JP2008510723A - 血管新生の治療法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1−1
Description
本出願は、2004年8月20日に出願された、米国仮出願番号第60/603,016号:発明の名称「血管内皮増殖因子及びラクトシルセラミドによって修飾された血管新生の治療法」の優先権を主張するものであり、その全を参照して本明細書に取り込む。
R及びR1は、水素及び置換基を有する又は有していない直鎖状又は分岐鎖状のC1−C6アルキルから成る群から独立に選択され、そして更にR及びR1は、一緒になって5、6又は7員環を形成していてもよく;
R2は、1個から3個の二重結合を有する又は有していない、分岐鎖状又は直鎖状のC6−C30アルキルから成る群から選択され;そして
R3は、1個から3個の二重結合を有する又は有していない、直鎖状又は分岐鎖状のC6−C20アルキル、アリール又は置換アリールから成る群から選択され、ここで、該置換アリールの置換基は、ハロゲン、C1−C4アルコキシ、メチレンジオキシ、C1−C4メルカプト、アミノ又は置換アミノであり、ここで、該置換アミノの置換基はC1−C4アルキルである;
の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を包含する。
1−フェニル−2−デカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール;
1−フェニル−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール;
1−フェニル−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ピペリジノ−1−プロパノール;
1−フェニル−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ピロリジノ−1−プロパノール;
1−モルホリノ−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ヒドロキシオクタデカ−4,5−エン;
1−ピロリジノ−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ヒドロキシオクタデカ−4,5−エン;
(1R,2R)−1−フェニル−2−デカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール(D−PDMP);又は
トランス−(2R,3R)−1−ピロリジノ−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ヒドロキシオクタデカ−4,5−エン・塩化ケレリトリン;
の1つ又はそれ以上である。
1)VEGF応答細胞集団をVEGFと共に培養し;
2)公知の又は候補のVEGF経路阻害剤を細胞に添加し;
3)VEGFが関連する工程における特定した細胞分子の活性を測定し;そし
て、
4)公知の又は候補のVEGF経路阻害剤の、細胞増殖、接着、1つ又はそれ以上のVEGF経路メンバータンパク質発現又はチューブ形成などの細胞に及ぼす効果を測定する;
工程が含まれる。
本発明は、血管新生に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療する、予防及び治療方法を提供する
R及びR1は、水素、及びアミノ、ヒドロキシ又はメルカプトのような置換基を有する又は有していない直鎖状又は分岐鎖状のC1−C6アルキルから成る群から、それぞれ独立に選択され、そして更にR及びR1は、一緒になって、ピロリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジノ又はアザシクロヘプチル等のような5、6又は7員環の置換基を形成することができ;
で表される化合物である。
(115)RELP(119)
(145)PTIKLGGHWKP(155)
(160)PRWKVAILIP(169)
(169)PFRNRHEHLP(178)
(178)PVLFRHLLP(186)
(316)PEGDTGKYKSIP(328)
(97)PENFTYSP(104)
(104)PYLP(107)
(107)PCPEKLP(113)
(143)PGGHWRP(149)
(145)PRWKVAVLIP(163)
(163)PFRNRHEHLP(172)
(172)PIFFLHLIP(180)
(311)PEGDLGKYKSIP(322)
(374)PELAP(378)
(115)RELP(119)
(145)PTIKLGGHWKP(155)
(160)PRWKVAILIP(169)
(169)PFRNRHEHLP(178)
(178)PVLFRHLLP(186)
(316)PEGDTGKYKSIP(328)
(97)PENFTYSP(104)
(104)PYLP(107)
(107)PCPEKLP(113)
(143)PGGHWRP(149)
(154)PRWKVAVLIP(163)
(163)PFRNRHEHLP(172)
(172)PIFFLHLIP(180)
(311)PEGDLGKYKSIP(322)
(374)PELAP(378)
a)好適な細胞を培地中で培養して、
1)候補のVEGF経路阻害剤又は活性化剤を添加し、
2)3Hチミジンのような放射線標識ヌクレオシドを、一般には約0.1〜100μCiの量で添加し;
b)前記細胞を、例えば、約6〜24時間インキュベートし、一般にはその後洗浄し;そして
c)その間のDNAへの放射線標識ヌクレオシドの取り込みを、アッセイ培養と同一に調製し、候補のVEGF経路阻害剤又は活性化剤を含まない条件下でインキュベートした対照培養と、対比させることにより測定する。
測定は、標識DNAをトリクロロ酢酸(TCA)でフィルター上に沈殿させ、続いてシンチレーションカウンターで測定することを含めた幾つかの方法によって実施することができる。このアッセイに関する開示のために、例えば、「Chatterjee, S., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1991) 181:554」、「Chatterjee, S. et al., (1982) Eur. J. Biochem. 120:435」を参照されたい。
a)検出可能な標識、例えば、検出可能な標識を作り出すことが出来る有色の、放射性の、発光性の(例えば、蛍光又はリン光)、又は酵素的な標識により、第1の免疫細胞集団、好ましくはある特定の白血球を標識し;
b)第1の細胞集団を、検出可能な標識、例えば、有色の、放射性の、発光性の(例えば、蛍光又はリン光)又は酵素的な標識、好ましくは工程a)で用いた標識と異なる標識で、標識された第2の内皮細胞集団と接触させ;そして
c)第1の細胞集団と第2の細胞集団の間の如何なる接着も検出する。
a)VEGF応答細胞の集団を、例えば、約1mgリポタンパク質欠乏血清/タンパク質/mL培地又はそれ以下の、リポタンパク質欠乏血清培地で、好ましくは集密になるまで培養し;
b)前記細胞を、好ましくは好適な分散性緩衝液、例えば、カコジル酸緩衝液に回収し;
c)回収した細胞を、一般的に約0.1〜100μCiの量の[14C]−UDP−ガラクトースのような、検出可能に標識されたヌクレオシド二リン酸糖供与体などの検出可能に標識された分子と好ましくはインキュベートし;そして
d)VEGF経路の酵素の活性を指標として、LacCer形成を測定する。
1)ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)及び/又は内因性PECAM−1発現欠如のヒト中・内皮腫細胞株[REN−野生型(WT)]及び/又はヒトPECAM−1を発現するREN(mt−rhPECAM−1)を培養し;
2)前記細胞を、候補のVEGF経路阻害剤又は活性化剤と接触させ;
3)前記細胞の、LacCerレベル及び/又はLacCerシンターゼ、PECAM−1、PLA2、VEGF又はVEGFRの1つ又はそれ以上の発現を分析する。
本明細書に記載した方法において有用な抗体は、VEGF、VEGFR、LacCerシンターゼ、LacCer、PECAM−1及びPLA2を含む、VEGF経路メンバーに特異的な抗体である。特に好ましい抗体は、VEGF経路メンバーの活性を阻害する抗体である。本明細書に記載した方法において有用な抗体を産生する方法は、以下に更に十分に説明する。
(115)RERLP(119)
(145)PTIKLGGHWKP(155)
(160)PRWKVAILIP(169)
(169)PFRNRHEHLP(178)
(178)PVLFRHLLP(186)
(316)PEGDTGKYKSIP(328)
(97)PENFTYSP(104)
(104)PYLP(107)
(107)PCPEKLP(113)
(143)PGGHWRP(149)
(145)PRWKVAVLIP(163)
(163)PFRNRHEHLP(172)
(172)PIFFLHLIP(180)
(311)PEGDLGKYKSIP(322)
(374)PELAP(378)
本明細書に記載された治療薬の低分子物質、ペプチド、核酸及び抗体は、医薬組成物に処方し、キットで提供することができる。医薬製剤は、送達のために医療器具上又はナノ粒子上に被覆されても良い。
VEGF経路阻害剤はまた、例えば、PECAM−1、LacCer、LacCerシンターゼ、又はPLA2siRNA分子を包含する。例えば、5’−CGGAGUGAGUGGCUUAACAdTdT−3’(センス)、5'−UGUUAAGCCACUCACUCCGdTdT−3’(アンチセンス)を含む。RNAi分子は、VEGF経路メンバーの何れか1つのmRNAの何れかの部分にも干渉するであろう。
(実施例)
材料及び方法は、http://circres.ahajournals.orgにおいて広範囲に入手可能なオンラインデータに見出すことができる。
ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)及び内皮細胞増殖培地EGM(登録商標)は、Cambrex(Walkersville, MD)から購入し、10%ウシ胎仔血清(FBS)を補充したEGM(登録商標)培地中で培養した。内因性PECAM−1発現を欠失したヒト中内皮腫細胞株[REN野生型(WT)]及びヒトPECAM−1を発現するREN(mt−rhPECAM−1)は、「Dr. Steven Albelda, University of Pennsylvania Medical Center, USA」により提供された。REN−WTを、10%FBSを補充したRPMI1640で増殖させた。REN(mtrhPECAM−1)を、G418(0.5g/L、Gibco)を含む同じ培地で培養した。
指示された時間間隔で、細胞をPBSで3回洗浄し、脂質を抽出し、HPTLCによるグリコスフィンゴリピドの測定を、前に記載したように実施した19。
VEGFとインキュベーションした細胞におけるLacCerシンターゼの活性は、前に記載されたように、ヌクレオチド糖供与体としてのUDP−[14C]ガラクトース及び受容体としてのグルコシルセラミドを採用して測定した19。
(N19)TT規則によるヒトGalT−VcDNA(GeneBank受入番号第AF038663号)のsiRNA配列は、それぞれ、5’−CGGAGUGAGUGGCUUAACAdTdT−3’(センス)、5’−UGUUAAGCCACUCACUCCGdTdT−3’(アンチセンス)であった。使用したスクランブル(陰性対照)siRNAは、それぞれ、5’−AUGGUGAUUAGACUGUACCdTdT−3’(センス)、5’−AAGCGUACUAGGAUGAGUAdTdT−3’(アンチセンス)であった。HUVECsは、製造者によって提供されるプロトコールに従って、オリゴフェクタミン(Invitrogen)を使用して、siRNA二重鎖でトランスフェクションした。
リアルタイムRT−PCRは、Bio−Rad iCycler Systemで実施した。プライマー対を設計し(Primer Quest-Integrated DNA technologies)、そして1stBASE(Singapore)から合成した。PECAM−1のプライマー配列は、それぞれ、(フォーワード)5’TGACCCTTCTGCTCTGTT3’及び(リバース)5’TGAGAGGTGGTGCTGACATC3’である。β−アクチンプライマーは、それぞれ、(フォーワード)5’AGGTCATCACTATTGGCAACGA3’及び(リバース)5’CACTTCATGATGGAATTGAATGTAGTT3’であった。温度サイクリング条件は以下の通りであった:94℃で10分の初期変性、次いで、それぞれ、94℃/30秒、60℃/40秒及び72℃/1分での40サイクルの増幅、そして最終伸長は、72℃で10分間実施した。
タンパク質25gを10%のSDS−PAGEに溶解し、ニトロセルロース膜に移した。膜結合の1次抗体を西洋わさびペルオキシダーゼにより可視化し、2次抗体を化学発光キットを使用して結合した。フィルムを、Molecular Dynamics Image Scannerを使用して密度測定的にスキャニングし、Image Quantソフトウエアを使用して解析した。
インビトロ血管新生アッセイは、Chemicon Inc. (Temecula, CA)から市販されているキットを用いて実施した。
全てのアッセイは、2回又は3回行い、値は、平均値±S.D.で表した。スチューデントのT検定を、データの統計的有意差を評価するのに使用した。P<0.05を有意とした。
PECAM−1発現に対するVEGFの効果を、HUVECsを種々の濃度のVEGF(5〜30ng/ml)を用い、異なった時間間隔でインキュベーションすることによって定量した。PECAM−1mRNAの発現の用量依存的な増加があった。PECAM−1の最大のmRNAの発現が、HUVECsをVEGFで処理(30ng/mlで4時間)した場合、リアルタイムRT−PCRにより測定して観察された(図1A)。同様に、HUVECsをVEGF25ng/mlで異なった時間処理した場合、リアルタイムRT−PCRにより明らかにされたように、最大のPECAM−1mRNAの発現が、4〜5時間で観察され、その後減少した(図1B)。更に、PECAM−1タンパク質発現は、VEGF(30ng/ml)で4時間インキュベーションの後に最大であった(図1C)。HUVECsを、VEGF(25ng/ml)と種々の時間間隔でインキュベーションした場合、PECAM−1タンパク質の発現は4時間で最大であった(図1D)。
図2Aに示すように、HUVECsをVEGF(25ng/ml)で処理すると、時間依存的様式でLacCerのデノボ(de novo)生合成が、有意に促進され(図2A、パネルAの白四角形)、これはインキュベーション開始10分後の早期に起こり、その後VEGF処理細胞でより高いまま継続した。著しく対照的に、20μMのD−PDMP[(グルコシルセラミドシンターゼの阻害剤;セラミドからグルコシルセラミド(GlcCer)の合成を遮断する)、及びLacCerシンターゼの阻害剤]で、前処理したHUVECsは、VEGF誘導のLacCer生合成を軽減した(図2A、パネルAの斜線四角形)。VEGFは、又、インキュベーション10分という早期に、GlcCerの生合成を促進し(図2A、パネルBの白四角形)、そしてD−PDMP前処理は、インキュベーション開始10分後の早期にVEGF誘導GlcCer合成を阻害した(図2A、パネルBの斜線球)。他方、LacCerのα−ガラクトシル化の産物であり、VEGFで処理された細胞で合成されるGbOse3Cerは、のレベルは、D−PDMPの存在、不存在に関わらず同じようなレベルであった(データは示していない)。
D−PDMP(10〜30μM)でのHUVECsの前処理は、VEGF誘導のPECAM−1発現の濃度依存性の阻害を発揮した(図2B)。HUVECsをD−PDMP(20μM)で90分間前処理し、次いでVEGF(25ng/ml)でインキュベーションすると、PECAM−1mRNA及びタンパク質の発現を無効にした。そして、これはLacCerによって回避された(図2C、3B)。
HUVECsをGlcCer、DGDG又はC2セラミド(各々、2.5μM)と4時間インキュベートした場合、HUVECsはPECAM−1発現を誘導しなかった(図3A)。更に、HUVECsをD−PDMPで処理し、次いでGlcCer、DGDG又はC2セラミドとインキュベーションすると、VEGF誘導のPECAM−1発現(図3B)及び血管新生(図3C、パネルe、f及び図3D)に対するD−PDMPの阻害効果を回避することができなかった。対照的に、LacCerは、D−PDMP及びVEGFの存在/不存在とは無関係にPECAM−1発現及び血管新生を有意に誘導した(図3B、Cのパネルb及び図3D)。これらの観察は、VEGF誘導のPECAM−1発現及び血管新生は、強く関連しており、LacCerによって調節されることを示唆する。
グルコシルセラミド・シンターゼの特異的阻害剤である、PPMP(20μM)でHUVECsを前処理すると、VEGF誘導のPECAM−1発現及び血管新生が軽減される結果となる(図4A、B)ことが見出された。LacCerは、VEGF誘導のPECAM−1発現及び血管新生に対するPPMPの阻害効果を逆転させた(図4A、B)。GlcCerはまた、PECAM−1発現及び血管新生に関するPPMPの阻害効果を逆転させた(図4A、B)が、LacCerに比較するとより少ない程度であった。それ故、これらの結果は、LacCerシンターゼのVEGF標的は、HUVECsにおけるPECAM−1発現及び血管新生において決定的に重要な意味があることを示唆している。
LacCerが、VEGF誘導のPECAM−1発現及び血管新生を介在するのに明確に必要とされるか否かを調べるために、本発明者らは、ヒトGalT−Vを対象とするsiRNA二重鎖を用いて、GalT−V遺伝子発現を抑制させた。GalT−Vを過剰発現しているHUVECs及び変異CHO細胞株の2つの別々の調製物から調製した細胞溶解物を用いたウエスタン免疫ブロット法から、ウサギポリクローナルGalT−V抗体(IgG)が、見かけの分子量約55KDaを有するGalT−Vと特異的に反応することが明らかになった(図5A)。更に、GalT−V特有のsiRNA二重鎖(100nM)のトランスフェクションは、HUVECsにおけるタンパク質発現を著しく減少させた(約70%GalT−V)(図5B)。更に、これらの細胞におけるGalT−V酵素の活性は、又、スクランブルsiRNA処理細胞と比較した場合、約62%減少した(図5C)。更に、GalT−Vの発現が抑制されたHUVECs(GalT-V silenced HUVECs)におけるVEGFのPECAM−1発現、及び血管新生に対する効果を調べた。スクランブルsiRNAトランスフェクションの細胞(図6B、パネルB)と比較した場合、VEGFで処理したLacCerシンターゼ(GalT−V)抑制細胞で、PECAM−1発現(図6A)及び鈍化した血管新生(図6B、パネルD及び図6C)において、変化が見られなかった。これらの結果は、LacCerは、HUVECsにおけるVEGF誘導PECAM−1発現及び血管新生を介在することの証拠を提供している。
PECAM−1が、VEGF/LacCer誘導血管新生に絶対的に必要とされるかどうかを調べるために、は、PECAM−1モノクローナル抗体でHUVECsを前処理し、次いで、VEGF又はLacCerでインキュベーションした。マウスのIgG前処理細胞ではないPECAM−1mAb(モノクローナル抗体)において、VEGF/LacCer後処理は、血管新生を顕著には誘導しなかった(図7A、パネルe、f及びg)。更に、PECAM−1が、VEGF/LacCer血管新生に極めて重要であるかどうかを理解するため、本発明者らは、表現型の上では内皮細胞に似ているが、しかし内因性PECAM−1発現を欠いているREN(WT)細胞において実験を実施した。他方、2.5kb完全なヒトPECAM−1cDNAを、PECAMの構成的発現のためにCMVプロモーターの下で、哺乳類発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)にクローン化し、RENWTにトランスフェクションし、前記27したようにREN(mt−rhPECAM−1)を作成した。REN(WT)細胞においては、VEGF/LacCerは、2%のFBS処理細胞(図8A)と比較した場合、インビトロでの血管新生アッセイ(図8B、C)でチューブ様構造を形成することができなかった。他方、ヒトPECAM−1遺伝子でトランスフェクションしたREN細胞において、VEGF/LacCerは、対照(図8D)と比較した場合、インビトロでの血管新生アッセイでチューブ形成を誘導した(図8E、F)。従って、これらの実験の結果は、PECAM−1発現は、VEGF/LacCer誘導の血管新生に必要であることを示している。更に、HUVECsをVEGF受容体(KDR/Flk−1)の拮抗薬SU1498で前処理し、次いでLacCerでなくVEGFでインキュベーションすると、チューブ形成/血管新生を誘導することができなかった。このことは、VEGFが血管新生を導き出すために、KDR/Flk−1を必要とすることを示唆している(図7c、d及びh)。これらの観察は、LacCerが、HUVECsにおけるPECAM−1発現及び血管新生を導く、VEGF誘導のシグナル伝達経路において、KDR/Flk−1の下流側に存在することを示唆している。
PKC阻害剤CC(5.0μM)、GO6850及び6976(50nM)並びにPLA2阻害剤BPB(10μM)及びMAFP(3.0μM)は、媒体(DMSO)のみで処理した細胞と比較した場合、VEGF/LacCer誘導PECAM−1発現(図1Aのオンラインデータ補充を参照されたい)及びチューブ形成(図1Bのオンラインデータ補充を参照されたい)を無効にした。このことは、LacCerが、PKC及びPLA2を補充することによってPECAM−1発現を誘導し、そしてこれらはLacCerがPECAM−1発現及び血管新生を誘導するために補充することができる下流のシグナル伝達の事象であることを示唆している。
NAC、NAPDHオキシダーゼ阻害剤(DPI)、又はNF−κB阻害剤(PDTC)のような抗酸化剤で、HUVECsを前処理すると、VEGF/LacCer誘導のPECAM−1(図2Aのオンラインデータ補充を参照)及び細胞質内NF−κB発現(図2Aのオンラインデータ補充を参照されたい)を著しく鈍化させた。この結果は、VEGFがLacCerのデノボ合成を誘導し、代わりに外部から添加したLacCerが、多分、PECAM−1発現を誘導するためにNF−κBを活性化することができるNADP(H)オキシダーゼを経由して、フリーラジカル生成を引き起こすことができることを示唆している17−19。
L−PDMPは、LacCerシンターゼの強力な活性化剤であることは以前から知られていた17,30。従って、PECAM−1発現及び血管新生に対してL−PDMPの効果があることが確定されている。細胞をL−PDMPの濃度を増加しつつ処理すると、PECAM−1発現(図3Aのオンラインデータ補充を参照されたい)及び血管新生(図3Bのオンラインデータ補充を参照されたい)を有意に誘導した。これらの観察は、PDMPの立体異性体が、LacCerシンターゼ、PECAM−1発現及び血管新生の上方及び下方の調節に関与していることを示している。
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Claims (50)
- 血管内皮増殖因子(VEGF)経路阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含む、血管新生が関与する疾患又は症状に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療する方法。
- 血管新生が関与する疾患又は症状が、癌、冠動脈性心臓病、腫瘍転移、炎症性血管障害又は糖尿病である、請求項1に記載の方法。
- VEGF経路が、ラクトシルセラミド・シンターゼ(LacCerシンターゼ)、VEGF、血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)、血小板内皮細胞接着分子1(PECAM−1)、ラクトシルセラミド(LacCer)又はPLA2の1つ又はそれ以上の相互作用又は関与を含む、請求項1に記載の方法。
- VEGF経路阻害剤が、式I:
R及びR1は、水素及び置換基を有する又は有していない直鎖状又は分岐鎖状のC1−C6アルキルから成る群から独立に選択され、そして更にR及びR1は、一緒になって5、6又は7員環を形成していてもよく;
R2は、1個から3個の二重結合を有する又は有していない、分岐鎖状又は直鎖状のC6−C30アルキルから成る群から選択され;そして
R3は、1個から3個の二重結合を有する又は有していない、直鎖状又は分岐鎖状のC6−C20アルキル及びアリール又は置換アリールから成る群から選択され、ここで、該置換アリールの置換基は、ハロゲン、C1−C4アルコキシ、メチレンジオキシ、C1−C4メルカプト、アミノ又は置換アミノであり、ここで、該置換アミノの置換基はC1−C4アルキルである;
の化合物、又は薬学的に許容されるその塩である、請求項1に記載の方法。 - R及びR1が一緒になって5、6又は7員環を形成する、請求項4に記載の方法。
- R及びR1が一緒になってピロリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジノ又はアザシクロヘプチル環を形成する、請求項5に記載の方法。
- VEGF経路阻害剤が、
1−フェニル−2−デカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール;
1−フェニル−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール;
1−フェニル−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ピペリジノ−1−プロパノール;
1−フェニル−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ピロリジノ−1−プロパノール;
1−モルホリノ−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ヒドロキシオクタデカ−4,5−エン;
1−ピロリジノ−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ヒドロキシオクタデカ−4,5−エン;
(1R,2R)−1−フェニル−2−デカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール(D−PDMP);又は
トランス−(2R,3R)−1−ピロリジノ−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ヒドロキシオクタデカ−4,5−エン・塩化ケレリトリン;
の1つ又はそれ以上である、請求項1に記載の方法。 - VEGF経路阻害剤が、SU−1498、Go6976、Go6850、臭化ブロモフェナシル(BMB)、フルオロホスホン酸メチルアラキドニル(MAFP)、カルボジチオ酸ピロリジン、塩化ジフェニレン・ヨードニウム及びN−アセチル−L−システイン;PECAN−1、PLA2、LacCer又はLacCerシンターゼの抗体又はそのフラグメント;PECAN−1、PLA2、LacCer又はLacCerシンターゼペプチド;PECAN−1、PLA2、LacCer又はLacCerシンターゼRNAiの1つ又はそれ以上である、請求項1に記載の方法。
- RNAiが、5’−CGGAGUGAGUGGCUUAACAdTdT−3’(センス)、5’−UGUUAAGCCACUCACUCCGdTdT−3’(アンチセンス)又はそのフラグメント若しくは変異体の1つ又はそれ以上である、請求項8に記載の方法。
- PECAM−1、PLA2、LacCer又はLacCerシンターゼ抗体が、IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSVND(GalT−V);IGMHMI---- RLYTNKNSTLNGT(GalT−VI);VLENSTKNSNDPAVFKDNPTEDVEYQCVADN(PECAM−1);PERLP;PTIKLGGHWKP;PRWKVAILIP;PFRNRHEHLP;PVLFRHLLP;PEGDTGKYKSIP;PENFTYSP;PYLP;PCPEKLP;PGGHWRP;PRWKVAVLIP;PFRNRHEHLP;PIFFLHLIP;PEGDLGKYKSIP;PELAP;CC(P)−x−H(LGY)−x−Cに特異的であり、且つ、ヒスチジンHが、酵素(PLA2)又はそのフラグメント若しくは変異体の活性部位である、請求項8に記載の方法。
- PECAM−1、PLA2、LacCer又はLacCerシンターゼペプチドが、IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSVND(GalT−V);IGMHMI---- RLYTNKNSTLNGT(GalT−VI);VLENSTKNSNDPAVFKDNPTEDVEYQCVADN(PECAM−1);PERLP;PTIKLGGHWKP;PRWKVAILIP;PFRNRHEHLP;PVLFRHLLP;PEGDTGKYKSIP;PENFTYSP;PYLP;PCPEKLP;PGGHWRP;PRWKVAVLIP;PFRNRHEHLP;PIFFLHLIP;PEGDLGKYKSIP;PELAP;CC(P)−x−H(LGY)−x−Cの1つ又はそれ以上であり、且つ、ヒスチジンHが、酵素(PLA2)又はそのフラグメント若しくは変異体の活性部位である、請求項8に記載の方法。
- 対象が血管新生が関与する疾患又は症状の治療を要していること同定することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記同定が、癌、冠動脈性心臓病、腫瘍転移、炎症性血管障害、虚血再潅流傷害、高血圧又は糖尿病の診断を含む、請求項12に記載の方法。
- VEGF経路阻害剤が、対象に対して、経口で、筋肉内に、腫瘍内に、ステントで又は腹腔内に投与される、請求項1に記載の方法。
- 治療有効量のVEGF阻害剤がVEGF誘導のインビトロ血管新生/チューブ形成を減少させる、請求項1に記載の方法。
- 1つ又はそれ以上のVEGF経路阻害剤が、医療器具上に被覆されている又は医療器具内に含有されている、請求項1に記載の方法。
- 医療器具が生分解性の生体高分子を含む、請求項16に記載の方法。
- 医療器具がステントである、請求項17に記載の方法。
- 対象の血管新生を低下させるVEGF経路阻害剤の治療能を測定する方法であって:
侵襲的な外科的処置を対象に行い;
VEGF経路阻害剤を対象に投与し;そして
対象の血管成長を調べる;
ことを含む方法。 - 侵襲的な外科的処置が腫瘍切除である、請求項19に記載の方法。
- 対象が動物モデルである、請求項19に記載の方法。
- 動物モデルが腫瘍の異種移植片である、請求項21に記載の方法。
- 対象の血管新生を低下させるVEGF経路阻害剤の治療能を測定する方法であって:
対象の血管新生の治療前レベルを測定し;
治療有効量のVEGF経路阻害剤を対象に投与し;そして
対象の血管新生の治療後レベルを測定する;
ことを含む方法。 - 血管新生の低下がVEGF経路阻害剤が有効であることを示す、請求項23に記載の方法。
- 血管新生の治療前及び治療後のレベルが病変組織で測定される、請求項23に記載の方法。
- 病変組織が、肺、心臓、肝臓、腫瘍又は脈管構造の1つ又はそれ以上である、請求項23に記載の方法。
- 血管新生のレベルが、PECAM−1発現、GalT−V発現、チューブ形成又はLacCerレベルによって測定される、請求項23に記載の方法。
- 血管新生治療のためのVEGF経路阻害剤候補の治療能を測定する方法であって:
細胞集団を準備し;
細胞を候補の組成物に接触させ;そして
候補組成物の、PECAM−1発現、GalT−V発現、チューブ形成又はLacCerレベルの1つ又はそれ以上に対する効果を測定する;
ことを含む方法。 - 細胞を候補の化合物に接触させる前に、細胞をVEGFに接触させることを更に含む、請求項28に記載の方法。
- 細胞を候補の化合物に接触させた後に、細胞をVEGFに接触させることを更に含む、請求項28に記載の方法。
- 血管内皮増殖因子(VEGF)経路活性化剤の治療有効量を対象に投与することを含む、組織変性に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療する方法。
- 組織変性が、胎児の子宮内発育、全身性硬化、創傷治癒、虚血、再潅流傷害、糖尿病、冠動脈疾患、腫瘍成長に関係する、請求項31に記載の方法。
- VEGF経路が、ラクトシルセラミド・シンターゼ(LacCerシンターゼ)、VEGF、血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)、血小板内皮細胞接着分子1(PECAM−1)、ラクトシルセラミド(LacCer)又はPLA2の1つ又はそれ以上の相互作用又は関与を含む、請求項31に記載の方法。
- VEGF経路活性化剤が、式I:
R及びR1は、水素及び置換基を有する又は有していない直鎖状又は分岐鎖状のC1−C6アルキルから成る群から独立に選択され、そして更にR及びR1は、一緒になって5、6又は7員環を形成していてもよく;
R2は、1個から3個の二重結合を有する又は有していない、分岐鎖状又は直鎖状のC6−C30アルキルから成る群から選択され;そして
R3は、1個から3個の二重結合を有する又は有していない、直鎖状又は分岐鎖状のC6−C20アルキル及びアリール又は置換アリールから成る群から選択され、ここで、該置換アリールの置換基は、ハロゲン、C1−C4アルコキシ、メチレンジオキシ、C1−C4メルカプト、アミノ又は置換アミノであり、ここで、該置換アミノの置換基はC1−C4アルキルである;
の化合物のL−異性体、又は薬学的に許容されるその塩である、請求項31に記載の方法。 - R及びR1が一緒になって5、6又は7員環を形成する、請求項34に記載の方法。
- R及びR1が一緒になってピロリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジノ又はアザシクロヘプチル環を形成する、請求項35に記載の方法。
- VEGF経路阻害剤が、
1−フェニル−2−デカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール;
1−フェニル−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−モルホリノ−1−プロパノール;
1−フェニル−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ピペリジノ−1−プロパノール;
1−フェニル−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ピロリジノ−1−プロパノール;
1−モルホリノ−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ヒドロキシオクタデカ−4,5−エン;
1−ピロリジノ−2−ヘキサデカノイルアミノ−3−ヒドロキシオクタデカ−4,5−エン;
のL−異性体の1つ又はそれ以上である、請求項31に記載の方法。 - 対象が組織変性の治療を要していること同定することを更に含む、請求項31に記載の方法。
- VEGF経路活性化剤が、対象に対して、経口で、筋肉内に、腫瘍内に、ステントで又は腹腔内に投与される、請求項38に記載の方法。
- 対象の組織変性を低下させるVEGF経路活性化剤の治療能を測定する方法であって:
対象の治療前の組織変性レベルを測定し;
VEGF経路活性化剤の治療有効量を対象に投与し;そして
対象の治療後の組織変性レベルを測定する;
ことを含む方法。 - 組織変性の低下がVEGF経路活性化剤が有効であることを示す、請求項40に記載の方法。
- 組織変性の治療前及び治療後のレベルが病変組織で測定される、請求項40に記載の方法。
- 病変組織が、胎児、肺、心臓、肝臓、脈管構造又は神経組織の1つ又はそれ以上のものである、請求項40に記載の方法。
- 脈管構造が、心臓又は他の組織への側副血流を増加させる1つ又はそれ以上の心室微細血管の形成である、請求項43に記載の方法。
- 組織変性のレベルが、PECAM−1発現、GalT−V発現、チューブ形成又はLacCerレベルによって測定される、請求項40に記載の方法。
- 組織変性治療のためのVEGF経路活性化剤候補の治療能を測定する方法であって:
細胞集団を準備し;
細胞を候補組成物に接触させ;そして
候補組成物の、PECAM−1発現、GalT−V発現、チューブ形成又はLacCerレベルの1つ又はそれ以上に対する効果を測定する;
ことを含み、且つ、PECAM−1発現、GalT−V発現、チューブ形成又はLacCerレベルの1つ又はそれ以上の増加が、候補組成物が有効であり得ることを示す方法。 - 血管内皮増殖因子(VEGF)経路阻害剤及びVEGF経路活性化剤の治療有効量を対象に投与することを含む、血管新生に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療する方法。
- 阻害剤が特定の組織で血管新生を減少させ、そして活性化剤が他の組織で成長を促進させる、請求項47に記載の方法。
- 阻害剤及び活性化剤が生分解性の生体高分子上に被覆されている又は生体高分子内に含有されている、請求項47に記載の方法。
- 阻害剤及び活性化剤がナノ粒子上に被覆されている、請求項47に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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