CN107502623B - 递送VEGF-siRNA的纳米金刚石,其制备,活性和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了递送VEGF‑siRNA的递送体系VEGF‑siRNA/ND‑CONHCH2CH2NH‑SDGR，公开了它的制备方法，公开了它的纳米结构，公开了它转染VEGF‑siRNA的效率，公开了它沉默VEGF基因的作用，公开了它下调VEGF蛋白表达的作用，公开了它抑制瘤细胞增殖的作用，进一步公开了它抑制S180小鼠肿瘤生长的作用，因而公开了它在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。

Description

递送VEGF-siRNA的纳米金刚石,其制备,活性和应用
技术领域
本发明涉及递送VEGF-siRNA的体系VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR，涉及它的制备方法，涉及它的纳米结构，涉及它转染VEGF-siRNA的效率，涉及它沉默VE GF基因的作用，涉及它下调VEGF蛋白表达的作用，涉及它抑制瘤细胞增殖的作用，进一步涉及它抑制S180小鼠肿瘤生长的作用，因而涉及它在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。属于生物医药学领域。
背景技术
肿瘤生长与转移依赖于新生血管提供营养以及排泄代谢产物，VEGF作为内皮细胞的有丝分裂原和促血管生成因子影响肿瘤的血管生成的整个过程。下调血管内皮生长因子表达，是抑制肿瘤生长的有效手段。安全有效地将VEGF基因载入肿瘤细胞，取决于载体。纳米金刚石是碳元素组成的非病毒性载体。粒径小、比表面积大、化学稳定、安全和生物相容是的纳米金刚石的基本特点。
RNA干扰是极具潜力的肿瘤治疗途径之一。siRNA一旦进入肿瘤细胞就能抑制目的基因表达，从而抑制肿瘤细胞生长。由于siRNA易被体内核酸酶降解、半衰期短、转染效率低，所以发明siRNA的靶向载体，具有临床应用的重要性。RGD四肽与肿瘤细胞表面整合素αγβ3的受体可特异性结合，具有肿瘤靶向性。发明人曾经公开VEGF-siRNA/ND-CORGDS是VEGF-siRNA的递送体系。可是2mgVEGF-siRNA/ND-CORGDS只能包载0.1μg VEGF-siRNA。载VEGF-siRNA的容量小。此外，VEGF-siRNA/ND-CORGDS向肿瘤细胞转染VEGF-siRNA的时间为6小时。转染时间长。为了提高RGD四肽修饰的纳米金刚石包载VEGF-siRNA的容量并缩短RGD四肽修饰的纳米金刚石向肿瘤细胞转染VEGF-siRNA的时间，发明人经过艰苦的研究。最终发明人发现，将纳米金刚石表面的酰氯基与乙二胺的一个氨基酰胺化，RGDS与乙二胺的另一个氨基酰胺化，制得的ND-CONHCH2CH2NH-SDGR再包载VEGF-siRNA。
1mgVEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR中可包载17.8μg VEGF-siRNA。包载容量提高了35.6倍。VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR转染VEGF-siRNA的时间为4小时。转染时间缩短了2小时。这是意想不到的技术效果。根据这个发现，发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的第一个内容是提供VEGF-siRNA的递送体系VEGF-siRNA/ND-CONHCH2-CH2NH-SDGR。
本发明的第二个内容是提供VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR的制备方法。
本发明的第三个内容是提供VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR的纳米结构。
本发明的第四个内容是评价VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR转染VEGF-siRNA的效率。
本发明的第五个内容是评价VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR沉默VEGF基因的作用。
本发明的第六个内容是评价VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR下调VEGF蛋白表达的作用。
本发明的第七个内容是评价VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR抑制肿瘤细胞增殖的作用。
本发明的第八个内容是评价VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR抑制肿瘤生长的作用。因而公开了它在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。
附图说明
图1ND，ND-CONHCH2CH2NH2，ND-CONHCH2CH2NH-SDGR及VEGF-siRNA/ND-
CONHCH2CH2NH-SDGR的扫描电镜图和透射电镜图。
图2VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR的原子力显微镜图。
图3VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR的DSC放热曲线。
图4激光共聚焦评价ND-CONHCH2CH2NH-SDGR转染VEGF-siRNA到HeLa细胞的效率。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR
1)制备Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl
将0.500g(1.16mmol)的Boc-Arg(Tos)溶解在5mL无水四氢呋喃(THF)中，在溶液中加入0.190g(1.40mmol)N-羟基苯丙三氮唑(HOBt)溶解完全。在冰浴条件下逐滴滴加 入无水四氢呋喃0.288g(1.40mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)，并且活化30min以上，得到溶液I。将0.282g(1.40mmol)HCl·Gly-OBzl溶解于无水四氢呋喃，并且用N-甲基吗啉(NMM)将溶液调至pH＝8.0，得到溶液II。活化完成后，将反应液II加入反应液I中，室温下在磁力搅拌器上反应12h，利用薄层层析版监测到反应液中原料Gly-OBzl斑点消失。将反应液过滤，弃去反应生中生成的杂质二环己基脲(DCU)，将得到的滤液减压蒸馏去除四氢呋喃，残留的固体用50mL乙酸乙酯溶解，之后用饱和的碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液，5％的硫酸氢钾水溶液和饱和氯化钠水溶液依次萃洗，重复三次。将所得的有机相加入无水硫酸钠进行干燥，过滤并且回收溶剂，得到目标化合物Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl 0.640g(92.25％)。
2)制备Boc-Arg(Tos)-Gly
将所得产物Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl取0.127g(0.26mmol)溶于2.5mL甲醇中，加入0.018g的钯碳(15％)，用真空循环水泵将反应瓶中气体抽出后通入氢气，室温在搅拌器上反应12h，薄层层析版监测反应液可见Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl斑点消失。减压蒸馏除尽甲醇，得到0.1g(93.2％)白色固体粉末目标化合物。
3)制备Boc-Asp(OMe)-Ser-OBzl
按照1)的接肽法由0.576g(2.33mmol)Boc-Asp(OMe)与0.648g(2.80mmol)HCl·Gly-OBzl制得Boc-Asp(OMe)-Ser-OBzl 1.02g(98.88％)，为淡黄色油状物。
4)制备HCl·Asp(OMe)-Ser-OBzl
取1.050g(2.73mmol)溶于5mL长期干燥的乙酸乙酯中，冰浴条件下再加入15mL4mol/L氯化氢的乙酸乙酯，冰浴下反应4h后，可见溶液中有大量白色固体析出，薄层层析硅胶板可监测到原料斑点消失。将反应液过滤，将滤出物用干燥乙酸乙酯反复冲洗，将残留物加入少量乙醚进行反复减压蒸馏去除氯化氢，最后得到目标化合物为无色粉末。
5)制备Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Ser-OBzl
按照1)的接肽法由1.503g(3.10mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly与1.200g(3.33mmol)HCl·Asp(OMe)-Gly-OBzl制得2.196g(89.44％)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Ser-OBzl，为无色固体。ESI-MS(m/e):792[M+H]+。
6)制备Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Ser-OBzl
按照2)的氢解方法将3.46g(4.99mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Ser-OBzl加入660mg钯碳(15％)的甲醇溶液中，制得2.59g(84.64％)Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Ser-OBzl，为无色固体。ESI-MS(m/z):702[M+H]+。IR(cm-1)：3323.17,2934.65,1657.08,1438.90, 1393.41,1246.81,1162.49,1079.44,1017.38,814.29,672.66.1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ/ppm:8.185(d,J＝9Hz,1H),8.070(s,1H),7.945(d,9Hz,2H),7.635(d,J＝9Hz,2H),7.285(d,J＝9.0Hz,2H),6.935(d,J＝9.0Hz,2H),6.630(s,1H),4.730(q,J＝9.0Hz,1H),4.205(q,J＝3.0Hz,1H),3.885(m,1H),3.710(m,1H),3.630(m,1H),3.580(s,3H),3.030(s,2H),2.765(dd,J1＝4.0Hz,J2＝4.0Hz,H),2.500(m,1H),2.340(s,1H),1.600(s,1H),1.380(m,12H)。
7)制备ND-CO2H
将纳米金刚石粉末(ND)置于真空干燥箱中干燥48h，将500mg ND悬浮于20mL浓酸溶液(浓硫酸/浓硝酸，3/1，v/v)，90℃回流48h。反应液冷却，超声3h，然后8000rpm离心15min，弃上清，加入NaOH水溶液(0.1M)，超声1h，90℃回流1h，冷却，离心弃去上清，加入盐酸(0.1M)，超声1h，90℃回流1h，冷却，离心去上清，残留物用双蒸水洗五次至上清液呈中性，13000rpm离心30min，残留物悬浮在无RNA酶水中，冷冻干燥，得到标题化合物，为灰色粉末。IR(cm-1)：3398.32,2975.76,2162.96,1979.27,1727.67,1644.98,879.71。
8)制备ND-COCl
将ND-CO2H置于真空干燥箱中干燥96h，之后悬浮于二氯亚砜(SOCl2)中超声15min，120℃回流24h，冷却，室温下减压浓缩除二氯亚砜，残留物加无水乙醚反复减压浓缩，将产物直接应用于下一步反应。IR(cm-1)：3375.13,2963.99,1712.16,1630.72,1263.19,1081.34,901.70,806.42。
9)制备ND-CONHCH2CH2NHBoc
将1.0g N-叔丁氧羰基乙二胺溶解于25mL无水四氢呋喃中，将得到的溶液加入到0.1g ND-COCl粉末中，超声15min，50℃反应6h，冷却，8000rpm离心15min，残留物以双蒸水洗五次至上清液液呈中性，13000rpm离心30min，将残留物悬浮在无RNA酶水中，冷冻干燥，得到标题化合物，为灰色粉末。IR(cm-1)：3397.32,2926.45,1762.99,1718.88,1630.90,1155.33,1018.56,923.62。
10)制备ND-CONHCH2CH2NH2
按照4)的方法，由0.20g ND-CONHCH2CH2NHBoc与25mL氯化氢乙酸乙酯溶液(4M)反应2.5h，8000rpm离心15min，残留物用双蒸水洗五次至上清液呈中性，13000rpm离心30min，将残留物悬浮在无RNA酶水中，冷冻干燥，得到标题化合物，为灰色粉末。IR(cm-1)：3375.13,2963.99,1712.16,1630.72,1263.19,1081.34,901.70,806.42。
11)制备ND-CONHCH2CH2NH-SD(OMe)GR(Tos)Boc
将0.900g Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Ser-OBzl溶解在20mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.300gND-NHCH2CH2NH2，搅拌12h，超声3h，搅拌24h，8000rpm离心15min，残留物13000rpm离心30min，残留物悬浮在无RNA酶水中，冷冻干燥，得到0.352g标题化合物，为灰色粉末。IR(cm-1)：3327.18,2977.14,1660.38,1541.42,1439.13,1367.24,1249.47,1130.20,814.85,674.68。
12)制备ND-CONHCH2CH2NH-SDGR
冰水浴下将0.330g ND-CONHCH2CH2NH-SD(OMe)GR(Tos)Boc悬浮于10ml三氟甲磺酸/三氟乙酸混酸中(1/4，v/v)，室温搅拌30min，8000rpm离心15min。冰水浴下将上清酸液调pH至中性后弃去，残留物用双蒸水洗五次至上清液pH呈中性，13000rpm离心30min，残留物悬浮在无RNA酶水中，冷冻干燥，得到标题化合物，为灰色粉末。IR(cm-1)：3354.08,1660.97,1537.07,1242.95,1170.05,1026.37,762.21,636.98。
13)制备VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR
将1mg ND-CONHCH2CH2NH-SDGR悬浮于无RNA酶水中，配制成浓度为3.71μg/mL的溶液，加入同体积VEGF-siRNA(10μM)，混匀，至少静置10min，得到标题化合物。IR(cm-1)：3364.42,1661.32,1537.27,1108.15,1026.37,636.54。
实施例2表征VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR的纳米结构
取100μL ND，ND-CONHCH2CH2NH2，ND-CONHCH2CH2NH-SDGR和VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR与无RNA酶水制备的悬浮液(25μg/mL)，分别滴加到玻璃片上，37℃真空干燥箱干燥两周，表面镀纳米金后在扫描电镜(HITACHI S-4800，日本)测定扫描电镜图。取20μL ND，ND-CONHCH2CH2NH2，ND-CONHCH2CH2NH-SDGR和VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR与无RNA酶水制备的悬浮液(25μg/mL)，分别滴加到200目的铜网上，37℃真空干燥箱干燥两周，在透射电镜(JEM-1230，JEOL，日本)测定透射电镜图。结果见图1。图1表明，在扫描电镜下ND的粒径为30-60nm，ND-CONHCH2CH2NH2的粒径为40-60nm，ND-CONHCH2CH2NH-SDGR的粒径为50-80nm，VEGF-siRNA/ND-CONH-CH2CH2NH-SDGR的纳米粒径为80-110nm。
将雄性SD大鼠麻醉，颈动脉插管取血，用3.8％的柠檬酸钠浸润过的离心管接血，取血后立即离心，第一次4℃，4000rpm离心10min，第二次4℃，10000rpm离心10min，小心吸取上清用水稀释20倍后得到空白血浆。取1mg VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR分别用水和空白血浆悬浮，制成浓度为3.71μg/mL的悬浮液，各吸取100μL分别滴加到云母片上，37℃烘干24h，在原子力显微镜 (Veeco diNanoscope 3D，美国)下测定原子力显微镜图。结果见图2。结果表明在水和血浆中VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR都形成粒径为100nm左右的纳米粒。
实施例3VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR的差示量热扫描分析
用无RNA酶水将ND-CONHCH2CH2NH-SDGR按照载siRNA的浓度120，80，40，20，0nM配置样品液，分别取25μL样品液加入铝坩埚，在坩埚盖扎孔然后用密封压机冷压密封(保证底部平整、坩埚和盖紧密)，将差事扫描量热仪(DSC 204F1
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000061
NETZSCH，德国)设置开启保护气、吹扫器(N2，20mL/min)，设置冷却速率20K/min，从20℃升温至200℃，根据放热-温度曲线中，VEGF-siRNA浓度对吸热峰的影响观察VEGF-siRNA和载体的结合情况。结果见图3。图中峰谷由低到高表示载体与VEGF-siRNA混合配制的药物溶液中的VEGF-siRNA浓度依次为120，80，40，20，0nM。从图中可见随着VEGF-siRNA量升高，熔点从149.1℃降低至138.7℃。同时，随形成的VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR浓度增加，吸热越来越少，表明ND-CONHCH2CH2NH-SDGR成功包载了VEGF-siRNA。
实施例4测定VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR中VEGF-siRNA的量
1)制胶首先将制胶用具用无水乙醇润洗，晾干。取0.5g琼脂糖加入50mL Tris-硼酸电泳缓冲液(成分包括三羟甲基氨基甲烷，硼酸，乙二胺四乙酸)，在烧杯中用封口膜封好扎眼，放入微波炉中加热3min使琼脂糖彻底溶解，冷却到50℃左右，加入8μL溴化乙锭(10mg/mL)，混合均匀之后缓慢倒入水平放置的内槽，梳子插到固定位置，待凝胶凝固，形成均匀的胶层，垂直拔出梳子。
2)制备样品分别配置浓度为0，0.09，0.19，0.37，0.74，1.48，2.97，5.94μg/μL的ND-CONHCH2CH2NH-SDGR悬浮液，各取20μL加入到1mL的离心管中，然后各离心管中加入浓度为10μM的VEGF-siRNA 8μL，震荡混匀，室温静置至少10min使ND-CONHCH2CH2NH-SDGR与VEGF-siRNA充分悬浮，取8支新的离心管，编号1-8，按ND-CONHCH2CH2NH-SDGR浓度从低到高分别取20μL悬浮液，然后向编号的离心管中加入RNA上样缓冲液(5μL×5)。震荡混匀后放入37℃恒温孵育箱孵育0.5h，得到电泳样品。
3)上样及电泳首先将内槽和凝胶放入电泳槽中，向电泳槽中加入350mLTris-硼酸电泳缓冲液，按照载体浓度由低到高依次加20μL得到的电泳样品到孔中。将电泳仪(DYY-6C，北京六一仪器厂，中国)电压设置为95V，运行30min，电泳结束后通过紫外凝胶成像系统(FluorChem FC3，ProteinSimple，美国)并拍照。结果表明ND-CONHCH2CH2NH-SDGR浓度为零的时候荧光强度最强，并且随ND-CONHCH2CH2- NH-SDGR浓度升高荧光逐渐减弱，ND-CONHCH2CH2NH-SDGR浓度为1.48μg/μL开始无荧光。因而得到1μg ND-CONHCH2CH2NH-SDGR可包载2.965pmol VEGF-siRNA，包载VEGF-siRNA的包载容量相比于VEGF-siRNA/ND-CORGDS提高了35.6倍。
实施例5测定VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR体外释放VEGF-siRNA
分别设置三个浓度测定体外释放，每1mg ND和ND-CONHCH2CH2NH-SDGR分别载22.235μg，17.788μg和13.341μg的FAM-VEGF-siRNA，加入TE缓冲液[Tris-HCl(10mM)和EDTA(1mM)pH 8.0，液体最终总体积为500μL，于37℃摇床120次/分振荡，分别于0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，24h，72h，120h，144h，168h，192h，216h，240h，264h，288h和312h 14000rpm离心15min，取200μL上清液并加入新TE缓冲液补足至500μL，上清液加入96孔板中在激发波长480nm和发射波长520nm处测定FAM荧光，计算累积释放FAM-VEGF-siRNA的百分数，实验重复三次。结果见表1和表2。
表1 VEGF-siRNA/ND累积释放FAM-VEGF-siRNA百分量(均值±SD％，n＝3)
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000071
表2 VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR累积释放VEGF-siRNA百分量(均值±SD％，n＝3)
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000072
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000081
FAM-VEGF-siRNA在ND与ND-CONHCH2CH2NH-SDGR上于24h之内均有突释现象，随后siRNA平稳释放。144h FAM-VEGF-siRNA/ND释放FAM-VEGF-siRNA完全，而312h FAM-VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR释放FAM-VEGF-siRNA完全。
实施例6激光共聚焦评价VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR向HeLa细胞转染VEGF-siRNA的效率
设置三个组，分别为无血清培养基组，FAM-VEGF-siRNA组和FAM-VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR组，FAM-VEGF-siRNA浓度均为100nM。HeLa细胞模型。将对数生长期的细胞在密度生长达到70-80％消化下来，1500rmp离心3min，用完全DMEM培养基吹打均匀，稀释细胞浓度至1.5×105cells/mL，35-mm共聚焦培养皿中每孔加入1mL细胞混悬液，培养12h其密度达到60％后，将上清液弃去，用磷酸盐缓冲液洗三遍，将Hoechst 33342用DMEM培养基稀释并加入共聚焦皿中，每皿1mL对细胞核染色，将皿放入细胞培养箱培养30min，然后用温磷酸盐缓冲液洗五次，残留物入无血清、青霉素及链霉素的DMEM培养基配制的FAM-VEGF-siRNA和FAM-VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR溶液，转染4h，用温磷酸盐缓冲液洗5次，用激光共聚焦显微镜观察转染情况，利用Image-Pro Plus v 6.0(Media Cybernetics，美国)将图片转换成灰度8.0，根据IOD Sum/Aera Sum测定平均荧光强度值。结果表明，FAM-VEGF-siRNA为绿色荧光标记的基因，Image-Pro Plus v 6.0(Media Cybernetics，美国)分析得到平均荧光强度值为67.64。VEGF-siRNA组在4小时后细胞中没有见到绿色荧 光，说明基因不能直接穿过细胞膜发生作用，这一结果与噻唑蓝法测定的VEGF-siRNA组对HeLa细胞无增殖抑制相符合。VEGF-siRNA/ND-NHCH2CH2NH-SDGR组转染4小时后，蓝色细胞核无碎裂，细胞状态良好，细胞质中可清晰见到绿色荧光围绕在核周，说明4小时之内VEGF-siRNA已成功地转染到HeLa细胞中。
实施例7反转录-聚合酶链反应评价VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR沉默VEGF基因作用
提取细胞全RNA对数生长期的HeLa细胞，在其密度生长达到70-80％将其消化下来，1500rmp离心3min，用完全培养基吹打均匀，稀释细胞浓度至2×105cells/mL，六孔板中每孔加入2mL细胞混悬液，培养12h，密度增加60％后将上清液弃去，残留物用磷酸盐缓冲液洗3次，加入不含FBS、青霉素和链霉素的DMEM培养基，设置无血清培养基组、VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR组和非同源RNA组。VEGF-siRNA浓度为100nM，每孔加入2mL，培养箱中培养24小时后，取出放于冰上，弃上清液，加入冰磷酸盐缓冲液洗三次后将磷酸盐缓冲液吸尽弃去。每孔加入1mL总RNA抽提试剂(Trizol reagent，life，美国)在冰上晃动，用移液器吹打至细胞完全裂解，将6个孔的总RNA抽提试剂分别转移到1.5mL离心管中编号1-6，在冰上静置5min。每个离心管中加入200μL三氯甲烷，剧烈震荡30s，室温静置3min，4℃12000rpm离心15min，离心后可见离心管中液体分为上下两层，上层为水相，下层为有机相，RNA溶解于水相中。1-6孔分别吸取400μL上层水相并且转移至新的无RNA酶离心管中，编号A-F，向A-F各管中分别加入0.5mL异丙醇，冰盒上静置10min，待RNA充分沉淀，4℃12000rpm离心10min，弃去上清。A-F管分别加入75％乙醇，振荡涡旋30s清洗RNA沉淀，然后4℃8000rpm离心5min，弃上清，残留物暴露在空气中室温干燥10min，每管加入50μL无RNA酶水吹打溶解RNA。分别取2μL滴加到超微量分光光度计(Nanodrop-1000，Thermo，美国)的测量臂上，设置测定RNA-40，测定各组RNA浓度。
RNA逆转录提前30min将需要的样品及试剂放在冰盒上融化，根据测定的RNA浓度将RNA稀释并且计算2μg需要的体积，将反转录-聚合酶链反应专用96孔反应板放在冰上，每孔加1μL逆转录酶(20×)、10μL反转录缓冲液(2×)以及RNA溶液，用无RNA酶水补足每孔混匀，使液体总体积为20μL，将96孔板用配套封膜密封在4℃1000rmp离心3min，然后放至核酸扩增仪(PCR System 9700，Applied Biosystems，美国)中，设置94℃逆转5min，75℃30s，72℃25s，72℃7min，4℃∞，循环设置30。逆转录完成后，设置超微量分光光度计测定cDNA-50，分别吸取2μL测定cDNA浓度。
反转录-聚合酶链反应提前30min将基因表达预混液(
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000102
Gene ExpressionMaster Mix，Applied Biosystems，美国)、血管内皮生长因子基因检测试剂盒(VEGFassay，Applied Biosystems，美国)及3-磷酸甘油脱氢酶基因检测试剂盒(GAPDH assay，Applied Biosystems，美国)放在冰盒上融化，根据测定的cDNA浓度将cDNA稀释并计算25ngcDNA需要的稀释液体积，将聚合酶链反应专用96孔板放置冰上，每孔加1μL引物(3-磷酸甘油脱氢酶基因或者血管内皮生长因子基因)，10μL基因表达预混液以及cDNA溶液，用无RNA酶水补足至每孔总体积为20μL。将96孔板用配套封膜密封，4℃于1000rmp离心3min后放至实时定量聚合酶链反应仪(Applied Biosystem 7500，Applied Biosystem，美国)中，条件设置为hold：50℃下2min，95℃下10min。40循环：90℃下15s，0℃下1min。将仪器方法设置为2-△△Ct法(Ct：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，△Ct＝待测样品的基因Ct值-待测样品内参的Ct值，△△Ct＝扩增后△Ct-扩增前 △Ct)，以3-磷酸甘油脱氢酶基因(GAPDH)作内参，对各实验组的mRNA相对定量。实施例中的RNAiMAX为市售的阳性转染载体试剂。测定结果见表3。结果表明，VEGF-siRNA/RNAiMAX组和VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR组mRNA明显减少，且两组之间p＞0.05无统计学差异。证明在mRNA水平，VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR和阳性对照脂质体的转染能力相当，能够达到基因沉默目的。非同源siRNA/RNAiMAX、VEGF-siRNA，非同源siRNA/RNAiMAX/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR组与无血清培养基组之间无统计学差异，说明它们不能抑制mRNA表达。
表3 VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGRD对HeLa细胞同源mRNA表达的影响
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000101
实施例8酶联免疫吸附评价VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR下调VEGF蛋白表达作用
蛋白提取对数生长期HeLa细胞密度增加70-80％之后消化下来，1500rmp离心3min，用完全培养基吹打均匀，稀释细胞浓度至5×105cells/mL，24孔板中每孔加入500μL细胞混悬液，培养12h密度增加60％后将上清液弃去，残留物用磷酸盐缓冲液洗三次，设无血清培养基组、VEGF-siRNA组、非同源siRNA组、VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2N H-SDGR组(siRNA浓度设置为60、80和100nM)、非同源siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR组，VEGF-siRNA/RNAiMAX组，非同源siRNA/RNAiMAX组，其中未标明浓度给药组的基因浓度均为100nM，给药4h后更换上清液为无FBS、青霉素及链霉素的DMEM培养基并且在培养箱中继续培养48h，取上清液，4℃于1000rpm离心5min，留取300μL上清液。
试剂盒检测将试剂盒置于室温平衡至少30min，将VEGF标准品加1.4mL标准品溶解液(Standard Dilute Buffer，life，美国)，轻柔震荡混匀，静置10min，取2mL离心管8支，管1加入510μL标准品溶解液，剩余7管每管加300μL标准品溶解液，取90μLVEGF标准蛋白溶液加入管1，然后依次取300μL混匀后的溶液加入后面的离心管，倍比稀释，配置浓度分别为1500，750，375，188，93.8，46.9，23.4，0pg/mL的标准蛋白稀释液。分别设空白孔、标准品孔和VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR孔。标准品孔和VE GF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR孔分别加入50μLRNA孵育液(RNA Incubation B uffer，life，美国)，溶解液(DiluteBuffer，life，美国)标准品孔加VEGF蛋白稀释液，VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR孔加细胞上清液。将96孔板封膜室温孵育2h，孵育后用洗涤液(wash buffer)洗4次，甩干。标准品孔和VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR孔分别加100μL人VEGF亲和素偶联物(HumanVEGFBiotin Conjugate，l ife，美国)，封膜室温孵育1h，孵育后用洗涤液洗4次，甩干。加入稀释的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(Streptavidin-HRP，life，美国)100μL，封膜室温孵育30min，孵育后用洗涤液洗4次，甩干。空白孔、标准品孔和VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR孔加100μL发光剂(Stablized Chromogen，life，美国)封膜室温避光孵育30min，每孔加入100μL终止液(stop solution，life，美国)轻敲混匀。在两小时内用酶标仪在450nm波长测量各孔的吸光度。实施例中的RNAiMAX为市售的阳性转染载体试剂。结果见表4。
表4 VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGRD对HeLa细胞表达VEGF的影响
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000111
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000121
结果表明，阴性对照组，VEGF-siRNA组，非同源siRNA/RNAiMAX组和非同源siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR组与无血清培养基组的HeLa细胞分泌VEGF的量无显著性差异，说明VEGF-siRNA没有起到下调VEGF蛋白表达的作用。
VEGF-siRNA/RNAiMAX组和VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR梯度给药各组的HeLa细胞，与无血清培养基组的HeLa细胞分泌VEGF的量均有统计学差异，说明VEGF-siRNA确有下调VEGF基因表达的作用。
VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR组的HeLa细胞的VEGF蛋白表达量随VEGF-siRNA浓度增加而减少，并且VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR在VEGF-siRNA浓度为100nM时与同浓度的VEGF-siRNA/RNAiMAX的蛋白抑制率有差异，一定程度表明合成的载体转染效率与市售转染试剂相比转染效果好。
实施例9评价VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR抑制肿瘤细胞增殖的作用细胞模型为HeLa细胞，用DMEM培养。完全培养基中含有10％灭活的胎牛血清、1×105U/L的青霉素和100mg/L的链霉素。对数生长期的HeLa细胞，在其密度生长达到70-80％将其消化下来，1500rmp离心3min，用完全培养基吹打均匀，稀释细胞浓度至1×105cells/mL，96孔板中每孔加入100μL细胞混悬液，培养12h其密度达到60％后，将上清液弃去，用磷酸盐缓冲液洗3次，残留物加无血清培养基，VEGF-siRNA，非同源siRNA，VEGF-siRNA/RNAiMAX，非同源siRNA/RNAiMAX，VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR和非同源siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR全用不含FBS、青霉素及链霉素的DMEM培养基混合。VEGF-siRNA浓度为200、160、120、80、40nM。4h后更换为完全培养基继续培养24h。每孔中加入50μL(6mg/mL)MTT，继续孵育4h，弃上清液，每孔加50μL二甲基亚砜，将96孔板置于振荡器上振荡10min，使甲臜结晶溶解充分，用酶标仪检测波长为570nm下的光密度。根据光密度值计算药物对细胞的存活率，设置五个复孔，实验重复三次。生长抑制率＝[(对照组平均OD值－样品组平均OD值)/空白组平均OD值]×100％，将实验重复三次。结果见表5和表6。
表5 ND-CONHCH2CH2NH-SDGR对HeLa细胞增殖的影响(均值±SD％，n＝5)
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000122
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000131
表6 VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR对HeLa细胞增殖的影响(均值±SD％，n＝5)
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000132
结果表明，VEGF-siRNA，非同源siRNA和非同源siRNA/RNAiMAX在各浓度下对HeLa细胞增殖的影响与无血清培养基无统计学意义(p＞0.05)，对HeLa细胞增殖无影响。非同源siRNA/ND-CONHCH2CH2SDGR在100nM时对HeLa细胞增殖的影响与无血清培养基无统计学意义(p＞0.05)，对HeLa细胞增殖无影响。VEGF-siRNA/RNAiMAX作为阳性药物，在剂量为100nM下使HeLa细胞增殖百分数为34.15％，明显影响HeLa细胞增殖。在40、60、80、100、120nM时VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR对HeLa细胞增殖的抑制率与VEGF-siRNA/RNAiMAX无统计学差异，明显影响HeLa细胞增殖。
实施例10评价VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR抑制肿瘤生长的作用
S180小鼠分为5组，每10只为一组，分别为生理盐水组、阿霉素组、VEGF-siRNA组、VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDG组以及ND-CONHCH2CH2NH-SDGR组。VEGF- siRNA剂量为0.3mg/kg，每天给一次药。给药方式为尾静脉注射。连续给药5天，每天固定时间给药，一共给药5次。VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR的剂量为0.15mg/kg。尾静脉注射给药，每天一次，连续给药5天，每天固定时间给药，一共给药5次。ND-CONH-CH2CH2NH-SDGR剂量为0.3mg/kg。尾静脉注射给药，每天一次，连续给药5天，每天固定时间给药，一共给药5次。阿霉素剂量为2μmol/kg，尾静脉注射给药，每天一次，连续给药5天，每天固定时间给药，一共给药5次。生理盐水剂量为0.2mL/只，尾静脉注射给药，每天一次，连续给药5天，每天固定时间给药，一共给药5次。在连续给药5天之后，第6天在处死前称取体重记录数据，然后用颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠固定，剪开右腋肿瘤生长部位的皮肤，将肿瘤暴露出来，钝性剥离，称重并且记录，按抑瘤率％＝[(生理盐水组平均瘤重－给药组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重]×100％计算抑瘤率。结果见表7。肿瘤被剥离的小鼠继续解剖取出脑、心、肝、肾、和脾称重并按器官指数(g/100g)＝器官重/小鼠体重计算脑、心、肝、肾、和脾指数。结果见表8。
表7 VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR的抗肿瘤活性(均值±SD g，n＝8)
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000141
a)与生理盐水比p＜0.01；b)与生理盐水比p＜0.05；c)与生理盐水比p＜0.01,与阿霉素比p＞0.05。
结果表明VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR抑瘤率为61.31％，具有良好的抗肿瘤活性。
表8 VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR对小鼠各脏器指数的影响(均值±SD，脏器g/体重100g，n＝8)
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000142
Figure DEST_PATH_GDA0001135395350000151
a)与生理盐水比p＜0.01；b)与生理盐水比p＜0.05。
结果表明VEGF-siRNA/ND-CONHCH2CH2NH-SDGR只对脾脏有点影响。

Claims (3)

1.一种由NDCONH(CH2)2NH-SDGR包裹VEGF-小干扰RNA构成的VEGF-小干扰RNA递送体系。
2.权利要求1所述的一种由NDCONH(CH2)2NH-SDGR包裹VEGF-小干扰RNA构成的VEGF-小干扰RNA递送体系的合成方法，其特征在于，所述NDCONH(CH2)2NH-SDGR的合成方法包括纳米金刚石表面羧基化、酰氯化后依次连接乙二胺和RGDS，最后包载VEGF-小干扰RNA。
3.权利要求1所述的一种由NDCONH(CH2)2NH-SDGR包裹VEGF-小干扰RNA构成的VEGF-小干扰RNA递送体系在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。
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