JP2008500029A5 - - Google Patents
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Claims (53)
- 核酸を増幅する方法であって、
(a)単一ストランド核酸の一つ又はそれ以上の鋳型ストランドを、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドの一部に相補的な一つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップと、
(b)前記一つ又はそれ以上のプライマーのうちの少なくとも1つのプライマーを前記プライマーが相補的である前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドの一部にアニーリングさせるステップと、
(c)前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドを核酸重合酵素及び少なくとも4種類の異なるヌクレオシド三リン酸と接触させるステップと、
(d)前記核酸重合酵素によって前記少なくとも一つのアニーリングされたプライマーを延長し、これにより、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに結合された一つ又はそれ以上の延長生成物を形成するステップと、
(e)前記一つ又はそれ以上の延長生成物を前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドから分離させるステップと、
(f)前記核酸を増幅するために前記ステップ(a)、(b)、(c)、(d)、及び(e)を反復するステップと、を有し、
前記ステップ(a)〜(e)の各サイクルにおける前記(e)の前記一つ又はそれ以上の延長生成物の少なくとも一つは、ステップ(a)〜(e)の次のサイクルにおける鋳型ストランドとして使用され、最後のサイクルに対してステップ(e)はオプションであり、
前記ステップ(b)または(d)のうちの少なくとも一つは前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を適用するステップを含むことを特徴とする方法。 - 更に、前記ステップ(e)は前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を応力を適用するステップを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに制御された量の張力を適用するステップは、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに機械的張力、水力学的応力、または電場のエネルギーを適用するステップを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに制御された量の機械的張力を直接適用するステップは、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドが付着された表面を移動するステップを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を適用するステップは、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに流体の流れによって引き起こされる水力学的張力を制御するステップを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドは、流体の流れに露出された表面に固定される、流体の流れに露出された表面に固定されたDNA重合酵素に結合される、または、逆伝搬性の流体の流れによって維持されかつ延長される、ことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を適用するステップは、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドの少なくとも一つのストランドの一側または両側の末端に連結された一つ又はそれ以上の粒子に力を適用するステップを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(e)で、張力を適用するステップは、前記ステップ(d)で適用されるのと同じ種類の張力の増加された量を適用するステップを含むことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記ステップ(b)は、約0〜約65pN、約10〜約65pN、および0pNより大きく〜約45pNの中から選択された範囲内で、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を適用するステップを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(d)は、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を適用し、前記核酸上の複製することが難しい序列が複製される時期に対応する時点で前記張力を増大させるステップを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記核酸は、50%を超えるGC含量を有する数個の残分の一つ又はそれ以上のセグメントを含み、前記核酸は、90%より高い効率で増幅されることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記核酸は、8個又はそれ以上の塩基対の反復単位を含む一つ又はそれ以上のセグメントを含み、前記核酸は、90%より高い効率で増幅されることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記ステップ(a)、(b)、(c)、(d)及び(e)は、約65℃未満で行われることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(a)、(b)、(c)、(d)及び(e)は、少なくとも約50回反復されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 約1000塩基より多くの塩基で構成された鋳型ストランドが増幅されることを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記方法は、約1時間又はそれ未満に完了することを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 前記核酸は、pH4−7またはpH8−10を有する溶液中で増幅されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 約1μl未満の容量を有する反応チャンバで行われることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(a)を最初に行う前に、
RNA試料を取得するステップと、
相補的なDNAストランドの生成を可能にするのに十分な組成物の存在下で、前記RNAを逆転写酵素と接触させるステップと、
前記単一ストランド核酸を形成するために、前記DNAを前記RNAから分離するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記ステップ(a)を最初に行う前に、
DNA試料を取得するステップと、
前記DNAを変性させるステップと、
前記変性したDNAストランドを反応チャンバ内で基板に結合させるステップと、
前記反応チャンバをフラッシングして前記試料から汚染物を除去するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記ステップ(a)の最初において、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドは、一つのDNA分子から取得されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(a)の少なくとも最初において、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドは、精製されていない試料物質内に含まれていることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 核酸を増幅する方法であって、
(a)単一ストランド核酸の一つ又はそれ以上の鋳型ストランドを、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドの一部に相補的な一つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、前記一つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも1つのプライマが基板に結合された一つ又はそれ以上の分子を結合できる複合体化基を含む、ステップと、
(b)前記少なくとも1つのプライマを前記プライマーが相補的である前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドの一部に前記一つ又はそれ以上の複合体化基とアニーリングさせるステップと、
(c)前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドを核酸重合酵素及び少なくとも4種類の異なるヌクレオシド三リン酸と接触させるステップと、
(d)前記核酸重合酵素によって前記一つ又はそれ以上のプライマーを延長し、これにより、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに結合された一つ又はそれ以上の延長生成物を形成するステップと、
(e)前記一つ又はそれ以上の延長生成物を前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドから分離させるステップと、
(f)前記核酸を増幅するために前記ステップ(a)、(b)、(c)、(d)、及び(e)を反復するステップと、を有し、最後のサイクルに対してステップ(e)はオプションであり、
前記ステップ(a)〜(e)の各サイクルにおける前記(e)の前記一つ又はそれ以上の延長生成物の少なくとも一つは、ステップ(a)〜(e)の次のサイクルにおける鋳型ストランドとして使用され、
前記ステップ(b)、(d)および(e)のうちの少なくとも一つは、前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに張力を適用するステップを含むことを特徴とする方法。 - 前記一つ又はそれ以上の複合体化基は、活性化可能であることを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 前記基板に結合された前記一つ又はそれ以上の複合体化基及び前記一つ又はそれ以上の分子は、ビオチン及びストレプトアビジンであることを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 前記一つ又はそれ以上の複合体化基は、光活性化可能な束縛されたビオチンを含むことを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 病原菌を検出する方法であって、
請求項1に記載の方法を含み、
前記病原菌と特異的に関連したヌクレオチド序列の存在如何に対して増幅された核酸を探索するステップをさらに含む、
ことを特徴とする方法。 - 核酸を増幅する方法であって、
(a)二重ストランド核酸分子を二つの単一ストランド核酸分子に分離させるのに十分な張力を前記二重ストランド核酸分子の一つ又は2つのストランドに適用することによって、二重ストランド核酸分子を変性させるステップであって、前記張力が適用された一つまたは二つの前記単一ストランド核酸分子が鋳型核酸ストランドとなるステップと、
(b)一つ又は2つの前記鋳型核酸ストランドを前記鋳型核酸ストランドの一部に相補的な一つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、核酸重合酵素及び少なくとも4種類の異なるヌクレオシド三リン酸と接触させるステップと、
(c)前記ステップ(a)で前記一つ又は2つの鋳型核酸ストランドに適用された張力を減少させて、前記一つ又はそれ以上のプライマーを前記一つ又はそれ以上のプライマーが相補的である前記各鋳型ストランドの対応する部分にアニーリングさせるステップと、
(d)前記一つ又は2つの鋳型ストランドに適用された張力を制御して前記核酸重合酵素によって前記一つ又はそれ以上のプライマーを延長させ、これにより、一つ又はそれ以上の延長生成物が一つ又はそれ以上の鋳型ストランドに結合されて前記一つ又はそれ以上の二重ストランドの核酸分子を形成するステップと、
(e)前記核酸を増幅するために前記ステップ(a)、(b)、(c)、及び(d)を反復するステップと、を有し、
前記ステップ(a)〜(d)の各サイクルにおける前記(d)で形成された前記一つ又はそれ以上の二重ストランドの核酸分子の少なくとも一つは、ステップ(a)〜(d)の次のサイクルにおけるステップ(a)で二重ストランドの核酸分子として使用されることを特徴とする方法。 - 前記張力を適用する、前記張力を減少させる、および前記張力を制御するステップのうちの少なくとも1つは、前記張力が適用される前記核酸分子を基板または一つ又はそれ以上の粒子または両者に結合させるステップ及び前記基板または一つ以上の粒子の運動を制御するステップを含むことを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 前記張力を適用する、前記張力を減少させる、および前記張力を制御するステップのうちの少なくとも1つは、前記張力が適用される前記核酸分子を一つ又はそれ以上の粒子に結合させるステップ及び光学的な操作または磁気的な操作によって前記一つ又はそれ以上の粒子の運動を制御するステップを含むことを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 前記張力を適用する、前記張力を減少させる、および前記張力を制御するステップのうちの少なくとも一つは、前記張力が適用される前記核酸分子に対する流体の流れを調整するステップを含むことを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 前記核酸分子のうちの少なくとも一つは、前記基板に結合された重合酵素によって結合され、流体が前記基板上を流れていることを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 前記核酸分子のうちの少なくとも一つは、基板に結合されることを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 前記核酸分子のうちの少なくとも一つは、流体の流れの速度勾配で、又は逆伝搬性の流体の流れによって伸びることを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 前記ステップ(d)は、複製することが難しい前記一つ又はそれ以上の鋳型ストランドの序列が複製される時期に対応する時点で前記張力を増大させるステップを含むことを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 前記の全体プロセスは、周囲の温度で行われることを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 前記の全体プロセスは、約20℃より高く、約60℃より低い温度で行われることを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 前記の全体プロセスは、室温で行われ、前記ステップ(b)で、前記張力は、約65pNより大きく、前記ステップ(c)で、前記張力は、約0pN〜約60pNの範囲に減少し、前記ステップ(d)で、前記張力は、約0pN〜約45pNの範囲に調整されることを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 重合酵素連鎖反応によって核酸を増幅する方法であって、
(a)二重ストランド核酸を変性させて単一ストランド鋳型ストランドを生成するステップと、
(b)前記鋳型ストランドにプライマーをアニーリングさせるステップと、
(c)鋳型ストランドで駆動された重合酵素によって前記プライマーを延長して二重ストランド核酸分子を生成するステップと、
(d)前記ステップ(a)〜(c)を反復して前記二重ストランド核酸分子を増幅するステップと、を有し、
前記ステップ(a)〜(c)の各サイクルにおける前記(c)で生成した前記二重ストランド核酸分子の少なくとも一つは、ステップ(a)〜(c)の次のサイクルのステップ(a)で変性され、
前記ステップ(b)と(c)のうちの少なくとも一つは、前記核酸に張力を適用するステップを含むことを特徴とする方法。 - 前記張力を適用するステップは、機械的張力、水力学的応力、または電場力またはそれらの組み合わせを適用するステップを含むことを特徴とする請求項39に記載の方法。
- 前記ステップ(a)〜(d)は、80℃以下、30℃以下および周囲温度から選択された温度で行われることを特徴とする請求項39に記載の方法。
- 前記ステップ(a)で適用される張力は、65pNまたはそれより大きい、または、
前記ステップ(b)で適用される張力は、(i)50pNまたはそれより小さい、(ii)30pN〜50pN、(iii)35pN〜45pN、または、
前記ステップ(c)で適用される張力は、45pNまたはそれより小さいことを特徴とする請求項39に記載の方法。 - 核酸増幅を行う方法であって、
(a)二重ストランド核酸を変性させて単一ストランドの鋳型ストランドを生成するステップと、
(b)前記鋳型ストランドにプライマーをアニーリングさせるステップと、
(c)鋳型ストランドで駆動された重合酵素によって前記プライマーを延長して二重ストランド核酸分子を生成するステップと、
(d)前記ステップ(a)〜(c)を反復して前記二重ストランド核酸分子を増幅するステップと、を有し、
前記ステップ(c)は等温であり、前記核酸に機械的張力または水力学的張力を適用するステップを含み、
前記ステップ(a)〜(c)の各サイクルにおけるステップ(c)で生成された前記二重ストランド核酸分子の少なくとも1つは、前記ステップ(a)〜(c)の次のサイクルのステップ(a)で変性されることを特徴とする方法。 - 核酸増幅を行う方法であって、
(a)二重ストランド核酸を変性させて単一ストランドの鋳型ストランドを生成するステップと、
(b)前記鋳型ストランドにプライマーをアニーリングさせるステップと、
(c)鋳型ストランドで駆動された重合酵素によって前記プライマーを延長して二重ストランド核酸分子を生成するステップと、
(d)前記ステップ(a)〜(c)を反復して前記二重ストランド核酸分子を増幅するステップと、を有し、
前記ステップ(c)は前記核酸に変更可能な張力を適用するステップを有し、
前記変更可能な張力は、前記核酸の重合酵素のプルーフリーディング・エキソヌクレアーゼ活性を調製することを特徴とする方法。 - 核酸増幅を行う方法であって、
(a)二重ストランド核酸を変性させて単一ストランドの鋳型ストランドを生成するステップと、
(b)前記鋳型ストランドにプライマーをアニーリングさせるステップと、
(c)鋳型ストランドで駆動された重合酵素によって前記プライマーを延長して二重ストランド核酸分子を生成するステップと、
(d)前記ステップ(a)〜(c)を反復して前記二重ストランド核酸分子を増幅するステップと、を有し、
前記ステップ(c)で使用されたプライマーは、前記ステップ(c)で得られた延長生成物を固定化するための複合体基を含むことを特徴とする方法。 - 核酸増幅を行う方法であって、
(a)二重ストランド核酸を変性させて単一ストランドの鋳型ストランドを生成するステップと、
(b)前記鋳型ストランドにプライマーをアニーリングさせるステップと、
(c)鋳型ストランドで駆動された重合酵素によって前記プライマーを延長して二重ストランド核酸分子を生成するステップと、
(d)前記ステップ(a)〜(c)を反復して前記二重ストランド核酸分子を増幅するステップと、を有し、
前記ステップ(a)〜(c)の各サイクルにおけるステップ(c)で生成された前記二重ストランド核酸分子の少なくとも1つは、前記ステップ(a)〜(c)の次のサイクルのステップ(a)で変性され、
前記ステップ(b)と(c)のうちの少なくとも1つは、前記核酸に張力を適用するステップを含み、
前記鋳型ストランドの複製の数は、ステップ(a)〜(c)がn回繰り返された後で、2n倍に増加し、ここで、nは1より大きい整数であることを特徴とする方法。 - 前記ステップ(a)は前記核酸に張力を適用するステップを含むことを特徴とする請求項39に記載の方法。
- 核酸ストランドにプライマーのアニーリングの緊縮調節を制御する方法であって、
核酸ストランドにプライマーをアニーリングするステップを含み、
張力が前記核酸ストランドまたは前記プライマーに調整可能に適応されることを特徴とする方法。 - 核酸重合酵素によってプライマーを延長するときの誤り率を低下する方法であって、
核酸重合酵素によって核酸鋳型にアニーリングされたプライマーを延長して二重ストランドの核酸分子を生成するステップを含み、
張力が前記核酸鋳型または前記プライマーに調整可能に適応されることを特徴とする方法。 - 核酸重合酵素によってGCに富む鋳型でプライマーを延長するときの誤り率を低下する方法であって、
核酸重合酵素によってGCに富む核酸鋳型にアニーリングされたプライマーを延長して二重ストランドの核酸分子を生成するステップを含み、
張力が前記GCに富む核酸鋳型または前記プライマーに調整可能に適応されることを特徴とする方法。 - 核酸増幅の忠実度を改善する方法であって、
(a)二重ストランド核酸を変性させて単一ストランドの鋳型ストランドを生成するステップと、
(b)前記鋳型ストランドにプライマーをアニーリングさせるステップと、
(c)鋳型ストランドで駆動された重合酵素によって前記プライマーを延長して二重ストランド核酸分子を生成するステップと、
(d)前記ステップ(a)〜(c)を反復して前記二重ストランド核酸分子を増幅するステップと、を有し、
前記ステップ(a)〜(c)の各サイクルにおけるステップ(c)で生成された前記二重ストランド核酸分子の少なくとも1つは、前記ステップ(a)〜(c)の次のサイクルのステップ(a)で変性され、
前記ステップ(a)〜(c)の少なくとも1つは、前記核酸に張力を調整可能に適応するステップを含むことを特徴とする方法。 - 核酸序列に張力を適用するための装置であって、
1つまたはそれ以上の流体チャンネルと、
前記1つまたはそれ以上の流体チャンネル内で核酸分子を維持する手段と、
前記維持された核酸分子に可変的に制御された量の張力を適用する手段と、
を有することを特徴とする装置。 - 核酸分子に張力を適用するための微細流体装置であって、
a)基板と、
b)前記基板内に配置された流れチャンネルと、
c)核酸試料を前記流れチャンネル中に導入することができる前記流れチャンネルと流体連結する入口と、
d)前記核酸分子に張力を適用する手段と、
e)前記微細流体デバイス内で前記核酸分子を維持する手段と、
を有し、
前記微細流体デバイスは等温で操作されるように構成されていることを特徴とする微細流体装置。
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