JP5118025B2 - センスrna合成のための方法およびキット - Google Patents
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Description
本出願は、完全に本明細書に援用される、2005年6月10日出願の米国特許出願第11/150,794号に優先権を請求する。
配列表
コンピュータ読取り可能型の配列表は、その全体が本明細書に援用される。
技術分野
本発明は、一般的に、核酸分子を合成するための組成物および方法に関する。
マイクロアレイ技術は、遺伝子発現プロフィールを生成し、そして分析するための強力なツールとなってきている。しかし、マイクロアレイ発現分析は、多量のRNAを要求し、これはしばしば入手不能である(Wangら, BioTechniques 34:394−400(2003)を参照されたい)。この問題を克服するため、いくつかのRNA増幅技術が開発されてきている。しかし、これらの技術は、一般的に、増幅バイアス(例えば、米国特許第6,582,906号を参照されたい)として知られる現象に苦しむ。これらの場合、RNA分子の増幅集団は、元来の試料に存在するRNA分子の集団に比例的に対応しない。
本出願者らは、多様な核酸テンプレートから、sRNA分子を合成するための方法およびキットであって、第一のRNAポリメラーゼ認識配列および少なくとも第二の異なるRNAポリメラーゼ認識配列を含む、DNAポリメラーゼでは伸長不能な一本鎖プロモーター・テンプレートを、第一周期のcDNA分子の3’端に付着させる、前記方法およびキットを発明した。本出願者らは、こうしたプロモーター・テンプレートの使用によって、一本鎖プロモーター・テンプレートの再付着およびそれに続く二本鎖プロモーターへの酵素的変換後のcDNA合成の一連の各周期に関連する複雑な一連の工程を反復する必要を伴わずに、多数周期のsRNA合成が可能になることを発見した。第二以降の周期の逆転写中に、または逆転写直後にプロモーター配列相補体を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを付加することによってのいずれかで、二本鎖プロモーター配列(単数または複数)を再生する。非特異的アーチファクト数の付随する増加を伴わずに、特異的RNA増幅が、先の方法より100〜1000倍増加する。
本発明は、sRNA分子の合成のための方法およびキットに関する。用語「sRNA分子」、「RNA分子」、「DNA分子」、「cDNA分子」および「核酸分子」は、各々、単一の分子、単一種の複数の分子、および異なる種の多数の分子を含むよう意図される。該方法は、一般的に、少なくとも1つの第一周期一本鎖cDNA分子の3’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ;該オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、第一のRNAポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の3’側の少なくとも第二の異なるRNAポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレートをアニーリングさせ、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートはDNAポリメラーゼでは伸長不能である;該一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のRNAポリメラーゼ・プロモーター、および該第一のプロモーターの3’側の少なくとも第二のRNAポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、該オリゴデオキシヌクレオチド・テールを伸長させ;該第一のRNAポリメラーゼ・プロモーターを認識するRNAポリメラーゼを用いて、RNA転写の第一の周期を開始して、少なくとも1つの第一周期sRNA分子を産生し;該第一周期sRNA分子から、5’端および3’端を有する少なくとも1つの第二周期一本鎖cDNA分子を合成し;該第一周期sRNA分子を分解し;第二のRNAポリメラーゼ・プロモーターが形成されるように、第二の異なるRNAポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ;そして第二のRNAポリメラーゼ・プロモーターを認識するRNAポリメラーゼを用いて、RNA転写の第二周期を開始して、少なくとも1つの第二周期sRNA分子を産生する工程を含む。こうした頑強な線形増幅法は、少数の細胞を伴う発現分析を改善するとともに、非特異的増幅から生じるアーチファクトの数を減少させると期待される(Playerら, Expert Rev. Mol. Diagn. 4:831(2004)を参照されたい)。
実施例1
第一鎖cDNA合成
RNAqueous(登録商標)キット(Ambion)を用いて精製した各RNA試料に関して、以下のRNA/プライマー・ミックスを氷上で調製した:
1〜8μlの総RNA(2ngを超えない)
2μlの第一周期オリゴdT配列特異的RTプライマー(50ng/μl)(5’−TAC AAG GCA ATT TTT TTT TTT TTT TTT V−3’、ここでV=C、GまたはAデオキシリボヌクレオチド;配列番号4)
1μlの第一周期ランダム配列特異的RTプライマー(RNA質量にして2x)(5’−TAC AAG GCA ATT NNN NNN NNN−3、ここでN=ランダムに、A、G、CまたはTデオキシリボヌクレオチド;配列番号5)
RNアーゼ不含水で11μlに
第一周期RTプライマーは、第二周期RTプライマーの結合部位として働く、特定のヌクレオチド配列を含有する5’伸長を含む(図2aを参照されたい)。RNA/プライマー混合物を、80℃で10分間加熱して、そして直ちに氷上で1〜2分間冷却した。次いで、混合物を9μlのマスター混合物溶液と混合し、1xRT緩衝液(50mM Tris−HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2)、10mMジチオスレイトール(DTT)、各0.5mM dNTP、10U Superase−InTM(Ambion)、および200U SuperscriptTM II逆転写酵素(Invitrogen)を含有する最終体積20μlにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして42℃で2時間インキュベーションした。簡単に遠心分離した後、1xTE(10mM Tris−HCl、pH8.0、1mM EDTA)を用いて、反応を調整して100μlにした。
製造者のプロトコルにしたがって、MinEluteTM PCR精製キット(Qiagen)を用いて、反応を精製した。簡潔には、製造者によって提供されるPB緩衝液で、cDNA反応を600μlに調整した。cDNA反応をMinEluteTMカラムに適用し、そして1分間微量遠心分離した。収集試験管中のフロースルーを廃棄し、そして製造者に提供されたPE緩衝液750μlでカラムを洗浄した。収集試験管中のフロースルーを廃棄し、そしてカラムを500μlの80%エタノールで洗浄した。収集試験管中のフロースルーを廃棄し、そしてふたを開けたままカラムを5分間微量遠心分離して樹脂を乾燥させた。カラムを清浄な1.5mlの微量遠心管に入れ、そして製造者によって提供されたEB緩衝液10μlとカラム膜を室温で2分間インキュベーションした。2分間の微量遠心分離によって、第一鎖cDNA分子を溶出させた。
第一鎖cDNA分子を80℃で10分間加熱し、そして直ちに氷上で1〜2分間冷却した。次いで、10μl中のcDNA分子を10μlのマスター混合物溶液と混合して、1xテール付加緩衝液(10mM Tris−HCl、pH7.0、10mM MgCl2)、0.04mM dATP、および15U末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ(Roche Diagnostics、インディアナ州インディアナポリス)を含有する最終体積20μlにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして37℃で2分間インキュベーションした。80℃で10分間加熱することによって、反応を停止し、そして室温で1〜2分間冷却した。
3’アミノ修飾因子を含有する2μlのT7T3 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート(50ng/μl)(5’−TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAA ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAT TTT TTT TTT TTT T−3’;配列番号6)をオリゴdTテール付加cDNA分子に添加し、そして混合物を37℃で10分間インキュベーションして、鎖をアニーリングさせた。このテンプレートはDNAポリメラーゼでは伸長不能であり、T7 RNAポリメラーゼ認識配列、およびT7配列のすぐ3’側のT3 RNAポリメラーゼ認識配列を含有する。次いで、テール付加cDNA/プロモーター・テンプレート混合物を3μlのマスター混合物溶液と混合して、1xポリメラーゼ緩衝液(10mM Tris−HCl、pH7.0、10mM MgCl2)、各0.4mM dNTP、および2UのラージDNAポリメラーゼI(クレノウ酵素)(Roche)を含有する最終体積25μlにした。混合物を簡単に遠心分離し、そして室温で30分間インキュベーションした。65℃で10分間加熱することによって、反応を停止し、そして氷上に置いた。
プロモーター合成反応の半分(12.5μl)を37℃で10〜15分間加熱して、T7T3プロモーター鎖を再アニーリングさせて、そして次いで、マスター混合物溶液12.5μlと混合して、1x反応緩衝液、各7.5mMのrNTP、および2μlのT7 RNAポリメラーゼ(MEGAscriptTM転写キット、Ambion)を含有する最終体積25μlにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして加熱されたふたを備えたサーモサイクラー中で、37℃で4〜16時間インキュベーションした。あるいは、37℃の熱ブロック中で混合物を15分間インキュベーションし、その後、熱風ハイブリダイゼーション・オーブン中、37℃で4〜16時間インキュベーションした。この工程中、反応の蒸発および濃縮を回避することが必須である。
25μlのsRNAを、1μlの第二周期配列特異的RTプライマー(500ng/μl)(5’−TAC AAG GCA ATT−3’;配列番号7)と混合して、そして80℃で10分間加熱した。第二周期プライマーは、第一周期RTプライマーの5’伸長の特定のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を含有する(図2eを参照されたい)。反応を直ちに2分間氷冷し、簡単に遠心分離し、そして氷上に戻した。1μlのdNTPミックス(各10mM)および1μlのSuperscriptTM II逆転写酵素(200U/μl)を添加し、そしてRT反応を42℃で1時間インキュベーションした。1μlのRNアーゼH(2U/μl)(Invitrogen)を添加し、そして反応を37℃で20分間インキュベーションした。反応を65℃でインキュベーションして、酵素活性を停止させた。
2μlのT3プロモーター・オリゴヌクレオチド(50ng/μl)(5’−GAA ATT AAC CCT CAC TAA AGG G−3’;配列番号8)を第二周期cDNA反応に添加した。T3オリゴヌクレオチドは、最初のT7T3 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートのT3 RNAポリメラーゼ認識配列に相補的である。反応を37℃で10分間インキュベーションして、鎖をアニーリングさせた。
プロモーター合成反応を19μlのマスター混合物溶液と混合して、1x反応緩衝液、各7.5mMのrNTP、および2μlのT3 RNAポリメラーゼ(MEGAscriptTM転写キット、Ambion)を含有する最終体積25μlにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして加熱されたふたを備えたサーモサイクラー中で、37℃で4〜16時間インキュベーションした。あるいは、37℃の熱ブロック中で混合物を15分間インキュベーションし、その後、熱風ハイブリダイゼーション・オーブン中、37℃で4〜16時間インキュベーションした。この工程中、反応の蒸発および濃縮を回避することが必須である。
RNA清浄化のための製造者のプロトコルにしたがって、RNeasyキット(Qiagen)を用いて、第二周期sRNA分子を精製した。50μl RNアーゼ不含水中、精製sRNA分子を2回溶出させて、そして0.1xTE緩衝液、pH8.0中、260/280の波長比で、UV分光光度法によって定量化した。
第一周期cDNA合成のため、オリゴdT配列特異的プライマーのみを用いたことを除いて、実施例1に記載するように、各RNA試料を増幅した。氷上で、以下のRNA/プライマー・ミックスを調製した:
1〜8μlの総RNA(2ngを超えない)
2μlの第一周期オリゴdT配列特異的RTプライマー(50ng/μl)(5’−TAC AAG GCA ATT TTT TTT TTT TTT TTT V−3’、ここでV=C、GまたはA;配列番号4)
RNアーゼ不含水で11μlに
1ngの総RNAまたは水のみ(陰性対照)から出発して、複製物増幅を行った。1ngの総RNAを増幅した後、平均して、8〜10μgの増幅sRNAが回収され、これに対して、RNAの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、0.5〜4μgの非特異的増幅産物が回収された。
第一周期cDNA合成のため、ランダム配列特異的プライマーのみを用いたことを除いて、実施例1に記載するように、各RNA試料を増幅した。氷上で、以下のRNA/プライマー・ミックスを調製した:
1〜8μlの総RNA(2ngを超えない)
1μlの第一周期ランダム配列特異的RTプライマー(RNA質量にして2x)(5’−TAC AAG GCA ATT NNN NNN NNN−3、ここでN=ランダムに、A、G、CまたはT;配列番号5)
RNアーゼ不含水で11μlに
1ngの総RNAまたは水のみ(陰性対照)から出発して、複製物増幅を行った。1ngの総RNAを増幅した後、平均して、20〜25μgの増幅sRNAが回収され、これに対して、RNAの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、0.5〜4μgの非特異的増幅産物が回収された。
TdTを用いたcDNAテール付加工程において、dTTPをdATPの代わりに用い、そして用いた対応する3’アミノ修飾T7T3 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレートが5’−TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAA ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAA AAA AAA AAA AAA A−3’(配列番号9)であったことを除いて、実施例1に記載するように、各RNA試料を増幅した。
第一周期cDNA合成のため、もっぱらデオキシリボヌクレオチドからなるプライマーの代わりに、3’末端リボヌクレオチド配列特異的プライマーを用いたことを除いて、実施例1に記載するように、各RNA試料を増幅した。氷上で、以下のRNA/プライマー・ミックスを調製した:
1〜8μlの総RNA(2ngを超えない)
2μlの第一周期オリゴdT配列特異的RTプライマー(50ng/μl)(5’−TAC AAG GCA ATT TTT TTT TTT TTT TTT V−3’、ここでV=C、GまたはAリボヌクレオチド;配列番号10)
1μlの第一周期ランダム配列特異的RTプライマー(RNA質量にして2x)(5’−TAC AAG GCA ATT NNN NNN NNN−3、ここで、最初の8つのN=ランダムに、A、G、CまたはTデオキシリボヌクレオチド、および最後のN=ランダムに、A、G、CまたはUリボヌクレオチド;配列番号11)
RNアーゼ不含水で11μlに
1ngの総RNAまたは水のみ(陰性対照)から出発して、複製物増幅を行った。1ngの総RNAを増幅した後、平均して、20μgの増幅sRNAが回収され、これに対して、RNAの代わりに逆転写反応中で水のみを用いた場合、0.2〜0.5μgの非特異的増幅産物が回収された。
MinEluteTM PCR精製キットの代わりに、YM100微量濃縮装置(Millipore、マサチューセッツ州ビラーリカ)を用いて、第一周期cDNA精製を行ったことを除いて、実施例5に記載するように、各RNA試料を増幅した。100μlの希釈した逆転写反応を試料貯蔵容器に適用した。試験管のふたをしっかり閉じ、そして装置を13,000xgで6分間遠心分離した。200μlの1xTE緩衝液、pH8.0を、膜に触れずに試料貯蔵容器に添加した。上下に5回ピペッティングすることによって、液体を穏やかに混合した。ふたをしっかり閉じ、そして装置を13,000xgで6分間遠心分離した。収集試験管から試料貯蔵容器を分離し、そしてフロースルーを廃棄した。YM−100カラムを同じ収集試験管内に入れ、そして200μlの1xTE緩衝液を、膜に触れずに試料貯蔵容器に添加した。上下に5回ピペッティングすることによって、液体を穏やかに混合した。ふたをしっかり閉じ、そして装置を13,000xgで6分間遠心分離した。収集試験管から試料貯蔵容器を分離し、そしてフロースルーを廃棄した。YM−100カラムを同じ収集試験管内に入れ、そして5μlの10mM Tris、pH8.0を、膜に触れずに試料貯蔵容器に添加した。貯蔵容器側面を穏やかに叩いて液体を混合した。新たな収集試験管中に、試料貯蔵容器をさかさまに入れ、そしてすべての集合物を13,000xgで3分間遠心分離した。試験管の底に収集されたcDNAの体積は約5μlであり、そしてこれをRNアーゼ不含水で10μlに希釈した。
cDNA精製工程を省き、こうしてプロセスにおけるさらなるcDNAの損失を回避したことを除いて、実施例5に記載するように、各RNA試料を増幅した。逆転写プライマーの3’端上の末端リボヌクレオチドは、末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼで酵素的に伸長不能であるため、cDNA精製工程を省いてもよい。新たに合成されたcDNAの3’端のみが、TdTで伸長される。氷上で、以下のRNA/プライマー・ミックスを調製した:
1〜3μlの総RNA(2ngを超えない)
2μlの第一周期オリゴdT配列特異的RTプライマー(50ng/μl)(5’−TAC AAG GCA ATT TTT TTT TTT TTT TTT V−3’、ここでV=C、GまたはAリボヌクレオチド;配列番号10)
1μlの第一周期ランダム配列特異的RTプライマー(RNA質量にして2x)(5’−TAC AAG GCA ATT NNN NNN NNN−3、ここで、最初の8つのN=ランダムに、A、G、CまたはTデオキシリボヌクレオチド、および最後のN=ランダムに、A、G、CまたはUリボヌクレオチド;配列番号11)
RNアーゼ不含水で5μlに
RNA/プライマー混合物を80℃で10分間加熱し、そして直ちに氷上で1〜2分間冷却した。次いで、混合物を5.5μlのマスター混合物溶液と混合して、1xRT緩衝液(50mM Tris−HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2)、10mMジチオスレイトール(DTT)、各0.5mM dNTP、10U Superase−InTM(Ambion)、および200U SuperscriptTM II逆転写酵素(Invitrogen)を含有する最終体積10.5μlにした。混合物を簡単に遠心分離して、そして42℃で2時間インキュベーションした。次いで、第一鎖cDNA分子にテール付加して、そして実施例1に記載するように、さらにプロセシングした。
第二周期cDNA合成後に逆転写酵素を熱不活化せず、そしてT3プロモーター・オリゴヌクレオチドを第二周期cDNA反応に添加しなかったことを除いて、実施例7に記載するように、各RNA試料を増幅した。むしろ、第一周期のプロモーター合成反応由来の過剰なT7T3プロモーター・テンプレートが、第二周期cDNA分子の3’端に結合し、なお活性である逆転写酵素のDNA依存性DNAポリメラーゼ活性が、T3配列に隣接する二本鎖T7プロモーターを再生するのを可能にする(図3fを参照されたい)。
大部分のスポッティングされたマイクロアレイで、そして他の遺伝子発現アッセイ(例えばqRT−PCR)において用いられる標準的標識法で使用するため、テール付加法1を設計する。Affymetrix GeneChip(登録商標)マイクロアレイ、Amersham CodeLinkTMマイクロアレイ、Agilentオリゴ・マイクロアレイ、およびOciChipTMマイクロアレイに関して推奨されるものなどの、下流T7増幅/標識法で使用するため、テール付加法2を設計する。
精製された第二周期sRNA分子の所望の体積を、ヌクレアーゼ不含水で15.5μlに調整した。各テール付加反応に関して、反応中、sRNA各1μgに対して10mM ATPを1mM Tris、pH8.0中で1:50に希釈した。ポリAポリメラーゼ(PAP)(2U/μl)を1xPAP緩衝液(10mM Tris−HCl、pH7.0、10mM MgCl2)中で1:5に希釈し、そして使用するまで氷上に置いた。sRNA溶液を9.5μlのマスター混合物溶液と混合して、1xPAP緩衝液、2.5mM MnCl、0.2mM ATP(sRNA 1μgあたり)、および0.4UポリAポリメラーゼを含有する最終体積25μlにした。混合物を穏やかに混合し、遠心分離して、そして37℃の熱ブロック中で15分間インキュベーションした。3μlの0.5M EDTAを添加することによって、反応を停止した。RNA清浄化に関する製造者のプロトコルにしたがって、RNeasy MinEluteTMキット(Qiagen)を用いて、テール付加したsRNA分子を精製し、そして14μlのRNアーゼ不含水中に溶出した。回収した体積はおよそ12μlであった。
理想的には、このポリAテール付加法には、250〜500ngの第二周期sRNAを用いる。しかし、非常に少量の試料サイズ由来のsRNAを定量化することは常に可能であるわけではない。したがって、以下の表を用いて、ポリAテール付加反応中で用いるべき精製sRNAの量を決定してもよい:
適切な体積の精製第二周期sRNA分子を、ヌクレアーゼ不含水で15.5μlに調整した。各テール付加反応に関して、10mM ATPを1mM Tris、pH8.0中で1:100に希釈した。PAP(1マイクロリットルあたり2単位)を1xPAP緩衝液中で1:5に希釈し、そして使用するまで氷上に置いた。sRNA溶液を9.5μlのマスター混合物溶液と混合して、1xPAP緩衝液、2.5mM MnCl、0.2mM ATP(sRNA 1μgあたり)、および0.4UポリAポリメラーゼを含有する最終体積25μlにした。混合物を穏やかに混合し、遠心分離して、そして37℃の熱ブロック中で15分間インキュベーションした。3μlの0.5M EDTAを添加することによって、反応を停止した。RNA清浄化に関する製造者のプロトコルにしたがって、RNeasy MinEluteTMキット(Qiagen)を用いて、テール付加したsRNA分子を精製し、そして14μlのRNアーゼ不含水中に溶出した。回収した体積はおよそ12μlであった。
多数周期のsRNA合成を行うためのキットを、以下の構成要素で組み立てた:
第一周期オリゴdT配列特異的RTプライマー(50ng/μl);
第一周期ランダム配列特異的RTプライマー(250ng/μl);
dNTPミックス(各10mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP);
Superase−InTM RNアーゼ阻害剤(Ambion);
10mM dATP;
10x反応緩衝液(100mM Tris−HCl、pH7.0、100mM MgCl2);
末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ(7.5U/μl);
T7T3 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート(50ng/μl);
クレノウ酵素(2U/μl);
rNTPミックス(ATP、GTP、CTP、およびUTP)(各75mM);
10xRNAポリメラーゼ反応緩衝液(Ambion);
T7酵素ミックス(Ambion);
第二周期配列特異的RTプライマー(500ng/μl);
T3プロモーター・オリゴヌクレオチド(50ng/μl);および
T3酵素ミックス(Ambion)。
特許刊行物および非特許刊行物両方の、本明細書に引用するすべての刊行物は、本発明が属する当該技術分野における当業者の技術レベルの指標である。これらの刊行物はすべて、個々の刊行物が具体的に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いに、本明細書に完全に援用される。
Claims (23)
- 少なくとも1つのsRNA分子の多数周期の合成を行うための方法であって:
a)5’端および3’端を有する少なくとも1つの第一周期一本鎖cDNA分子を提供し;
b)前記の第一周期cDNA分子の3’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ;
c)前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、第一のRNAポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の3’側の少なくとも第二の異なるRNAポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレートをアニーリングさせ、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートはDNAポリメラーゼでは伸長不能である;
d)前記一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のRNAポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの3’側の少なくとも第二のRNAポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールを伸長させ;
e)前記の第一のRNAポリメラーゼ・プロモーターを認識するRNAポリメラーゼを用いて、RNA転写の第一の周期を開始して、少なくとも1つの第一周期sRNA分子を産生し;
f)前記の第一周期sRNA分子から、少なくとも1つの第二周期一本鎖cDNA分子を合成し、前記の第二周期一本鎖cDNA分子は5’端および3’端を有し;
g)前記の第一周期sRNA分子を分解し;
h)第二のRNAポリメラーゼ・プロモーターが形成されるように、前記の第二の異なるRNAポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ;そして
i)前記の第二のRNAポリメラーゼ・プロモーターを認識するRNAポリメラーゼを用いて、RNA転写の第二周期を開始して、少なくとも1つの第二周期sRNA分子を産生し、
それによって、少なくとも1つのsRNA分子の多数周期の合成を行い、そして多数のsRNAコピーを産生する
工程を含む、前記方法。 - a)が、5’端および3’端を有するRNA分子を提供し;そして前記RNA分子から一本鎖cDNA分子を合成する工程を含む、請求項1の方法。
- 一本鎖cDNA分子の合成が、逆転写酵素の存在下で、RNA分子とプライマーを接触させる工程を含む、請求項2の方法。
- プライマーが、オリゴdTプライマー、ランダム・プライマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項3の方法。
- プライマーが、特定のヌクレオチド配列を含有する5’伸長を含む、請求項4の方法。
- プライマーの3’末端ヌクレオチドが、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼの基質ではないが、逆転写酵素によって伸長可能である、請求項4の方法。
- プライマーの3’末端ヌクレオチドがリボヌクレオチドである、請求項6の方法。
- プライマーが、特定のヌクレオチド配列を含有する5’伸長を含み、前記プライマーの3’末端ヌクレオチドがリボヌクレオチドである、請求項4の方法。
- 一本鎖プロモーター・テンプレートが、T7、T3およびSP6 RNAポリメラーゼ認識配列からなる群より選択される第一のRNAポリメラーゼ認識配列、T7、T3およびSP6 RNAポリメラーゼ認識配列からなる群より選択される第二のRNAポリメラーゼ認識配列、ならびに場合によって、T7、T3およびSP6 RNAポリメラーゼ認識配列からなる群より選択される第三のRNAポリメラーゼ認識配列を含み、前記の第一、第二および場合による第三のRNAポリメラーゼ認識配列が異なる、請求項1の方法。
- f)が、逆転写酵素の存在下で、第一周期sRNA分子とプライマーを接触させる工程を含む、請求項1の方法。
- 逆転写酵素がRNアーゼH−である、請求項10の方法。
- 逆転写酵素がRNアーゼH+であり、そしてRNアーゼH+活性が、g)において第一周期sRNA分子を分解する、請求項10の方法。
- f)における逆転写酵素活性が、i)における第二周期RNA転写の開始前に不活化される、請求項10の方法。
- プライマーが、オリゴdTプライマー、ランダム・プライマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項10の方法。
- f)が、逆転写酵素の存在下で、sRNA分子と第二のプライマーを接触させることを含み、前記の第二のプライマーが、第一のプライマーの5’伸長中に含有される特定のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項5の方法。
- プライマーが、オリゴdTプライマー、ランダム・プライマー、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項5の方法。
- 生じた多数のsRNAコピーを逆転写し、それによって、多数の一本鎖cDNA分子を産生する工程をさらに含む、請求項1の方法。
- 生じた多数のsRNAコピーにポリAテールを付加する工程をさらに含む、請求項1の方法。
- 少なくとも1つのsRNA分子の多数周期の合成を行うための方法であって:
a)5’端および3’端を有する少なくとも1つの第一周期一本鎖cDNA分子を提供し;
b)前記の第一周期一本鎖cDNA分子の3’端上にオリゴデオキシヌクレオチド・テールを付着させ;
c)前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールに、第一のRNAポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の3’側の少なくとも第二の異なるRNAポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレートをアニーリングさせ、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートはDNAポリメラーゼでは伸長不能である;
d)前記一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のRNAポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの3’側の少なくとも第二のRNAポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記オリゴデオキシヌクレオチド・テールを伸長させ;
e)前記の第一のRNAポリメラーゼ・プロモーターを認識するRNAポリメラーゼを用いて、RNA転写の第一の周期を開始して、少なくとも1つの第一周期sRNA分子を産生し;
f)前記の第一周期sRNA分子から、少なくとも1つの第二周期一本鎖cDNA分子を合成し、前記の第二周期一本鎖cDNA分子は5’端および3’端を有し;
g)前記の第一周期sRNA分子を分解し;
h)前記の第二周期cDNA分子の3’端に、工程c)由来の過剰な一本鎖プロモーター・テンプレートをアニーリングさせ;
i)前記の過剰な一本鎖プロモーター・テンプレートが、第一のRNAポリメラーゼ・プロモーター、および前記の第一のプロモーターの3’側の少なくとも第二のRNAポリメラーゼ・プロモーターに変換されるように、前記の第二周期のcDNA分子の3’端を伸長させ;そして
j)前記の第一または第二のRNAポリメラーゼ・プロモーターを認識するRNAポリメラーゼを用いて、RNA転写の第二周期を開始して、少なくとも1つの第二周期sRNA分子を産生し、
それによって、少なくとも1つのsRNA分子の多数周期の合成を行い、そして多数のsRNAコピーを産生する
工程を含む、前記方法。 - i)における酵素活性が、j)における第二周期のRNA転写開始前に不活化される、請求項19の方法。
- 少なくとも1つのsRNA分子の多数周期の合成を行うためのキットであって:第一のRNAポリメラーゼ認識配列、および前記の第一の認識配列の3’側の少なくとも第二の異なるRNAポリメラーゼ認識配列を含む、一本鎖プロモーター・テンプレート、ここで前記一本鎖プロモーター・テンプレートに含まれる第一および第二のRNAポリメラーゼ認識配列はそれぞれ、T7、T3およびSP6 RNAポリメラーゼ認識配列からなる群より選択され、そして、該一本鎖プロモーター・テンプレートは、DNAポリメラーゼでは伸張不能であるように、3’末端が3’アミノ修飾因子、3’デオキシターミネーター、または3’ジデオキシターミネーターでブロッキングされている;前記の第二のRNAポリメラーゼ認識配列に相補的な一本鎖プロモーター・オリゴヌクレオチド;ならびに前記プロモーター・テンプレートおよびプロモーター・オリゴヌクレオチドを用いて、少なくとも1つのsRNA分子の多数周期の合成を行うための使用説明資料を含む、前記キット。
- 逆転写酵素;DNAポリメラーゼ;末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ;および1以上のRNAポリメラーゼをさらに含む、請求項21のキット。
- 少なくとも1つのsRNA分子の多数周期の合成を行うためのキットであって、以下の構成要素および試薬:
第一周期オリゴdT配列特異的RTプライマー;
第一周期ランダム配列特異的RTプライマー;
dNTPミックス;
RNアーゼ阻害剤;
dATP;
10x反応緩衝液;
末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ;
T7T3 RNAポリメラーゼ・プロモーター・テンプレート;
クレノウ酵素;
T7ポリメラーゼ;
T3ポリメラーゼ;
ヌクレアーゼ不含水;ならびに
前記キットの構成要素および試薬を用いて、sRNA分子を産生するための使用説明資料を含む、前記キット。
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