JP2613129B2

JP2613129B2 - 共焦点走査型顕微鏡

Info

Publication number: JP2613129B2
Application number: JP27800190A
Authority: JP
Inventors: 俊仁木村; 修岩崎
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1990-04-10
Filing date: 1990-10-17
Publication date: 1997-05-21
Anticipated expiration: 2012-05-21
Also published as: JPH04118614A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は暗視野測光方式の共焦点走査型顕微鏡に関
し、特に詳細には、光点の走査機構が改良された暗視野
測光方式の共焦点走査型顕微鏡に関するものである。

（従来の技術）従来より、照明光を微小な光点に収束させ、この光点
を試料上において２次元的に走査させ、その際該試料を
透過した光あるいはそこで反射した光、さらには試料か
ら発せられた蛍光を光検出器で検出して、試料の拡大像
を担持する電気信号を得るようにした光学式走査型顕微
鏡が公知となっている。

なかでも、照明光を光源から発生させた上で試料上に
おいて光点に結像させる一方、この試料からの光束を再
度点像に結像させてそれを光検出器で検出するように構
成した共焦点走査型顕微鏡は、試料面上にピンホールを
配する必要が無く、実現容易となっている。なお特開昭
62−217218号公報には、この共焦点走査型顕微鏡の一例
が示されている。

また、このような共焦点走査型顕微鏡において、解像
度を超えた微小物体像を識別可能とするために、暗視野
測光方式の適用も考えられている。この暗視野測光方式
の共焦点走査型顕微鏡は基本的に、照明光を発する光源と、試料が載置される試料台と、この照明光を試料上において微小な光点として結像さ
せる送光光学系と、上記試料を透過した直接光を遮断するビームトラップ
を含み、この試料で散乱した光を集光して点像に結像さ
せる受光光学系と、この点像を検出する光検出器と、上記光点を試料上において２次元的に走査させる走査
機構とから構成されるものである。

（発明が解決しようとする課題）従来の共焦点走査型顕微鏡においては、上記走査機構
として、試料台を２次元的に移動させる機構、あるいは照明
光ビームを光偏向器によって２次元的に偏向させる機構
が用いられていた。

しかしの機構を採用した場合には、高速走査を行な
うと試料が飛んでしまうという問題が生じていた。顕微
鏡で観察される試料としては生物試料も多く、この生物
試料を観察する際に高速走査ができないと、生物試料の
微妙な動きを捕えることが不可能となる。また、このよ
うな生物試料に限らなくても、ほぼリアルタイムで試料
像を撮像したいという要求は広く存在するものであり、
高速走査が不可能であれば、当然、このような要求に応
えることができない。

一方、の機構によれば十分高速の走査が可能である
が、この機構においては、ガルバノメータミラーやAOD
（音響光学光偏向器）等の高価な光偏向器が必要である
という難点が有る。またこのの機構においては、照明
光ビームを光偏向器で振るようにしているから、送光光
学系の対物レンズにはこの光ビームが刻々異なる角度で
入射することになり、それによる収差を補正するために
対物レンズの設計が困難になるという問題も認められて
いる。特にAODを使用した場合には、対物レンズ以外に
もAODから射出した光束に非点収差が生ずるため特殊な
補正レンズが必要となり、光学系をより複雑なものとし
ている。

そこで本発明は、高速走査が可能で、その一方、構成
が簡単で安価に形成することができる、暗視野測光方式
の共焦点走査型顕微鏡を提供することを目的とするもの
である。

（課題を解決するための手段及び作用）本発明による暗視野測光方式の共焦点走査型顕微鏡
は、先に述べたような試料台と、光源と、送光光学系
と、ビームトラップを含む受光光学系と、光検出器と、
光点の２次元走査機構とを備えた共焦点走査型顕微鏡に
おいて、上記送光光学系と受光光学系とを一体的に保持する移
動台と、この移動台を、上記光点が試料上を一方向に主走査す
るように往復移動させる主走査手段と、上記移動台と試料台とを、上記主走査の方向とほぼ直
交する方向に、該主走査の速度よりも低い速度で相対移
動させて、上記光点を試料上において副走査させる副走
査手段とによって走査機構を構成したことを特徴とする
ものである。

なお上述の副走査手段は、移動台を移動させるもので
あってもよいし、それとは反対に、試料台を移動させる
ものであってもよい。副走査速度は比較的低速とするこ
とができるから、上記のように試料台を移動させても、
試料が飛んでしまうことを防止可能である。

上記の構成においては、光点走査のために照明光ビー
ムが振られることがないから、光学系の設計は光軸上の
光線のみを考えて行なえばよいことになり、該光学系の
設計は非常に容易となる。

（実施例）以下、図面に示す実施例に基づいて本発明を詳細に説
明する。

第１図は、本発明の第１実施例による透過型共焦点走
査型顕微鏡を示すものであり、また第２および３図は、
それに用いられた走査機構を詳しく示している。第１図
に示されるように、RGBレーザ10からは、赤色光、緑色
光および青色光からなる照明光11が射出される。この照
明光11はビームコンプレッサ12でビーム径が縮小され、
屈折率分布型レンズ13で集光されてシングルモード光フ
ァイバー14内に入射せしめられる。

この光ファイバー14の一端は移動台15に固定されてお
り、該光ファイバー14内を伝搬した照明光11はこの一端
から出射する。この際光ファイバー14の一端は、点光源
状に照明光11を発することになる。移動台15には、コリ
メーターレンズ16および対物レンズ17からなる送光光学
系18と、対物レンズ19、集光レンズ20およびそれらの間
に配されたビームトラップ５からなる受光光学系21と
が、互いに光軸を一致させて固定されている。また両光
学系18、21の間には、移動台15と別体とされた試料台22
が配されている。なお受光光学系21のNA（開口数）は、
送光光学系18のそれよりも大とされている。

上記の照明光11はコリメーターレンズ16によって平行
光とされ、次に対物レンズ17によって集光されて、試料
台22に載置された試料23上で微小な光点Ｐに結像する。
試料23を透過した透過光11′の光束は、受光光学系21に
中心直接光として入射し、ビームトラップ５によって遮
断される。一方試料29で生じた散乱光11″は、対物レン
ズ19および集光レンズ20によって集光されて、シングル
モード光ファイバー24の一端から該光ファイバー24内に
入射せしめられる。この光ファイバー24の上記一端は移
動台15に固定されており、またその他端には屈折率分布
型レンズ25が接続されている。光ファイバー24内を伝搬
した散乱光11″はその他端から出射し、上記屈折率分布
型レンズ25によって平行光とされる。

この散乱光11″はダイクロイックミラー26に入射し、
その青色光11Bのみがそこで反射し、該青色光11Bは第１
光検出器27によって検出される。ダイクロイックミラー
26を透過した散乱光11″は別のダイクロイックミラー28
に入射し、その緑色光11Gのみがそこで反射する。この
緑色光11Gは、第２光検出器29によって検出される。そ
して上記ダイクロイックミラー28を透過した散乱光11″
（すなわち赤色光11R）はミラー30において反射して、
第３光検出器31によって検出される。

なお上記光検出器27,29,31としては例えばフォトダイ
オード等が用いられ、それらからは各々、試料23の拡大
像の青色成分、緑色成分、赤色成分を担持する信号SB,S
G,SRが出力される。

上述した通りこの共焦点走査型顕微鏡においては、暗
視野測光方式が適用されているから、上記信号SB,SG,SR
により、解像度を超えた微小物体像を識別可能なカラー
顕微鏡像を再生することができる。

次に、照明光11の光点Ｐの２次元走査について、第
２、３図を参照して説明する。第２図と第３図はそれぞ
れ、移動台15の周辺部分を、第１図の上方側、右方側か
ら見た状態を示している。この移動台15は架台32に、積
層ピエゾ素子33を介して保持されている。積層ピエゾ素
子33はピエゾ素子駆動回路34から駆動電力を受けて、移
動台15を矢印Ｘ方向に高速で往復移動させる。この往復
移動の振動数は、例えば10kHzとされる。その場合、主
走査幅を100μｍとすると、主走査速度は、 10×10³×100×10^-6×２＝2m/s となる。なお、光ファイバー14、24は可撓性を有するの
で、それぞれ照明光11、散乱光11″を伝搬させつつ、移
動台15の振動を許容する。

一方試料台22は、２次元移動ステージ35に固定されて
いる。この２次元移動ステージ35は、モータ駆動回路36
から駆動電流を受けるパルスモータ37により、マイクロ
メータ38を介して矢印Ｙ方向に往復移動される。それに
より試料台22は移動台15に対して相対移動され、前記光
点Ｐが試料23上を、前記主走査方向Ｘと直交するＹ方向
に副走査する。なおこの副走査の所要時間は例えば1/20
秒とされ、その場合、副走査幅を100μｍとすると、副
走査速度は、 20×100×10^-6＝0.002m/s ＝2mm/s と、前記主走査速度よりも十分に低くなる。この程度の
副走査速度であれば、試料台22を移動させても、試料23
が飛んでしまうことを防止できる。

以上のようにして光点Ｐが試料23上を２次元的に走査
することにより、該試料23の２次元像を担持する時系列
の信号SB,SG,SRが得られる。これらの信号SB,SG,SRは、
例えば所定周期毎に積分する等により、画素分割された
信号とされる。

また本実施例において２次元移動ステージ35が、モー
タ駆動回路39から駆動電流を受けるパルスモータ40によ
り、主、副走査方向Ｘ、Ｙと直交する矢印Ｚ方向（すな
わち光学系18、21の光軸方向）に移動される。こうして
２次元移動ステージ35をＺ方向に所定距離移動させる毎
に前記光点Ｐの２次元走査を行なえば、合焦点面の情報
のみが光検出器27、29、31によって検出される。そこ
で、これらの光検出器27、29、31の出力SB,SG,SRをフレ
ームメモリに取り込むことにより、試料23をＺ方向に移
動させた範囲内で、全ての面に焦点が合った画像を担う
信号を得ることが可能となる。

なおピエゾ素子駆動回路34およびモータ駆動回路36、
39には、制御回路41から同期信号が入力され、それによ
り、光点Ｐの主、副走査および試料台22のＺ方向移動の
同期が取られる。

以上説明した実施例においては、種々の変更が可能で
ある。例えばビームコンプレッサ12でビーム径が縮小さ
れた照明光11は、屈折率分布型レンズ13で集光されてシ
ングルモード光ファイバー14内に入射せしめられるが、
この屈折率分布型レンズ13の代わりに顕微鏡対物レンズ
等を用いてもよく、またシングルモード光ファイバー14
は、マルチモードのものにピンホール等をつけたもので
もよい。

また、受光光学系21側の集光素子である屈折率分布型
レンズ25は、顕微鏡対物レンズ等であってもよい、そし
て、２次元移動ステージ35に固定された試料台22をＹ方
向に往復移動（副走査）させるための駆動源であるパル
スモータ37は、エンコーダ付きのDCモータでもよく、ま
たこのように試料台22を移動させることによて光点Ｐの
副走査を行なう代わりに、移動台15を移動させることに
よって光点Ｐの副走査を行なうようにしてもよい。さら
に移動台15の移動は積層ピエゾ素子33を利用して行なう
他、例えばボイスコイルや音叉、あるいは超音波による
固体の固有振動を利用した走査方式等を用いて行なうこ
とも可能である。

次に第４図を参照して、本発明の別の実施例によるモ
ノクロ透過型の共焦点走査型顕微鏡について説明する。
この実施例においては、送光光学系および受光光学系と
共に、光源および光検出器もまた移動台に一体的に保持
されており、これにより光学系がさらに簡素化されたコ
ンパクトな共焦点走査型顕微鏡が実現されている。なお
第４図において、第１図ないし第３図と共通部分には同
じ番号を付し、それらについての詳細な説明は省略する
（以下、同様）。

この実施例では、照明光11を発する光源としてレーザ
ダイオード51が用いられており、このレーザダイオード
51は移動台15に一体的に保持されている。このレーザダ
イオード51から発せられた照明光11は、同じく移動台15
に一体的に保持された送光光学系18に直接入射し、これ
により前記実施例と同様に試料28上に微小な光点Ｐとし
て結像せしめられる。

試料23を透過して受光光学系21に中心直接光として入
射した透過光11′は、ビームトラップ５によって遮断さ
れる。一方、試料23で生じた散乱光11″は、移動台15に
一体的に保持された受光光学系21により集光され、アパ
ーチャピンホール53を通過した後、同様に移動台15に一
体的に保持された光検出器52に直接入射して、そこで結
像する。

この実施例においても、光点Ｐの２次元走査は前記実
施例と同様に行なわれ、光検出器52の出力がフレームメ
モリに取り込まれることにより、試料23のＺ方向移動範
囲内で、全ての面に焦点が合った画像を担う信号が得ら
れる。

なお、上記第４図の実施例のように照明光源と光検出
器とを移動台15に固定する場合でも、３色の光源と、各
色散乱光を検出する光検出器とを設けることにより、カ
ラー画像を撮像可能となる。また前記第１図の実施例の
ように、照明光源あるいは光検出器と移動台15との間に
光ファイバーを介在させる場合でも、モノクロ画像を得
るように構成可能であることは言うまでも無い。

次に、第５図を参照して本発明の第３実施例について
説明する。この第３実施例の共焦点走査型顕微鏡も、第
１図の装置と同様にカラー透過型のものであるが、第１
図の装置と比べると、光ファイバー14、24の代わりにそ
れぞれ偏波面保存光ファイバー70、71が用いられ、また
送光光学系18および受光光学系21内に各々λ/4板72、73
が配され、そして偏波面保存光ファイバー70に入射する
前の照明光11、偏波面保存光ファイバー71から出射した
散乱光11″がそれぞれλ/2板74、75に通される点が異な
っている。

上記偏波面保存光ファイバー70としては、第６図に断
面形状を示すように、クラッド70a内にコア70bが配さ
れ、このコア70bの両側に応力付与部70c、70cが形成さ
れてなる、いわゆるPANDA型のものが用いられている。
そして直線偏光した照明光11は、λ/2板74を適宜回転さ
せることにより、偏波面の向きが応力付与部70c、70cの
並び方向（矢印Ｖ方向）、あるいはそれに直交する方向
（矢印Ｕ方向）と揃う状態にして、該光ファイバー70内
に入射せしめられる。なおもう一方の偏波面保存光ファ
イバー71も、上記偏波面保存光ファイバー70と同様のも
のである。

偏波面保存光ファイバー70を伝搬した後、送光光学系
18のコリメーターレンズ16によって平行光とされた照明
光11は、λ/4板72を通過して円偏光とされ、次に対物レ
ンズ17によって集光されて、試料台22に載置された試料
23上で（表面あるいはその内部で）微小な光点Ｐに結像
する。

この場合も、試料23を透過した透過光11′の光束は、
ビームトラップ５によって遮断される。一方試料23で生
じた散乱光11″は、受光光学系21の対物レンズ19によっ
て平行光とされた後、λ/4板73により円偏光から直線偏
光に変換され、次に集光レンズ20によって集光され、偏
波面保存光ファイバー71の一端から該光ファイバー71内
に入射する。

偏波面保存光ファイバー71から出射した散乱光11″
は、λ/2板75を適宜回転させることにより、ダイクロイ
ックミラー26、28にＰ偏光あるいはＳ偏光の状態で入射
せしめられる。

上記の構成においては、照明光11、散乱光11″を伝搬
させる光ファイバーとして、偏波面保存光ファイバー7
0、71を用いているので、それらの光11、11″のゆらぎ
が抑えられるようになる。したがって、この散乱光11″
を検出した出力SB,SG,SRに基づいて再生される顕微鏡像
は、ムラの無い高画質のものとなりうる。

また上記の構成において、照明光11は円偏光状態で送
光光学系18から出射してそのまま受光光学系21に入射す
るから、移動台15部分の組立てに際して、両光学系18,2
1間で偏波面を合わせる調整は不要である。したがっ
て、両光学系18,21の組立ては各々別個に行なってお
き、これら両光学系18,21を光軸合せのみで組み合わせ
ることができるから、移動台15部分の組立ては容易にな
されうる。

なお、λ/4板72および73を設ければ、上述の通りの効
果が得られるので好ましいが、これらのλ/4板72および
73を省いても構わない。その場合は、光学系の組立てに
際して偏波面保存光ファイバー70と71とを、応力付与部
の並び方向が互いに合致するように、あるいは90゜ずれ
るように位置合わせ（軸周り方向の回転位置合わせ）す
ればよい。

同様に、λ/2板74あるいは75を省くこともできる。そ
うする場合は、偏波面保存光ファイバー70あるいは71を
上記のように軸周り方向に回転させることにより、各々
の保存する偏波面の向きを、照明光11あるいはダイクロ
イックミラー26、28に対して調整すればよい。

次に、第７図を参照して本発明の第４実施例について
説明する。本実施例の共焦点走査型顕微鏡は、第５図図
示の第３実施例装置と比べると、基本的に、送光光学系
18のコリメーターレンズ16と対物レンズ17との間に、円
板状のビームトラップ３が配され、そしてビームトラッ
プ５に代えて環状のビームトラップ４が用いられている
点が異なっている。

この装置においては、上述のビームトラップ３により
照明光11が輪帯照明光とされる。したがって、試料23を
透過した透過光（直接光）11′も輪帯光となり、この透
過光11′は上記環状のビームトラップ４によって遮断さ
れる。そして試料23で生じた散乱光11″は対物レンズ19
の広い中央部分に入射し、最終的に光検出器27、29、31
によって検出される。

なお第７図図示のように、受光側の偏波面保存光ファ
イバー71の光入射端前方には、集光レンズ20による集光
スポット径と等しい径の開口を有するアパーチャピンホ
ール２を配置するのが望ましい。

また、以上説明したような輪帯照明光を利用する構成
は、第１図あるいは第４図図示の基本構成を有する共焦
点走査型顕微鏡においても、同様に適用可能である。

（発明の効果）以上詳細に説明した通り、本発明の共焦点走査型顕微
鏡においては、送光光学系と受光光学系とを一体的に移
動台に保持させ、この移動台を往復移動させて光点の主
走査を行なうように構成したから、試料台を高速で移動
させる必要がなく、よって試料が飛んでしまうことを防
止可能で、また、高速走査も可能となる。

そして本発明の共焦点走査型顕微鏡においては、照明
光ビームが振られることがないから、光学系の設計が容
易となり、またガルバノメータミラーやAOD等の高価な
光偏向器が不要で簡単な構造となっているから、本装置
は従来の共焦点走査型顕微鏡に比べて安価に形成可能と
なる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の第１実施例による共焦点走査型顕微
鏡を示す概略正面図、第２図と第３図はそれぞれ、上記共焦点走査型顕微鏡の
要部を示す平面図と側面図、第４図は、本発明の第２実施例による共焦点走査型顕微
鏡を示す概略正面図、第５図は、本発明の第３実施例による共焦点走査型顕微
鏡を示す概略正面図、第６図は、上記第３実施例の共焦点走査型顕微鏡に用い
られた偏波面保存光ファイバーの断面図、第７図は、本発明の第４実施例による共焦点走査型顕微
鏡を示す概略正面図である。３、４、５……ビームトラップ 10……RGBレーザ、11……照明光 11′……透過光、11″……散乱光 14、24……光ファイバー、15……移動台 16……コリメーターレンズ、17、19……対物レンズ 18……送光光学系、20……集光レンズ 21……受光光学系、22……試料台 23……試料 26、28……ダイクロイックミラー 27、29、31、52……光検出器 30……ミラー、32……架台 33……積層ピエゾ素子、34……ピエゾ素子駆動回路 35……２次元移動ステージ 36、39……モータ駆動回路、37、40……パルスモータ 38……マイクロメータ、41……制御回路 51……レーザダイオード 53……アパーチャピンホール 70、71……偏波面保存光ファイバー 72、73……λ/4板、74、75……λ/2板

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】試料が載置される試料台と、照明光を発する光源と、この照明光を試料上において微小な光点として結像させ
る送光光学系と、前記試料を透過した直接光を遮断するビームトラップを
含み、この試料で散乱した光を集光して点像に結像させ
る受光光学系と、この点像を検出する光検出器と、前記送光光学系と受光光学系とを一体的に保持する移動
台と、この移動台を、前記光点が前記試料上を一方向に主走査
するように往復移動させる主走査手段と、前記移動台と試料台とを、前記主走査の方向とほぼ直交
する方向に、該主走査の速度よりも低い速度で相対移動
させて、前記光点を前記試料上において副走査させる副
走査手段とからなる共焦点走査型顕微鏡。