JP2014215286A - メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物のスクリーニング方法 - Google Patents

メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物のスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2014215286A
JP2014215286A JP2013095829A JP2013095829A JP2014215286A JP 2014215286 A JP2014215286 A JP 2014215286A JP 2013095829 A JP2013095829 A JP 2013095829A JP 2013095829 A JP2013095829 A JP 2013095829A JP 2014215286 A JP2014215286 A JP 2014215286A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mortalin
hsp60
cells
pigmentation
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2013095829A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6172740B2 (ja
Inventor
レヌー・ワダワ
Wadawa Renuu
カウル・スニル
Kaul Sunil
信裕 安藤
Nobuhiro Ando
信裕 安藤
クリスチャン・マエ
Mae Christian
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHANEL KESHOHIN GIJUTSU KAIHATSU KENKYUSHO KK
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Original Assignee
CHANEL KESHOHIN GIJUTSU KAIHATSU KENKYUSHO KK
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHANEL KESHOHIN GIJUTSU KAIHATSU KENKYUSHO KK, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST filed Critical CHANEL KESHOHIN GIJUTSU KAIHATSU KENKYUSHO KK
Priority to JP2013095829A priority Critical patent/JP6172740B2/ja
Priority to US14/786,475 priority patent/US10520492B2/en
Priority to PCT/EP2014/058697 priority patent/WO2014177550A1/en
Priority to EP14723389.4A priority patent/EP2992328B1/en
Publication of JP2014215286A publication Critical patent/JP2014215286A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6172740B2 publication Critical patent/JP6172740B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60Sugars; Derivatives thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00Drugs for dermatological disorders
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61QSPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407Specifically defined cancers
    • G01N33/5743Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/14Type of nucleic acid interfering N.A.
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50Physical structure
    • C12N2310/53Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531Stem-loop; Hairpin
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00Screening for compounds of potential therapeutic value
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20Dermatological disorders
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20Dermatological disorders
    • G01N2800/207Pigmentation disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Abstract

【課題】メラニン生成又は色素沈着を調節するための標的遺伝子又はタンパク質を同定し、メラニン生成又は色素沈着を操作する化合物のスクリーニング法を提供する。
【解決手段】メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、被験化合物と、モータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞とを、in vitroで接触させる工程と、被験化合物から、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程とを含む。
【選択図】なし

Description

[0001] 本発明は、メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物のスクリーニング法に関する。
[0002] メラニン生成とは、メラノサイトと呼ばれる特殊なメラニン生成細胞がメラニン色素を生成するプロセスである。メラノサイトは表皮の基底層にある細胞の5%から10%を占める。通常は皮膚1平方ミリメートル当たり1000個から2000個のメラノサイトがある。サイズは様々であるが、メラノサイトは通常、7マイクロメートルの長さである。
[0003] メラニンのレベルは異なるヒト個体群で変化し、メラノサイトの活動レベル及びそれが生成するユーメラニン及びフェオメラニンの量に応じて、明るい生体色素から暗い生体色素の個体まで変化する。このプロセスは、メラノサイトがアミノ酸チロシンからメラニンを生成するために必要なチロシナーゼ酵素によって調節され、前駆物質プロオピオメラノコルチンから生成されるMSH及びACTHペプチドなどのホルモンに大きく影響される。UV−B放射への曝露によって低レベルのメラニン生成が刺激される。
[0004] 合成されると、メラニンはメラノソームと呼ばれる特殊な構造に貯蔵される。メラノソームは、樹状突起と呼ばれる腕状構造に沿ってケラチノサイトの最上層へと送られる。メラニンは、そこでUVに誘導される損傷から皮膚を保護する際に重要な役割を果たす。内因性色素のレベルが低い個体は、皮膚癌の発病率が高い傾向があり、したがってメラニン生成を誘導する作用物質には、UVに誘導される皮膚の損傷及び発癌現象に対する保護物質として潜在能力がある。さらに、色素沈着を誘導する化学物質は、皮膚癌の分化剤としても働くことができる。他方で、脱色素を誘導する作用物質は、(i)しみ、すなわち老化した皮膚や、又はケロイド又は炎症後色素沈着過剰症などの特定の皮膚の状態に現れる暗い斑点の治療、及び(ii)化粧品で所望されるような皮膚の美白に有益である。メラニン生成は、まだ完全には理解されていない複雑なプロセスである。このプロセスに関与する細胞因子の同定の研究や、その安全で機能的な操作へのアプローチが必要である。
[0005] 1. Chiang HM, Lin JW, Hsiao PL, Tsai SY, Wen KC. Hydrolysates of citrus plants stimulate melanogenesis protecting against UV-induced dermal damage. Phytother Res 2010; 25: 569-76.
2. Kimura Y, Sumiyoshi M. French maritime pine bark (Pinus maritima Lam.) extract (Flavangenol) prevents chronic UVB radiation-induced skin damage and carcinogenesis in melanin-possessing hairless mice. Photochem Photobiol 2010; 86: 955-63.
3. Gidanian S, Mentelle M, Meyskens FL, Jr., Farmer PJ. Melanosomal damage in normal human melanocytes induced by UVB and metal uptake--a basis for the pro-oxidant state of melanoma. Photochem Photobiol 2008; 84: 556-64.
4. Costin GE, Hearing VJ. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. Faseb J 2007; 21: 976-94
5. Seo YK, Kim SJ, Boo YC, Baek JH, Lee SH, Koh JS. Effects of p-coumaric acid on erythema and pigmentation of human skin exposed to ultraviolet radiation. Clin Exp Dermatol 2011; 36: 260-6.
[0006] 本発明の目的は、メラニン生成又は色素沈着を調節するための標的遺伝子又はタンパク質を同定し、メラニン生成又は色素沈着を操作する化合物のスクリーニング法を提供することである。
[0007] 本発明の発明者らは、上記問題の解決を目指して鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、モータリン及びHsp60が皮膚の色素沈着に関与していることを実証した。さらに具体的には、本発明者らは、モータリン又はHsp60の発現レベルが高いと、メラニン生成又は色素沈着が増加し、モータリン又はHsp60の発現又は機能を抑制すると皮膚の脱色素又は美白につながることを明らかにした。
[0008] したがって、本発明は以下に関する。
[1]メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
被験化合物と、モータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞とを、in vitroで接触させる工程と、
被験化合物から、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程とを含む方法。
[2]脱色素、美白、又はメラニン生成の抑制のための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
被験化合物と、モータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞とを接触させる工程と、
被験化合物から、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを減少させる化合物を選択する工程とを含む方法。
[3]メラニン生成又は色素沈着を誘導するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
被験化合物と、モータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞とを接触させる工程と、
被験化合物から、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを増加させる化合物を選択する工程とを含む方法。
[4]被験化合物と細胞とを接触させる工程の前に、メラニン生成及び/又は色素沈着を誘導する工程をさらに含む、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の方法。
[5]モータリン及び/又はHsp60の発現レベルは、ELISAによって決定される、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法。
[6]モータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞は、ヒトメラノーマ細胞又はメラノサイトを含む、[1]〜[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7]色素沈着又はメラニン生成を誘導するための医薬組成物であって、(i)Hsp60遺伝子及び/又はモータリン遺伝子を含む発現ベクター、又は(ii)Hsp60タンパク質及び/又はモータリンタンパク質を含む、医薬組成物。
[8]組成物が皮膚の障害を治療するために使用される、[7]に記載の医薬組成物。
[9]皮膚の障害が、癌、色素沈着過度、発疹及びケロイドからなる群から選択される、[8]に記載の医薬組成物。
[10]モータリン、HSP60、及びミトコンドリア中の他のタンパク質に基づいてミトコンドリア機能を操作する工程を含む、色素沈着又はメラニン生成に介入する方法。
[11]モータリン、HSP60、及びミトコンドリア中の他のタンパク質に関与する細胞の酸化ストレス反応を操作する工程を含む、色素沈着又はメラニン生成に介入する方法。
[12]皮膚の美白のために、[1]〜[6]のいずれか1項の方法により得られる、モータリン及びHsp60から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現抑制剤の化粧品への使用。
[13]培養皮膚細胞のメラニン生成又は色素沈着を操作する方法であって、
幹細胞を皮膚細胞にin vitroで分化させる工程と、
培養皮膚細胞中のモータリン及び/又はHsp60の量を調節する工程とを含む方法。
[0009] 本発明のスクリーニング法により、メラニン生成又は色素沈着を調節する候補化合物、特に脱色素、美白、若しくはメラニン生成抑制のための候補化合物、又はメラニン生成若しくは色素沈着を誘導する候補化合物が選択される。選択される脱色素、美白、メラニン生成抑制のための化合物は、しみ、ケロイド、又は色素沈着過度を治療する薬品として、又は化粧品の美白作用物質として使用することができる。他方で、メラニン生成又は色素沈着を誘導するために選択される化合物は、UVに誘導される皮膚の損傷又は発癌性に対する保護作用物質として、又は皮膚癌の分化作用物質として使用することができる。
[0010] 本発明の医薬組成物は、チロシナーゼの活性化を通して色素沈着又はメラニン生成を誘導する。
[0011] 本発明のメラニン生成又は色素沈着を操作する方法により、移植に使用するために培養する皮膚の色を適宜調節することができる。
[0012]
図1は、コントロール、及び白い肌のドナー由来のOAG処理した初代メラノサイト(A)、及びヒトメラノーマ細胞G361(B)におけるメラノソーム誘導の免疫組織化学的分析の結果を示す。 図2は、OAG処理した(中心)、又はOAGとビタミンCで処理した(右)G361のメラニン含有量を示す。 図3は、チロシナーゼのウェスタンブロッティング(A)、及びチロシナーゼ活性アッセイ(B)の結果を示す。 図4は、OAGでメラニン生成を誘導したときのメラノソーム及びHsp60の免疫染色の結果を示す。 図5は、OAGでメラニン生成を誘導したときのメラノソーム及びモータリンの免疫染色の結果を示す。 図6は、OAG処理したG361細胞中でHsp60又はモータリンをノックダウンしたときのメラニン含有量を示す。 図7は、OAG処理したG361細胞中でHsp60又はモータリンをノックダウンときのチロシナーゼ活性を示す。 図8は、G361細胞中でモータリンを過剰発現させたときのメラニン含有量を示す。 図9は、G361細胞中でモータリンを過剰発現させたときのメラノソーム染色を示す。 図10は、G361細胞中でモータリンを過剰発現させたときのチロシナーゼ活性を示す。 図11は、様々な濃度でTXC処理した後にOAG処理した又はOAG未処理のG361細胞内のメラニン含有量を示す。 図12は、様々な濃度でTXC処理した後にOAG処理した又はOAG未処理のG361細胞のチロシナーゼ活性を示す。 図13は、TXC処理したG361細胞のチロシナーゼ、モータリン及びHsp60の発現を示す。 図14は、本発明のスクリーニング法の概略的な例を示す。
(スクリーニング法)
[0013] 本発明のスクリーニング法は、メラニン生成又は色素沈着を調節する候補化合物をスクリーニングする方法であって、(i)被験化合物と、モータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞とをin vitroで接触させる工程と、(ii)被験化合物からモータリン及び/又はHsp60の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程とを含む方法である。工程(ii)では、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを少なくとも20%変化させる任意の化合物を選択することが好ましい。
[0014] 本明細書で使用する「メラニン生成」という用語は、メラノサイト中でメラニンが生成されるプロセスを意味する。上述したように、メラニン生成が起きるためにはチロシナーゼが必要である。チロシナーゼは、メラノサイト中のチロシンを酸化してフェノールを生成し、これがさらに酵素的に又は非酵素的に酸化され、脱カルボキシル化され、重合されてメラニン、すなわち茶色系又は黒い色素を生成する。
生成されると、メラニンはメラノソームと呼ばれる細胞小器官に貯蔵されて、ケラチノサイトの最上層へと搬送され、これで細胞核中のDNAを紫外線損傷から保護する。
本明細書で使用する「色素沈着」という用語は、メラニンが過剰に蓄積して皮膚が着色されるプロセスを意味する。
[0015] 本明細書で使用する「メラニン生成又は色素沈着を調節する」という用語は、メラニン生成又は色素沈着の促進又は抑制を操作することを意味する。すなわち、メラニン生成又は色素沈着の調節とは、メラニン生成の抑制、脱色素、又は美白の誘導と、メラニン生成又は色素沈着の誘導との両方を含む。
[0016] 本明細書で使用する「候補化合物」という用語は、本発明のスクリーニング法で使用することができる任意の物質を意味する。候補化合物の例としては、核酸、ペプチド、タンパク質、糖類、脂質、低分子化合物、植物抽出物及びポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
[0017] 本明細書で使用する「モータリン」とはあるタンパク質であり、ミトコンドリア熱ショックタンパク質70(mthsp70)、ペプチド結合タンパク質74(PBP74)、又はブドウ糖調節タンパク質75(Grp75)とも呼ばれ、タンパク質のHsp70シャペロンファミリーのメンバーであり、様々な細胞内の位置でユニークな機能的特徴を有することが示されている。モータリンの機能的役割は、その細胞内局在に基づいて2つの主要クラスに分類することができる。第1のクラスの機能は、ミトコンドリア内で生じる機能に関し、核でコードされているタンパク質のミトコンドリア内への取り込み、新生タンパク質の折り畳み、ミトコンドリア内のタンパク質分解、及び完全性(integrity)及び機能を維持するためのミトコンドリア内成分との相互作用への関与を含む。第2のクラスの機能は、ミトコンドリア外での役割に関し、幾つかの細胞質の小胞体及び核タンパク質、中心体、成長因子、免疫系成分、及び代謝成分との相互作用と機能的調節とを含む(Wadhwa R他、J Biol Chem 1993; 268: 6615-21、Wadhwa R他、J Biol Chem 1998; 273: 29586-91、Wadhwa R他、Cancer Res 2000; 60: 6818-21、Kaul SC他、J Biol Chem 2005、Kanai M他、Genes Cells 2007; 12: 797-810、Ma Z他、Oncogene 2006; 25: 5377.5390、Lu WJ他、Cell Death Differ 2011; 18: 1046-56、Pilzer D他、Int Immunol 2005; 17: 1239-48)。
[0018] モータリンはヒトの癌において濃縮されることが多く、ヒトの発癌性と機能的に関連づけられてきた(Cussac他、2006、Dundas他、2005、Ma他、2006、Shin他、2003、Wadhwa他、2006、Lu他、2011、Yi他、2008)。モータリンの発現レベルが比較的高い癌細胞は、足場非依存性成長、ヌードマウスにおける腫瘍形成及び走化性など、悪性の増大を示す。タンパク質発現の定量的評価により、高レベルのモータリンを発現する腫瘍は、腫瘍の体積及び転移など、より攻撃的な悪性表現型を有することが分かる(Dundas他、2005、Lu他、2011)。さらに腫瘍組織におけるモータリンの発現レベルは、低い患者生存率(Dundas他、2005)及び手術後の腫瘍の再発(Yi他、2008)と正の相関を示す。
[0019] 正常なヒトの線維芽細胞でモータリンを強制的に過剰発現させると、その寿命が延長する(Kaul他、2001、Wadhwa他、1998、Wadhwa他、2002c)。癌以外に、モータリンはニューロン分化(Shin他、2012)、肥満(Olivia他、2012)及びNFκ−Bシグナル伝達(Li他、2010)など、ニューロン機能において役割を果たすことが報告されている。ミトコンドリア機能不全が、神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病)や脳虚血などの幾つかの主要な神経疾患の病因に関与しているという概念と一致して、モータリン機能不全もこのような疾患に関与していることが示されている。
[0020] 熱ショックタンパク質60(Hsp60)は、タンパク質のアセンブリと折り畳み(SoltysとGupta、1997)さらに細胞のストレス反応(GuptaとKnowlton、2002)に関与することが判明している別のミトコンドリアのストレスタンパク質である。モータリンと同様に、HSP60はミトコンドリア内及びミトコンドリア外の部位に見られ(SoltysとGupta、1996、Cechetto他、2000、Cicconi他、2004)、多くの種類の腫瘍で上方制御されている(Cappello他、2003、Pignatelli他、2003)。さらに、モータリン及びHsp60は複合体中に存在し、発癌に寄与していることが示されている(Wadhwa他、2005)。
[0021] 本明細書で使用する「モータリン」又は「Hsp60」は、メラニン生成又は色素沈着を誘導する機能を有する限り、自然に発生する又は人工的な変異体を含む。このような変異体は、例えばモータリン又はHsp60と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、メラニン生成又は色素沈着誘導能を有するポリペプチドを含んでいてもよい。変異体タンパク質がメラニン生成又は色素沈着誘導能力を有するか否かは、当業者は、本出願の実施例で説明するような任意の既知の方法により容易に識別することができる。
[0022] 本明細書で使用する「モータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞」という用語は、モータリン及びHsp60のうち少なくとも一方を、常に又は一過性に発現可能な細胞を指す。本明細書で使用する「発現」という用語は、鋳型DNAのシーケンスに基づいてmRNAが合成される転写と、mRNAを順番に解読するtRNAによってタンパク質が合成される翻訳との両方を含む。モータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞の例は、メラノサイト及びメラノーマ細胞を含む。メラノサイトは、チロシナーゼを含み、チロシンからメラニンを生成する細胞である。メラノーマは、メラノサイト内で発生する悪性腫瘍である。メラノーマ細胞としては、マウスのメラノーマB16細胞、ヒトのメラノーマSK−MEL−28細胞、及びヒトのメラノーマG361細胞が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞は既知の方法で培養することができる。
本出願でモータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞は、必ずしもメラニンを生成する細胞ではない。
[0023] 被験化合物とモータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞とを接触させる工程は、当業者が適宜行うことができる。例えば、このような工程は、モータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞の培地に適切な濃度で被験化合物を添加することによって行うことができる。
[0024] 被験化合物からモータリン及び/又はHsp60の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程は、例えば、細胞と被験化合物を接触させる前後にわたる複数の時点で、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを決定し、少なくとも2つの時点の発現レベルを比較することによって行うことができる。選択される化合物はモータリン及び/又はHsp60の発現レベルを少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも50%変化させる。
[0025] 細胞内のモータリン及び/又はHsp60の発現レベルの測定は、サンプル中の特定のタンパク質又はmRNAを検出又は測定する任意の方法で行うことができる。このような方法としては、タンパク質の量を決定することができるイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、表面プラズモン共鳴(SPR)、及びmRNAの量を決定することができるノーザンハイブリダイゼーション又は定量的リアルタイムRT−PCRが挙げられるが、これらに限定されない。これらの中で、本発明のスクリーニング法には、その単純さゆえに抗Hsp60抗体又は抗モータリン抗体を使用するイムノアッセイを使用することができる。
[0026] イムノアッセイのうち、酵素結合免疫吸着法(「ELISA」)が好ましい場合がある。何故なら、検出剤に結合した酵素を使用すると、タンパク質濃度の決定をより容易かつ迅速にできるからである。
例えば、ELISAを使用することによってモータリンの量を決定するためには、抗モータリン抗体を固相担体上で固定化し、その後に細胞溶解物を固相担体の表面に適用する。次に、第1の抗体によって認識されたエピトープとは異なるエピトープを認識し、酵素で標識された第2の抗モータリン抗体を追加し、捕捉されたモータリンと反応するようにインキュベートする。洗浄した後、発色させるために酵素の基質を固相担体の表面に添加する。モータリンの量は、吸光度などを測定することによって決定することができる。サンプル中で固相担体上に固定化された抗体とモータリンとの反応が生じた後、モータリンに特異的に結合する標識されていない一次抗体を使用し、次に第1の抗体に特異的に結合する標識されている二次抗体を使用することによって、モータリンを標識してもよい。
ペルオキシダーゼを酵素として使用する場合、基質は例えば3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)、又はo−フェニレンジアミン(OPD)とすることができる。アルカリホスファターゼを酵素として使用する場合、基質は例えばp−ニトロフェニルホスフェート(NPP)とすることができる。
[0027] 「固相担体」という用語は特に限定されず、例えばガラス、金属又はポリマーなどで作製したマイクロタイタープレート、プレート、ビーズ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、又はPVDF膜を含むことができる。標的タンパク質を捕捉するための抗体は、任意の既知の方法で固定化することができる。
[0028] 抗モータリン抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体とすることができ、両方とも任意の既知の方法により生成することができる。モノクローナル抗体は、モータリン又はその断片でヒト以外の哺乳動物を免疫し、その哺乳動物から抗体産生細胞を分離して、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマによって産生された抗体を精製することによって生成することができる。ポリクローナル抗体は、モータリン又はその断片で免疫した動物の血清から得ることができる。抗モータリン抗体として、既存の抗体を使用することもできる。
[0029] 抗Hsp60抗体は、抗モータリン抗体に関して以上に説明したのと同じ方法で得ることができる。
[0030] 本発明者らは、後述する実施例で示すように、モータリン又はHsp60の発現が増大するほど、チロシナーゼの活性が増大して、メラニン生成及び色素沈着が促進されることを見出した。
したがって、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを上昇させる物質は、紫外線に誘導される皮膚の損傷又は発癌に対する保護物質、又は皮膚癌の分化剤として使用することができる。
他方で、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを低下させる物質は、しみ、すなわち老化した皮膚や、ケロイド又は炎症後色素沈着過剰症などの特定の皮膚の状態に現れる暗い斑点の治療剤として使用することができる。このような物質は、美白を目的とする化粧品としても有用である。本明細書で使用する「美白」という用語は、皮膚の色をより透明に、より明るく、又はより白くするか、又は皮膚の暗い斑点又はそばかすを減少させるという意味である。
[0031] 本発明のスクリーニング法は、細胞と被験化合物とを接触させる工程の前に、細胞のメラニン生成又は色素沈着を誘導する工程をさらに含むことができる。このようなメラニン生成又は色素沈着の誘導は、ジアシルグリセロール(DAG)、1−オレオイル−2−アセチル−sn−グリセロール(OAG)又はアルファ−メラノサイト刺激ホルモン(αMSH)を細胞の培地に添加することによって行うことができる。
[0032] 本発明のスクリーニング法によってモータリン及び/又はHsp60の細胞発現レベルを低下させる化合物として選択される化合物は、美白を目的とする化粧品の成分として使用してもよい。
[0033] 図14は、本発明のスクリーニング法の概略的な例を示す。
図に示すように、G361細胞を96ウェルプレートに準備し、G361細胞の色素沈着を誘導するためにプレートの各ウェルにOAGを添加する。その後、候補化合物を適切な濃度で各ウェルに添加し、インキュベートする。化合物と標的との反応が生じるように、当業者はインキュベーションの条件を適宜決定することができる。
本発明のスクリーニング法は毒性アッセイを含むことができ、それによって細胞毒性を有する化合物を候補から除去することができる。毒性アッセイは、当業者が適宜行うことができる。
最後に、各ウェルのモータリン濃度を、例えばELISAアッセイによって測定する。
(化粧品)
[0034] 本発明の化粧品は、細胞中のモータリン及び/又はHsp60の発現レベルを低下させる化合物を含む。
本明細書で使用する「化粧品」という用語は、例えば、美しくする、魅力を増進する、又は身体の構造又は機能に影響せずに外観を変更するために人体に適用することが意図された物質又は組成物を意味する。このような用語の解釈は、各国の当局による定義に従ってもよい。
[0035] 本発明の化粧品の形態は特に限定されないが、水系(例えばスキンローション)、乳化剤系(例えばエマルジョン又はクリーム)、粉末、油脂、ゲル、軟膏、水−油の2相系(例えば油中水型エマルジョン又は水中油型エマルジョン)、水−油−粉末の3相系などを含むことができる。その使用又は剤形も特に限定されず、剤形は、クリーム、エマルジョン、ローション、フェイシャルマスク、口紅、ファンデーション、ゼリー、軟膏、フィルム、粉末など、通常の化粧品に使用される任意の剤形とすることができる。
[0036] 本発明の化粧品の製造方法は特に限定されず、化粧品の任意の既知の生産方法を含むことができる。例えばエマルジョン又はクリームの場合、選択される化合物を水相成分に乳化剤で溶解させ、油相成分を添加し、次に混合して成分を乳化することによって生成することができる。
[0037] 本発明の化粧品の組成物の特定の例は粉末成分、液体油脂、固形脂肪、ワックス、炭化水素油、高級脂肪酸、高級アルコール(好ましくは6個以上の炭素原子を有するアルコール、さらに好ましくは10個以上の炭素原子を有するアルコール)、合成エステル油、シリコーン化合物、界面活性剤、共界面活性剤、被膜形成剤、ゲル化剤、金属イオン封鎖剤、低級アルコール、多価アルコール又はその誘導体、単糖、オリゴ糖、アミノ酸、植物抽出物、有機アミン、高分子エマルジョン、冷却剤、pH調節剤、緩衝液、香料及び水を含む。従来の方法により所望の剤形形態を生成するために、かかる構成要素を必要に応じて適宜添加することができる。
[0038] 本発明の目的が損なわれない限り、これらの添加剤の含有量に特定の制限はなく、含有量は剤形又は製品の形態に応じて適宜選択することができる。これらの添加剤は、任意の工程で添加することができる。これらの添加剤を添加するタイミングは、添加剤の種類に応じて適宜選択することができる。
[0039] 粉末成分の例としては、タルク、カオリン、雲母、絹雲母、白雲母、金雲母、合成雲母、赤雲母、黒雲母、バーミキュライト、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、珪酸アルミニウム、珪酸バリウム、珪酸カルシウム、珪酸マグネシウム、珪酸ストロンチウム、金属タングステン酸塩、シリカ、ゼオライト、硫酸バリウム、か焼硫酸カルシウム(焼き石膏)、燐酸カルシウム、フッ素アパタイト、ヒドロキシアパタイト、セラミック粉末、金属石鹸(例えばミリスチン酸亜鉛、パルミチン酸カルシウム及びステアリン酸アルミニウム)及び窒化ホウ素などの無機粉末;ポリアミド樹脂粉末(ナイロン粉末)、ポリエチレン粉末、ポリメチルメタクリレート粉末、ポリスチレン粉末、スチレン/アクリル酸共重合体樹脂粉末、ベンゾグアナミン樹脂粉末、ポリテトラフルオロエチレン粉末及びセルロース粉末などの有機粉末;アルミニウム粉末及び銅粉末などの金属粉末顔料;ジルコニウム−、バリウム−、及びアルミニウム−レーキなどの有機顔料;クロロフィル及びβ−カロテンなどの天然色素が挙げられる。
[0040] 液体油脂の例としては、アボカド油、椿油、カメ油、マカダミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、オリーブ油、菜種油、卵黄油、ごま油、杏仁油、麦芽油、トガリバサザンカ油、ひまし油、亜麻仁油、ベニバナ油、綿実油、紫蘇油、大豆油、ピーナツ油、茶種油、カヤ種油、米糠油、中国桐油、日本桐油、ホホバ油、胚芽油、及びトリグリセリンが挙げられる。
[0041] 固体油脂の例としては、カカオバター、ココナツ油、馬油、硬化ココナツ油、ヤシ油、牛脂、羊脂、硬化牛脂、パーム核油、ラード、牛骨脂肪、木蝋核油、硬化油、牛脚油、木蝋、及び硬化ひまし油が挙げられる。
[0042] ワックスの例としては、蜜蝋、カンデリラ蝋、綿蝋、カルナウバ蝋、ベーラム蝋、中国虫白蝋、鯨蝋、モンタン蝋、ふすま蝋、ラノリン、カポック蝋、アセチル化ラノリン、液体ラノリン、サトウキビ蝋、ラノリン脂肪酸イソプロピルエステル、ラウリン酸ヘキシル、還元ラノリン、ホホバ蝋、ハードラノリン、セラック蝋、POEラノリンアルコールエーテル、POEラノリン酢酸アルコール、POEコレステロールエーテル、ラノリン脂肪酸ポリエチレングリコール、及びPOE水素化ラノリンアルコールエーテルが挙げられる。
[0043] 炭化水素油の例としては、液体パラフィン、オゾケライト、スクアラン、プリスタン、パラフィン、セレシン、スクアレン、ワセリン、微結晶蝋、及び水素化ポリデセンが挙げられる。
[0044] 高級脂肪酸の例としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、ウンデシレン酸、トール油酸、イソステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサペンタエン酸(EPA)、及びドコサヘキサエン酸(DHA)が挙げられる。
[0045] 高級アルコールの例としては、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、及びセトステアリルアルコールなどの直鎖アルコール;モノステアリルグリセリルエーテル(バチルアルコール)、2−デシルテトラデカノール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、ヘキシドデカノール、イソステアリルアルコール、及びオクチルドデカノールなどの分枝アルコールが挙げられる。
[0046] 合成エステル油の例としては、トリプロピレングリコールジネオペンタノエート、イソノナン酸イソノニル、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、アセチル化ラノリン、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソセチル、コレステリル12−ヒドロキシステアリン酸塩、エチレングリコールジ−2−ヘキサン酸エチル、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、N−アルキルグリコールモノイソステアレート、ネオペンチルグリコールジカプリレート、リンゴ酸ジイソステアリル、グリセリルジ−2−ヘプチルウンデカノエート、トリメチロールプロパントリ−2−ヘキサン酸エチル、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトールテトラ−2−ヘキサン酸エチル、グリセリルトリ−2−ヘキサン酸エチル、トリオクタン酸グリセリル、トリイソパルミチン酸グリセリル、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、セチル2−ヘキサン酸エチル、2−パルミチン酸エチルヘキシル、トリミリスチン酸グリセリル、グリセリドトリ−2−ヘプチルウンデカノエート、ひまし油脂肪酸メチルエステル、オレイン酸オレイル、アセトグリセリド、2−パルミチン酸ヘプチルウンデシル、アジピン酸ジイソブチル、N−ラウロイル−L−グルタミン酸−2−オクチルドデシルエステル、ジ−2−アジピン酸ヘプチルウンデシル、ラウリン酸エチル、ジ−2−セバシン酸エチルヘキシル、2−ミリスチン酸ヘキシルデシル、2−パルミチン酸ヘキシルデシル、2−アジピン酸ヘキシルデシル、セバシン酸ジイソプロピル、2−コハク酸エチルヘキシル、及びクエン酸トリエチルが挙げられる。
[0047] シリコーン化合物の例としては、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン及びジフェニルポリシロキサンなどの直鎖状ポリシロキサン類、及びオクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン及びドデカメチルシクロヘキサシロキサンなどの環状ポリシロキサン類を含むシリコーン油;三次元ネット構造を形成するシリコーン樹脂;シリコーンエラストマー;アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン及びフッ素変性ポリシロキサンなどの様々な変性ポリシロキサンが挙げられる。
[0048] シリコーンエラストマーの例としては、非乳化有機ポリシロキサンエラストマー又は乳化有機シロキサンエラストマーが挙げられる。非乳化有機ポリシロキサンエラストマーの例としては、ジメチコーン/ビニルジメチコーンクロスポリマー、ラウリルジメチコーン/ビニルジメチコーンクロスポリマーなどが挙げられる。
[0049] ジメチコーン/ビニルジメチコーンクロスポリマーには例えばDC9040及びDC9045という商品名でDOW CORNINGから市販されている製品と、SFE839という商品名でGENERAL ELECTRICから市販されている製品及びVelvasilシリーズの製品;例えばKSG−15、KSG−16及びKSG−18という商品名でSHIN ETSUから市販されている製品([ジメチコーン/フェニルビニルジメチコーンクロスポリマー]);GRANT INDUSTRIESからのGransil(商標)シリーズの製品が含まれる。
[0050] ラウリルジメチコーン/ビニルジメチコーンクロスポリマーには例えばKSG−31、KSG−32、KSG−41、KSG−42、KSG−43、及びKSG−44という商品名でSHIN ETSUから市販されている製品が含まれる。
[0051] 乳化オルガノシロキサンエラストマーとしては、ポリアルコキシル化シリコーンエラストマー又はポリグリセロール化シリコーンエラストマーなどが挙げられる。
[0052] ポリアルコキシル化シリコーンエラストマーとしては、DOW CORNING社より「DC9010」及び「DC9011」などの名称で市販されているもの、信越化学工業株式会社より「KSG−20」、「KSG−21」、「KSG−30」、「KSG−31」、「KSG−32」、「KSG−33」、「KSG−210」、「KSG−310」、「KSG−320」、「KSG−330」、「KSG−340」及び「X−226146」などの名称で市販されているものなどが挙げられる。
[0053] ポリグリセロール化シリコーンエラストマーとしては、信越化学工業株式会社より「KSG−710」、「KSG−810」、「KSG−820」、「KSG−830」、「KSG−840」、「KSG−31」、「KSG−32」、「KSG−41」、「KSG−42」、「KSG−43」及び「KSG−44」などの名称で市販されているものなどが挙げられる。
[0054] さらに、シリコーン樹脂加水分解タンパク質も使用することができる。シリコーン樹脂加水分解タンパク質の例としては、(加水分解絹/PG−プロピルメチルシランジオール)クロスポリマー及び(トリメチルシリル加水分解小麦タンパク質/PG−プロピルメチルシランジオール)クロスポリマーが挙げられる。市販されている製品をシリコーン樹脂加水分解タンパク質として使用することができる。このような市販されている製品の例としては、PROTESIL FN、PROTESIL LH、及びPROTESIL GLHという商品名のSeiwa Kasei Co., LTD.の製品が挙げられる。
[0055] 界面活性剤の例としては、親油性非イオン性界面活性剤及び親水性非イオン性界面活性剤が挙げられる。
[0056] 親油性非イオン性界面活性剤の例としては、ソルビタンモノオレエート、モノイソステアリン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、ジグリセロールソルビタンペンタ−2−エチルヘキシレート及びジグリセロールソルビタンテトラ−2−エチルヘキシレートなどのソルビタン脂肪酸エステル;グリセリルモノ綿実油脂肪酸、グリセリルモノエルケート、セスキオレイン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、グリセリルα,α’−ピログルタミン酸オレイン酸、及びモノステアリン酸リンゴ酸グリセリルなどのグリセリルポリグリセリル脂肪酸;モノステアリン酸プロピレングリコールなどのプロピレングリコール脂肪酸エステル;水素化ひまし油誘導体;グリセリンアルキルエーテルが挙げられる。
[0057] 非イオン性界面活性剤油の例としては、POE−モノオレイン酸ソルビタン、POE−モノステアリン酸ソルビタン、POE−モノオレイン酸ソルビタン及びPOE−テトラオレイン酸ソルビタンなどのPOE−ソルビタン脂肪酸エステル;POE−モノラウリン酸ソルビトール、POE−モノオレイン酸ソルビトール、POE−ペンタオレイン酸ソルビトール、POE−モノステアリン酸ソルビトールなどのPOEソルビトール脂肪酸エステル;POE−モノオレイン酸グリセリン、POE−モノステアリン酸グリセリン、POE−モノイソステアリン酸グリセリン及びPOE−トリイソステアリン酸グリセリンなどのPOE−グリセリン脂肪酸エステル;POE−モノオレイン酸、POE−ジステアリン酸、POE−モノジオレイン酸及びエチレンジステアリン酸グリコールなどのPOE−脂肪酸エステル;POE−ラウリルエーテル、POE−オレイルエーテル、POE−ステアリルエーテル、POE−ベヘニルエーテル、POE−2−オクチルドデシルエーテル及びPOE−コレスタノールエーテルなどのPOE−アルキルエーテル;プルロニック型界面活性剤(例えばPluronic);POE−POP−セチルエーテル、POE−POP−2−デシルテトラデシルエーテル、POE−POP−モノブチルエーテル、POE−POP−水素化ラノリン及びPOE−POP−グリセリンエーテルなどのPOE−POP−アルキルエーテルが挙げられる。
[0058] 共界面活性剤の例としては、高級アルコールが挙げられる。なかでも、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、セトステアリルアルコールなどの線状脂肪アルコールが好ましい。セチルアルコールがさらに好ましい。
[0059] ゲル化剤の例としては、非イオン性ポリマー、陽イオンポリマー、さらに陰イオンポリマー及び陰イオン基がある両性ポリマー、例えばアラビアゴム、カラギーナン、カラヤゴム、トラガカントゴム、マルメロの種(マルメロ)、カゼイン、ゼラチン、ペクチン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、ペクチン、フコイダン、ガラクトマンナン、カードラン、ゲランガム、Fucogel(登録商標)(フコースが豊富な多糖)、コラーゲン、ヒアルロン酸ナトリウム、Alcasealan(登録商標)(アルカリゲネスから生成される多糖)、プロピレンアルギン酸グリコール、及びジアルキルジメチルアンモニウム硫酸セルロース)が挙げられる。
[0060] 金属イオン封鎖剤としては、例えば、1−ヒドロキシエタン−1,1−ジフォスホン酸、1−ヒドロキシエタン−1,1−ジフォスホン酸四ナトリウム塩、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸、リン酸、クエン酸、アスコルビン酸、コハク酸、エデト酸、エチレンジアミンヒドロキシエチル三酢酸3ナトリウム等が挙げられる。
[0061] 低級アルコールの例としては、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、イソブチルアルコール、及びt−ブチルアルコールが挙げられる。
[0062] 多価アルコール又はその誘導体としては、例えば、2価のアルコール(例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ペンチレングリコール、トリメチレングリコール、1,2−ブチレングリコール、1,3−ブチレングリコール、テトラメチレングリコール、2,3−ブチレングリコール、ペンタメチレングリコール、2−ブテン−1,4−ジオール、ヘキシレングリコール、オクチレングリコール等);3価のアルコール(例えば、グリセリン、トリメチロールプロパン等);4価アルコール(例えば、1,2,6−ヘキサントリオール等のペンタエリスリトール等);5価アルコール(例えば、キシリトール等);6価アルコール(例えば、ソルビトール、マンニトール等);多価アルコール重合体(例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール等);2価アルコールアルキルエーテル類(例えば、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル等);2価アルコールエーテルエステル(例えば、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート等);グリセリンモノアルキルエーテル(例えば、キミルアルコール、セラキルアルコール、バチルアルコール等);糖アルコール(例えば、ソルビトール、マルチトール、マルトトリオース、マンニトール、ショ糖、エリトリトール、グルコース、フルクトース、デンプン分解糖、マルトース、キシリトース、デンプン分解糖還元アルコール等)等が挙げられる。
[0063] 単糖としては、例えば、三炭糖(例えば、D−グリセリルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン等);四炭糖(例えば、D−エリトロース、D−エリトルロース、D−トレオース、エリスリトール等);五炭糖(例えば、L−アラビノース、D−キシロース、L−リキソース、D−アラビノース、D−リボース、D−リブロース、D−キシルロース、L−キシルロース等);六炭糖(例えば、D−グルコース、D−タロース、D−プシコース、D−ガラクトース、D−フルクトース、L−ガラクトース、L−マンノース、D−タガトース等);七炭糖(例えば、アルドヘプトース、ヘプロース等);八炭糖(例えば、オクツロース等);デオキシ糖(例えば、2−デオキシ−D−リボース、6−デオキシ−L−ガラクトース、6−デオキシ−L−マンノース等);アミノ糖(例えば、D−グルコサミン、D−ガラクトサミン、シアル酸、アミノウロン酸、ムラミン酸等);ウロン酸(例えば、D−グルクロン酸、D−マンヌロン酸、L−グルロン酸、D−ガラクツロン酸、L−イズロン酸等)等が挙げられる。
[0064] オリゴ糖としては、例えば、ショ糖、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ゲンチオビオース、ウンビリシン、ラフィノース、ゲンチアノース、マルトトリオース、メレジトース、プランテオース、ウンベリフェロース、スタキオース、ベルバスコース等が挙げられる。
[0065] アミノ酸としては、例えば、中性アミノ酸(例えば、スレオニン、システイン等);塩基性アミノ酸(例えば、ヒドロキシリジン等)等が挙げられる。また、アミノ酸誘導体として、例えば、アシルサルコシンナトリウム(ラウロイルサルコシンナトリウム)、アシルグルタミン酸塩、アシルβ−アラニンナトリウム、グルタチオン、ピロリドンカルボン酸等が挙げられる。
[0066] 有機アミンとしては、例えば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モルホリン、トリイソプロパノールアミン、2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール等が挙げられる。
[0067] 高分子エマルジョンとしては、例えば、アクリル樹脂エマルジョン、ポリアクリル酸エチルエマルジョン、アクリルレジン液、ポリアクリル酸アルキルエマルジョン、ポリ酢酸ビニル樹脂エマルジョン、天然ゴムラテックス等が挙げられる。
[0068] これらの添加剤はCosmetic, Toiletry and Fragrance Associationが出版した2002年のInternational Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook第9版で言及されており、それを参照することができる。
[0069] 本発明による外用剤用組成物は、ビタミン、抗酸化剤、保湿剤、血流促進剤、抗菌剤、細胞(皮膚)活性剤、皮膚軟化剤、老化防止剤、汚染防止剤、角質溶解剤、収斂剤、抗炎症剤、美白剤、及び日焼け止め剤などの様々な活性剤をさらに含むことができる。
[0070] ビタミン類としては、例えば、ビタミンA、B1、B2、B6、C、Eおよびその誘導体、パントテン酸およびその誘導体、ビオチン等が挙げられる。
[0071] 抗酸化剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、グルコシドアスコルビル、リン酸アスコルビルマグネシウム、リン酸アスコルビルナトリウム、ソルビン酸アスコルビルなどのアスコルビン酸及びその誘導体;酢酸トコフェロール、ソルビン酸トコフェロール、その他のトコフェロールのエステルなどのトコフェロール及びその誘導体;ジブチルヒドロキシトルエン(BHT)及びブチルヒドロキシアニソール(BHA);没食子酸エステル;リン酸;クエン酸;マレイン酸;マロン酸;コハク酸;フマル酸;ケファリン;ヘキサメタリン酸塩;フィチン酸;エチレンジアミンテトラ酢酸:及びアイリッシュモス(Chondrus crispus)、ロディオラ属(Rhodiola)、高度好熱菌、マテ茶葉、オーク材、カユ・ラペ樹皮(kayu rapet bark)、サクラ葉、イランイラン葉(ylang ylang leaves)などの植物エキスが挙げられる。
[0072] 保湿剤としては、例えば、ポリエチレングリコール;プロピレングリコール;ジプロピレングリコール;グリセリン;1,3−ブチレングリコール;キシリトール;ソルビトール;マルチトール;コンドロイチン硫酸などのムコ多糖類;ヒアルロン酸;ヒアルロン酸ナトリウム;ヒアルロン酸アセチルナトリウム;ムコイチン硫酸;カロニン酸;アテロコラーゲン;コレステリル−12−ヒドロキシステアレート;胆汁酸塩;ピロリドンカルボン酸塩及び乳酸塩などのNMF(自然保湿因子)の主成分;尿素、システイン及びセリンなどのアミノ酸類;短鎖可溶性コラーゲン;ジグリセリン(EO)PO付加物;NOFより「Lipidure HM」及び「Lipidure PBM」などの名称で市販されている2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのホモポリマー又はコポリマー;パンテノール;アラントイン;NOFより「Wilbride S 753」の名称で市販されているPEG/PPG/ポリブチレングリコール-8/5/3グリセリン;旭化成ケミカルズ株式会社より「AMINOCOAT」の名称で市販されているトリメチルグリシン;スウィートチェスナット(Castanea sativa)エキス、ヘーゼルナットタンパク質加水分解物、チューベローズ(Polianthes tuberosa)多糖類、アルガンツリー種子油(Argania spinosa kernel oil)、丸善製薬株式会社より「真珠エキス」(登録商標)の名称で市販されているコンキオリン含有真珠エキスなどの各種植物エキスが挙げられる。
[0073] 皮膚軟化剤としては、ポリメタクリル酸グリセリル、メチルグルセス−20(methyl gluceth-20)などが挙げられる。
[0074] 老化防止剤としては、例えば、アシルアミノ酸(具体的には、SEDERMA社より「Maxilip」、「Matrixyl 3000」、「Biopeptide CL」の名称で市販されているもの、SEPPIC社より「Sepilift」の名称で市販されているものなどが挙げられる。);エンドウ(Pisum sativum)エキス;ダイズタンパク質加水分解物;マンヌロン酸メチルシラノール;加水分解ペポカボチャ種子油粕;セネデスムスエキスなどが挙げられる。

[0075] 抗汚染剤としては、例えば、ワサビノキ種子エキス(Moringa pterygosperma seed extracts)(具体的には、LSN社より「Purisoft」の名称で市販されているものが挙げられる。);シアバターエキス(具体的には、SILAB社より「Detoxyl」の名称で市販されているもの、セイヨウキズタエキス(ivy extract)、フィチン酸、ヒマワリ種子エキスのブレンド(例えば、SEDERMA社より「OSMOPUR」の名称で市販されているもの)などが例示される。)などが挙げられる。
[0076] 角質溶解剤としては、例えば、α−ヒドロキシ酸(具体的には、グリコール酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マンデル酸及び酒石酸などが例示される)、β−ヒドロキシ酸(具体的には、サリチル酸などが例示される)、それらのエステル(具体的には、乳酸C12−13アルキル)及びこれらのヒドロキシ酸を含む植物エキス(具体的には、ロゼリソウ(Hibiscus sabdriffa)エキスなどが例示される)などが挙げられる。
[0077] 収斂剤の例としては、ハマメリス抽出物などが挙げられる。
[0078] 抗炎症剤としては、例えば、ビサボロール、アラントイン、トラネキサム酸、酸化亜鉛、硫黄酸化物及びその誘導体、コンドロイチン硫酸塩、グリチルリチン酸及びその誘導体(グリチルリチン酸塩など)などが挙げられる。
[0079] また、本発明の外用剤用組成物は、メラニン生成メカニズム(ステージI)に関与するメラニン細胞特異的糖タンパク質であるPmel17などの構造タンパク質の合成を阻害するために、ホワイトニング剤を少なくとも1種含んでいてもよい。ホワイトニング剤としては、BASF社より「Cytovector」(商標)の名称で市販されているフェルラ酸含有サイトベクター(水、グリコール、レシチン、フェルラ酸、ヒドロキシエチルセルロース)などが挙げられる。
[0080] さらに、必要に応じて、本発明による外用剤用組成物は、特許出願第WO2009/010356号に記載されているように、少なくとも1つのペプチドを含むことができる。
[0081] さらに、必要に応じて、本発明による外用剤用組成物は、メラニン合成への抑制効果及び/又は小眼球関連転写因子(MITF)発現への抑制効果及び/又は抗チロシナーゼ活性及び/又はエンドセリン−1合成への抑制効果を有する美白剤を含むことができる。このような美白剤の例としては、Licorice抽出物(商標)という商品名でMaruzen Pharmaceuticalsから市販されている甘草エキスを挙げることができる。
[0082] さらに、必要に応じて、本発明による外用剤用組成物は、ビタミンC化合物などの抗酸化作用をも有するホワイトニング剤を含んでいてもよい。例えば、アスコルビン酸塩、脂肪酸又はソルビン酸のアスコルビルエステル、その他のアスコルビン酸誘導体などが挙げられる。具体的には、リン酸アスコルビル塩(リン酸アスコルビルマグネシウム、リン酸アスコルビルナトリウムなど)、アスコルビン酸のサッカリドエステル(アスコルビル−2−グルコシド、2−O−α−D−グルコピラノシル L−アスコルビン酸、6−O−β−D−ガラクトピラノシル L−アスコルビン酸など)が例示される。このタイプの活性成分は、DKSH社より「Ascorbyl glucoside」(商標)の名称で市販されている。
[0083] さらに、本発明の水中油型乳化組成物は、他のホワイントニング剤を含んでいてもよい。例えば、植物エキス(房咲水仙などのエキス)、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、システイン、4−チオレゾルシン、レゾルシノールもしくはルシノール又はそれらの誘導体、グリチルリチン酸及びヒドロキノン−β−グルコシドなどの色素沈着抑制剤を含んでいてもよい。
[0084] さらに、必要に応じて、本発明による外用剤用組成物は、有機及び/又は無機日焼け止め剤を含んでいてもよい。
[0085] 有機日焼け止め剤の例としては、ジベンゾイルメタン誘導体(例えば、ブチルメトキシジベンゾイルメタン(HOFFMANN LA ROCHEからParsol 1789という商品名で市販されている製品)など);桂皮酸誘導体(例えばエチルヘキシルメトキシ桂皮酸エステル(HOFFMANN LA ROCHEからParsol MCXという商品名で市販されている製品)、サリチル酸塩、パラアミノ安息香酸など);β−β’−ジフェニルアクリル酸誘導体;ベンゾフェノン誘導体;ベンジリデンショウノウ誘導体(テレフタリリデン−ジショウノウスルホン酸;フェニルベンズイミダゾール誘導体;トリアジン誘導体;フェニルベンゾトリアゾール誘導体;アントラニル酸誘導体などが挙げられ、いずれもコーティング又はカプセル化されていてもよい。
[0086] 無機日焼け止め剤の例としては、例えば酸化チタン、酸化鉄、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム又は酸化セリウムナノ顔料のようなコーティングした、又はコーティングしていない金属酸化物から形成したナノ顔料を挙げることができ、これはすべてそれ自体がよく知られているUV光防護剤である。
[0087] 本発明の外用剤用組成物の剤形形態は任意に選択可能であり、溶液型、エマルジョン型、及びゲル型のいずれかを採用することができる。これは外用剤用組成物に導入され、任意のタイプの液体又は半液体又は固体組成物とすることができ、溶液、エマルジョン、ゲルを含むが、任意選択で自身中に水及び/又は油相を含む粉末でもよい。
[0088] さらに外用剤用のこれらの組成物の製品形態も任意に選択可能であり、組成物は、顔用クレンザ、フェースローション、エッセンス液、乳液、クリーム及びパックなどの顔用化粧品;ファンデーション、口紅及びアイシャドーなどのメーキャップ用化粧品;身体用メーキャップ製品;ヘアケア化粧品;口腔ケアの洗面用化粧品;香水類;洗浄剤;及び軟膏に適用可能である。
(医薬組成物)
[0089] 本発明のスクリーニング法により選択されるモータリン及び/又はHsp60の発現レベルを低下させる化合物は、しみ、ケロイド、又は色素沈着過度など、過剰なメラニンによって引き起こされる疾患又は症状の治療に使用する医薬組成物に使用することができる。
本発明のスクリーニング法により選択されるモータリン及び/又はHsp60の発現レベルを上昇させる化合物は、癌の治療又は予防に、又は皮膚癌の分化に使用する医薬組成物に使用することができる。
上記医薬組成物は、標的細胞のミトコンドリア機能及び/又は酸化ストレスに作用することができる。
[0090] 本発明の医薬組成物は、任意の既知の方法により製剤化することができる。製剤の例としては、顆粒、細顆粒剤、粉末薬剤、錠剤、カプセル型製剤、液体薬剤、シロップ剤、咀嚼型製剤、トローチ剤、舌下製剤などの経口剤;軟膏、ゲル、クリーム、パッチなどの局所製品;注射用製剤;吸入薬;点眼液;座剤を挙げることができる。
各製剤における選択された化合物の量は、当業者が適宜決定することができる。
[0091] 本発明は、(i)モータリン及び/又はHsp60遺伝子を含む発現ベクター、又は(ii)モータリンタンパク質及び/又はHsp60タンパク質を含む医薬組成物も提供する。
このような医薬組成物は、患者の体内のモータリン及び/又はHsp60を直接増加させ、メラニン生成又は色素沈着を誘導することができる。したがって、医薬組成物は、UVに誘導される皮膚の損傷又は皮膚癌の予防薬として、又は皮膚癌の分化剤として使用することができる。
この医薬組成物は、上記方法によって調製してもよい。
(培養皮膚の色の操作方法)
[0092] 本発明は培養皮膚細胞のメラニン生成又は色素沈着を操作する方法も提供し、これは、幹細胞をin vitroで皮膚細胞に分化させる工程と、培養皮膚細胞中のモータリン及び/又はHsp60の量を調節する工程とを含む。
この方法により、iPS細胞又はES細胞などの幹細胞を分化させることによって培養皮膚を生成する場合に、例えば培養皮膚を移植する患者の皮膚の色にあわせて、培養皮膚の色を操作することができる。
[0093] モータリン及び/又はHsp60の量の調節は、例えば本発明のスクリーニング法により選択される化合物を幹細胞の培地に添加することによって行うことができる。モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを上昇させる化合物を培地に添加すると、培養皮膚の色を褐色又は黒の方向に変化させることができる。他方で、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを低下させる化合物を培地に添加すると、培養皮膚の色を白の方向に変化させることができる。
モータリン及び/又はHsp60の量の調節は、モータリン及び/又はHsp60を培地に直接添加することによって、又はモータリン及び/又はHsp60遺伝子を含む発現ベクターで幹細胞を形質転換させることによって実行することができる。
実施例
[0094] 以降で本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はそれに限定されないことに留意されたい。
以下の実施例に使用される方法について、次に説明する。
材料及び方法
細胞培養、処理及びトランスフェクション
ヒトメラノーマG361は、日本の東北大学生物医学的研究用細胞資源センターから購入し、加湿したインキュベータ(36℃、5%CO2)内で10%のウシ胎児血清を添加したDMEM-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Invitrogen)中で培養した。明るい肌及び暗い肌のドナー由来のヒト初代メラノサイトは、ScienCell Research Laboratoriesから購入し、推奨されたメラノサイト増殖培地で培養した。細胞は、推奨されたプロトコルに従い、Fugene (Roche)を使用して、モータリン又はHSP60タンパク質をコードする発現プラスミドで形質転換した。通常、70〜80%コンフルエントの6cmの培養皿に、3〜5μgのプラスミドDNAを使用した。細胞はプラスミドで48時間インキュベートし、その後に細胞を回収して、下記のようなプロトコルによって発現を示す遺伝子を調べた。shRNAトランスフェクションについては、Oligofectamine(商標) Transfection Reagent (Life technologies(商標))を製造業者の指示に従って使用した。トランスフェクトした細胞を、ピューロマイシン(1μg/ml)を添加した培地で24〜48時間インキュベートし、次に下記のようなアッセイのために処理した。
薬剤処理
細胞は、ジアシルグリセロール(OAG、20μg/ml)、3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX−100μM)(Merck Millipore)、PD98059(20μg/ml)(Life Technologies)及び過酸化水素(150〜300μM)などの色素誘導物質で48時間処理した。
ビタミンC処理
細胞はジアシルグリセロール(OAG、20μg/ml)で24時間処理し、その後に下記のような通常の培地又はビタミンC(0.1〜0.3mM)で24〜48時間回収した。
TXC処理
細胞はTXCで以下のように処理した。
G361細胞を一晩培養し、表面に十分付着させて、その後に下記のようにTXC添加培地又はOAGで処理し、その後に図に示した用量のTXC培地内で回収した。
Hsp60及びモータリンのノックダウン
−モータリンshRNAベクターの構築
モータリンを標的とするshRNAを発現するプラスミドを、既報(Miyagishi他(2004)J Gene Med, 6: 715-723及びYoo他、(2010)J. Gene Medicine 12, 586-595)にしたがって、U6プロモータベクターで生成した。モータリンについて使用した3つの標的サイトは#007-GCAACAAGCTGAAAGAAGA(配列番号:1)、#008-GCCAGAAGGACAACATATG(配列番号:2)及び#009-GAATGAGGCTAGACCTTTA(配列番号:3)であった。通常、モータリン標的shRNAを生成するために、センスオリゴヌクレオチド5' -gatcccGCAACAAGCTGAAAGAAGAttcaagagaTCTTCTTTCAGCTTGTTGCttttttggaaa-3'(配列番号:4)及びそれとコグネートのアンチセンスオリゴヌクレオチド5'-agcttttccaaaaaaGCAACAAGCTGAAAGAAGAttcaagagaTCTTCTTTCAGCTTGTTGCgg-3'(配列番号:5)をアニールすることによって、ヒトモータリンを標的とするshRNAを発現するDNA断片を生成した。19−ヌクレオチドのモータリン標的配列は大文字で表示され、9−ヌクレオチドヘアピン及び指向性クローニングに必要な配列は小文字で示されている。
−HSP60 shRNAベクターの構築
HSP60を標的とするshRNAを発現するベクターを上述したように生成した。使用した2つの標的サイトは-5' GTGAGATGAGGAGCCAGTACC 3'(配列番号:6)及び5' TTCAAGCATTAAGGCTCGGGC 3'(配列番号:7)であった。
−HSP60及びモータリン過剰発現ベクター
Hsp60及びモータリンを過剰発現させるために、レトロウィルス発現システムを使用した。既報(Wadhwa他、2006 International J Cancer, 118: 2973-2980)にしたがって、完全長のHSP60又はモータリンタンパク質をコードするcDNAをベクターのBamHIサイト内にクローニングした。レトロウィルスを産生するために、Plat−E、すなわちエコトロピック・マウス白血病ウィルス(MuLV)パッケージング細胞株に、pVPack-GP(gal及びpolを発現する)及びpVPack VSVG(envを発現する)ベクター(カリフォルニア州Stratagene)と、pCXneoレトロウィルスベクター又はpCX4neo/モータリンをFuGENE6(Boehringer Mannheim)を使用してトランスフェクトした。48時間後に培養上清を採取し、0.45μmのフィルタで濾過して、感染用のウィルス株として使用した。MCF7細胞(6ウェルディッシュで2×105/ウェル)を8μg/mlのポリブレンで1時間、37℃で処理し、その後に200μlの濾過したウィルスストックを1時間、細胞に感染させた。プレートは15分おきに傾けて、ウィルス粒子を細胞全体に広げた。1時間後、2mlのDMEMを培養物に加えて、ウィルスストックを希釈し、次にプレートを37℃でさらに48時間インキュベートした。安定した発現細胞株が得られるまで、G418(1mg/ml)を含む培地内で細胞を選別した。
チロシナーゼELISA
細胞(約10000個/ウェル)を96ウェルのNunc-Immuno maxisorpプレートで培養した。約70%コンフルエントで、上述のように細胞にshRNAプラスミド(100ng/ウェル)をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、ピューロマイシン添加培地内で細胞を選別し、次に下記のようにチロシナーゼELISAのために処理した。細胞をPBSで2回洗浄し、RIPA溶解緩衝液(Santa Cruz Biotehnology)中に溶解させた。溶解物中のタンパク質濃度を測定し(Pierce BCA Protein Assayキット、Thermo Scientific)、コーティング緩衝液(0.1Mの重炭酸ナトリウム、0.02%のアジ化ナトリウム、pH9.6)中でサンプルを1μg/μlの濃度まで希釈した。コーティング緩衝液で100μlの最終ボリュームとして5μgのタンパク質サンプルを各ウェルに加えた。プレートを10分間優しく振盪し、次にしっかり密封して室温で2時間放置した。溶液を廃棄し、プレートを洗浄緩衝液(PBS0.5%のTween 20)で5分間洗浄した。ブロッキング緩衝液(200μl)を各ウェルに加え、プレートを室温で2時間インキュベートし、その後に洗浄緩衝液で2回(毎回3分間)洗浄した。抗チロシナーゼ抗体(50μl、ブロッキング緩衝液中に5μg/ml)を各ウェルに加え、プレートを密封して1〜2時間室温に維持し、その後に洗浄緩衝液で洗浄した(3×10分間)。プレートを2次抗体(アルカリホスファターゼ、APヤギ抗ラビットIgG)で1時間インキュベートし、その後に洗浄緩衝液で3〜5回洗浄した。100μlのAP(−ニトロフェニルホスフェート、Disodium Salt、PNPP)用基質を各ウェルに加えた。プレートを再び密封して30分間放置し、その後にチロシナーゼ発現の定量的評価を表す405nmの吸光度を測定した。
メラニン含有量
細胞を96ウェルプレートで培養し、プレートの表面に24時間付着させ、その後に上述のとおり図の説明文で示したようにトランスフェクション及び処理をした。細胞をPBSで洗浄した。各々に水酸化カリウム(KOH−0.85N、100μl)を加えた。プレートを暗所で一晩優しく振盪した。色素の吸光度を405nmで測定した。標準的な精製メラニン(シグマ)を使用して、メラニン含有量を計算した。
免疫染色
細胞を、12ウェル培養ディッシュに配置したカバーガラス上で培養し、処理した。上述の処理の最後に、カバーガラスを冷リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、細胞を予め冷却したメタノール:アセトン(1:1v/v)混合物で5〜10分間固定した。固定した細胞をPBSで洗浄し、PBS中の0.2%のトリトンX−100で10分間透過性処理して、PBS中び2%ウシ血清アルブミン(BSA)で20分間ブロッキングした。細胞を、抗モータリン、抗HSP60、抗チロシナーゼ、及び抗メラノソーム抗体で染色した。Alexa-488又はAlexa-594結合抗体(Molecular probes)で2次染色することにより、免疫染色を視覚化した。PBS中の0.2%トリトンX−100(PBST)で3回から4回洗浄した後、細胞にFluoromount(Difco)を重ねた。落射蛍光のカールツァイス顕微鏡で細胞を検査した。
ウェスタンブロッティング
細胞を6ウェルプレートで増殖させ、処理した。上述したトランスフェクション又は薬剤処理の後、細胞をRIPA溶解緩衝液で溶解させた。細胞溶解物(30μg)をSDS−PAGE上で分離し、その後に半乾燥トランスファブロッタを使用してニトロセルロース膜(Millipore)上に転写した。イムノアッセイは抗モータリン、抗HSP70及び抗チロシナーゼ抗体で行った。形成された免疫複合体は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗ラビット/マウス免疫グロブリンGで視覚化した。LAS 3000 mini(富士フイルム)でバンドを検出した。
結果
メラニン生成に関与する遺伝子をスクリーニングするアッセイの確立
図1は、コントロール及び明るい肌のドナー由来のOAG処理した初代メラノサイト(A)及びヒトメラノーマ細胞G361(B)におけるメラノソーム誘導の免疫組織化学的分析の結果を示す。細胞を検出するために核染色法としてPI染色法を使用した。明るい肌のドナー由来の初代メラノサイト及びヒトメラノーマ細胞G361の両方で、OAGによりメラノソーム産生が誘導された。
図2は、メラニン含有量の計算結果を示す。OAG処理した細胞で、メラニン含有量の増加が観察された。ビタミンC(脱色素のための陽性コントロール)での処理は、OAGで誘導されるメラニンの含有量低下を引き起こした。
図3は、チロシナーゼのウェスタンブロッティング(A)及びチロシナーゼELISAアッセイ(B)の結果を示す。OAG処理したG361細胞では、チロシナーゼの発現及び活性の増大が観察された。ビタミンC処理は、OAGで誘導されるチロシナーゼの減少を引き起こした。
これらの結果は、この実験システムが本発明の効果を適切に示すことを裏付けた。shRNAスクリーニングの結果、モータリン及びHsp60遺伝子を選択し、メラニン生成におけるその役割の検証に用いた。
選択した遺伝子のメラニン生成におけるその役割の検証
図4は、OAGでメラニン生成を誘導した際のメラノソーム及びHsp60の免疫染色の結果を示す。OAGによるメラニン生成の誘導の結果、Hsp60が上方制御された。
図5は、OAGでメラニン生成を誘導した際のメラノソーム及びモータリンの免疫染色の結果を示す。OAGによるメラニン生成の誘導の結果、モータリンが上方制御された。
図6は、OAGで処理したG361細胞におけるHsp60又はモータリンのノックダウンの際のメラニン含有量を示す。Hsp60又はモータリンのノックダウンにより、G361細胞中のメラニンがOAGで誘導される量が減少した。
図7は、OAGで処理したG361細胞中でHsp60又はモータリンのノックダウンの際のチロシナーゼ活性を示す。Hsp60及びモータリンのノックダウンにより、G361細胞中のチロシナーゼ活性のOAG誘導による増加が減少した。
図8は、G361細胞においてモータリンを過剰発現させたときのメラニン含有量を示す。モータリンが過剰発現した結果、内因性のメラニン含有量が増加した。
図9は、G361細胞においてモータリンを過剰発現させたときのメラノソーム染色を示す。モータリンが過剰発現した結果、内因性のメラノソームが増加した。
図10は、G361細胞においてモータリンを過剰発現させたときのチロシナーゼ活性を示す。モータリンが過剰発現した結果、チロシナーゼ活性が増加した。
以上の結果は、Hsp60及びモータリンの細胞内含有量が、チロシナーゼ活性及びメラニン産生とメラノソーム産生と正に相関することを示す。したがって、Hsp60及びモータリンをメラニン生成の指標として使用できることが確認される。
本発明のスクリーニング法の有用性の検証
図11は、様々な濃度でTXC処理した後の、OAG処理又はOAG未処理のG361細胞内のメラニン含有量を示す。TXC処理は、内因性のメラニン及び細胞内でOAGに誘導されたメラニンの減少を引き起こした。
図12は、様々な濃度でTXC処理した後の、OAG処理又はOAG未処理のG361細胞のチロシナーゼ活性を示す。TXC処理は、細胞内でOAGに誘導されたチロシナーゼ活性の減少を引き起こした。
図13は、TXC処理したG361細胞のチロシナーゼ及びHsp60の発現、及びTXC処理したG361細胞のOAGに誘導されたモータリンの発現を示す。TXC処理は、G361細胞におけるチロシナーゼ及びHsp60の内因性発現、及びモータリンの内因性及びOAG誘導性発現を引き起こした。
以上の結果は、チロシナーゼ、モータリン及びHsp60の発現を減少させるTXC処理が、G361細胞内の内因性又はOAG誘導性のメラニンの減少を誘導することを示す。これらの結果に基づき、本発明のスクリーニング法によって選択される化合物は、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを低下させるので、TXCと同様に、脱色素、美白又はメラニン生成の抑制に有用であることが理解される。

Claims (13)

  1. メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
    被験化合物と、モータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞とを、in vitroで接触させる工程と、
    前記被験化合物から、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程と
    を含む方法。
  2. 脱色素、美白、又はメラニン生成の抑制のための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
    被験化合物と、モータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞とを接触させる工程と、
    前記被験化合物から、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを減少させる化合物を選択する工程と
    を含む方法。
  3. メラニン生成又は色素沈着を誘導するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
    被験化合物と、モータリン及び/又はHsp60を発現可能な細胞とを接触させる工程と、
    前記被験化合物から、モータリン及び/又はHsp60の発現レベルを増加させる化合物を選択する工程と
    を含む方法。
  4. 前記被験化合物と細胞とを接触させる工程の前に、メラニン生成及び/又は色素沈着を誘導する工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
  5. モータリン及び/又はHsp60の発現レベルは、ELISAによって決定される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
  6. モータリン及び/又はHsp60を発現可能な前記細胞は、ヒトメラノーマ細胞又はメラノサイトを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
  7. 色素沈着又はメラニン生成を誘導するための医薬組成物であって、(i)Hsp60遺伝子及び/又はモータリン遺伝子を含む発現ベクター、又は(ii)Hsp60タンパク質及び/又はモータリンタンパク質を含む、医薬組成物。
  8. 前記組成物は、皮膚の障害を治療するために使用される、請求項7に記載の医薬組成物。
  9. 前記皮膚の障害は、癌、色素沈着過度、発疹及びケロイドからなる群から選択される、請求項8に記載の医薬組成物。
  10. モータリン、HSP60、及びミトコンドリア中の他のタンパク質に基づいてミトコンドリア機能を操作する工程を含む、色素沈着又はメラニン生成に介入する方法。
  11. モータリン、HSP60、及びミトコンドリア中の他のタンパク質に関与する細胞の酸化ストレス反応を操作する工程を含む、色素沈着又はメラニン生成に介入する方法。
  12. 皮膚の美白のために、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法により得られる、モータリン及びHsp60から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現抑制剤の化粧品への使用。
  13. 培養皮膚細胞のメラニン生成又は色素沈着を操作する方法であって、
    幹細胞を皮膚細胞にin vitroで分化させる工程と、
    前記培養皮膚細胞中のモータリン及び/又はHsp60の量を調節する工程と
    を含む方法。
JP2013095829A 2013-04-30 2013-04-30 メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物のスクリーニング方法 Active JP6172740B2 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013095829A JP6172740B2 (ja) 2013-04-30 2013-04-30 メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物のスクリーニング方法
US14/786,475 US10520492B2 (en) 2013-04-30 2014-04-29 Method of screening for candidate compounds for regulating melanogenesis or pigmentation
PCT/EP2014/058697 WO2014177550A1 (en) 2013-04-30 2014-04-29 Method of screening for candidate compounds for regulating melanogenesis or pigmentation
EP14723389.4A EP2992328B1 (en) 2013-04-30 2014-04-29 Method of screening for candidate compounds for regulating melanogenesis or pigmentation

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013095829A JP6172740B2 (ja) 2013-04-30 2013-04-30 メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物のスクリーニング方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2014215286A true JP2014215286A (ja) 2014-11-17
JP6172740B2 JP6172740B2 (ja) 2017-08-02

Family

ID=50693649

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013095829A Active JP6172740B2 (ja) 2013-04-30 2013-04-30 メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物のスクリーニング方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10520492B2 (ja)
EP (1) EP2992328B1 (ja)
JP (1) JP6172740B2 (ja)
WO (1) WO2014177550A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020213743A1 (ja) * 2019-04-19 2020-10-22 株式会社 資生堂 光老化及び/又は真皮色素沈着を予防及び/又は改善するための方法,装置,および抗光老化及び/又は真皮色素沈着抑制剤,抗光老化及び/又は真皮色素沈着抑制剤のスクリーニング方法,抗光老化及び/又は真皮色素沈着抑制美容処置の評価方法,並びに光老化及び/又は真皮色素沈着度の評価方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108919605B (zh) * 2018-07-27 2021-12-21 京东方科技集团股份有限公司 光阻组合物、像素界定层、其制备方法及应用
CN114703066B (zh) * 2022-04-29 2023-01-17 山东大学 一种栅藻、其活性成分的提取方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004091473A (ja) * 2002-07-12 2004-03-25 Tadayasu Takada 色素沈着改善治療薬
JP2008019252A (ja) * 2006-06-15 2008-01-31 Takeda Chem Ind Ltd 色素沈着症の予防または治療用医薬組成物
JP2008232693A (ja) * 2007-03-19 2008-10-02 Kose Corp 美白成分のスクリーニング方法
JP2010083804A (ja) * 2008-09-30 2010-04-15 Saishunkan Seiyakusho:Kk 美白化粧料
JP2011190200A (ja) * 2010-03-12 2011-09-29 Saishunkan Seiyakusho:Kk 熱ショックタンパク質の発現誘導剤

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020034772A1 (en) 1999-06-29 2002-03-21 Orlow Seth J. Methods and compositions that affect melanogenesis

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004091473A (ja) * 2002-07-12 2004-03-25 Tadayasu Takada 色素沈着改善治療薬
JP2008019252A (ja) * 2006-06-15 2008-01-31 Takeda Chem Ind Ltd 色素沈着症の予防または治療用医薬組成物
JP2008232693A (ja) * 2007-03-19 2008-10-02 Kose Corp 美白成分のスクリーニング方法
JP2010083804A (ja) * 2008-09-30 2010-04-15 Saishunkan Seiyakusho:Kk 美白化粧料
JP2011190200A (ja) * 2010-03-12 2011-09-29 Saishunkan Seiyakusho:Kk 熱ショックタンパク質の発現誘導剤

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARTA F ET AL: "Analysis of candidate genes through a proteomics-based approach in primary cell lines from malignant", MELANOMA RESEARCH, vol. 15, no. 4, JPN6016043061, pages 235 - 244, XP008096548, ISSN: 0003572545, DOI: 10.1097/00008390-200508000-00002 *
FRANCESCO CAPPELLO ET AL.: "Hsp60 expression, new locations, functions, and perspectives for cancer diagnosis and therapy", CANCER BIOLOGY & THERAPY, vol. 7, no. 6, JPN6016043060, 1 June 2008 (2008-06-01), pages 801 - 809, XP055132679, ISSN: 0003572544, DOI: 10.4161/cbt.7.6.6281 *
JI H. LEE ET AL.: "1,25-Dihydroxyvitamin D3 enhances NK susceptibility of human melanoma cells via Hsp60-mediated FAS e", EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. Vol.41,No.10,, JPN6016043062, 6 October 2011 (2011-10-06), pages 2937 - 2946, ISSN: 0003572546 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020213743A1 (ja) * 2019-04-19 2020-10-22 株式会社 資生堂 光老化及び/又は真皮色素沈着を予防及び/又は改善するための方法,装置,および抗光老化及び/又は真皮色素沈着抑制剤,抗光老化及び/又は真皮色素沈着抑制剤のスクリーニング方法,抗光老化及び/又は真皮色素沈着抑制美容処置の評価方法,並びに光老化及び/又は真皮色素沈着度の評価方法
JPWO2020213743A1 (ja) * 2019-04-19 2020-10-22
JP7439059B2 (ja) 2019-04-19 2024-02-27 株式会社 資生堂 光老化及び/又は真皮色素沈着を予防及び/又は改善するための方法,装置,および抗光老化及び/又は真皮色素沈着抑制剤,抗光老化及び/又は真皮色素沈着抑制剤のスクリーニング方法,抗光老化及び/又は真皮色素沈着抑制美容処置の評価方法,並びに光老化及び/又は真皮色素沈着度の評価方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2992328B1 (en) 2017-01-11
US10520492B2 (en) 2019-12-31
US20160153968A1 (en) 2016-06-02
JP6172740B2 (ja) 2017-08-02
WO2014177550A1 (en) 2014-11-06
EP2992328A1 (en) 2016-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5324781B2 (ja) Pth断片含有化粧品
CN109998938B (zh) 一种用于美白亮肤淡斑的多肽组合物
JP4167063B2 (ja) 植物アルガニア・スピノーザの葉抽出物を含有する化粧品および/または皮膚薬調製物
KR100978545B1 (ko) 박하 추출물의 화장 용도
JP2018516261A (ja) パープル・コーンフラワー搾汁液を含む化粧品組成物
BRPI0721862B1 (pt) preparação compreendendo sais solúveis estáveis de ácido fenilbenzimidazol sulfônico, e uso de aminoácidos básicos
KR100866302B1 (ko) 식물 아르가니아 스피노사의 추출물로부터의 천연단백질을 함유하는 화장용 및/또는 피부약학용 제제
JP4846968B2 (ja) 植物ライチ・チネンシス・ソンの抽出物の使用
JP2009522336A (ja) フェノール化合物とベンゾフェノンを含む安定化製剤
WO2007077260A1 (en) Formulations of low oil content comprising diphenylmethane derivatives
JP2003524650A (ja) 植物抽出物を含有する化粧品製剤
KR20130067249A (ko) 올리고펩티드를 함유하는 화장 조성물
JP6172740B2 (ja) メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物のスクリーニング方法
US9668960B2 (en) Methods useful in studying or modulating skin or hair pigmentation, plant extracts for use in compositions and cosmetic care method
JP2003531844A (ja) 植物Arganiaspinosaの抽出物を含有する化粧品製剤および/または医薬製剤
ES2622114T3 (es) Sustancia para restablecer una coexpresión y una interacción normales entre las proteínas LOX y NRAGE
FR3076722A1 (fr) Association synergique de tétrapeptides
JP2018518496A (ja) ポリアルキレングリコール誘導体を含む医薬組成物
JP2007530476A (ja) ブクホルジア属に属する植物の抽出物の化粧品および医薬品における使用
JP7053466B2 (ja) Uv日焼け止め因子およびカルノシンを有するエマルジョン
EP2260831A1 (en) Plant extracts modulating Myo-X for use in compositions
JP2003535882A (ja) 植物ピスチア・ストラチオテスの抽出物を含有する調製物
EP1570838A1 (en) Dendrite elongation inhibitor for melanocyte and skin preparation for external use containing the same
JP2005247732A (ja) 皮膚外用剤
KR20230144615A (ko) 신규한 lrat 억제제

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20151224

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20151224

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20160205

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20161031

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20161108

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20161216

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170301

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170331

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170428

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20170606

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20170629

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6172740

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250