し、絞り手段としてのピンホール板を８、
その開口（ピンホール）を8aで示してある。同図の
（１）−（ａ）と（１）−（ｂ）は、各々ビームプロフ
ァイルが矩形状である場合と釣鐘状である場合につい
て、試料を透過した光束の結像位置（点像中心）が光軸
Ｃと一致している正常な状態を示しており、一方同図の
（２）−（ａ）、（２）−（ｂ）は各々、ビームプロフ
ァイルが矩形状である場合と、釣鐘状である場合につい
て、点像中心が光軸Ｃから上記最大値εだけ外れた状態
を示している。この図から明らかなように、ビームプロ
ファイルが矩形状の場合は、d/2＋εD/2、すなわちｄ
＋２εＤとなっていれば、釣鐘状の場合と異なり、ピ
ンホール8aを通過する光量に、点像位置ずれによる変動
が生じない。

（実 施 例） 以下、図面に示す実施例に基づいて本発明を詳細に説
明する。

第１図は、本発明の第１実施例による透過型の共焦点
走査型顕微鏡を示すものであり、また第２および３図
は、それに用いられた走査機構を詳しく示している。

第１図に示されるように、照明光11を発する点光源と
してレーザダイオード５が、移動台15に一体的に保持さ
れている。この移動台15には、コリメーターレンズ16お
よび対物レンズ17からなる送光光学系18と、対物レンズ
19および集光レンズ20からなる受光光学系21とが、互い
に光軸を一致させて固定されている。なおコリメーター
レンズ16と対物レンズ17との間には、後述するビーム整
形を果たすガウシアンモードフィルター６が配され、対
物レンズ19と集光レンズ20との間には、後述するフォー
カス制御用のハーフミラー７が配されている。

また両光学系18、21の間には、移動台15と別体とされ
た試料台22が配されている。そして受光光学系21の下方
において移動台15には、両光学系18、21と光軸を揃えて
ピンホール板８が固定され、そのさらに下方には、光検
出器９が固定されている。

上記の照明光11はコリメーターレンズ16によって平行
光とされ、次に対物レンズ17によって集光されて、試料
台22に載置された試料23上で（表面部分あるいはその内
部で）微小な光点Ｐに結像する。試料23を透過した透過
光11′の光束は、受光光学系21の対物レンズ19によって
平行光とされ、次に集光レンズ20によって集光されて、
ピンホール板８の位置で点像Ｑに結像される。この点像
Ｑはピンホール8aを介して、光検出器９によって検出さ
れる。この光検出器９としては例えばフォトダイオード
等が用いられ、それからは、試料23の拡大像を担持する
信号Ｓが出力される。

次に、照明光11の光点Ｐの２次元走査について、第
２、３図を参照して説明する。第２図と第３図はそれぞ
れ、移動台15の周辺部分を、第１図の上方側、右方側か
ら見た状態を示している。この移動台15は架台32に、積
層ピエゾ素子33を介して保持されている。積層ピエゾ素
子33はピエゾ素子駆動回路34から駆動電力を受けて、移
動台15を矢印Ｘ方向に高速で往復移動させる。この往復
移動の振動数は、例えば10kHzとされる。その場合、主
走査幅を100μｍとすると、主走査速度は、 10×10³×100×10^-6×２＝2m/s となる。

一方試料台22は、２次元移動ステージ35に固定されて
いる。この２次元移動ステージ35は、モータ駆動回路36
から駆動電流を受けるパルスモータ37により、マイクロ
メータ38を介して矢印Ｙ方向に往復移動される。それに
より試料台22は移動台15に対して相対移動され、前記光
点Ｐが試料23上を、前記主走査方向Ｘと直交するＹ方向
に副走査する。なおこの副走査の所要時間は例えば1/20
秒とされ、その場合、副走査幅を100μｍとすると、副
走査速度は、 20×100×10^-6＝0.002m/s ＝2mm/s と、前記主走査速度よりも十分に低くなる。この程度の
副走査速度であれば、試料台22を移動させても、試料23
が飛んでしまうことを防止できる。

以上のようにして光点Ｐが試料23上を２次元的に走査
することにより、前記光検出器９からは、該試料23の２
次元像を担持する時系列の信号Ｓが得られる。この信号
Ｓは例えば所定周期毎に積分する等により、画素分割さ
れた信号とされる。

また本実施例においては２次元移動ステージ35が、モ
ータ駆動回路39から駆動電流を受けるパルスモータ40に
より、主、副走査方向Ｘ、Ｙと直交する矢印Ｚ方向（す
なわち光学系18、21の光軸方向）に移動される。こうし
て２次元移動ステージ35をＺ方向に所定距離移動させる
毎に前記光点Ｐの２次元走査を行なえば、合焦点面の情
報のみが光検出器９によって検出される。そこで、この
光検出器９の出力Ｓをフレームメモリに取り込むことに
より、試料23をＺ方向に移動させた範囲内で、全ての面
に焦点が合った画像を担う信号を得ることが可能とな
る。

なおピエゾ素子駆動回路34およびモータ駆動回路36、
39には、制御回路41から同期信号が入力され、それによ
り、光点Ｐの主、副走査および試料台22のＺ方向移動の
同期が取られる。

次に、点像Ｑの位置ずれに対処する点について説明す
る。ガウシアンモードフィルター６は照明光11のビーム
プロファイルを、第４図に示すように、フラットな最大
光強度部分を有する略矩形状に整形する。この第４図
は、光点Ｐの部分において、前記矢印Ｘ方向について照
明光11の光強度分布を示すものであるが、勿論前記矢印
Ｙ方向も含めて、すべてのビーム断面方向についてこの
ような光強度分布となっている。

上記光点Ｐにおけるフラットな最大光強度部分の径を
Ｄ（第４図参照）とすると、点像Ｑにおけるフラットな
最大光強度部分の径もＤとなる。送光光学系18および受
光光学系21は、ピンホール8aの径をｄ、点像Ｑの光学系
光軸からの位置ずれ量の想定される最大値をεとしたと
き、 ｄ＋２εＤ なる関係が満足されるように構成されている。ここで第
５図の（１）−（ａ）、（１）−（ｂ）にビームプロフ
ァイルが矩形状である場合と釣鐘状である場合につい
て、点像Ｑの中心が光学系光軸Ｃと一致している正常な
状態を示し、一方同図の（２）−（ａ）、（２）−
（ｂ）にはビームプロファイルが矩形状である場合と釣
鐘状である場合について、点像Ｑの中心が光軸Ｃから上
記最大値εだけ外れた状態を示している。ビームプロフ
ァイルが矩形状である場合、上記のようにｄ＋２εＤ
すなわちd/2＋εD/2となっていれば、点像位置が最大
値εずれても、ビームプロファイルが釣鐘状の場合と異
なり、ピンホール8aを通過する光量に、上記点像位置ず
れによる変動が生じない。つまり、ピンホール板８を介
して点像Ｑを検出する光検出器９の出力信号Ｓは、上記
点像Ｑの位置ずれが生じても、それによって変動するこ
とはない。

次に、点像Ｑの光軸方向のずれに対処する点について
説明する。第１図に示される通り、試料23を透過した透
過光11′の一部は、ハーフミラー７によって分岐され
る。この分岐された透過光11″はシリンドリカルレンズ
50によって一方向に集光された上で、４分割光検出器51
によって検出される。一方ピンホール板８はピエゾ素子
52により、光軸方向に移動されるようになっている。こ
のピエゾ素子52は、ピエゾ素子駆動回路53によって駆動
される。

光点Ｐの集束位置が光軸方向に偏位すると、それに応
じて点像Ｑの結像位置も同方向に、つまりピンホール板
８に対して上下方向に偏位してしまう。そうなると、光
検出器９により該点像Ｑを正しく検出することが不可能
になる。そこで上記４分割光検出器51の４つの出力はフ
ォーカスエラー検出回路54に入力され、該検出回路54は
これらの出力に基づいていわゆる非点収差法により、光
点Ｐの集束位置偏位（フォーカスエラー）の方向と量を
求める。このフォーカスエラーの方向と量を示す信号Ｅ
はフォーカス制御回路55に入力される。該制御回路55
は、この信号Ｅが示すフォーカスエラー方向にエラー量
に応じた距離だけピンホール板８を移動させるように、
ピエゾ素子52を駆動する。それによりピンホール板８の
光軸方向位置は、点像Ｑの結像位置に追随するように制
御される。

次に、第６図を参照して本発明の第２実施例について
説明する。なおこの第６図において、前記第１図中の要
素と同等の要素には同番号を付し、それらについての説
明は、特に必要の無い限り省略する（以下、同様）。

この装置のRGBレーザ10からは、赤色光、緑色光およ
び青色光からなる照射光11が射出される。この照明光11
はビームコンプレッサ12でビーム径が縮小され、屈折率
分布型レンズ13で集光されてシングルモード光ファイバ
ー14内に入射せしめられる。

この光ファイバー14の一端は移動台15に固定されてお
り、該光ファイバー14内を伝搬した照明光11はこの一端
から出射する。この際光ファイバー14の一端は、点光源
状に照明光11を発することになる。この照明光11はコリ
メーターレンズ16によって平行光とされ、前述のような
ビーム整形作用を果たすガウシアンモードフィルター６
を通過した後、対物レンズ17によって集光されて、試料
台22に載置された試料23上で微小な光点Ｐに結像する。
試料23を透過した透過光11′の光束は、受光光学系21の
対物レンズ19によって平行光とされ、次に集光レンズ20
によって集光されて、シングルモード光ファイバー24の
一端から該光ファイバー24内に入射せしめられる。この
光ファイバー24の上記一端は移動台15に固定されてお
り、またその他端には屈折率分布型レンズ25が接続され
ている。光ファイバー24内を伝搬した透過光11′はその
他端から出射し、上記屈折率分布型レンズ25によって平
行光とされる。

この透過光11′はダイクロイックミラー26に入射し、
その青色光11Bのみがそこで反射し、該青色光11Bは第１
光検出器27によって検出される。ダイクロイックミラー
26を透過した透過光11′は別のダイクロイックミラー28
に入射し、その緑色光11Gのみがそこで反射する。この
緑色光11Gは、第２光検出器29によって検出される。そ
して上記ダイクロイックミラー28を透過した透過光11′
（すなわち赤色光11R）はミラー30において反射して、
第３光検出器31によって検出される。こうして、光検出
器27,29,31からは各々、試料23の拡大像の青色成分、緑
色成分、赤色成分を担持する信号SB,SG,SRが出力され
る。

この実施例においては、光ファイバー24の端面が絞り
部材を構成しているから、そのコア径をｄとして、前述
のｄ＋２εＤなる関係を満足するように送光光学系18
および受光光学系21を構成する。

なおこの第６図においては、前述したフォーカスエラ
ー補正のための制御系を特に示していないが、勿論、こ
のような補正制御系を設けるのが好ましい。そしてその
場合は、フォーカスエラー補正のために、第１図の実施
例でピンホール板８を移動させた代わりに、光ファイバ
ー24の端面位置が変化するように該光ファイバー24を軸
方向に移動させればよい。またこの第６図の装置におい
ても、あるいは第１図の装置においても、フォーカスエ
ラー補正のために、集光レンズ20を光軸方向に移動させ
るようにしてもよい。

以上説明した実施例においては、種々の変更が可能で
ある。例えば、２次元移動ステージ35に固定された試料
台22をＹ方向に往復移動（副走査）させるための駆動源
であるパルスモータ37は、エンコーダ付きのDCモータで
もよく、またこのように試料台22を移動させることによ
って光点Ｐの副走査を行なう代わりに、移動台15を移動
させることによって光点Ｐの副走査を行なうようにして
もよい。さらに移動台15の移動は積層ピエゾ素子33を利
用して行なう他、例えばボイスコイルおよび超音波によ
る固体の固有振動を利用した走査方式等を用いて行なう
ことも可能である。

さらに光点Ｐの走査は、上記のような移動台15は使用
せずに、従来から一般に行なわれているように、試料台
22を２次元方向に移動させて行なってもよいし、あるい
は照明光ビームを２次元方向に偏向させて行なってもよ
いし、さらには照明光ビームの偏向と試料台22の移動と
を組み合わせて行なってもよい。

第７図には、照明光ビームを偏向させるようにした本
発明の第３実施例を示す。この第３実施例装置において
RGBレーザ10からは、赤色光、緑色光および青色光から
なる照明光11が射出される。この照明光11は、ビームエ
キスパンダ12′でビーム径が調整された後、前述のよう
なビーム整形作用を果たすガウシアンモードフィルター
６を通過してガルバノメータミラー70に入射し、そこで
紙面とほぼ直角な方向に偏向される。

偏向された照明光11は、対物レンズ17によって集光さ
れて、試料台22に載置された試料23上で（表面部分ある
いはその内部で）微小な光点Ｐに結像する。試料23を透
過した透過光11′の光束は、受光光学系21の対物レンズ
19によって平行光とされ、次にガルバノメータミラー71
に入射する。ガルバノメータミラー71は上記のガルバノ
メータミラー70と同期して駆動し、このガルバノメータ
ミラー70による透過光11′の偏向を打ち消すように該透
過光11′を偏向させる。それにより、ガルバノメータミ
ラー71で反射した後の透過光11′は一定の光路を進行
し、次に集光レンズ20によって集光されて、ピンホール
板８の位置で点像Ｑに結像される。

ピンホール板８のピンホール8aを通過した透過光11′
は、コリメーターレンズ72によって平行光とされ、その
青色光11B、緑色光11G、赤色光11Rが各々集光レンズ7
3、74、75で集光された上で、第１光検出器27、第２光
検出器29、第３光検出器31によって検出される。

照明光11は、前述のように偏向されることにより、試
料23上を１次元的に走査（主走査）する。それととも
に、第１実施例のものと同様の２次元移動ステージ35に
より、試料台22が上記主走査の方向とほぼ直角な方向
（図中左右方向）に往復移動されて、照明光11の副走査
がなされる。

次に、第８図を参照して本発明の第４実施例について
説明する。なおこの第８図では、光検出器の周辺部分は
省略してあるが、その部分は本質的に第７図の装置のも
のと同様に形成される。

この装置においては、主走査用ガルバノメータミラー
70に入射する前の照射光11が、副走査用ガルバノメータ
ミラー76に入射し、そこでガルバノメータミラー70によ
る偏向方向とほぼ直角な方向に偏向される。それによ
り、試料台22上の試料23に入射する照明光11は２次元的
に偏向され、試料台22を固定したままで照明光11の主、
副走査がなされる。

そして、ガルバノメータミラー71で反射偏向された透
過光11′は、さらに別のガルバノメータミラー77に入射
する。ガルバノメータミラー77は副走査用ガルバノメー
タミラー76と同期して駆動し、このガルバノメータミラ
ー76による透過光11′の偏向を打ち消すように該透過光
11′を偏向させる。それにより、ガルバノメータミラー
77で反射した後の透過光11′は一定の光路を進行する。

以上説明した第３実施例および第４実施例において
も、送光光学系18および受光光学系21は、ピンホール8a
の径をｄ、点像Ｑの光学系光軸からの位置ずれ量の想定
される最大値をεとしたとき、 ｄ＋２εＤ なる関係を満足するように構成されている。

以上詳細に説明した通り、本発明においては、種々の
照明光光点走査機構を適用することができる。しかし第
１実施例および第２実施例のように、移動台15を移動さ
せて光点Ｐの走査を行なうようにすれば、試料台22を高
速で移動させる必要がなく、よって試料23が飛んでしま
うことを防止可能で、また、高速走査も可能となる。さ
らに上記移動台15を利用すれば、照明光ビームが振られ
ることがないから、光学系の設計が容易となり、またガ
ルバノメータミラーやAOD等の高価な光偏向器が不要と
なるから、装置を安価に形成可能となる。

（発明の効果） 以上詳細に説明した通り本発明の共焦点走査型顕微鏡
においては、照明光のビームプロファイルを、フラット
な最大光強度部分を有する略矩形状とするとともに、光
検出器の前に配される絞り開口の径をｄ、点像における
フラットな最大光強度部分の径をＤ、該点像の光学系光
軸からの位置ずれ量の想定される最大値をεとしたと
き、 ｄ＋２εＤ なる関係が満足されるように構成したから、上記の位置
ずれが生じても、それによる影響を受けないで、正しく
この点像を検出することが可能となる。よって本装置に
よれば、常に解像度の高い顕微鏡を得ることができる。

また本発明の共焦点走査型顕微鏡は、上記点像の位置
ずれ補正のための制御系が不要であるから、安価に形成
可能であり、また、この制御の応答速度のために試料走
査速度が制限されることがなく、よって高速走査が可能
になって、撮像時間の短縮化が実現される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の第１実施例による共焦点走査型顕微
鏡を示す概略正面図、 第２図と第３図はそれぞれ、上記共焦点走査型顕微鏡の
要部を示す平面図と側面図、 第４図は、上記共焦点走査型顕微鏡における照明光のビ
ームプロファイルを示す概略図、 第５図は、上記共焦点走査型顕微鏡と従来装置における
照明光のビームプロファイルと、点像の位置ずれと、ピ
ンホール径との関係を説明する説明図、 第６図は、本発明の第２実施例による共焦点走査型顕微
鏡を示す概略正面図、 第７図は、本発明の第３実施例による共焦点走査型顕微
鏡を示す概略側面図、 第８図は、本発明の第４実施例による共焦点走査型顕微
鏡の要部を示す斜視図である。 ５……レーザダイオード ６……ガウシアンモードフィルター ７……ハーフミラー、８……ピンホール板 8a……ピンホール ９、27、29、31……光検出器 10……RGBレーザ、11……照明光 11′……透過光、14、24……光ファイバー 15……移動台、16、72……コリメーターレンズ 17、19……対物レンズ、18……送光光学系 20、73、74、75……集光レンズ 21……受光光学系、22……試料台 23……試料、26、28……ダイクロイックミラー 30……ミラー、32……架台 33……積層ピエゾ素子 34、53……ピエゾ素子駆動回路 35……２次元移動ステージ 36、39……モータ駆動回路、37、40……パルスモータ 38……マイクロメータ、41……制御回路 50……シリンドリカルレンズ 51……４分割光検出器、52……ピエゾ素子 54……フォーカスエラー検出回路 55……フォーカス制御回路 70、71、76、77……ガルバノメータミラー

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料が載置される試料台と、 照明光を発する光源と、 この照明光を試料上において微小な光点として結像させ
   る送光光学系と、 前記試料を透過した光束を集光して点像に結像させる受
   光光学系と、 この点像の結像位置に微小開口が位置するように配され
   た絞り部材と、 この微小開口を介して前記点像を検出する光検出器と、 前記光点を試料上において２次元的に走査させる走査機
   構とを備えた共焦点走査型顕微鏡において、 前記照明光のビームプロファイルを、フラットな最大光
   強度部分を有する略矩形状とするビーム整形手段が設け
   られるとともに、 前記微小開口の径をｄ、前記点像におけるフラットな最
   大光強度部分の径をＤ、該点像の光学系光軸からの位置
   ずれ量の想定される最大値をεとしたとき、前記送光光
   学系および受光光学系が、 ｄ＋２εＤ なる関係を満足するように構成されていることを特徴と
   する共焦点走査型顕微鏡。