JP2003513105A - ｅＮＯＳ活性の調節とその治療的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ｅＮＯＳ発現及び活性の上方制御のためのＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターの使用を提供する。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦレセプターアゴニストは高血圧、糖尿病、狭心症、血栓症、アテローム性動脈硬化症、心不全、及び一酸化窒素が重要な調節因子である他の症状又は障害の治療又は予防に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 (発明の分野) 本発明は、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）活性を調節するためのＶＥＧ
Ｆ及びその変異体、ＶＥＧＦレセプターアゴニスト、及びその他の薬剤の使用に
関する。特に、ｅＮＯＳ活性の調節は血管内皮細胞機能障害と関連する哺乳動物
の疾患又は障害を治療又は防止するために使用される。

【０００２】 (発明の背景) 脈管構造の２つの主要な細胞成分は内皮細胞と平滑筋細胞である。内皮細胞は
全血管の内部表面の内張りを形成し、血液と組織の間の非血栓形成性界面を構成
する。加えて、内皮細胞は新しい毛細血管や血管の発生のために重要な成分であ
る。よって、内皮細胞は、腫瘍増殖及び転移、並びに種々の非新生物疾患又は障
害に関連して、脈管形成又は新血管形成中に増殖する。 天然に生じる種々のポリペプチドは内皮細胞の増殖を誘発することが報告され
ている。これらのポリペプチドには、塩基性及び酸性の線維芽細胞増殖因子（Ｆ
ＧＦ）、Burgess及びMaciag, Annual Rev. Biochem., 58:575（1989）、血小板
由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、Ishikawa等, Nature, 338:557（198
9）、並びに血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Leung等, Science 246:1306（1989
）；FerraraおよびHenzel, Biochem．Biophys．Res．Commun．161:851（1989）
；Tischer等, Biochem．Biophys．Res．Commun．165:1198（1989）；Ferrara等
、ＰＣＴ公開特許第ＷＯ90/13649号（1990年11月15日公開）がある。 ＶＥＧＦは血管新生及び脈管形成のキーとなる因子として報告されている。Fe
rrara及びDavis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25。脈管形成プロセスに寄
与するその他の成長因子と比較すると、ＶＥＧＦは内皮細胞に対して特異性が高
い点で独特である。ＶＥＧＦは例えば創傷治癒、女性生殖器、骨／軟骨形成及び
胚形成のような正常な生理的プロセスばかりでなく、例えば腫瘍成長、加齢性黄
斑変性（ＡＭＤ）及び糖尿病性網膜症のような病的血管新生を含む症状又は疾患
の発生の間においても重要である。上掲のFerrara及びDavis-Smyth (1997)；Fol
kman J. (1995) Nature Med. 1:27-31；Pepper MS. (1997) Arterioscler Throm
b. Vasc. Biol. 17:605-619。

【０００３】 血管新生及び脈管形成において血管新生因子であることに加えて、ＶＥＧＦは
、多面的成長因子として、例えば内皮細胞生存、血管透過及び血管拡張、単球走
化作用及びカルシウム流入のようなその他の生理的及び病理的プロセスにおいて
多重の生物学的効果を示す。上掲のFerrara及びDavis-Smyth (1997)。 ＶＥＧＦはウシ下垂体小胞又は星状小胞細胞で条件づけられた培地中で最初に
同定された。生化学分析によって、約４５０００ダルトンの見かけ分子量と血管
内皮細胞に対して見かけ上の細胞分裂誘発特異性を持つウシＶＥＧＦは二量体タ
ンパク質であることが示されている。ウシＶＥＧＦをコードしているＤＮＡは、
ハイブリッド形成プローブとしてタンパク質のアミノ末端アミノ酸配列に基づく
オリゴヌクレオチドを使用して、そのような細胞から調製されるｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることによって単離された。 ヒトＶＥＧＦは、ウシＶＥＧＦのｃＤＮＡをハイブリッド形成プローブとして
使用し、ヒト細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーを先ずスクリーニングす
ることにより得た。こうして同定された１つのｃＤＮＡは、ウシＶＥＧＦと９５
％を越える相同性を有している１６５アミノ酸のタンパク質をコードしており；
この１６５アミノ酸のタンパク質は一般にはヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）又はＶ
ＥＧＦ_１６５と称されている。ヒトＶＥＧＦの分裂促進活性は、哺乳動物宿主細
胞中でヒトＶＥＧＦのｃＤＮＡを発現させることによって確認された。ヒトＶＥ
ＧＦのｃＤＮＡを形質移入した細胞で条件づけた培地は毛細血管内皮細胞の増殖
を促進したが、対照細胞では促進しなかった。［Leung, Science 246:1306（198
9）を参照］。 血管内皮細胞増殖因子は引き続いての治療的利用のために天然源から単離され
精製されうるが、濾胞細胞中のタンパク質の比較的低い濃度とＶＥＧＦを回収す
るコストが努力と費用の双方の点で高いことから商業的には利用できない。従っ
て、組換えＤＮＡ技術を介してＶＥＧＦをクローニングし発現させる更なる努力
がなされている。［例えば、Laboratory Investigation, 72:615 (1995)及びそ
こに引用されている文献を参照］。

【０００４】 ＶＥＧＦは選択的ＲＮＡスプライシングの結果として複数のホモ二量体形態（
単量体当たり１２１、１４５、１６５、１８９及び２０６のアミノ酸）として様
々な組織中で発現される。ＶＥＧＦ_１２１はヘパリンに結合しない可溶性マイト
ジェンであり；ＶＥＧＦのより長い型は漸次高くなる親和性でヘパリンに結合す
る。ＶＥＧＦのヘパリン結合形態はプラスミンによってカルボキシ末端で切断さ
れ、ＶＥＧＦの拡散可能形態を放出する。プラスミン切断後に同定されたカルボ
キシ末端ペプチドのアミノ酸配列シークエンシングの結果はＡｒｇ_１１０−Ａｌ
ａ_１１１である。ホモ二量体として単離されたＶＥＧＦ（１−１１０）であるア
ミノ末端「コア」タンパク質は、無処置のＶＥＧＦ_１６５ホモ二量体と比較して
同様の親和性で中和モノクローナル抗体（例えば４．６．１及び３．２Ｅ３．１
．１と称される抗体）及びＦＬＴ−１及びＫＤＲレセプターの可溶型に結合する
。 ある種のＶＥＧＦ関連分子もまた同定されている。Ogawa等は哺乳動物のＶＥ
ＧＦと約２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド（ＶＥＧＦ−Ｅと呼ばれ
る）をコードしている遺伝子を記載している。ＶＥＧＦ−Ｅは、ヒツジとヤギ、
希にはヒトに感染し血管新生を伴う病巣を発生させるパラポックスウイルスであ
るＯｒｆウイルス（ＮＺ-７株）のゲノムにおいて同定された。研究者は細胞増
殖実験を実施し、ＶＥＧＦ−ＥがヒトＶＥＧＦと殆ど同程度にヒトの臍静脈の内
皮細胞並びにラットの肝臓類洞の内皮細胞の成長を刺激することを報告している
。結合実験もまた報告されている。競合実験は、ＫＤＲレセプター又はＦＬＴ−
１レセプターの何れかを過剰発現している細胞を、固定量の^１２５Ｉ標識ヒトＶ
ＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｅと共にインキュベートし、ついで未標識ヒトＶＥＧＦ又
はＶＥＧＦ−Ｅの添加量を増加させて実施されている。研究者はＶＥＧＦ−Ｅが
ＦＬＴ−１と比較してＫＤＲレセプターに選択的に結合したと報告している［Og
awa等, J. Biological Chem. 273:31273-31281 (1998)］。 Meyer等, EMBO J., 18:363-374 (1999)はまたＶＥＧＦ−Ｅと称されるＶＥＧ
Ｆファミリーのメンバーを同定している。Meyer等によって報告されたＶＥＧＦ
−Ｅ分子はＯｒｆウイルス株Ｄ１７０１のゲノムにおいて同定された。インビト
ロでＶＥＧＦ−Ｅが組織因子の放出を刺激し血管内皮細胞の増殖を刺激すること
が見いだされた。ウサギのインビボモデルでは、ＶＥＧＦ−Ｅはウサギの角膜に
おける血管新生を刺激した。ある種のアッセイにおける、Meyer等によって報告
されたＶＥＧＦ−Ｅ分子の結合特性の分析により、その分子がＦＬＴ−１レセプ
ターと比較してＫＤＲレセプターに選択的に結合することが明らかにされた。 olofsson等, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:11709-11714 (1998)は、「ＶＥＧ
Ｆ−Ｂ」と称されるタンパク質がＦＬＴ−１に選択的に結合することを報告して
いる。研究者は、ＶＥＧＦ−ＢにおけるＡｓｐ６３、Ａｓｐ６４、及びＧｌｕ６
７残基がアラニン残基に変異した突然変異実験を開示している。ＶＥＧＦ−Ｂの
変異型の結合特性の分析により、変異体タンパク質が低下したＦＴＬ−１に対す
る親和性を示すことが明らかになった。

【０００５】 ＶＥＧＦはＫＤＲ（キナーゼドメイン領域）及びＦＬＴ−１（ＦＭＳ様チロシ
ンキナーゼ）レセプターのそれぞれに対する結合を担う二つの部位を含んでいる
。これらのレセプターは主として内皮（血管）細胞上に存在すると信じられてい
る。最近、Soker等がニューロピリンと同一の配列を有する別のＶＥＧＦレセプ
ターを同定した。Soker等, Cell, 92:735-745 (1998)。このレセプターはＶＥＧ
Ｆ_１６５と胎盤由来成長因子−２（ＰＬＧＦ−２）に結合したがＶＥＧＦ_１２１ には結合しなかった。上掲のSoker等；Migdal等, J. Biol. Chem. 273:22272-22
278 (1998)。 ＶＥＧＦ生産は例えばトラウマ等の結果として酸素欠乏状態になる細胞におい
て増加し、ＶＥＧＦが各レセプターに結合して生物学的応答を生じるシグナル伝
達経路を誘発する。例えば、そのようなレセプターへのＶＥＧＦの結合は血管透
過性を増大させ、細胞を分割させ膨張させて新しい血管経路を形成する−すなわ
ち、脈管形成及び血管新生である。［例えばMalavaud等, Cardiovascular Resea
rch, 36:276-281 (1997)を参照］。ＫＤＲレセプターを通してのＶＥＧＦ誘導シ
グナル伝達はＶＥＧＦの分裂促進効果の原因であり、またおそらくはＶＥＧＦの
血管形成活性の大きな原因であると報告されている。［Waltenberger等, J. Bio
l. Chem., 269:26988-26995 (1994)］。しかしながらＦＬＴ−１の生物学的役割
は十分には理解されていない。 レセプター結合に関与するＶＥＧＦタンパク質の部位又は領域が特定され近接
して位置していることが見いだされている。［Weismann等, Cell, 28:695-704 (
1997)；Muller等, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:7192-7197 (1997)；Muller等,
Structure, 5:1325-1338 (1997)；Fuh等, J. Biol. Chem., 273:11197-11204 (1
998)を参照］。ＫＤＲレセプターは、ＶＥＧＦの位置８２にアルギニン（Ａｒｇ
又はＲ）を、位置８４にリジン（Ｌｙｓ又はＫ）を、位置８６にヒスチジン（Ｈ
ｉｓ又はＨ）を含むループ上の部位を主に通してＶＥＧＦに結合することが見い
だされている。ＦＬＴ−１レセプターは、位置６３にアスパラギン酸（Ａｓｐ又
はＤ）を、位置６４にグルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）を、位置６７にグルタミン
酸（Ｇｌｕ又はＥ）を含むループ上の部位を主に通してＶＥＧＦに結合すること
が見いだされている。［Keyt等, J. Biol. Chem., 271:5638-5646 (1996)］。こ
れらの発見に基づき、野生型ＶＥＧＦタンパク質は、ＫＤＲのような一つのレセ
プターに選択的に結合するＶＥＧＦ変異体を創製する試みで、特異的レセプター
結合部位に突然変異を導入するための出発点として使用されている。上掲のKeyt
等；Shen等 (1998) J. Biol. Chem. 273:29979-29985。得られたＶＥＧＦ変異体
は中程度のレセプター選択性を示した。より最近では、ＶＥＧＦの結晶構造とＶ
ＥＧＦのＫＤＲ結合部位の機能性マッピングに基づいて、ＶＥＧＦが分子の両端
に位置する二つの対称的な結合部位を使用してＫＤＲレセプターに係合すること
が更に見いだされている。各部位はＶＥＧＦホモ二量体の両方のサブユニットか
らの残基からなる結合のための「ホットスポット」から構成されている。Muller
等, Structure, 5:1325-1338 (1997)。これらの結合決定基の二つはトランスフ
ォーミング成長因子β２（ＴＧＦ−β）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に
保存されている短い３重鎖βシート上のドミナントなホットスポット内に位置し
ている。

【０００６】 内皮由来一酸化窒素（ＮＯ）及び内皮型ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）が様々なＶ
ＥＧＦ誘導活性において重要な役割を担っている可能性があることが最近の研究
で報告されている。ＮＯは内皮機能の重要なメディエータであり、血管ホメオス
タシス、血小板凝集及び血管新生のレギュレータであると信じられている。Buss
e及びFlemming (1996) J. Vasc. Res. 33:181-194。ＮＯは、内皮型一酸化窒素
合成酵素（ｅＮＯＳ）、誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）及び神経型ＮＯＳ（ｎＮＯＳ
）と命名された３つのアイソフォームからなる酵素であるＮＯ合成酵素によるＬ
-アルギニンのシトルリンへの転換から生産される。Nathan及びXie (1994) J. B
iol. Chem. 269:13725-13728。ＶＥＧＦはウサギ、ブタ、ウシ及びヒトの血管内
皮細胞からのＮＯの速やかな放出を誘導することが示されている。（例えば、va
nderZee等, Circulation, 95:1030-1037 (1997)；Parenti等, J. Biol. Chem.,
273:4220-4226 (1998)；Morbidelli等, Am. J. Physiol., 270:H411-H415 (1996
)；Papapetropoulis等, J. Clin. Invest., 100:3131-3139 (1997)；Kroll等, B
iochem. Biophys. Res. Comm., 252:743-746 (1998)；Hood等, Am. J. Phys., 2
74:H1054-H1058 (1998)を参照）。インビトロアッセイでは、ＶＥＧＦは、ＮＯ
依存的にヒト内皮細胞を刺激して成長させ、３-Ｄコラーゲンゲルモデルにおい
て管様構造のＮＯ依存的形成を促進することが見いだされた（上掲のPapapetrop
oulis等）。逆に、ｅＮＯＳ阻害剤はＶＥＧＦ誘導分裂促進及び血管形成効果を
阻害することが報告されている。（上掲のPapapetropoulis等）。あるインビボ
実験では、ｅＮＯＳ発現の不活性化によりｅＮＯＳノックアウトマウスモデルで
ＶＥＧＦ誘導血管新生が損なわれたことが報告されている。（Murohara等, J. C
lin. Invest., 101:2567-2578 (1998)； Ziche等, J. Clin. Invest., 99:2625-
2634 (1997)；Rudic等, J. Clin. Invest., 101:731-736 (1998)）。最近、Liu
等, J. Biol. Chem., 274:15781-15785 (1999)はＶＥＧＦがカベオリンと呼ばれ
るｅＮＯＳの内因性阻害剤を下方制御することが報告されている。 ＶＥＧＦは、計測用ラットに意識的に静脈注射したときに、用量依存的にイン
ビトロで血管拡張を誘導し、一過性頻脈、低血圧及び心拍出量の減少を生じるこ
とが示されている。Yang等, J. Cardiovasc. Pharmacol., 27:838-844 (1996)。
このような急性血行力学的効果は、主に内皮細胞由来ＮＯによって媒介された静
脈還流の減少によって引き起こされると思われる。上掲のYang等；Hariawala等,
J. Surg. Res., 63:77-82 (1996)。Wu等, Am. J. Physiol., 271:H2735-H2739
(1996)は、ＶＥＧＦの局所適用によっって、単離された冠状細静脈において一過
性で用量依存的なアルブミン透過性の増加が生じることを記載している。

【０００７】 インビトロでのＬ−ＮＡＭＥによるｅＮＯＳの阻害は平均動脈圧（ＭＡＰ）の
増加（Yang等, 1996 Cardiovasc. Pharmacol. 27:838-844；Sase等, 1997 Trend
s J. Cardiovasc. Med. 7:28-37）及び血管新生の減少（Papapetropoulis等, 19
97 J. Clin. Invest. 100:3131-3139）を生じることが報告されている。ｅＮＯ
Ｓ遺伝子を欠く遺伝子操作されたマウスは損なわれた内皮依存的血管拡張、血管
新生及び高血圧を示し（Murohara等, 1998 J. Clin. Invest. 101:2567-2578；
上掲のYang等, 1996）、また遺伝子導入によるマウスｄのｅＮＯＳの過剰発現が
一酸化窒素生産を増大させＭＡＰ及び新脈管（neointima）形成を有意に減じる
ことが示されている（上掲のSase等；Drummond及びHarrison, 1998, J. Clin. I
nvest. 102:2033-2044；Ohashi等, 1998 J. Clin. Invest. 102:2061-2071）。 ＮＯの短期的放出及びｅＮＯＳ調節におけるＶＥＧＦの関与に関する多くの研
究があるが、ｅＮＯＳ発現及び／又は活性に対するＶＥＧＦの慢性的効果は文献
には示されていない。更に、インビボにて血管疾患を治療し又は予防する際の一
酸化窒素の持続性放出の生物学的効果は今日まで明確には実証されていない。こ
れは、大部分は、哺乳動物が一酸化窒素ドナーとして外因的に投与されるある種
の薬剤に対して急速に耐性を生じ得るので、一酸化窒素の補充が困難になるため
である。（Drummond及びHarrison, 1998, J. Clin. Invest. 102:2033-2044）。 生理学的又は薬理学的アプローチによるｅＮＯＳの発現の上方制御は、例えば
内因性ＮＯの生産と持続的放出を増大させることによって内皮細胞機能障害に関
連する疾患の処置への有用な治療的アプローチを提供しうる。

【０００８】 （発明の概要） 本発明は、長期のＶＥＧＦ治療がｅＮＯＳ発現及び活性を効果的に上方制御し
、それによって持続性の一酸化窒素の生産を亢進し、ＶＥＧＦによるｅＮＯＳの
上方制御にはＶＥＧＦ−ＫＤＲレセプター、ＫＤＲ関連チロシンキナーゼ（ＴＫ
）の活性化及び下流のＰＫＣ依存性経路が必要となるという知見に基づいている
。ｅＮＯＳ発現／活性の調節は、例えばｅＮＯＳ機能障害及び／又は一酸化窒素
生産における欠陥を含む内皮細胞機能障害によって特徴付けられた障害の治療に
おいて、臨床的に有用である。 従って、一実施態様では、本発明は、特許請求の範囲に記載されている如く、
例えば有効量のＶＥＧＦ、レセプター-選択的ＶＥＧＦ変異体、又はＶＥＧＦレ
セプター活性化のアゴニストとして作用する薬剤又は分子の投与によって、一酸
化窒素が重要なレギュレータである哺乳動物の障害、例えば高血圧、糖尿病、ア
テローム性動脈硬化症、血栓症、狭心症及び心不全を治療する方法を提供する。 別の実施態様では、本発明は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターアゴニストを
提供することによって内皮機能障害に関連する症状から哺乳動物を保護する方法
を提供する。 更に別の実施態様では、本発明はレセプター選択的ＶＥＧＦ変異体を提供する
ことによって、内皮細胞において内因性ＮＯの持続的生産を刺激する方法を提供
する。好ましくは、ＫＤＲ選択的ＶＥＧＦ変異体がＫＤＲレセプターに特異的に
結合するために使用され、それは一方でｅＮＯＳの上方制御及び持続的のＮＯ生
産に至る経路を活性化する。

【０００９】 （発明の詳細な記載） Ａ．定義 ここで使用される「ＶＥＧＦ」及び「天然ＶＥＧＦ」という用語は、Leung等,
Science 246:1306（1989）、及びHouck等, Mol. Endocrin., 5:1806（1991）に
記載されているような、１６５−アミノ酸血管内皮細胞増殖因子及び関連する１
２１−、１８９−、及び２０６−アミノ酸血管内皮細胞増殖因子を、それらの天
然に生じる対立遺伝子体及びプロセシングを受けた型と共に意味する。「ＶＥＧ
Ｆ」及び「天然ＶＥＧＦ」という用語は、１６５のアミノ酸のヒト血管内皮細胞
増殖因子のアミノ酸８から１０９又は１から１０９を含んでなるポリペプチドの
切断型を意味するためにも使用される。ＶＥＧＦのそのようなあらゆる形態の表
示は本願においては例えば「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（１−１０
９）」又は「ＶＥＧＦ_１６５」によって特定されうる。「切断型」天然ＶＥＧＦ
のに対するアミノ酸位置は天然ＶＥＧＦ配列に示されているようにして番号が付
される。例えば、切断型天然ＶＥＧＦにおけるアミノ酸位置１７（メチオニン）
はまた天然ＶＥＧＦの位置１７（メチオニン）である。切断型天然ＶＥＧＦは天
然ＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦＬＴ−１レセプターに対する結合親和性を有
している。 ここで用いられる「ＶＥＧＦ変異体」という用語は、天然ＶＥＧＦ配列に一又
は複数のアミノ酸突然変異を含むＶＥＧＦポリペプチドを意味し、好ましくはＫ
ＤＲレセプター又はＦＬＴ−１レセプターの何れかに対して選択的な結合親和性
を有する。一実施態様では、ＶＥＧＦ変異体は天然ＶＥＧＦ配列の位置１７から
２５及び／又は６３から６６の任意の一つにおいて一又は複数のアミノ酸突然変
異を含む。場合によっては、一又は複数のアミノ酸突然変異はアミノ酸置換を含
む。場合によっては、ＶＥＧＦ変異体は一又は複数のアミノ酸突然変異を含み、
天然ＶＥＧＦによるＫＤＲレセプターに対する結合親和性よりも等しいか大であ
るＫＤＲレセプターへの結合親和性を示し、好ましくは、ＦＬＴ−１に対する天
然ＶＥＧＦの結合親和性よりも少ない結合親和性をＦＬＴ−１レセプターに対し
て示す。ＫＤＲレセプターに対するＶＥＧＦ変異体の結合親和性が天然ＶＥＧＦ
と比較してほぼ等しい（不変）又はより大きく（増加）、またＦＬＴ−１レセプ
ターに対するＶＥＧＦ変異体の結合親和性が（天然ＶＥＧＦと比較して）より少
ないか又は殆どなくなっている場合は、ＶＥＧＦ変異体の結合親和性はＫＤＲレ
セプターに対して「選択的」である。あるいは、ＶＥＧＦ変異体は一又は複数の
アミノ酸変異を含み、天然ＶＥＧＦによるＦＬＴ−１レセプターに対する結合親
和性に等しいかより大なる結合親和性をＦＬＴ−１レセプターに対して示し、好
ましくはＫＤＲに対する天然ＶＥＧＦの結合親和性よりも少ない結合親和性をＫ
ＤＲレセプターに対して示す。ＦＬＴ−１レセプターに対するＶＥＧＦ変異体の
結合親和性が天然ＶＥＧＦと比較して殆ど等しい（不変）かより大きく（増加）
、ＫＤＲレセプターに対するＶＥＧＦ変異体の結合親和性が（天然ＶＥＧＦと比
較して）少ないか殆ど消失している場合、ＶＥＧＦ変異体の結合親和性はＦＬＴ
−１レセプターに対して「選択的」である。本発明の好適なＶＥＧＦ変異体は（
天然ＶＥＧＦと比較して）ＦＬＴ−１レセプターに対して少なくとも１０倍低い
結合親和性を持ち、更により好ましくは（天然ＶＥＧＦと比較して）ＦＬＴ−１
レセプターに対して少なくとも１００倍低い結合親和性を持つ。ＫＤＲ又はＦＬ
Ｔ−１に対するＶＥＧＦ変異体のそれぞれの結合親和性は、当該分野で知られ以
下の実施例で更に記載されるＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅア
ッセイによって定量できる。本発明の好適なＶＥＧＦ変異体はまたＫＤＲレセプ
ターのリン酸化をまた示す。本発明の好適なＶＥＧＦ変異体は加えてもしくは別
に（ＨＵＶＥＣ増殖アッセイのような公知の方法によって定量できる）内皮細胞
増殖を誘導する。内皮細胞増殖の誘導はＫＤＲレセプターによるシグナル伝達の
結果であると現在のところ信じられている。

【００１０】 ここに記載されるＶＥＧＦ変異体の略記標示のために、番号は、（上掲のLeun
g等及び上掲のHouck等において与えられている）推定天然ＶＥＧＦのアミノ酸配
列に沿ったアミノ酸残基の位置を意味することを特記しておく。アミノ酸の特定
にはアミノ酸のアルファベット一文字を使用する。つまり、 Asp D アスパラギン酸 Ile I イソロイシン Thr T スレオニン Leu L ロイシン Ser S セリン Tyr Y チロシン Glu E グルタミン酸 Phe F フェニルアラニン Pro P プロリン His H ヒスチジン Gly G グリシン Lys K リジン Ala A アラニン Arg R アルギニン Cys C システイン Trp W トリプトファン Val V バリン Gln Q グルタミン Met M メチオニン Asn N アスパラギン ここで使用される「ＶＥＧＦレセプター」という用語は、ＶＥＧＦの細胞レセ
プターで、通常は血管内皮細胞に見いだされる細胞表面レセプター、並びにＶＥ
ＧＦに結合する能力を保持しているその断片と変異体（例えば細胞外ドメインの
断片又は切断型）を意味する。ＶＥＧＦレセプターの一例は、fms様チロシンキ
ナーゼ（ＦＬＴ又はＦＬＴ−１）、すなわちチロシンキナーゼファミリーの膜貫
通レセプターである。本願で使用される「ＦＬＴ−１レセプター」という用語は
、例えばDeVries等, Science 255:989（1992）；及びShibuya等, Oncogene 5:51
9（1990）によって記載されているＶＥＧＦレセプターを意味する。全長ＦＬＴ
−１レセプターは細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びチロシンキナーゼ活性
を持つ細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインはＶＥＧＦの結合に関与し、細胞
内ドメインはシグナル伝達に関与している。ＶＥＧＦレセプターのもう一つの例
はＫＤＲレセプター（ＦＬＫ−１とも称される）である。本願で使用される「Ｋ
ＤＲレセプター」という用語は、例えばMatthews等, Proc．Nat．Acad．Sci．88
:9026 (1991）；及びTerman等, Oncogene 6:1677（1991）；Terman等, Biochem
．Biophys．Res．Commun．187:1579（1992）によって記載されたＶＥＧＦレセプ
ターを意味する。

【００１１】 レセプター「アゴニスト」は天然に生じるリガンドによって正常に活性化され
るレセプターに対して親和性を持ち、これを活性化させ、生化学反応を誘起させ
る薬剤である。一般には、アゴニストのレセプター活性化能はレセプターの天然
リガンドと少なくとも定性的に類似している（また本質的には定量的に類似して
いる）。レセプターアゴニストの非限定的な例には、リガンド変異体、レセプタ
ーに対する抗体及びレセプター-リガンド複合体に対する抗体が含まれる。 ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体
の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体が、
少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクロー
ナル抗体は高度に特異的で、一つの抗原部位に対するものである。さらに、異な
る決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体
調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するもので
ある。 ここで、モノクローナル抗体は、特に重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種か
ら誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配
列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は他の抗
体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である「
キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいてそれらの
抗体の断片を含む（米国特許第4,816,567号；及びMorrison等, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)）。 「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に相当する、及
び／又はここにおいて開示されたヒト抗体を製造する何れかの技術を使用して製
造されたアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト
抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。

【００１２】 「治療」とは、治療的処置及び予防的又は防護的処置の両方を意味し、ここで
目的が標的とする病理症状又は障害を防ぐ又は遅延させる（軽減する）ことであ
る。治療が必要なものには、既に疾患を持つもの、並びに疾患を有する傾向にあ
るもの又は疾患を防護すべきものが含まれる。 「治療的有効量」とは、所望の治療効果を達成するために必要な時間、必要な用
量での効果的な量を意味する。抗体の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、
性別、及び体重のような因子、及び個体における所望の反応を誘発する抗体の能
力に応じて変化しうる。治療的有効量はまた抗体の任意の毒性又は致命的な影響
より治療的に有益な効果がより重いものである。「予防的有効量」とは所望の予
防的効果を達成するのに必要な時間、必要な用量での効果的な量を意味する。典
型的には、予防的投薬は疾患の初期段階の前又は初期段階の患者に使用されるの
で、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。 「慢性」投与とは、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤を投与し、初期
の治療効果（活性）を長時間にわたって維持することを意味する。間欠投与とは
、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる治療
である。 治療目的で「哺乳動物」と言うときは、ヒト、家及び牧場の動物、及び動物園
の動物、運動用の動物、愛玩用動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、
ブタ等々を含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは
哺乳動物はヒトである。 一又は複数の更なる治療薬剤と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及
び任意の順序での連続した投与を含む。

【００１３】 ＮＯに「関連した」又はｅＮＯＳ機能障害「によって特徴付けられる」及び／
又はＮＯが「重要な制御因子」である病理的症状及び障害は、一酸化窒素の不足
又は過剰が疾患と相関している症状及び障害である。このような障害及び症状に
は、例えば、哺乳動物細胞又は組織中の一酸化窒素レベルが正常な又は健康な哺
乳動物細胞又は組織と比較して不十分な量で存在している高血圧、糖尿病、血栓
症、狭心症、アテローム性動脈硬化症、及び心不全が含まれる。ＶＥＧＦの使用
が有益である更なる利用には、血管形成の前、血管形成と同時又は血管形成に続
いてｅＮＯＳ又はＮＯ生産を増加させて、再狭窄又は内膜新生（neointima）を
防止するためのＶＥＧＦの使用が含まれる。 ここで使用される「高血圧」又は「高血圧症状」という用語は典型的には末梢
血管抵抗又は心拍出量又は双方の増加によっって特徴付けられる哺乳動物におけ
る生理的状態又は症候群を意味する。臨床的には、「高血圧」又は「高血圧症状
」は場合によってはおよそ１４０ｍｍＨｇの最大血圧とおよそ９０ｍｍＨｇの最
小血圧に等しいかこれより高い血圧測定値によって示されうる。高血圧は更にOa
tes, "Antihypertensive Agents and the Drug Therapy of Hypertension", ３
３章, Goodman及びGilman, 9版, 780-781頁において更に特徴付けされている。
ここで使用される用語には、急性と慢性の高血圧症状が含まれる。 ここで使用されるｅＮＯＳ活性の「調節」は広義に使用され、ｅＮＯＳタンパ
ク質の発現及び／又は活性を誘導又は上昇させ、阻害又は減少させ、あるいは維
持する能力を意味する。

【００１４】 Ｂ．発明の実施の形態 一態様では、本発明は高血圧、糖尿病、血栓症、狭心症、心不全又はアテロー
ム性動脈硬化症のようなＮＯ関連障害又は症状を治療する方法を提供する。出願
人は、ｒｈＶＥＧＦで治療（０．０５マイクログラム／Ｋｇ体重／分での冠動脈
内又は静脈内注入投与による）した幾人かの冠状動脈疾患患者（ヒト）において
平均動脈圧が用量−速度依存的に減少することを知見した。平均動脈圧のこの種
の減少は急性であり、典型的には注入から最初の２０分の間に観察された。これ
に対して、ＶＥＧＦに対する組換えヒト化モノクローナル抗体で治療した幾人か
の癌患者（ヒト）においては平均動脈圧が用量依存的に増加しうる。このような
平均動脈圧の増加は内在性ＶＥＧＦの中和によるものと信じられている。更に、
ＶＥＧＦのブロック又は中和はｅＮＯＳ生産を下方制御するか、内皮細胞機能を
減少させ得、血管ホメオスタシスに影響を及ぼして血圧増加を生じる。従って、
ＶＥＧＦ、又はここに記載したようなＶＥＧＦレセプターの活性化を調節する分
子は、ＮＯ又はｅＮＯＳ機能障害に関連する症状又は障害を治療するのに使用す
ることができる。 本発明はまた血栓症のような内皮機能障害に関連する症状から哺乳動物の患者
を保護する方法を提供する。ＶＩＶＡの臨床実験（血管新生に対する虚血でのＶ
ＥＧＦ）からの初期の結果は、ＶＥＧＦで治療した狭心症患者がプラセボ群と比
較して、狭心症の部類、狭心症の頻度、及び長い時点でのトレッドミル回数のよ
うな指標において改善の傾向を示すことを示している。本発明のＶＥＧＦ又はＶ
ＥＧＦレセプターアゴニストは内皮細胞においてｅＮＯＳ及びＮＯを上方制御す
ることによって重要な血管保護効果を提供する。本発明に係るＶＥＧＦ又はＶＥ
ＧＦレセプターアゴニストでの標的患者の持続性の治療によって、ｅＮＯＳ上方
制御とＮＯの保持された生産に対して慢性的な効果がもたらされ、これは、ＮＯ
のレベルの維持が所望される治療的処置又は予防的処置に対して有益である。ｅ
ＮＯＳ酵素を上方制御することによって内在性ＮＯ生産を増加させることによっ
て、本発明の方法はまた狭心症患者のように患者がその時点で外因性硝酸供給源
に依存している治療又は予防において適用できる。Luscher TF (1992) Br. J. C
lin. Pharmacol. 34 Suppl. 1:29S-35S。

【００１５】 本発明は更に、内皮細胞における内因性ＮＯの持続性生産を刺激するためにＫ
ＤＲ選択的ＶＥＧＦ変異体を使用する方法を提供する。天然ＶＥＧＦは生理的及
び病理的血管機能において多重の生物学的効果を有する多面性成長因子である。
インビトロ又はインビボで使用される場合、天然ＶＥＧＦは目的の機能に加えて
望まない悪影響を生じ得、ＶＥＧＦの治療上の利用をしばしば複雑にする問題と
なる。従って、本発明はレセプター選択的変異体を天然ＶＥＧＦタンパク質より
も副作用の少ないだいたい治療薬剤として使用する方法を提供する。 一態様では、本発明のＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターアゴニストは内皮細胞
におけるｅＮＯＳの発現レベルを上方制御することができる。特定の機序に限定
されるものではないが、ｅＮＯＳの発現レベルは、ｅＮＯＳ遺伝子の転写を増大
させることにより、又は別に転写されたｅＮＯＳ ｍＲＮＡの分解を防止するこ
とにより、又は双方を組み合わせることにより上方制御させることができる。他
の態様では、本発明のＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターアゴニストは内在性ｅＮ
ＯＳの活性を上方制御することができる。多くのタンパク質がｅＮＯＳに関連し
、タンパク質間相互作用を介してｅＮＯＳ活性を調節することが示されている。
例えば、ｅＮＯＳと結合した場合、カベオリン（caveolin）とＰＬＣ−γはｅＮ
ＯＳ活性を減少させる一方、ＨＳＰ−７０とＨＳＰ−９０はｅＮＯＳ活性を増加
させることが示されている。出願人は、培養された内皮細胞において、ＶＥＧＦ
で処理をすると、ｅＮＯＳからのカベオリンとＰＬＣ−γの分解を誘発し、ｅＮ
ＯＳのＨＳＰ−７０とＨＳＰ−９０への結合を増加させることを観察した。更に
、持続的なＶＥＧＦでの処理によって、ｅＮＯＳ活性化の他の指標であるｅＮＯ
Ｓのホスホチロシンレベルを低減させることが示された（実施例１４）。

【００１６】 開示した方法に使用されるＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ変異体は当該分野で公知の様
々な方法によって調製されうる。好ましくは、本発明の方法において用いられる
ＶＥＧＦは組換えＶＥＧＦ_１６５を含んでなる。ＶＥＧＦのアミノ酸配列はＶＥ
ＧＦのＤＮＡにおける突然変異によって調製できる。そのような変異体には、例
えば上掲のLeung等及び上掲のHouck等に示されたアミノ酸配列中の残基の欠失、
挿入又は置換が含まれる。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせが所望の活性
を有する最終構築物に到達するために実施される。明らかに、変異体をコードす
るＤＮＡにおいてなされる突然変異は配列を読み枠から外して位置させてはなら
ず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造をつくりだす相補的領域を作り出さない［EP75
,444Aを参照］。 ＶＥＧＦ変異体は場合によっては天然ＶＥＧＦをコードしているＤＮＡにおけ
るヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発又はファージディスプレイ法によって
、変異体をコードしているＤＮＡをつくり、ついで組換え細胞培養中でＤＮＡを
発現させることによって調製されてもよい。 アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体は予め決
定される必要はない。例えば、与えられた部位における突然変異の性能を至適化
するために、標的コドン又は領域でランダム突然変異誘発を行わせ、発現された
ＶＥＧＦ変異体を所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングするこ
とができる。既知の配列を持つＤＮＡ中の予め決められた部位に置換的突然変異
を行わしめる方法は、例えば部位特異的突然変異誘発のようによく知られている
。 ここに記載されたＶＥＧＦ変異体の調製は好ましくは、実施例に記載されるも
ののようなファージディスプレイ法によって達成される。 そのようなクローンが選択された後、突然変異されたタンパク質領域は除去さ
れ、タンパク質生産のための適切なベクター、つまり一般には適切な宿主の形質
転換のために使用されうるタイプの発現ベクターに配される。 アミノ酸配列の欠失は一般には約１から３０残基、より好ましくは１から１０
残基であり、典型的には隣接するものである。

【００１７】 アミノ酸配列挿入は、１残基から本質的に無制限の長さのポリペプチドのアミ
ノ-及び／又はカルボキシル末端融合、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列
内挿入を含む。配列内挿入（すなわち、天然ＶＥＧＦ配列内の挿入）は一般には
約１から１０残基、より好ましくは１から５の範囲でありうる。末端挿入の例に
は、宿主細胞に対して異種性であろうと相同的であろうと、組換え宿主からの分
泌を容易にするためのＮ末端へのシグナル配列の融合が含まれる。 更なるＶＥＧＦ変異体は、天然ＶＥＧＦの少なくとも一つのアミノ酸残基が除
去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。このような置換は表１
に示したものに従ってなされる。 機能又は免疫学的同一性における変化は表１のものより保存性が少ない置換を
選択することにより、すなわち（ａ）例えばシート又は螺旋高次構造として、置
換領域におけるポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）標的部位における分子
の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持することに対してのその効果がよ
り顕著に異なる残基を選択することによりなされうる。一般にはＶＥＧＦ変異体
の性質に最も大なる変化をつくりだすと予想される置換は、（ａ）グリシン及び
／又はプロリン（Ｐ）が他のアミノ酸に置換され又は欠失もしくは挿入され；（
ｂ）親水性残基、例えばセリル又はスレオニルが疎水性残基、例えばロイシル、
イソロイシル、フェニルアラニル、バリル又はアラニルを置換し、又はこれらに
より置換され；（ｃ）システイン残基が任意の他の残基を置換し、又はそれによ
り置換され；（ｄ）陽性の側鎖を持つ残基、例えばリジル、アルギニル、又はヒ
スチジルが、陰性電荷を持つ残基、例えばグルタミル又はアスパルチルを置換し
、又はそれにより置換され；（ｅ）陰性側鎖を持つ残基が陽性電荷を持つ残基を
置換し、又はそれにより置換され；又は（ｆ）嵩のある側鎖を持つ残基、例えば
フェニルアラニンが、そのような側鎖を持たないもの、例えばグリシンを置換し
、又はそれにより置換されたものである。

【００１８】 置換、欠失、又は挿入の効果は常套的なスクリーニングアッセイを使用して当
業者により容易に評価されうる。例えば、ファージディスプレイ選択ＶＥＧＦ変
異体は組換え細胞培養において発現され得、場合によっては細胞培養物から精製
される。ついで、ＶＥＧＦ変異体はＫＤＲ又はＦＬＴ−１レセプター結合親和性
及び他の生物活性、例えば本願において開示されているものについて評価されう
る。細胞溶解物又は精製されたＶＥＧＦ変異体の結合特性又は活性は所望される
特徴のために好適なスクリーニングアッセイでスクリーニングされ得る。例えば
、天然ＶＥＧＦと比較した場合のＶＥＧＦ変異体の免疫学的特徴の変化、例えば
所定の抗体に対する親和性が望ましい。そのような変化は、当該分野で知られて
いる方法に従って実施できる競合型のイムノアッセイによって測定することがで
きる。ＶＥＧＦ変異体の各レセプター結合親和性は、当該分野で知られ、更に以
下の実施例に記載されるＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及び／又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイ
によって定量することができる。本発明の好適なＶＥＧＦ変異体はまたＫＤＲレ
セプターのリン酸化を誘導する能力を反映するＫＩＲＡアッセイ（実施例に記載
したようなもの）において活性を示す。本発明の好適なＶＥＧＦ変異体は加えて
又は別に（実施例のＨＵＶＥＣ増殖アッセイのような公知の方法によって定量す
ることができる）内皮細胞増殖を誘導する。ここに開示される特定のＶＥＧＦ変
異体に加えて、Keyt等, J. Biol. Chem., 271:5638-5646 (1996)に記載されたＶ
ＥＧＦ変異体もまた本発明において使用することが考えられる。 ＶＥＧＦ変異体は当該分野で知られている技術、例えば組換え法によって調製
することができる。これらの方法で使用される単離されたＤＮＡとは、ここでは
、３'-及び／又は５'-フランキング領域を持つと持たないにかかわらず、化学的
に合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、染色体、又は染色体外ＤＮＡを意味するものと
理解される。好ましくは、ここでのＶＥＧＦ変異体は組換え細胞培養中で合成に
よってつくられる。

【００１９】 そのような合成に対しては、まず、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ変異体をコードする
核酸を取得することが必要である。ＶＥＧＦ分子をコードするＤＮＡはウシ下垂
体濾胞細胞から（ａ）これらの細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを調製し、（ｂ
）ＶＥＧＦ又はその断片（１００塩基対長さまで又はそれ以上）をコードする標
識ＤＮＡを用いてハイブリダイゼーション解析を実施し、（ｃ）制限酵素分析に
よってクローンを解析し核酸配列を決定して全長クローンを同定することによっ
て得られうる。全長クローンがｃＤＮＡライブラリー中に存在していない場合は
、適当な断片を、最初にここに開示された核酸配列定法を用いて様々なクリーン
から回収し、ＶＥＧＦをコードする全長クローンを構築するためにクローンに共
通な制限部位で連結する。あるいは、ゲノムライブラリーが所望のＤＮＡを提供
する。 このＤＮＡがひとたびライブラリーから同定され単離されたなら、更なるクロ
ーニング又は発現のために複製可能なベクター中に結合させられる。 組換え発現系の一例では、ＶＥＧＦコード化遺伝子がＶＥＧＦをコードしてい
るＤＮＡを含む発現ベクターとの形質転換によって細胞系に発現される。培養培
地又は宿主細胞のペリプラズムにＶＥＧＦを得るように、すなわち分泌分子を得
るように、そのようなプロセシングを達成できるように宿主細胞を形質転換する
ことが好ましい。 「形質移入」とはあらゆるコード配列が実際に発現されるかされないにかから
わず、宿主細胞によって発現ベクターが取り込まれることを意味する。数多くの
形質移入法が当業者に知られており、例えばＣａＰＯ_４及びエレクトロポレーシ
ョンである。成功裏の形質移入はこのベクターの作用の任意の指標が宿主細胞内
で生じる場合に一般に認められる。 「形質転換」とは、ＤＮＡが、染色体外成分としてであれ染色体統合によって
であれ、複製可能であるように生物体にＤＮＡを導入することを意味する。使用
される宿主に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的な方法を使用し
てなされる。Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972)及びMand
el等, J. Mol. Biol., 53: 154 (1970)に記載されているような塩化カルシウム
を用いるカルシウム処理は、実質的な細胞壁障壁を含む原核生物又は他の細胞に
対して一般的に使用される。そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞に対して
は、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム
沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は１９８３年
８月１６日に発行されたAxelの米国特許第４３９９２１６号に記載されている。
酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)
及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実
施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核注入
又はプロトプラスト融合もまた用いることもできる。

【００２０】 ここに開示されるベクターと方法は広範囲の原核生物体及び真核生物体に対す
る宿主細胞における使用に適している。 一般には、もちろん、本発明において有用なＤＮＡ配列の最初のクローニング
及びベクターの構築には原核生物が好適である。例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２
９４（ＡＴＣＣ番号３１４４６）は特に有用である。使用できる他の微生物菌株
には大腸菌Ｂ及び大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＴＣＣ番号３１５３７）のような大腸
菌株が含まれる。これらの例はもちろん限定するものではなく例示を意図するも
のである。 原核生物もまた発現に使用できる。上述の菌株並びに大腸菌株Ｗ３１１０（Ｆ
-、ラムダ-、原栄養菌株、ＡＴＣＣ番号２７３２５）、Ｋ５７７２（ＡＴＣＣ番
号５３６３５）、及びＳＲ１０１、桿菌、例えば枯草菌(Bacillus subtilis)、
他の腸内細菌、例えばマウスチフス菌(Salmonella typimurium)又はセラチアマ
ルセサンズ(Serratia marcesans)、及び種々のシュードモナス(Pseudomonas)種
が使用されうる 一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール
配列を含んでいるプラスミドベクターが、これらの宿主との関連で用いられる。
そのベクターは、通常、複製部位を持ち、並びに形質転換細胞において表現型の
選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、大腸菌は、典型的には、E.
coli種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を使って形質転換される（例えば、
Bolivar等、Gene, 2: 95 [1977]参照）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテ
トラサイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、よって形質転換細胞を同定するため
の簡単な手段を提供する。そのｐＢＲ３２２プラスミド、もしくは他の微生物プ
ラスミド又はファージもまた、それ自身のタンパク質の発現に関して微生物によ
り使用され得るプロモーターを含むか、又は含むよう改変される。 組換えＤＮＡ作製において最も一般的に使用されているプロモーターには、β
ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーター系［Cahng 等, Na
ture, 375:615 (1978)；Itakura等, Science, 198:1056 (1977); Goeddel等, Na
ture, 281:544 (1979)］及びトリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel等,
Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP出願公開番号0036,776］が含まれる。
これらは最も一般的に使用されているが、他の微生物プロモーターが発見され使
用されており、そのヌクレオチド配列に関する詳細は公開されており、当業者は
それらをプラスミドベクターと機能的に連結させることができる［例えば、Sieb
enlist 等, Cell, 20:269 (1980)を参照］。

【００２１】 原核生物に加えて、酵母菌培養物のような真核微生物をまた使用することがで
きる。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は、多くの他の菌
株も一般的に利用できるが、真核生物微生物のなかで最も一般的に用いられる。
サッカロミセスでの発現のためには、例えばプラスミドＹＲｐ７[Stinchcomb等,
Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7:141 (1979); Tschemer等, Gene
. 10:157 (1980)]が一般に使用される。このプラスミドは、例えばＡＴＣＣ番号
第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力
に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を既
に含んでいる[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。酵母宿主細胞ゲノムの特徴と
してｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における
増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。 酵母ベクターにおける好適なプロモーター配列に、３-ホスホグリセラートキ
ナーゼ［Hitzeman等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素
［Hess等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland等, Biochemistry, 17
：4900(1987)］のプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホス
ホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレ
ートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。適切な発現プラスミドを
構築する際には、これらの遺伝子に関連する終結配列がまたｍＲＮＡのポリアデ
ニル化をもたらすために発現されることが望ましい配列の発現ベクター３'に連
結される。その他のプロモーターは、成長条件によって転写が制御されるという
更なる利点を持つもので、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、
酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、及び上述のグリセルアルデ
ヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支
配する酵素のプロモーター領域である。酵母適合性プロモーター、複製起点及び
終結配列を含んでいる任意のプロモーターが好適である。

【００２２】 微生物に加えて、多細胞生物体由来の細胞の培地もまた宿主として使用できる
。原理的には、脊椎動物であれ無脊椎動物培地であれ、任意のかかる細胞培地が
使用可能である。しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培地（組織
培養）中での脊椎動物細胞の増殖が近年は常套的手法になっている［Tissue Cul
ture, Academic Press,編者Kruse及びPatterson (1973)］。そのような有用な宿
主セルラインの例は、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）株化細胞、及びＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、及びＭＤＫ
株化細胞である。そのような細胞のための発現ベクターは通常は（必要ならば）
複製起点、発現される遺伝子の前に位置するプロモーターを、任意の必要なリボ
ソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位及び転写終結
配列と共に含む。 哺乳動物細胞における使用のためには、発現ベクターに対する調節機能はウイ
ルス材料によってしばしばもたらされる。例えば、一般的に使用されるプロモー
ターは、ポリオーマ、アデノウイルス２から、最も頻繁にはシミアンウイルス４
０（ＳＶ４０）から由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは
、両方ともＳＶ４０ウイルス複製起点をまた含む断片として容易に得られるので
、特に有用である［Fiers等, Nature, 273:113 (1978)］。ウイルス複製起点に
位置するBglI部位に向けてHindIII部位から伸展するおよそ２５０ｂｐの配列が
含まれている限り、より小さい又はより大きいＳＶ４０断片もまた使用されうる
。更に、そのようなコントロール配列が宿主細胞系と適合性がある限り、所望の
遺伝子配列に通常関連するプロモーター又はコントロール配列を使用することも
でき、望ましいことも多い。

【００２３】 複製のオリジンは、ＳＶ４０又は他のウィルス（例えば、ポリオーマ、アデノ
、VSV、BPV）に由来するような、外来性のオリジンを含むベクターの構成により
提供されるか、又は宿主細胞の染色体複製機構により提供されるであろう。ベク
ターが宿主細胞の染色体に組み込まれるなら、 後者の方法で十分である。 良好なタンパク量が細胞培養により生産される；しかしながら、第二のコード
配列を使用して改良することが、さらに生産性のレベルを増強するのに役に立つ
。一つの第二のコード配列は、メトトレキセート（MTX）などの外的にコントロ
ールされる因子によ影響を受けるりジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）を含み、その
結果、メトトレキセート濃度を調節することにより発現調節を可能にする。 ＶＥＧＦとＤＨＦＲの両方をコードするＤＮＡ配列を含む当該発明のベクター
による形質移入のための好ましい宿主細胞はを選択するにおいて、用いられるＤ
ＨＦＲタンパク質のタイプにより宿主を選択することが妥当である。野生型のＤ
ＨＦＲタンパク質が用いられる場合、ＤＨＦＲ遺伝子を欠失している宿主細胞を
選択し、その結果、形質移入が成功したことのマーカとして、ヒポキサンチン、
グリシン、及びチミジンを欠く選択培地中でＤＨＦＲコード配列の使用を可能に
することが好ましい。この場合、妥当な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損し、Ur
laub及びChasin等のProc.Natl.Acad.Sci. (USA), 77:426 (1980)中に記述される
ように増殖されたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株である。 一方、調節配列としてMTXと低結合親和性を持つＤＨＦＲタンパク質が使用さ
れる場合、ＤＨＦＲ欠損細胞を用いる必要はない。突然変異ＤＨＦＲはメトトレ
キセートに対して耐性を持つので、宿主細胞がそれ自身メトトレキセート感受性
であるならば、ＭＴＸを含む培地を選択手段として使用することができる。ＭＴ
Ｘを取り込むことができるほとんどの真核細胞は、メトトレキセート感受性のよ
うである。このような有用な細胞株は、CHO株、CHO-K1株(ATCC No. CCL61)であ
る。 所望のコード配列及びコントロール配列を含む適切なベクターの構成には、標
準的なライゲーション技術が用いられる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片
は切断され、仕立てられ、必要なプラスミドを調製するために所望の形態に再連
結される。 平滑末端が必要な場合は、標品は10ユニットのポリメラーゼI（Klenow）を用
いて15℃にて15分間反応させ、フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈
殿処理される。 切断されたＤＮＡ断片のサイズによる分離は、例えば、6パーセントのポリア
クリルアミドゲルを用いて、Goeddel等のNucleic Acids Res. 8:4057 (1980)に
記載の方法により行われる。

【００２４】 正しい配列がプラスミドに構築されたことを確認するために、典型的にはライ
ゲーション反応混合物が大腸菌K12株294(ATCC 31,446)又は他の適当な大腸菌株
を形質転換するために用いられ、適当なアンピシリン又はテトラサイクリンによ
り、成功した形質転換体が選択される。形質転換体からプラスミドが調製され、
制限酵素地図及び／又はMessing等のNucleic Acies Res., 9:309 (1981)による
方法、又はMaxam等のMethods of Enzymology, 65:499 (1980)による方法による
ＤＮＡ配列決定により解析される。 哺乳類細胞宿主へＤＮＡを導入し、安定な形質移入細胞のための培地中での選
択の後、ＤＨＦＲタンパク質コード配列の増幅は、ＤＨＦＲ活性の競合阻害剤で
ある約20,000-500,000 nM濃度のメトトレキセート(ＭＴＸ)の存在下で、増殖中
の宿主細胞培養により影響を受ける。勿論、効果的な濃度範囲は、ＤＨＦＲ遺伝
子の性質及び宿主の性質に高度に依存する。明らかに、通常定義される上限及び
下限は確認できない。また、ＤＨＦＲを阻害する他の葉酸アナログ又は他の化合
物の適切な濃度が使用され得る。しかしながら、ＭＴＸ自体が、簡便で、容易に
入手可能であり、効果的である。 また、ＫＤＲレセプター又はＦＬＴ-１レセプターに対する抗体は、本発明の
方法において使用されてもよい。場合によっては、ＫＤＲレセプター又はＦＬＴ
-１レセプター抗体はモノクローナル抗体である。場合によっては、ＫＤＲレセ
プター抗体はアゴニスト抗体であり、好ましくは、eNOSレベル及び／又は活性を
上方制御することができる。そのようなモノクローナル抗体を調製するハイブリ
ドーマ法において、マウス又は他の適当な宿主動物は、免疫に使用されたタンパ
ク質に特異的に結合する抗体を産生し、又は産生し得るリンパ球を誘発するため
に、皮下、腹腔内又は筋肉内経路により免疫化される。或いは、リンパ球はイン
ヴィトロで免疫化されてもよい。その後、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形
成させるためにポリエチレングリコールなどの適当な融合試薬を用いて、ミエロ
ーマ細胞と融合される。Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Pract
ice, pp.59-103(Academic Press, 1986)を参照。 抗原は、ＫＤＲレセプター又はＦＬＴ-１レセプター、又は場合によっては、h
ＶＥＧＦのレセプターへの結合に関与する一又は複数のアミノ酸残基を持つ、そ
れらの断片又は部分又はエピトープ、又は変異体である。例えば、hＶＥＧＦと
の結合に関与する領域は、細胞外ドメインの範囲内又は全ドメインに及ぶため、
ＫＤＲの細胞外ドメイン配列で免疫することは、hＶＥＧＦのアゴニスト又はア
ンタゴニストである抗体を産生する上で特に有益である。ＫＤＲ又はＦＬＴ-１
に対するキメラ、抗イディオタイプ、ヒト化又はヒト抗体が当該発明における使
用に対して考慮され、当業者に既知の技術を使用して調製される。

【００２５】 また、ＶＥＧＦレセプターモノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５
６７号中に記載されているような組換えＤＮＡ法でも作製される。当該発明のモ
ノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、通常の方法（例えば
、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能
なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）を用いて配列決定される
。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい原料として役立
つ。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター中に挿入され、その後、サルのCOS細
胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、又はミエローマ細胞などの宿主
細胞へ形質移入される。また、ＤＮＡは、例えば相同のマウス配列に代えてヒト
重鎖及び軽鎖の定常ドメインに対するコード配列に置換えることにより[米国特
許第４，８１６，５６７号；Morrison等、上掲]、又はイムノグロブリンコード
配列を非イムノグロブリンポリペプチドに対するコード配列の全て又は一部と共
有結合的に結合させることにより修飾される。このような非イムノグロブリンポ
リペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換されることが可能であり、キ
メラ二価抗体を作成するために本発明の抗体の一の抗原連結サイトの可変ドメイ
ンと置換されることが可能である。 ＶＥＧＦレセプター抗体は、一価の抗体であってもよい。一過抗体の調製法は
、当該技術において周知である。例えば、一の方法は、イムノグロブリンの軽鎖
及び修飾された重鎖の組換体発現に関係する。一般に、重鎖のクロスリンクを防
ぐために、重鎖はFc領域のいずれかの点において切り取られる。或いは、クロス
リンクを防ぐために、関連するシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換される
か、又は除去される。 また、インビトロの方法は一価の抗体を調製するためにも適している。その断
片、特に、Fab断片を生産するための抗体の切断は、当該技術分野において知ら
れている所定の技術を用いて達成することができる。 ＶＥＧＦレセプター抗体は、さらに、ヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト
（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、非ヒトイムノグロブリンに由来する最小
配列を含む、キメラのイムノグロブリン、イムノグロブリン鎖、又はその断片（
Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂又は抗体の他の抗原結合サブ配列）である。ヒト化抗体
は、レシピエントの相補性決定領域（CDR）由来の残基が、所望の特異性、親和
性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、などの非ヒト種（ドナー抗体）の
CDR由来の残基と置換されるヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）を含む
。ある場合に、ヒトイムノグロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒ
ト残基によって置換えられる。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移
入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見いだされない残基をも含む可能
性がある。通常、ヒト化抗体は、少なくとも一の、典型的には二の可変ドメイン
の全てを実質的に含み、全ての又は実質的に全てのCDR領域が非ヒトイムノグロ
ブリンのCDR領域に対応し、全ての又は実質的に全てのFR領域がヒトイムノグロ
ブリンのコンセンサス配列のFR領域である。最適には、ヒト化抗体は、少なくと
もイムノグロブリン定常領域（Fc）の一部、典型的にはヒトイムノグロブリン定
常領域の一部も含むであろう[Jones等、Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann
等、Nature, 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:59
3-596 (1992)]。

【００２６】 非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野においてよく知られている。一般
的に、ヒト化抗体は、非ヒトである原料から導入された一又は複数のアミノ酸残
基を持つ。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」残基と称され、典
型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、基本的に齧歯動物のCD
Rs又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することにより、ウィンター及
び共同研究者［Jones等、 Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann等、Nature,
332:323-327 (1988)、Verhoeyen等、 Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法
を使用して行える。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体(米国特
許第４，８１６，５６７号)であり、実質的に無傷のヒト可変ドメインより実質
的に少ない部分が、非ヒト種由来の対応する配列で置換された。実際には、ヒト
化抗体は、典型的には幾つかのCDR残基及びおそらく幾つかのFR残基が齧歯類抗
体の類似部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。また、ヒト抗体は
、ファージディスプレイライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 2
27:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で
知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner
等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる(Cole等, M
onoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoe
rner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) )。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫
グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子
が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することが
できる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆ
る観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察
される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，
５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同
第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Mark
s等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1
994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnol
ogy 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); L
onberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている
。

【００２７】 一実施態様では、当該発明の治療的な方法には、高血圧を治療するために哺乳
動物へVEGFを投与することが含まれる。高血圧は、哺乳動物において比較的普通
にみられる心血管性の疾患である。例えば、上昇した動脈血圧は脈管構造におけ
る病理学的な変化、又は心臓の左心室の肥大を引き起こす可能性がある。高血圧
は、冠状動脈又は心筋梗塞の疾患を導くのと同様に、ある種の哺乳動物において
脳卒中を引き起こす。 本発明のＶＥＧＦは、治療されるべき特異的な高血圧性の状態、個々の患者の
状態、薬剤の到達部位、投与方法及び開業医に知られている他の要因を考慮にい
れ、一貫性のある良好な医療行為の様式で製剤化され投与されてもよい。ＶＥＧ
Ｆの「有効量」は、治療される状態又はその症状を予防し、悪化を減少させ、緩
和し、治す量を含む。場合によっては、ＶＥＧＦの「有効量」は、哺乳動物中で
の一酸化窒素を増強し又は上方制御する量である。場合によっては、ＶＥＧＦは
、慢性の高血圧に苦しむ患者を治療するための他に、高血圧の急性状態を治療す
るために使用されてもよい。 ＶＥＧＦは、望ましい程度の純度を持ったVEGFと生理的に受容可能な坦体、賦
形剤、又は安定化剤と混合することにより保存又は投与のために調製される。好
ましい担体媒体及びその調製は、例えばヒト血清アルブミンを含む他のヒトタン
パク質を含めて、Oslo等により編集されたRemington's Pharmaceutical Science
s, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co.,に記載されている。典型的には、適
量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用さ
れる。担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液のようなバ
ッファーが含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８である。例えばVEGF
が水溶性であれば、pH約7.0から約8.0のリン酸又は他の有機酸塩のようなバッフ
ァー中に製剤化されてもよい。VEGFが水に部分的に可溶性の場合、溶解度を増加
させるために、0.04%−0.05%(w/v)の量で、例えばTween80などのTween、Pluroni
cs、又はPEGなどの非イオン性界面活性剤で製剤化することにより、マイクロエ
マルジョンとして調製されてもよい。 更なる坦体には、マイクロカプセル粒子及び移植可能な（粒子）の形成を含む
徐放性製剤が含まれる。徐放性製剤物の例には、例えば固体疎水性ポリマーの半
透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、例えばフィルム、リポソーム又は
マイクロカプセル等の成形品の形態である。ポリ-D-(-)-3ヒドロキシブチル酸[
ＥＰ１３３，９８８Ａ]など、ポリ-(β-ヒドロキシカルボン酸)の他のポリマー
が使用可能であるが、本目的に適する物質は、ラクチドである。例えば、ポリ（
ラクトン）、ポリ（アセタール）、ポリ（オルトエステル）、又はポリ（オルト
炭酸塩）などの他の生物分解性のポリマーも適している。

【００２８】 徐放性組成物の例としては、米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４
８１Ａ、米国特許第３，８８７，６９９，号、ＥＰ１５８，２７７Ａ、カナダ特
許第１１７６５６５号、Sidman等、Biopolymers, 22:547 (1983)、及びLanger等
、Chem. Tech., 12:98 (1982)を参照のこと。 例えば、投与経路及び投与されるＶＥＧＦの濃度に依存して、ある種の坦体が
より好ましいことは、当業者にとって明らかであろう。 場合によっては、他の成分、例えば、アスコルビン酸などの抗酸化物；例えば
、ポリアルギニン又はトリペプチドなどの低分子量（約10残基以下）ペプチド；
血清アルブミンゼラチン又はイムノグロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピ
ロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ア
ルギニンなどのアミノ酸；セルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース
、又はデキストランを含む、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；EDTAなどのキ
レート剤；及びマンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；などが添
加されてもよい。賦形剤、坦体、安定化剤又は他の添加剤の使用により結果的に
VEGFの塩の形態になってもよい。 担体、賦形剤、安定化剤、又は他の添加剤を選択するとき、選択された化合物
及び対応する分解産物は、無毒性であって、治療される状態及び／又はその徴候
の悪化を避けなくてはならない。この点は、対照となる疾患の動物モデル、又は
そのようなモデルが入手できない場合は、正常動物における所定のスクリーニン
グによって決定され得る。 治療的な投与に使用されるＶＥＧＦは、無菌的でなくてはならない。無菌性は
、滅菌された濾過膜（例えば、0.2ミクロン膜）を通して濾過することにより容
易に達成される。ＶＥＧＦは、通常、凍結乾燥形態又は水溶液として保存される
。 哺乳動物への投与は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）又は注
入など、有効な形態での血流への到達を保証する他の方法により達成される。Ｖ
ＥＧＦが非経口的に使用されるのであれば、ＶＥＧＦを含む治療組成物は、例え
ば、皮下注射用針によって貫通可能なストッパーを備える静脈注射用溶液バッグ
又はバイアルなどの滅菌されたアクセスポートを備える容器中に配置される。 一般的に、条件が許す場合には、部位特異的な到達のためにＶＥＧＦを製剤化
して投与してもよい。 一態様において、本発明のＶＥＧＦは、一日の計画において約4時間、およそ0
.05μg/kg/分に至る投与量で静脈内注入により投与されてもよい。そのようなＶ
ＥＧＦは48時間又は72時間のインターバルで投与されてもよい。場合によっては
、ＶＥＧＦは、およそ0.25から約2.5 mg/kg、好ましくはおよそ0.3から約1.0 mg
/kgの投与量で徐放性製剤中、筋肉内又は皮下に投与されてもよい。さらに、Ｖ
ＥＧＦは、上皮細胞機能又はｅＮＯＳの発現を改善するためにＶＥＧＦ遺伝子産
物の徐放発現を提供するプラスミド又はウィルスベクターを介して哺乳動物へ投
与されてもよい。また、ステント移植において、ＶＥＧＦの使用が考慮されても
よい。ＮＯは、抗血栓性薬剤であり、平滑筋細胞（SMC）の増殖及び再狭窄を阻
害することも示されているので、STENTでコートされたVEGFの局所的な配達は、
局所的なｅＮＯＳの上方制御を提供し、例えば、バルーン傷害(injury)後の再狭
窄を防ぐのに有益である。

【００２９】 また、本発明のＶＥＧＦは創傷治癒のような徴候を治療するために、局所的な
適用において使用され得る。局所的に適用される場合、ＶＥＧＦは、治癒を促進
し感染を防ぐために局所的なｅＮＯＳ及びｉＮＯＳ産物を上方制御することがで
きる。局所的な適用に使用されるとき、ＶＥＧＦは、坦体、アジュバント、安定
化剤、又は賦形剤のような添加剤とうまく組合わすことができる。上述されたよ
うに、ＶＥＧＦとの混合物のための添加剤を選択するとき、添加剤は製薬的に受
容可能であり、意図される投与に対し効果的でなくてはならない。さらに、添加
剤はＶＥＧＦの活性に影響を与えてはならない。局所的な製剤に適する例には、
精製されたコラーゲンを含む又は含まない、軟膏剤、クリーム、ゲル又は懸濁液
が含まれる。また、組成物は径皮貼布、硬膏剤、及び絆創膏中に染みこませても
よく、好ましくは液体又は半液体状態である。 望ましい編成を持つゲル製剤は、ＶＥＧＦをセルロース誘導体のような水溶性
の多糖類、又はポリエチレングリコールのような合成ポリマーと混合することに
より調製される。多糖類及びポリエチレングリコールに適用される「水溶性」と
いう用語は、コロイド性溶液及び拡散性溶液を意味する。多糖類やＰＥＧについ
て述べる「水溶性」とは、コロイド溶液や分散液等も含む。一般的には、セルロ
ース誘導体の水溶性はエーテル基の置換度により決定され、ここで使用される安
定化誘導体は水溶性に成し得るに足りる量のエーテル基をセルロース錯の無水グ
ルコース一体当たり有することが望ましい。一般液に、無水グルコース一体当た
り少なくとも0.35のエーテル基のエーテル置換度で十分である。さらに、セルロ
ース誘導体は、例えば、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ又はＣｓ等のアルカリ金属塩の形態であ
っても良い。

【００３０】 適切な多糖類の例には、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセ
ルロース、及びヒドロキシアルキルセルロースを含むエーテル化セルロース誘導
体のようなセルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセ
ルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース
、及びヒドロキシプロピルセルロース；デンプン及び分別デンプン；寒天；アル
ギン酸及びアルギン酸塩；アラビアゴム；プルラン；アガロース；カラゲナン；
デキストラン；デキストリン；フルクタン；インシュリン；マンナン；キシラン
；アラビナン；キトサン；グリコーゲン；グルカン；及び合成バイオポリマー；
並びにキサンタンゴムのようなゴム；グアールゴム；イナゴマメゴム；アラビア
ゴム；トラガカントゴム；及びカラヤゴム；及びこれらの誘導体及び混合物であ
る。ここで好ましいゲル化剤は、生物学系に不活性で、無毒性で、調製が単純で
、なおかつ緩すぎず粘りすぎず、そしてそこに保持されるＶＥＧＦを不安定化さ
せないものである。 好ましくは、多糖類はエーテル化セルロース誘導体、より好ましくは良好特徴
づけられ、精製され、米国特許に記載されたものであり、例えば、ヒドロキシプ
ロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチ
ルセルロースなどのメチルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース誘導体
である。ここで最も好ましいのはメチルセルロースである。メチルセルロースを
含むゲル製剤は、好ましくは約２−５％のメチルセルロース及びゲルmlあたり30
0−1000 mgのＶＥＧＦを含む。さらに好ましくは、ゲル製剤は約3%のメチルセル
ロースを含む。

【００３１】 ゲル製剤に有用なポリエチレングリコールは、典型的には、適切な粘性を得る
ために、低分子量と高分子量のポリエチレングリコールの混合物である。例えば
、分子量400−600のポリエチレングリコールと分子量1500のポリエチレングリコ
ールとの混合物が、ペーストを得るために適当な割合で混合されるとき、本目的
には効果的であろう。 ＶＥＧＦ治療を他の新規な又は従来の治療（例えば、aFGF、bFGF、PDGF、IGF
、NGF、HGFアナボリックステロイド、EGF、TGF-βのような成長因子）と組合わ
せることは、ここでの適用範囲内である。そのような薬剤がタンパク性である場
合には都合が良いであろうが、そのような共治療薬剤が本発明の組成物自体に含
まれる必要はない。このような混合物は、ＶＥＧＦと同様な方法で適切に投与さ
れる。 また、前述の製剤及び投与方法は、ＶＥＧＦレセプターの選択的変異体又はＶ
ＥＧＦ抗体のようなＶＥＧＦレセプター活性を変更する他の分子を投与するのに
利用される。効果的な投与量及びそのような投与に対する計画は、経験的に決定
されてもよく、そのような決定をすることは、当該技術の範囲内である。 以下の実施例は、単に例示的目的のために提供され、決して当該発明の範囲を
限定することを意図するものではない。 当該明細書中の全ての特許及び引用された参考文献は、その全体が出典明示に
よってここに取り込まれる。

【００３２】 （実施例） 下記の実施例に相当する商業的に入手可能な試薬は、他に示されていなければ
、製造者による指示書に従って使用された。ＡＴＣＣ受託番号によって、下記の
実施例、及び明細書を通して同定された細胞の起源は、バージニアー州、マナサ
ス、アメリカン タイプ カルチャー コレクションである。

【００３３】 実施例１ ｅＮＯＳ発現のＶＥＧＦ上方制御 ＶＥＧＦがｅＮＯＳ発現を制御するかどうかを研究するために、ウシ副腎皮質
内皮細胞（ＡＣＥ）をｒｈＶＥＧＦとともに０−５日間に渡ってインキュベート
した。インキュベーションの終了時に、全細胞可溶化物を調製し、ウェスタンブ
ロット分析法によってｅＮＯＳタンパク質レベルを測定した。 材料： 組み換えヒトＶＥＧＦ_１６５（ｒｈＶＥＧＦ_１６５）を大腸菌で生産させた（
Siemeisterら., Biochem. Biophys. Res. Comm., 222: 249-255(1996)を参照；
また、Ｒ＆Ｄシステムから入手可能）。ＶＥＧＦ_１１０ヘアピン結合ドメイン欠
損変異体を、前出にて説明したようなプラスミンによるタンパク質限定分解によ
って作製した（Keytら., 1996, J. Biol. Chem., 271: 7788-7795）。 ＶＥＧＦレセプター選択性変異体ＦＬＴ−ｓｅｌ（Ｒ８２Ｅ／Ｋ８４Ｅ／Ｈ８
６Ｅ、ＫＤＲ結合が欠損）及びＫＤＲ−ｓｅｌ（Ｄ６３Ａ／Ｅ６４Ａ／Ｅ６７Ａ
、ＦＬＴ−１結合が欠損）を、前出にて説明したようなMuta-Geneファージミド
インビトロ突然変異誘発法を用いて調製した（Keytら., 1996, J. Biol. Chem.,
271:4538-5646）。組み換えヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）のヘテロ二量体型を
、前出にて説明したようにチャイニーズハムスター卵巣細胞で生産し、それより
単離した（Shenら., 1997, Am. J. Physiol., 272:L1115-L1120）。

【００３４】 組み換えヒト繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、組み換えヒト胎盤成長因子（Ｐ
ＬＧＦ）、組み換えヒトトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−ベーター１、
ＴＧＦ−ベーター２）、及び組み換えヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）は、R&D Syst
ems、Inc．（Minneapolis, MN）から購入した。モノクローナル抗-ｅＮＯＳ抗体
は、BIOMOL（Phymouth Meeting. PA）から購入した。モノクローナル抗-ＰＫＣ
抗体は、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂ（Lexington, KY）から購入した。Ｓ
Ｕ１４９８は、CALBIOCHEM（San Diego, CA）から購入した。ＰＰ１、ＰＤ９８
０５９、スタウロスポリン、ハービマイシンＡ、ゲニステイン、ホルボール１２
−ミリスチン酸１３−酢酸塩（ＰＭＡ）、ワートマニン、Ｌｙ２９４００２、Ｌ
−Ｎ^Ｇ−ニトロアルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）は、BIOMOL（Phymou
th Meeting. PA）へ発注した。ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＡＰ）は、Sigm
a（St. Louis., MO）から入手した。ＮＯＳ検出アッセイキットは、STRATAGENE
（La Jolla, CA）から購入した。Ｌ−［２，３，４，５−^３Ｈ］アルギニン塩酸
塩は、Amersham Phamacia Biotechから購入した。Geneticin（G480）は、Life T
echnologies(Gaithersburg,MD)から購入した。特に限定しない限り、すべての試
薬を１０００ｘ原液として調製した。

【００３５】 細胞培地： ウシ副腎皮質毛細血管内皮細胞（ＡＣＥ）を調製し、前出で説明したようにし
て維持した（Ferraraら., 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 161: 851-858
）。要約すると、細胞を６−ウェル培養プレート（Costar）にプレートし、２ｍ
Ｍ Ｌ-グルタミン酸（Life Technologies）、１０％ウシ血清（HyClone Lab., I
nc.）及び１００μｇ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（Life Technolog
ies）を補充した低グルコースダルベッコ改良イーグル培地で生育させた。ＡＣ
Ｅ細胞は、４−８継代の間のものを用いた。 ブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞、及びレセプター形質移入ＰＡＥ細胞（ＰＡＥ
／ＫＤＲ及びＰＡＥ／ＦＬＴ−１）については、Napoleone Ferrara（Genetech,
Inc.）からの提供があり、これを１０％ ＦＢＳ（ＰＡＥのための）又は２５０
μｇ／ｍｌ Ｇ４８０（ＰＡＥ／ＫＤＲ及びＰＡＥ／ＦＬＴ−１のための）を含
むハムＦ−１２培地で培養した。 薬物療法として、細胞を、ＶＥＧＦ又は特定の他の薬剤で補充した１０％ Ｆ
ＢＳを含む培地でインキュベートした。培地は２４時間毎に交換した。

【００３６】 ｅＮＯＳのウェスタンブロット検出： 細胞溶解とウェスタンブロットに関する方法は、Shen等., 1998 J. Biol. Che
m. 273:29979-29985に記載されている。モノクローナル抗-ｅＮＯＳ抗体を、ｅ
ＮＯＳタンパク質を検出するために１：２５００で用いた。西洋わさびペルオキ
シダーゼでコンジュゲートした二次抗体（１：２５００）（Zymed）、及び増幅
化学発光キットを、ｅＮＯＳの免疫反応性バンドを視覚化するために用いた。最
適曝露時間を確定するために、フィルムの複数回の曝露が行われた。このタンパ
ク質バンドをデンシトメータで走査し、その相対強度をImageQuant software（M
olecular Dynamics）を用いて定量化した。

【００３７】 ｅＮＯＳ活性アッセイ： ｒｈＶＥＧＦで２日間に渡って処理した、又は処理しなかったＡＣＥ細胞のｅ
ＮＯＳ活性を、［^３Ｈ］アルギニンからの［^３Ｈ］シトルリンの形成を測定する
ことによって測定した。要約すると、ＡＣＥ細胞を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、ｐＨ７．４、及び１ｍＭ ＥＧＴＡを含む緩衝液でホモジナイズし、そして５
分間に渡る１４，０００ｒｐｍでの超遠心分離にかけた。その上澄み液の５０μ
ｇのタンパク質を、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
４、３μＭ テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、１μＭ フラビンアデニンジ
ヌクレオチド（ＦＡＤ）、１μＭ フラビンアデニンモノヌクレオチド、［^３Ｈ
］アルギニンの０．１μＣｉ／ｍｌ、そしてアッセイキット（STRATAGENE）に含
まれている他のコファクター（カルシュウム及びカルモジュリン）とともに３７
℃で４５分間に渡ってインキュベートした。この反応は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
、ｐＨ５．５、５ｍＭ ＥＤＴＡによって停止させた。アルギニンに結合する平
衡化した樹脂をこの反応液へ添加し、そしてピペットでスピンカップへ移した。
ｐＨ５．５においてイオン的に中性である［^３Ｈ］シトルリンを完全にこのカッ
プへ流し、次いでシンチレーションカウンティングによって［^３Ｈ］シトルリン
を定量化した。 集密化したＡＣＥ細胞は、５００ｐＭ ｒｈＶＥＧＦでインキュベートした。
全細胞溶解物は、上文に記載されたように調製した。タンパク質の等量を還元条
件下で変性させ、１０％ Novex mini ゲルで分離し、ＰＤＶＦ膜へ移した。ｅＮ
ＯＳタンパク質のシグナルをＥＣＬによって視覚化し、デンシトメトリーを用い
て定量化した。２日間に渡ってＶＥＧＦで処理又は処理しなかった細胞のｅＮＯ
Ｓ活性を、製造者のプロトコールに従ってStratageneのＮＯＳ検出キットを用い
てアッセイした。

【００３８】 ＣＧＭＰアッセイ： ｅＮＯＳ活性は、ｅＮＯＳ活性化の結果であるＮＯ遊離に続く下流産物である
サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）の生産を測定することでも測定することができ
る。Papaetroulis等.,上掲。BioMolの一つの製品のように、商業的に入手可能な
ｃＧＭＰアッセイキットがある。BioMol EIA cGMPキットは、０．１ｍ ＨＣｌで
処理した試料中のｃＧＭＰの定量的測定のための競合的免疫アッセイである。こ
のキットは、ｃＧＭＰに対するポリクローナル抗体で競合的に試料中のｃＧＭＰ
へ結合するもの、或いはｃＧＭＰが共有結合的に連結しているアルカリフォスフ
ァターゼ分子を用いる。インキュベーション後、過剰の試薬を洗い流し、基質を
添加する。次いで、酵素反応を止め、マイクロプレートリーダー上で生じた黄色
を４０５ｎｍで測定する。結合黄色の強度は、試料中のｃＧＭＰの濃度に反比例
した。

【００３９】 結果： ＶＥＧＦは、５００ｐＭ ＶＥＧＦとのインキュベーションに続いて起こる最
大増加をともなう用量依存的なｅＮＯＳの上方制御を誘導した（データは示さず
）。Ｆｉｇ１Ａはタイムコース実験の結果を示し、長期に渡るＶＥＧＦ処理がｅ
ＮＯＳ発現の一過性の増加を誘導することを示している。発現のピーク（５．５
倍）は、５００ｐＭ ＶＥＧＦへの２日間（４８時間）の追加曝露で観察された
（Ｆｉｇ１Ｂ）。 更には、０−６０分又は２日間に渡ってＶＥＧＦとインキュベートした、又は
インキュベートしなかった細胞可溶化物のｅＮＯＳ活性を、ＮＯＳ検出キットを
用いて測定した。Ｆｉｇ１Ｃは、ＶＥＧＦ−処理細胞のｅＮＯＳ活性が未処理コ
ントロール細胞のｅＮＯＳ活性に比べて約５倍高いことを示し、それは増加した
ｅＮＯＳタンパク質レベルに比例した（５．５倍）。Ｆｉｇ１Ｄは、急なＶＥＧ
Ｆ処理（０−６０分）によって、ｅＮＯＳ活性が時間依存的に増加することを示
している。 （１）アッセイがＣａ^＋２依存性ＮＯＳ活性を測定し、並びに（２）ＶＥＧＦ
処理又は未処理細胞のいずれかにおいて、ウェスタンブロットによって検出可能
なｅＮＯＳタンパク質がないことから、ＡＣＥ細胞において測定された全ＮＯＳ
活性はｅＮＯＳ活性を表すと思われる（データは示されず）。これとともにこれ
らのデータは、培養された内皮細胞のｅＮＯＳ発現及び活性の双方が、ＶＥＧＦ
によって増加したことを示している。

【００４０】 実施例２ ｅＮＯＳ発現における一酸化窒素の負のフィードバック ＶＥＧＦ誘導によるｅＮＯＳ発現での一酸化窒素の役割は、ｅＮＯＳ阻害剤で
あるＬ−ＮＡＭＥ（２ｍＭ）、一酸化窒素供与体であるＳＮＡＰ、又はｅＮＯＳ
の基質であるＬ−アルギニンとＶＥＧＦの共インキュベーションによって調べら
れた。ＡＣＥ細胞をＶＥＧＦのみと、又はｅＮＯＳ阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥと
の組み合わせによってインキュベートした。この研究で用いられた材料と方法は
、実施例１のために上記した。 Ｆｉｇ２は、ＶＥＧＦ単独によって、時間依存的であるが、２日間の追加曝露
で最適効果をともなう一過性のｅＮＯＳ発現が誘導されることを示している。対
照的に、Ｌ−ＮＡＭＥのＶＥＧＦとの共インキュベーションはｅＮＯＳ発現の持
続的増加を引き起こし、一方では、ＮＯ供与体であるＳＮＡＰは、ｅＮＯＳの一
過性及び持続的増加の双方を妨げた（Ｆｉｇ２）。これらの結果は、培養中の内
皮細胞のｅＮＯＳによって生産される一酸化窒素、或いは外来性の一酸化窒素供
与体が、ｅＮＯＳ発現に対して負のフィードバックを有しうることを示唆してい
る。

【００４１】 実施例３ ＶＥＧＦ誘導ｅＮＯＳ発現にはＫＤＲレセプター活性化が必要である ＶＥＧＦ誘導によるｅＮＯＳ発現に関与しているＶＥＧＦレセプターを確定す
るために、幾つかの方法が利用された。最初に、ＶＥＧＦレセプターであるＫＤ
Ｒ又はＦＬＴ−１−のいずれか一つへ等濃度で優先的に結合するＶＥＧＦ選択性
変異体を、ＡＣＥ細胞と２日間に渡ってインキュベートした。この研究に用い、
そしてＦｉｇ３Ａに示された特定の試薬は：レーン１がコントロール；レーン２
がＶＥＧＦ_１６５；レーン３がＶＥＧＦ_１１０；レーン４がＫＤＲ−ｓｅｌ；レ
ーン５がＦＬＴ−ｓｅｌ；レーン６がＰＬＧＦであった。ｅＮＯＳタンパク質は
、実施例１のために記載した方法を用いて検出した。この研究で利用した材料と
方法は、実施例１のために上記されている。 Ｆｉｇ３Ａは、ＫＤＲ及びＦＬＴ−１への正常な結合をするヘパリン結合ドメ
イン欠損変異体であるＶＥＧＦ_１６５及びＶＥＧＦ_１１０の双方が、同じ程度の
ｅＮＯＳ発現を誘導したことを示している。ＫＤＲ選択性変異体（ＫＤＲ−ｓｅ
ｌ）は、正常にＫＤＲレセプターへ結合するが、ＦＬＴ−１への結合は低下する
。ＫＤＲ選択性変異体はｅＮＯＳ発現を上方制御したが、ＦＬＴ−１選択性結合
変異体（ＦＬＴ−ｓｅｌ）はそれができなかった。ＦＬＴ−１のみに結合するこ
とが知られている胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）は、ｅＮＯＳ発現に対す効果を有し
なかった。これらのデータは、ＫＤＲレセプターがＶＥＧＦ誘導によるｅＮＯＳ
発現に関与している支配的なレセプターであったことを示唆する。

【００４２】 レセプターを形質移入したブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞を用いた実験によっ
て、ｅＮＯＳ上方制御へのＫＤＲレセプターの関与が更に確かめられた。ＰＡＥ
、ＰＡＥ／ＫＤＲ及びＰＡＥ／Ｆｌｔ−１細胞を５００ｐＭ ｒｈＶＥＧＦとと
もに、又は５００ｐＭ ＶＥＧＦをともなわずに２日間に渡ってインキュベーシ
ョンした。ｅＮＯＳは、実施例１のために上文で記載されているようにして検出
された。この研究で用いられた他の材料及び方法は、実施例１のために上記され
たものである。 Ｆｉｇ３Ｂに示されたデータは、ＶＥＧＦが、ＦＬＴ−１形質移入ＰＡＥ（Ｐ
ＡＥ／ＦＬＴ）細胞ではなく、ＫＤＲ形質移入ＰＡＥ（ＰＡＥ／ＫＤＲ）細胞に
おいてのみｅＮＯＳの上方制御を誘導することを示している。 ｅＮＯＳの上方制御のためには、ＫＤＲレセプターチロシンキナーゼの活性化
が必修であることが示された。ＶＥＧＦと選択性ＫＤＲチロシンキナーゼ阻害剤
であるＳＵ−１４９ｇとの共インキュベーションは、ｅＮＯＳ発現の用量依存性
阻害を起こした（Ｆｉｇ３Ｃ）。 この研究で用いられた材料と方法は、実施例１のために上文に記載されたも
のである。集密化したＡＣＥ細胞を、２日間に渡って、５００ｐＭ ｒｈＶＥＧ
Ｆとの組み合わせでＳＵ１４９８と共インキュベーションした。示されたデータ
は、３つの独立した実験の代表例である。 高濃度（１００μＭ）では、ＳＵ−１４９８は完全にＶＥＧＦ誘導によるｅＮ
ＯＳの上方制御を遮断した。総合すると、これらのデータは、ＶＥＧＦ誘導によ
るｅＮＯＳの上方制御のためには、ＫＤＲレセプター活性化が必修であることを
示している。

【００４３】 実施例４ チロシンキナーゼの阻害及び／又はＰＫＣはＶＥＧＦ誘導ｅＮＯＳ発現を阻害す
る ＶＥＧＦ誘導によるｅＮＯＳ発現でのレセプター活性化に続く、下流のシグナ
ル伝達分子の役割を調べるために、種々の阻害剤を試験した。この研究で用いら
れた材料と方法は、実施例１のために上文に記載されたものである。ＡＣＥ細胞
を、２日間に渡って、５００ｐＭ ｒｈＶＥＧＦとの組み合わせで特異的チロシ
ンキナーゼによって処理した。ｅＮＯＳタンパク質をウェスタンブロットによっ
て検出した。 使用し、Ｆｉｇ４に示した特定の試薬は：レーン１、コントロール（ＶＥＧＦ
又は阻害剤を含まず）；レーン２、ＶＥＧＦ（５００ｐＭ）；レーン３、ＶＥＧ
Ｆ及びハービマイシンＡ（「Ｈｅｒ」；２μＭ）；レーン４、ＶＥＧＦ＋ＰＰ１
（１０μＭ）；レーン５、ＶＥＧＦ及びスタウロスポリン（「Ｓｔａ」；５００
ｎＭ）；レーン６、ＶＥＧＦ及びＧＦＸ（ＧＦ１０９２０３Ｘ、１０μＭ）；レ
ーン７、ＶＥＧＦ及びカルフォスチンＣ（「Ｃａｌ」、１０μＭ）；レーン８、
ＶＥＧＦ及び、chelerythrine chloride（「ｃｈｅ」、１０μＭ）；レーン９、
ＶＥＧＦ及びＧｏ６９７６（「Ｇｏ」、１０μＭ）；レーン１０、ＶＥＧＦ及び
Rotterlin Mallotoxin（「Ｒｏｔ」、５０μＭ）；レーン１１、ＶＥＧＦ及びＨ
８（２５μＭ）；レーン１２、ＶＥＧＦ及びＨ８（２５μＭ）である。示された
データは、３つの独立した実験の代表例である。 Ｆｉｇ４Ａのデータは、チロシンキナーゼの不可逆的で選択的阻害剤であるゲ
ニステイ又はハービマイシンＡによるチロシンキナーゼ活性の阻害が、ＶＥＧＦ
誘導によるｅＮＯＳ発現を遮断することを示す。更には、ＰＰ１によるＰＫＣの
上流シグナル分子であるＰＬＣ−ガンマの阻害は、ｅＮＯＳ発現も遮断する。Ｆ
ｉｇ４Ｂは、デンシトメータを用いたｅＮＯＳレベルの各定量化を示す。 ＰＫＣのアイソ型及びＶＥＧＦ誘導によるｅＮＯＳの上方制御の活性化を調べ
るために、ＡＣＥ細胞を１０分間に渡ってｒｈＶＥＧＦ（５００ｐＭ）で処理し
た。再分布又はＰＫＣのアイソ型を調べるために、細胞基質及び膜分画を調製し
た。ＶＥＧＦは、ＰＫＣ−アルファ、−ガンマ、及び−イプシロンの急激な再分
布を誘導した（Ｆｉｇ５Ａ参照）。更には、ＶＥＧＦ処理によって、時間依存的
にＰＫＣ活性が増加した（Ｆｉｇ５Ｂ）。 ＰＭＡとのインキュベーションによって、潜在的なＰＫＣアクチベーターは時
間依存的（Ｆｉｇ５Ｃ）及び用量依存的（データ示さず）なｅＮＯＳレベルの増
加を引き起こした。これらのデータは、ＶＥＧＦ誘導によるｅＮＯＳ発現でのＰ
ＫＣ活性化及びシグナル伝達に関する重要な役割を示す。

【００４４】 実施例５ ｅＮＯＳ発現における他の血管形成因子の効果 また、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータを含む幾つかの他の血管形成
因子のｅＮＯＳ発現に対する効果を研究した。２日間に渡って、ＡＣＥ細胞をＶ
ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１又はＴＧＦ−ベータ２によ
って処理した。この研究で用いた材料及び方法は、実施例１のために上記したも
のである。 Ｆｉｇ６は、ＶＥＧＦに加えて、ＨＧＦもｅＮＯＳ発現を増加させることがで
き、それとは逆にＦＧＦ、ＥＧＦはｅＮＯＳ発現に対して顕著な効果がないこと
を示す。ＴＧＦ−ベータ１及びＴＧＦ−ベータ２は、内在性のｅＮＯＳ発現を低
下させる。これらのデータは、インビトロにおけるｅＮＯＳ発現を増加させる能
力に関して、ＶＥＧＦ及びＨＧＦは他の血管成長因子とは異なることを示唆して
いる。

【００４５】 実施例６ ＫＤＲ特異的ＶＥＧＦ変異体の選択 ＫＤＲ特異的変異体を作製するために、Ｆｌｔ−１結合に重要であるが、ＫＤ
Ｒ結合には重要でないＶＥＧＦ（１−１０９）の残基がランダムに変異された二
つのファージライブラリを構築した。 ファージミド構築 ファージライブラリを構築するために、ＶＥＧＦの１−１０９残基をコードす
るｃＤＮＡを有するファージミドベクターを最初に生成した。ファージミドベク
ターであるｐｈＧＨａｍ−ｇ３（Genentech, Inc.）へＮｓｉＩ／ＸｂａＩによ
る制限断片の事後ライゲーションを可能にするプライマーを利用したＶＥＧＦの
残基１−１０９をコードするｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって、ファージミドベク
ターｐＢ２１０５（Genentech, Inc.）を生成した。これによって、残基１０９
のすぐ後にアンバーコードを導入し、残基２４９から４０６を含むｇＩＩＩのＣ
末端の半分へＶＥＧＦ１−１０９ｃＤＮＡを融合した。 一つのライブラリでは、ＶＥＧＦ１−１０９の位置１８、２１、２２、及び２
５においてすべての可能な残基の組み合わせが許容され（Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣ
、及びＳ＝Ｃ又はＧである、ＮＮＳ配列へ標的コドンを変えるオリゴヌクレオチ
ドを用いて）、位置１７については、４０％の確率で変化が可能であった（野生
型の７０％の確率、及び標的コドン中の各ベースの三つの他のベースタイプ各々
の１０％の確率を行使することによる）。 標的コドンをＮＮＳ配列へ変えるために、次のオリゴヌクレオチドを使用した
： Ｌ−５２８：CAC GAA GTG GTG AAG TTC NNS GAT GTC NNS NNS CGC AGC NNS TGC
CAT CCA ATC GAG（配列番号：１） Ｌ−５３０：GGG GGC TGC TGC AAT NNS GAG NNS NNS GAG TGT GTG CCC ACT（配
列番号：２） 二番目のライブラリでは、ＶＥＧＦ１−１０９の位置６３、６５、及び６６に
おいてすべての可能な残基の組み合わせが可能となり、位置６４については、４
０％の確立で変化が可能であった。

【００４６】 ヘテロ二重鎖ＤＮＡの合成 ヘテロ二重鎖ＤＮＡは、Kunkelら, Meth. Enzym. 204:125-139(1991)を改良し
た手法に従って合成された。この方法では、突然変異誘発オリゴヌクレオチドを
生物的に活性な共有結合的閉環状ＤＮＡ（ＣＣＣ-ＤＮＡ）分子へ導入する。下
記の段階に従ってこの手法を実行した。 最初に、上記のオリゴヌクレオチドは５'-リン酸化物である。エッペンドルフ
チューブ内で、２μｇのオリゴヌクレオチド、２μｌの１０ｘＴＭ緩衝液（500m
M Tris-HCl、100mM MgCl₂、pH7.5）、２μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、及び１μｌの１
００ｍＭ ＤＴＴを混合をし、そして次に全容量が２０μｌとなるように水を加
えることによって、これを調製した。２０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（Weiss ユニット）をこの混合液へ添加し、この混合液を３７℃で１時間に
渡ってインキュベートした。 次に、各５'-リン酸化オリゴヌクレオチドを、ファージミドテンプレート（du
t-/ung-大腸菌株ＣＪ-２３６より精製された一本鎖ＤＮＡ）へアニールした。最
初に１μｇの一本鎖ＤＮＡテンプレート、０．１２μｇのリン酸化オリゴヌクレ
オチド、そして２．５μｌの１０ｘＴＭ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．５）を混合し、全容量が２５μｌとなるよ
うに水を加えることで、これを調製した。オリゴヌクレオチドのテンプレートに
対する長さの比率が１：１００と推測される、３：１のオリゴヌクレオチドのテ
ンプレートに対するモル比率をＤＮＡ量は示した。この混合液を９０℃で２分間
に渡ってインキュベートし、次に５０℃で３分間に渡ってインキュベートし、さ
らに２０℃で５分間に渡ってインキュベートした。 次に、アニール化混合液へ次の試薬を加えることによって、各５'-リン酸化オ
リゴヌクレオチドを酵素的に伸張させ、ＣＣＣ−ＤＮＡ分子を形成するようにラ
イゲーションした：１μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、１μｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、
１．５μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、３ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、及び３ユ
ニットのＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ。この混合液を２０℃で３時間に渡ってイン
キュベートした。 ＤＮＡをエタノール沈殿によって精製し、１５μｌの水に再溶解した。

【００４７】 大腸菌エレクトロポレーション 大腸菌エレクトロポレーションによって、ライブラリーファージを大腸菌ＸＬ
１−ｂｌｕｅ（Stratagene, LaJolla、CA）として知られる大腸菌のサプレッサ
ー菌株中に生成した。エレクトロポレーションのために、精製ヘテロ二重鎖ＤＮ
Ａを、最初に氷上の０．２-ｃｍ ギャップ エレクトロポレーションキュベット
で冷却し、１００μｌの一定分量のエレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１−ｂｌ
ｕｅを氷上で解凍した。この大腸菌細胞をＤＮＡへ添加し、数回ピペットを上下
することにより混合した。 この混合液をキュベットへ移し、ジーンパルサー（Bio-rad, Hercules、CA）
を用いて以下の条件でエレクトロポレーションした：２．５ｋＶの磁界強度、２
００ｏｈｍｓの電気抵抗、及び２５ｍＦの電気容量。その直後、１ｍｌのＳＯＣ
培地（５ｇの細菌−酵母抽出物、２０ｇの細菌−トリプトン、０.５ｇのＮａＣ
ｌ、０.２ｇのＫＣｌ；水を加えて１リッターとし、ＮａＯＨによりｐＨを７.０
へ調整；オートクレーブ；次に５ｍｌのオートクレーブした２ＭのＭｇＣｌ_２、
及びフィルターにより無菌化された２０ｍＬの１Ｍのグルコースを加える）を加
え、混合液を無菌培養試験管へ移し、３７℃で３０分間渡って振とうして生育さ
させた。 ライブラリーの多様性を測定するために、連続希釈液は２ＹＴ（１０ｇの細菌
-酵母抽出物、１６ｇの細菌-トリペプトン、５ｇのＮａＣｌ；水を加えて１リッタ
ーとして、ＮａＯＨによりｐＨを７．０へ調整；オートクレーブ）プレート（５
０μｇ/ｍｌのアンピシリンを補充）へプレートされた。更に、この培養液を２
５ｍｌの２ＹＴ、２５ｍｇ／ｍｌのアンピシリン、Ｍ１３−ＶＣＳ（１０^１０ｐ
ｆｕ／ｍＬ）（Stratagene、LaJolla、CA）を含むバッフルフラスコへ移し、３
７℃で一晩振とうした。

【００４８】 次に、培養液を１０分間に渡って１０ｋｒｐｍで２℃のSorvall GSA ローター
（１６０００ｇ）で遠心分離した。その上清を新鮮な試験管へ移し、ファージを
沈殿するために１/５容量のＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液（２００ｇ/ＬのＰＥＧ-８０
００、１４６ｇ/ＬのＮａＣｌ；オートクレーブ）を添加した。その上清/ＰＥＧ
−ＮａＣｌ溶液を室温で５分間インキュベートし、ファージペレットを得るため
に再び遠心分離した。 上清をデカントして廃棄した。ファージペレットを簡単に再遠心分離し、その
残存上清を取り除いて廃棄した。ファージペレットを１／２０容量のＰＢＴ緩衝
液（ＰＢＳ、０．２% ＢＳＡ、０．１% Ｔｗｅｅｎ２０）へ再懸濁し、再懸濁ペ
レットを５分間に渡って１５ｋｒｐｍで２℃のＳＳ-３４ローター(２７０００ｇ
)で遠心分離することによって、不溶性物質を取り除き廃棄した。この残存上清
は、ファージを含んでいた。 上清を確保し、結合親和性によってＶＥＧＦ変異体を識別することに利用した
。大腸菌のサプレッサー菌株中にファージを生成することによって、ファージ表
面にＶＥＧＦ（１−１０９）変異体−ｇＩＩＩ融合タンパク質が発現し表示され
、ファージがＫＤＲ及び／又はＦｌｔ−１レセプターへ結合することが可能とな
った。

【００４９】 ライブラリーの親和性分類 各ライブラリーを、H. Jin, J. Clin. Invest., 98: 969 (1996)で使用され、
レセプター選択的変異体を生成するのに有用であることが示された方法に類似し
た競合結合技術を用いて、ＫＤＲ(１−３)モノマーへの結合について分類した。 競合結合技術を実施するために、各ライブラリーを、固定化したＫＤＲ(１−
３)モノマー（Genentech, South San Francisco, California)への結合について
、競合するＦｌｔ-１(１−３)モノマー(Genentech, Inc.)の高濃度（100nM）溶
液の存在下で分類した。これは、最初にマキシソープ免疫プレートウェル（Nalg
e Nunc International, Rochester, New York）を、被覆バッファー（50mM炭酸
ナトリウムpH9.6）中の2-5μg/mlのＫＤＲ(１−３)モノマーでウェル当たり80μ
lで被覆し、終夜4℃でインキュベートすることにより達成した。必要とされるウ
ェルの数はライブラリの多様性に依存する。被覆溶液を除去して、200μlのＰＢ
Ｓ中の0.2%ＢＳＡで1時間ブロックした。同時に、同数の未被覆ウェルをネガテ
ィブコントロールとしてブロックした。

【００５０】 ウェルをＰＴバッファー（ＰＢＳ、0.05%Tween20）で８回洗浄してブロックバ
ッファーを除去した。次いで、ＰＢＴバッファー（ＰＢＳ、0.2%ＢＳＡ、0.1%Tw
een20）中のライブラリファージ溶液（10^１２ファージ/ml）の100μlのアリコー
トを、被覆及び未被覆の各ウェルに添加した。Flt-1(1-3)モノマーをファージ溶
液とともに添加した。ウェルを室温で2時間、穏やかに振盪させながらインキュ
ベートした。 次いでウェルを、ファージ溶液及び任意のFlt-1-結合ファージを除去するため
にＰＴバッファー（ＰＢＳ、0.05%Tween20）で１０回洗浄した。ＫＤＲ-結合フ
ァージは、ウェルを100μlの0.2mMグリシンとともにpH2で5分間室温でインキュ
ベートすることによりウェルから溶離させた。ＫＤＲ-結合ファージを回収する
ために、グリシン溶液をエッペンドルフ管に移し、1.0MのTris-HCｌでpH8.0にお
いて中和させた。

【００５１】 次いで、溶離したファージ溶液の半分を１０容量の活性に成長している大腸菌
XL1-ブルー（ＯＤ_６００＜10）に添加して37℃で30分間振盪させながらインキュ
ベートすることによりＫＤＲ-結合ファージを再増殖させた。次いで培地の連続
希釈物を2YT/ampプレート（50mg/mlアンピシリンを添加した2YT）に蒔き、溶離
されたファージの数を測定した。これは、ＫＤＲ(１−３)モノマー被覆ウェル及
び未被覆コントロールウェルの両方について測定した。 プレートからの培地を10容量の2YT/amp/VCS（50mg/mlのアンピシリン及び10^{１ ０} pfu/mlのM13-VCSを添加した2YT）に移し、37℃で振盪させながら終夜インキュ
ベートした。次いでファージを単離した。

【００５２】 再増殖したファージは、競合するFlt-1(1-3)モノマーの高濃度溶液（100nM）
の存在下で、固定化ＫＤＲ(１−３)モノマーへの結合について分類し、次いでFl
t-1-結合ファージを洗い落としてＫＤＲ-結合ファージを再成長させた。アフィ
ニティソート手法は、濃縮比率の計算によって監視し、濃縮比率が最大になるま
で（約5〜6ソーティングサイクル）繰り返した。 濃縮比率は、ＫＤＲ(１−３)モノマーで被覆したウェルから溶離されたファー
ジの数を、未被覆のコントロールウェルに結合したファージの数で除したもので
ある。１より大きな比率は、通常、ＫＤＲ(１−３)タンパク質に特異的に結合す
るファージを表し、よって添加したFlt-1(1-3)モノマーへの結合に対する耐性を
示している。濃縮比率が最大に達したとき、個々のクローンを特異的結合性につ
いて分析した。

【００５３】 ファージＥＬＩＳＡ ＶＥＧＦ１−１０９変異体−ｇＩＩＩタンパク質を表面に持つファージのＫＤ
Ｒ(１−３)モノマーへの特異的な結合は、Muller 等，PNAS, 94:7192(1997)に記
載のファージＥＬＩＳＡを使用して測定された。ファージＥＬＩＳＡでは、マイ
クロタイタープレート（Maxisorp, Nunc-Immunoplate, Nalgc Nunc Internation
al, ロチェスター，ニューヨーク）を、pH9.6で50mM 炭酸ナトリウム中の精製Ｋ
ＤＲ(１−３)モノマー又はFlt-1(1-3)モノマー（5μg/ml）で被覆し、4℃で一晩
インキュベートした。プレートを、0.5%ＢＳＡでブロックした。次に、ほぼ飽和
した濃度の競合レセプター（ＫＤＲ(１−３)モノマー又はFlt-1(1-3)モノマー）
とともにＶＥＧＦ１−１０９変異体の連続希釈液を、100μlのバッファー（PBS,
0.5% Tween20, 0.5% BSA）中のウェルへ添加した。平衡化の後、プレートを洗
浄し、そして結合したファージミドを、製造者指示書に従って、西洋ワサビ由来
のペルオキシダーゼ共役抗-Ｍ１３抗体（ファルマシア バイオテク，Piscataway
, ニュージャージー）によって染色した。アフィニティー（EC50）は、ファージ
ミド結合の最高値の半値となる競合レセプターの濃度として計算した。 アフィニティ−分類より得られ、Flt-1(1-3)モノマーへ耐性を示したＶＥＧＦ
１−１０９変異体の配列は、ファージミドｃＤＮＡの配列から決定された。

【００５４】 ＶＥＧＦ１−１０９変異体の精製 ＶＥＧＦ１−１０９変異体タンパク質は、大腸菌（27c7）の振盪フラスコ培養
からの牽引体として単離された。変異タンパク質のリフォールディングは、Yiha
i等, J.Biol.Chem..271:3154-3162(1996)に記載のように行われた。変異体は、
ｐＨ６で１ｍＭ酸化グルタチオンを加えた6Mグアニジン塩酸と混合、そしてアン
フォウルドされ、2mM還元グルタチオンを含む2M尿素及び20mM Tris-HCｌに含ま
れる0.5mM酸化グルタチオンに対して、pH8で10時間に渡って透析された。尿素は
、4℃で一晩、20mMのTris-HCl（pH8）の20倍容量に対してゆっくりと透析するこ
とで除かれた。各変異体は、ミスフォウルドされた単量体の痕跡を除くために、
更に、アニオン交換（ファルマシア HiTrap Q, 1ml）（ファルマシア バイオテ
ク，Piscataway, ニュージャージー）によって精製された。純変異体産物の同一
性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法によって確認された。 表２は、ＶＥＧＦ変異体識別符号、導入されたアミノ酸置換、及び各々の置換
されたアミノ酸をコードするコドンを示す。ある変異体識別符号（例えばLK-VRB
-1s）の次の星印（^＊）は、特に好ましい結合親和性及び／又は生物活性を明示
した種々のＶＥＧＦ変異体を示す。「ｓ」（例えばLK-VRB-1s）を含む変異体識
別符号は、ＶＥＧＦの１−１０９切断型で構成され、表中に提供され詳述された
変異体を含むＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを示す。「ｆ」（例えばLK-VRB-1f）
を含んだ変異体識別符号は、ＶＥＧＦの全長１−１６５型を構成し、表に提供さ
れ詳述された変異体を含んだＶＥＧＦ変異体ポリペプチドを示す。変異体配列の
変異の命名及び同定は、命名の協定に従う。例えば、表２の最初のエントリーで
は、変異は「Ｍ１８Ｅ」に相当する。これは、天然ＶＥＧＦ配列の１８位置（Le
ung 等，上掲 及びHouck等，上掲 に報告されている天然ヒトＶＥＧＦのアミノ
酸配列の番号化を使用した）が、ＶＥＧＦ変異体を調製するために、その位置の
天然メチオニン（Ｍ）がグルタミン酸残基へ置換されるように変異されたことを
意味する。「ヌクレオチド配列」に相当する表２の欄は、各々のアミノ酸変異を
コードする（5'→3'）各々のコドンを提供する。例えば、表２の最初のエントリ
ーでは、Ｍ１８Ｅ変異は、コドン「ＧＡＧ」によってコードされている。

【００５５】

【００５６】 実施例７ ＶＥＧＦ変異体のＫＤＲレセプターへの結合 ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体及びＶＥＧＦ１６５変異体（実施例１に記載）
のＫＤＲレセプターへの結合は、ビオチン化天然ＶＥＧＦ（８−１０９）のＫＤ
Ｒレセプターへの結合を阻害する変異体の能力を測定することによって評価され
た。評価されたＶＥＧＦ変異体は、表２に示された変異を含んでいた。 レセプター結合アッセイ法は、96-ウェルのイムノプレート（Maxisorp, Nunc-
Immunoplate, Nalgc Nunc International, ロチェスター，ニューヨーク）にて
実行された。各ウェルは、ｐＨ９．６で５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液中の、ＭＡＫＤ
５（ジェネンテック，サウス サンフランシスコ、カリフォルニア）として知ら
れているＫＤＲに対する８μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む１００μｌの
溶液で被覆され、４℃で一晩インキュベートされた。上清は廃棄され、ウェルは
洗浄緩衝液（PBS中の0.05% Tween20）で３回洗浄され、プレートはブロック緩衝
液（PBS中の0.5% BSA, 0.01% チメロサール）によって室温で１時間ブロックさ
れた（ウェル当たり150μｌ）。上清は廃棄され、ウェルは洗浄された。

【００５７】 連続希釈された天然ＶＥＧＦ（８−１０９）、天然ＶＥＧＦ（１−１６５）、
天然ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体、又はＶＥＧＦ１６５変異体（単量体で0.16
-168nM）は、アッセイ緩衝液（ PBS中の0.5%BSA,0.05% Tween20）中で、ビオチ
ン化天然ＶＥＧＦ（８−１０９）（84nM）及びＫＤＲ（１−３）（1μg/ml）と
室温で２時間インキュベートされた。この混合溶液（100μｌ)の一定量は、予め
被覆されたマイクロタイターウェルに添加され、プレートは室温で１時間インキ
ュベートされた。マイクロタイタープレートに結合したＫＤＲ（１−３）及びビ
オチン化天然ＶＥＧＦの複合体は、ウェルをペルオキシダーゼラベル化ストレプ
トアビジン（0.2mg/ml, シグマ、セントルイス、ミズーリー）と室温で３０分間
インキュベートすることによって検出された。次に、ウェルは、３，３'，５，
５'−テトラメチルベンジジン（0.2グラム／リッター；Kirkegaard and Perry L
aboratories, ゲーサーズバーグ、メリーランド）と室温で約１０分間インキュ
ベートされた。吸光度は、Vmaxプレートリーダー（Molecular Devices, Menlo P
ark, CA）上で450nmにおいて読んだ。 滴定曲線は、4-変数非線形回帰カーブフィッティングプログラム（KaleidaGra
ph, Synergy Software, Reading, PA）でフィッティングさせた。天然ＶＥＧＦ
（８−１０９）の滴定曲線の中間点吸収に相当するＶＥＧＦ変異体の濃度は計算
され、次いで天然ＶＥＧＦ滴定曲線の中間点吸収に対応する天然ＶＥＧＦの濃度
で除した（Fig７を参照のこと）。 ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体及びＶＥＧＦ１６５変異体のために決定された
結合親和性が、表３に示されている。多くのＶＥＧＦ変異体は、天然ＶＥＧＦ（
８−１０９）の結合の約２倍以内である、ＫＤＲレセプターへの結合を示した。

【００５８】 実施例８ ＶＥＧＦ変異体のＦｌｔ−１レセプターへの結合 ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体及びＶＥＧＦ１６５変異体（実施例６に記載）
のＦｌｔ−１レセプターへの結合は、ビオチン化天然ＶＥＧＦ（８−１０９）の
Ｆｌｔ−１レセプターへの結合を阻害する変異体の能力を測定することによって
評価された。評価されたＶＥＧＦ変異体は、表２に示された変異を含んでいた。 レセプター結合アッセイ法は、９６−ウェルのイムノプレート（Maxisorp, Nu
nc-Immunoplate, Nalgc Nunc International, ロチェスター，ニューヨーク）に
て実行される。各ウェルは、ｐＨ９．６で５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液中の、ヒトＩ
ｇＧ Ｆｃ（Jackson ImmunoResearch, West Grove, ペンシルバニア）に対する
２μｇ／ｍｌのウサギＦ(ａｂ')_２を含む100μlの溶液で被覆され、４℃で一晩
インキュベートされた。次に上清は廃棄され、ウェルは洗浄緩衝液（PBS中の0.0
5% Tween20）で３回洗浄され、プレートはブロック緩衝液（PBS中の0.5% BSA, 0
.01% チメロサール）によって室温で１時間ブロックされた（ウェル当たり150μ
ｌ）。上清は廃棄され、ウェルは洗浄された。 ウェルは、アッセイ緩衝液（PBS中に0.5%BSA, 0.05% Tween20）中にＦｌｔ−
ＩｇＧ（キメラFlt-ヒト Fc分子）を５０ｎｇ／ｍｌで含む１００μｌの溶液で
満たされた。ウェルは、室温で１時間インキュベートされ、洗浄緩衝液（PBS中
に0.05% Tween20）で３回洗浄された。

【００５９】 連続希釈された天然ＶＥＧＦ（８−１０９）、天然ＶＥＧＦ１６５、天然ＶＥ
ＧＦ（１−１０９）変異体、又はＶＥＧＦ１６５変異体（単量体で0.03-33nM）
は、ビオチン化天然ＶＥＧＦ（８−１０９）（0.21nM）又はビオチン化天然ＶＥ
ＧＦ１６５（0.66nM）と混合された。この混合溶液（100μｌ)の一定量は、予め
被覆されたマイクロタイターウェルに添加され、プレートは室温で２時間インキ
ュベートされた。マイクロタイタープレートに結合したＦｌｔ−ＩｇＧ及びビオ
チン化天然ＶＥＧＦの複合体は、ウェルをペルオキシダーゼラベル化ストレプト
アビジン（0.2mg/ml, シグマ、セントルイス、ミズーリー）と室温で３０分間イ
ンキュベートすることによって検出された。次に、ウェルは、３，３'，５，５'
−テトラメチルベンジジン（0.2グラム／リッター；Kirkegaard and Perry Labo
ratories, ゲーサーズバーグ、メリーランド）と室温で約１０分間インキュベー
トされた。吸光度は、Vmaxプレートリーダー（Molecular Devices, Menlo Park,
CA）上で450nmにおいて読んだ。 滴定曲線は、4-変数非線形回帰カーブフィッティングプログラム（KaleidaGra
ph, Synergy Software, Reading, PA）でフィッティングさせた。天然ＶＥＧＦ
（８−１０９）の滴定曲線の中間点吸収に相当するＶＥＧＦ変異体の濃度は計算
され、次いで天然ＶＥＧＦ滴定曲線の中間点吸収に対応する天然ＶＥＧＦの濃度
で除した。 ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体及びＶＥＧＦ１６５変異体のために決定された
結合親和性が、表３に示されている。多くのＶＥＧＦ変異体は、天然ＶＥＧＦ（
８−１０９）の結合より２，０００倍より低い値より高いＦｌｔ−１レセプター
への結合を示した。表３に報告されている、あるＶＥＧＦ変異体（例えば，LK-V
RB-7s^＊及びLK-VRB-8s^＊）のＦＬＴ−１レセプターについての相対的結合親和性
は、検出可能な結合がＥＬＩＳＡアッセイ法の感度を越えていたので、ｎＭ値で
は報告されていない。

【００６０】

【００６１】 実施例９ ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体によるＫＤＲレセプターリン酸化の誘発 ＶＥＧＦ変異体の活性を決定するために、変異体のＫＤＲレセプターリン酸化
の誘発する能力は、ＫＩＲＡアッセイ法によって測定された。評価されたＶＥＧ
Ｆ変異体は、表２に見出される変異を含んでいた。特に、次のＶＥＧＦ（１−１
０９）変異体が研究された：LK-VRB-1s^＊；LK-VRB-2s^＊；LK-VRB-3s；LK-VRB-4s
；LK-VRB-5s；及びLK-VRB-6s。 連続希釈ＶＥＧＦ（１−１０９）変異体（0.01-10nM）は、Ｎ-末端にｇＤタッ
グを有するＫＤＲレセプター（ジェネンテック、サウス サン フランシスコ、カ
リフォルニア）を発現するＣＨＯ細胞へ加えられた。細胞は、ｐＨ７．２で０．
５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓに
よって溶解され、溶解液中のリン酸化ｇＤ−ＫＤＲレセプターは、ＥＬＩＳＡを
実行することで数量化された。 ＥＬＩＳＡでは、96-ウェルのイムノプレート（Maxisorp, Nunc-Immunoplate,
Nalgc Nunc International, ロチェスター，ニューヨーク）が使用された。各
ウェルは、ｐＨ９．６で５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液中の、３ｃ８（ジェネンテック
、サウス サン フランシスコ、カリフォルニア）として知られるｇＤに対する１
μｇ／ｍｌのマウスモノクローナルを含む１００μｌの溶液で被覆され、４℃で
一晩インキュベートされた。上清は廃棄され、ウェルは洗浄緩衝液（PBS中の0.0
5% Tween20）で３回洗浄され、プレートはブロック緩衝液（PBS中の0.5% BSA, 0
.01% チメロサール）によって室温で１時間ブロックされた（ウェル当たり150μ
ｌ）。次に、上清は廃棄され、ウェルは洗浄された。

【００６２】 溶解液のアリコート（100μl）は、予め被覆されたウェルに加えられ、室温で
２時間インキュベートされた。リン酸化ｇＤ−ＫＤＲレセプターは、ウェルを４
Ｇ１０（0.05mg/ml）（Upstate Biotechnology, レークプラシッド，ニューヨー
ク）として知られているホスホチロシンに対するビオチン化モノクローナル抗体
と室温で２時間インキュベートし、続いてウェルをペルオキシダーゼラベル化ス
トレプトアビジン（0.2mg/ml, シグマ、セントルイス、ミズーリー）と室温で１
時間インキュベートすることによって検出された。次に、ウェルは、３，３'，
５，５'−テトラメチルベンジジン（0.2グラム／リッター；Kirkegaard and Per
ry Laboratories, ゲーサーズバーグ、メリーランド）と室温で約１５−２０分
間インキュベートされた。吸光度は、Vmaxプレートリーダー（Molecular Device
s, Menlo Park, CA）上で450nmにおいて読んだ。 滴定曲線は、4-変数非線形回帰カーブフィッティングプログラム（KaleidaGra
ph, Synergy software, Reading, PA）でフィッティングさせた。天然ＶＥＧＦ
の滴定曲線の中間点吸収に相当するＶＥＧＦ変異体の濃度は計算され、次いで天
然ＶＥＧＦ滴定曲線の中間点吸収に対応する天然ＶＥＧＦの濃度で除した（Fig
８を参照のこと）。 ＶＥＧＦ変異体のリン酸化誘発活性は、表４に提供されている。ＶＥＧＦ変異
体は、天然ＶＥＧＦ（８−１０９）の活性の２倍以内のリン酸化誘発活性を示し
た。

【００６３】

【００６４】 実施例１０ 内皮細胞増殖アッセイ ＶＥＧＦ（１−１０９）又はＶＥＧＦ１６５変異体（一つのVEGF165変異体、L
K-VRB-2fと同じ）の分裂促進活性は、標的細胞としてヒト臍静脈内皮細胞（HUVE
C）（セル システム、Kirkland、ワシントン）を使用して決定された。評価され
たＶＥＧＦ変異体は、表２中の変異を含んでいた。特に、次のＶＥＧＦ（１−１
０９）変異体が研究された：LK-VRB-1s^＊；LK-VRB-2s^＊；LK-VRB-7s^＊；及びLK-
VRB-8s^＊。 ＨＵＶＥＣは、ＣＳ−Ｃ完全生育培地（セル システム、Kirkland、ワシント
ン）中の酸性ＦＧＦなどの成長因子で維持及び生育される初代株化細胞である。
アッセイの準備のためには、初期継代（５継代より早い）の細胞は、洗浄されて
９６−ウェルプレート（ウェル当たり100μｌに3000細胞）に接種され、すべて
の成長因子を除くが２％のダイアフィルトレーションされた胎児ウシ血清（Gibc
oBRL, Gaithersburg, MD)で補充されたＣＳ−Ｃ培地中で、新鮮飢餓培地と交換
する前に、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間に渡って飢餓
状態にした。同じ飢餓培地で希釈された幾つかの濃度（約10nMから0.01nM）のＶ
ＥＧＦ変異体は、ウェル当たりの容量が１５０μｌとなるようにウェルへ加えら
れ、１８時間インキュベーションされた。

【００６５】 ＶＥＧＦ変異体によって誘発されたＤＮＡ合成を測定するために、^３Ｈ−チミ
ジン（Amersham Life Science, Arlington Heights, IL）は、０．５μＣｉ／ウ
ェルで各ウェルへ加えられ、細胞が放射能を取り込むように２４時間に渡ってイ
ンキュベートされた。そして、細胞はその他の９６−ウェルフィルタープレート
上へ収集され、過度のラベル（放射能）は、プレートをトップカウント（Packar
d, Meriden, Conneticut）へのせる前に洗い流された。 細胞は、トップカウントによって数えられた。測定されたカウント毎分（CPM
）は、活性を比較するために、個々の変異体の濃度に対してプロットされた（Fi
g９）。 ＶＥＧＦ変異体の細胞増殖能力は、表５に示されている。一般的に、ＶＥＧＦ
変異体は、天然変異体（８−１０９）の能力の２倍以内の細胞増殖能力を示した
。

【００６６】

【００６７】 実施例１１ ＫＤＲ及びＦＬＴ−１レセプターへのＶＥＧＦ変異体の結合を測定するためのＲ
ＩＡアッセイ ＲＩＡアッセイは、天然ＶＥＧＦ１６５又は天然ＶＥＧＦ（８−１０９）と比
較される、ＫＤＲレセプター及びＦＬＴ−１レセプターへの幾つかのＶＥＧＦ変
異体（表２に記載）の相対的結合親和性を調べるために、Mullerら，PNAS, 94:
7192-7197(1997)に記載のように原則的に実施された。その結果は、下記の表６
に示されている。

【００６８】

【００６９】 実施例１２：ＫＤＲ-特異的ＶＥＧＦ変異体によるｅＮＯＳの上方制御 実施例６−１１で同定し特徴づけたＶＥＧＦ変異体を、ＫＤＲレセプター活性
とｅＮＯＳ上方制御との間の特異的相関関係を例証するために使用した。この実
験で使用した方法及び材料は実施例１に記載したものである。ＡＣＥ細胞を500p
Mの特異的ＶＥＧＦ変異体とともに2日間処理した。ｅＮＯＳタンパク質はウェス
タンブロットによって検出した。Ｆｉｇ１０は、ＶＥＧＦ_１６５及びＶＥＧＦ_{１ １０} の両方の、ＫＤＲ及びＦＬＴ-１への正常な結合性を持つヘパリン結合ドメ
インを欠く変異体が、同程度のｅＮＯＳ発現を誘発したことを示す。ＶＥＧＦ変
異体ＬＫ-ＶＲＢ-２ｆ(ＫＤＲ-ｆｕｌｌ)及びＬＫ-ＶＲＢ-２ｓ＊（ＫＤＲ-ｓｈ
ｏｒｔ）は、ＫＤＲレセプターに対して高度に特異的な結合性を示した（表６）
。ＦＬＴ-特異的変異体（Ｆｌｔ-ｓｈｏｒｔ）は比較のために使用した。Ｆｉｇ
１０に示されるように、両方のＫＤＲ-特異的変異体はｅＮＯＳ発現を顕著に上
方制御するが、ＦＬＴ-１選択的結合変異体（ＦＬＴ-ｓｅｌ）がそのようなこと
がない。これらのデータは、同定されたＫＤＲ特異的ＶＥＧＦ変異体が、ｅＮＯ
Ｓを上方制御し、ｅＮＯＳ活性の異常又はＮＯ放出又は生成の欠陥を伴うｅＮＯ
Ｓ異常関連疾患又は状態を治療することにおける野生型ＶＥＧＦと置換できるこ
とを示唆している。

【００７０】 実施例１３：ＶＥＧＦアンタゴニストによるｅＮＯＳのインビボ下方制御 ＶＥＧＦ活性による内因性ｅＮＯＳの変性を、マウスモデルにおいてインビボ
で試験した。変異体Ｆｌｔレセプターを有するキメラタンパク質、ｍｕＦｌｔ-
ＩｇＧを、この実験におけるアンタゴニストとして使用した。マウスを、ｍｕＦ
ｌｔ-ＩｇＧ又はコントロール抗体（抗-ｇｐ１２０）、25mg/日、Ｉ．Ｐ．で14
日間処理した。実験の終わりに、肝臓を取り出してホモジナイズした。次いで、
組織ホモジェネートを抗-ｅＮＯＳモノクローナル抗体で免疫沈降させた。ｅＮ
ＯＳ含有量は、実施例１に記載したようにウェスタンブロットで検出した。 Ｆｉｇ１１は、ＭｕＦｌｔ-ＩｇＧで処理したマウスにおけるｅＮＯＳ発現レ
ベルが有意に低下したことを示している。よって、これらの結果は、ＶＥＧＦア
ンタゴニストがｅＮＯＳ発現を下方制御することを示唆し、ｅＮＯＳの調節にお
ける内因性ＶＥＧＦの役割を暗示している。

【００７１】 実施例１４：ＶＥＧＦによるｅＮＯＳ活性の変調 ｅＮＯＳ活性及び内因性ＮＯ放出の変調におけるＶＥＧＦの役割を更に解明す
るために、ＶＥＧＦ刺激後のｅＮＯＳのホスホチロシンレベルを実験した。この
経時的実験において、最初に内皮細胞をＶＥＧＦで、０、５、１０１５、３０又
は６０分間処理した。細胞を、チロシンホスファターゼインヒビター（バナジン
酸ナトリウム及びフッ化ナトリウム）を含有するバッファー中に溶解させた。細
胞溶解物を、最初に抗-ｅＮＯＳ抗体で免疫沈降させ、次いで抗-ホスホチロシン
抗体で免疫ブロットした。ホスホチロシンレベルを実施例１に記載したようなウ
ェスタンブロットで検出した。Ｆｉｇ １２は、ＶＥＧＦ処理が長くなると、ｅ
ＮＯＳのホスホチロシンレベルが徐々に低下し、それは逆にｅＮＯＳ活性化及び
持続的なＮＯ放出に寄与しうる。 ｅＮＯＳ活性に起因する幾つかのｅＮＯＳ関連タンパク質が、ＶＥＧＦ処理下
でのｅＮＯＳとの結合／解離について分析された。最初に内皮細胞をＶＥＧＦで
、０（コントロール）、１、５、１５、３０又は６０分間処理した。細胞溶解物
を、抗-ｅＮＯＳ抗体で免疫沈降させ、次いでα-カベオリン、ＰＬＣ-γ、Ｈｓ
ｐ９０又はＨｓｐ７０に対する抗体でウェスタンブロット分析のために免疫ブロ
ットした。結果は、ＶＥＧＦがカベオリン及びＰＬＣ-γのｅＮＯＳ結合レベル
を、短い曝露時間（1分間）でも有意に低下させることを示している。一方、Ｖ
ＥＧＦはｅＮＯＳに結合するＨｓｐ９０及びＨｓｐ７０のレベルを向上させるこ
とができる。これらの結果は、ＶＥＧＦは、その種々のタンパク質との結合性を
変調させることによりｅＮＯＳ活性を調節できることを示唆している。

【００７２】 上記の説明は、当業者が本発明を実施可能とするのに十分であると考えられる
。ここに示し記載したものに加えた本発明の種々の変更は、上記の説明から当業
者によって明らかであり、添付する請求の範囲内にある。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【Ｆｉｇ１Ａ−１Ｄ】 ＶＥＧＦのｅＮＯＳの上方制御活性を示す。Ｆｉｇ
１ＡはＶＥＧＦでの処置によるｅＮＯＳ発現の時間依存的増加の誘導を示す代表
的なウェスタンブロットである。矢印はｅＮＯＳを示す。Ｆｉｇ１ＢはｅＮＯＳ
レベルの濃度測定分析を示す棒グラフである（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。Ｆｉｇ１
ＣはｅＮＯＳ活性に対するＶＥＧＦの慢性的効果を示す棒グラフで、未処置対照
（０日）に対するＶＥＧＦ処置細胞（ＶＥＧＦ暴露２日後）の活性比によって表
されている（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。Ｆｉｇ１ＤはｅＮＯＳ活性に対するＶＥＧ
Ｆの急性効果を示す棒グラフで、未処置対照（０日）に対するＶＥＧＦ処置細胞
（０から６０分の間処置）の活性の増加パーセントによって表されている。

【Ｆｉｇ２】 ＶＥＧＦ、Ｌ−ＮＡＭＥ、ＳＮＡＰ（単独）又はＬ−ＮＡＭ
Ｅ又はＳＮＡｐとのＶＥＧＦの組み合わせで０−５日の間処置した後のｅＮＯＳ
タンパク質の増加倍数を示すグラフである。

【Ｆｉｇ３Ａ−３Ｃ】 ｅＮＯＳ調節に対するＶＥＧＦレセプター特異性を
示す。Ｆｉｇ３Ａは、ＶＥＧＦ_１６５、ＶＥＧＦ_１１０及びＫＤＲ選択的結合変
異体（「ＫＤＲ−ｓｅｌ」）がｅＮＯＳの上方制御を誘導するが、ＦＬＴ−１レ
セプター選択的変異体（「ＦＬＴ−１−ｓｅｌ」及びＰＬＧＦ）は誘導しないこ
とを示す棒グラフである。Ｆｉｇ３ＢはＫＤＲ形質移入ＰＡＥ細胞においてＶＥ
ＧＦ誘導ｅＮＯＳ上方制御を示すがＦＬＴ−１が入ＰＡＥ細胞では示さないウェ
スタンブロットである。Ｆｉｇ３ＣはＫＤＲチロシンキナーゼ選択的阻害剤ＳＵ
１４９８によるＶＥＧＦ誘導型ｅＮＯＳの上方制御の用量依存的防止を示すウェ
スタンブロットである。矢印はｅＮＯＳを示す。

【Ｆｉｇ４Ａ−４Ｂ】 ｅＮＯＳに対するＶＥＧＦ調節の阻害を示す。Ｆｉ
ｇ４Ａは様々なチロシンキナーゼの阻害剤、ＰＬＣ-γ又はＰＫＣと組み合わせ
てＶＥＧＦで処置したＡＣＥ細胞におけるｅＮＯＳ発現に対する効果を示すウェ
スタンブロットである。Ｆｉｇ４Ｂは濃度測定によるｅＮＯＳレベルの分析を示
す棒グラフである。

【Ｆｉｇ５Ａ−５Ｃ】 ＶＥＧＦによるｅＮＯＳ調節におけるＰＫＣ活性を
示す。Ｆｉｇ５Ａは、ＶＥＧＦでの処置により細胞質ゾルから膜フラクションへ
のＰＫＣ-α、γ及びεの迅速な再分散が生じたことを示すウェスタンブロット
である。Ｆｉｇ５ＢはＶＥＧＦがＰＫＣ活性を増加させることを示している。Ｆ
ｉｇ５ＣはＰＭＡでのＰＫＣの活性化がｅＮＯＳレベルを増加させることを示し
ている。

【Ｆｉｇ６】 ｅＮＯＳ発現に対する様々な血管新生因子の効果を示す棒グ
ラフである。ヒストグラムは未処置の対照細胞に対して規準化された成長因子処
置細胞中のｅＮＯＳタンパク質の増加倍数を示している。

【Ｆｉｇ７】 天然ＶＥＧＦに対するＥＬＩＳＡアッセイ滴定曲線を示す（
８−１０９）。

【Ｆｉｇ８】 天然ＶＥＧＦに対するＫＩＲＡアッセイ滴定曲線を示す（８
−１０９）。

【Ｆｉｇ９】 天然ＶＥＧＦに対するＨＵＶＥＣ増殖アッセイ滴定曲線を示
す（８−１０９）。

【Ｆｉｇ１０】 ＶＥＧＦ_１６５、ＶＥＧＦ_１１０、二つのＫＤＲ選択的Ｖ
ＥＧＦ変異体（ＫＤＲ−ｆｕｌｌ及びＫＤＲ−ｓｈｏｒｔ）、又はＦｌｔ選択的
変異体（Ｆｌｔ−ｓｈｏｒｔ）により処置された内皮細胞中のｅＮＯＳ発現レベ
ルを示すウェスタンブロットである。

【Ｆｉｇ１１】 ＶＥＧＦアンタゴニスト（ＭｕＦｌｔ−ＩｇＧ）により影
響を受けたインビボでのｅＮＯＳ発現を示すウェスタンブロットデータである。

【Ｆｉｇ１２】 異なった時間過程でＶＥＧＦで処置された内皮細胞中での
ｅＮＯＳのホスホチロシンレベルを示すウェスタンブロットである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/08 9/08 9/10 9/10 9/12 9/12 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/52 ＺＮＡ // Ｃ０７Ｋ 14/52 ＺＮＡ 16/28 16/28 Ａ６１Ｋ 37/36 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シェン，ベン−クァン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94116， サン フランシスコ，32番 アヴェニュー 2055 (72)発明者 ジオンチェック，トーマス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94037， モンタラ，ピー．オー．ボックス 370153 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA17 BA01 BA08 BA21 BA22 BA23 BA44 CA18 CA53 CA56 CA59 DB52 DB57 MA17 MA66 NA14 ZA362 ZA392 ZA422 ZA452 ZA542 ZC192 ZC352 4C085 AA13 AA16 BB11 CC02 CC03 CC21 CC23 EE01 GG02 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA01 DA75 EA24 FA72 FA74

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物の一酸化窒素（ＮＯ）関連障害を治療する方法にお
   いて、有効量の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）又はＶＥＧＦレセプターアゴニス
   トを前記哺乳動物に投与することを含む方法。
2. 【請求項２】 前記障害が高血圧、糖尿病、狭心症、血栓症、心不全又はア
   テローム性動脈硬化症である請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記ＶＥＧＦが組換えヒトＶＥＧＦを含む請求項１に記載の
   方法。
4. 【請求項４】 前記ＶＥＧＦレセプターアゴニストがＫＤＲレセプター選択
   的変異体を含む請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記ＶＥＧＦレセプターアゴニストがＫＤＲレセプター抗体
   を含む請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記ＫＤＲレセプター抗体がキメラ抗体を含んでなる請求項
   ５に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記ＫＤＲレセプター抗体がヒト抗体を含んでなる請求項５
   に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記哺乳動物がヒトである請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記ＶＥＧＦが静脈内注射によって前記哺乳動物に投与され
   る請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記有効量のＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターアゴニスト
    が前記哺乳動物中の一酸化窒素生産を亢進する請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 哺乳動物をＮＯ関連病理状態から保護する方法において、
    有効量のＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターアゴニストを前記哺乳動物に投与する
    ことを含む方法。
12. 【請求項１２】 前記有効量のＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターアゴニスト
    が前記哺乳動物中の一酸化窒素生産を亢進する請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 哺乳動物において再狭窄を低減させる方法において、血管
    形成術を受けるか受けた哺乳動物に、有効量のＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプター
    アゴニストを投与してｅＮＯＳ発現を上方制御することを含む方法。
14. 【請求項１４】 内皮細胞において内因性ＮＯの持続性生産を刺激する方法
    において、内皮細胞を有効量のＶＥＧＦレセプターアゴニストに曝露し、内皮細
    胞中の内皮型ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）を上方制御することを含む方法。
15. 【請求項１５】 ＶＥＧＦレセプターアゴニストがＫＤＲレセプターに対し
    て選択的な結合親和性を持つＶＥＧＦ変異体である請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 ＶＥＧＦ変異体が天然のＶＥＧＦ配列（配列番号：４）の
    位置１７から２５の間に一又は複数のアミノ酸置換を含む請求項１５に記載の方
    法。
17. 【請求項１７】 ＶＥＧＦ変異体が少なくとも次の置換：Ｍ１８Ｅ、Ｙ２１
    Ｌ、Ｑ２２Ｒ及びＹ２５Ｓを含む請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 ＶＥＧＦ変異体が天然のＶＥＧＦ配列の位置６３から６６
    の間に一又は複数のアミノ酸置換を含む請求項１５に記載の方法。
19. 【請求項１９】 ＶＥＧＦ変異体が少なくとも次の置換：Ｄ６３Ｓ、Ｇ６５
    Ｍ、Ｌ６６Ｒを含む請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 ＶＥＧＦレセプターアゴニストがＫＤＲレセプター抗体で
    ある請求項１４に記載の方法。