JP2008232693A - 美白成分のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質量を指標とすることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法及び、メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質の産生抑制効果を指標とすることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法。
【選択図】 なし
Description
<手順>
1.正常ヒトメラノサイト(NHEM:クラボウ社)を直径10cmのシャーレに
3000cells/cm2播種する。
2.前記播種した細胞を5日間培養し、スクリーニング対象の薬剤を2日目及び4
日目に添加する。
3.培養5日後に培地を取り除き、PBS(−)で洗浄後、トリプシンによって細
胞を剥離させる。
4.遠心によって細胞を回収し、細胞数をカウントして各試料における細胞数を一
定にし、5%トリクロロ酢酸5mLにて懸濁し、冷却遠心を行う。
5.上清を取り除き、ペレットにジエチルエーテルとエタノールの重量比が3:1
の溶液5mL添加する。
6.冷却遠心を行い、この上清を取り除きペレットを風乾させる。
7.次に標準として100μg/mLの合成メラニン(Sigma社)を1NのK
OHを用いて溶解させ1、10、20、50μg/mLの希釈系列を作成し、
吸光度=400nmにおける値を測定し、検量線を作成する。
8.風乾させたメラニンのペレットに1NのKOHを添加して溶解させ、吸光度=
400nmにおける値を測定して各濃度におけるメラニン量産生量を算出する。
注1:雪見草抽出物の製造例
雪見草の葉及び茎の300gに、精製水、50vol%
含水エタノールを3L加え、室温又は加温して1日間抽出を行った後、濾過し、得られた濾液中の溶媒を留去して乾固し、固形分である雪見草の精製水抽出物(収量18.5g)、50vol%含水エタノール抽出物(収量9.9g)を得た。
<手順>
1.正常ヒトメラノサイト(NHEM:クラボウ社)を直径10cmのシャーレに
3000cells/cm2播種する。
2.前記播種した細胞を5日間培養し、スクリーニング対象の薬剤を2日目及び4
日目に添加する。
3.培養5日後に培地を取り除き、PBS(−)で洗浄後、トリプシンによって細
胞を剥離させる。
4.次に、回収した細胞にpH7.5の10mMトリス塩酸緩衝液抽出バッファー
を加えた後、超音波にて4℃で10分間して細胞を破砕し、遠心分離により細
胞残渣を取り除いてから、タンパク定量を行う。
5.各サンプルのタンパク量が一定となるように10%のポリアクリルアミドゲル、
にサンプルをのせ、SDS−PAGEを行った。
6.0.1%のL−DOPA溶液を含むPBS(−)溶液を泳動後のゲルに添加し、
37℃にて1時間インキュベート行う。
7.10%酢酸、40vol%含水エタノールで10分固定し、水洗する。
8.検出したバンドはデンシトメトリーで読み込み、面積を測定してチロシナーゼ
活性量とみなした。
<手順>
1.正常ヒトメラノサイト(NHEM:クラボウ社)を直径10cmのシャーレに
3000cells/cm2播種する。
2.前記播種した細胞を5日間培養し、スクリーニング対象の薬剤を2日目及び4
日目に添加する。
3.培養5日後に培地を取り除き、PBS(−)で洗浄後、トリプシンによって細
胞を剥離させる。
4.次に、回収した細胞にpH7.5の10mMトリス塩酸緩衝液抽出バッファー
を加えた後、超音波にて4℃で10分間して細胞を破砕し、遠心分離により細
胞残渣を取り除いてから、タンパク定量を行う。
5.各サンプルのタンパク量が一定となるように10%のポリアクリルアミドゲル
にサンプルをのせ、SDS−PAGEを行った。
6.電気泳動終了後、ゲル上のタンパクをニトロセルロース膜に転写し、ウエスタ
ンブロッティングを行うことによりgp100を検出した。
7.1次抗体は抗ヒトgp100モノクローナル抗体(SANTA CRUZ社)、
2次抗体は抗マウスペルオキシダーゼ標識IgG(アマシャム社)を用いてケ
ミルミネッセンス法により検出した。
8.検出したバンドはデンシトメトリーで読み込み、面積を測定してgp100の
発現量とみなした。
Claims (4)
- メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質量を指標とすることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法。
- メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質の産生抑制効果を指標とすることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法。
- メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質量を指標とし、メラニンのケラチノサイトへの受け渡しを阻害することを特徴とする美白成分のスクリーニング方法。
- メラノソーム構造蛋白質がgp100であることを特徴とする請求項1〜3の何れかの項記載のスクリーニング方法。
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