JP4819727B2

JP4819727B2 - 美白成分のスクリーニング方法

Info

Publication number: JP4819727B2
Application number: JP2007069983A
Authority: JP
Inventors: 正大森山; 真希荒川; 修坂田; 英次成; 靜香上原; 昭伸林
Original assignee: Kose Corp
Current assignee: Kose Corp
Priority date: 2007-03-19
Filing date: 2007-03-19
Publication date: 2011-11-24
Anticipated expiration: 2027-03-19
Also published as: JP2008232693A

Description

本発明は、皮膚に作用させる美白成分のスクリーニング方法に関するものであり、メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質量を指標とする美白成分のスクリーニング方法に関するものである。

しみが発生するメカニズムは、紫外線やサイトカイン等の活性化因子の刺激により、メラノサイト内で、メラニン合成が増加することから開始される。そして、合成されるメラニンはメラノソームと呼ばれる顆粒内に蓄積される。その後、メラニン生合成を十分に行い成熟したメラノソームは、メラノサイトの樹枝状突起の先端まで運ばれ、そこから周囲のケラチノサイト（表皮細胞）へ受け渡される。そして、表皮全体の細胞にメラニン顆粒が行き渡って初めて、しみとして現れる。

前記したような、しみの発生を抑制するために、アスコルビン酸、アルブチン、エラグ酸等の各種美白成分が開発されている。しかしながら、これら美白成分は、チロシナーゼ活性阻害効果やメラノサイト活性化因子の結合阻害効果等の主にメラニンを合成する過程に着目したものばかりであった。（例えば、特許文献１参照）
特開２００２−１７９５１６号公報

しかしながら、しみの発生メカニズムは、メラニン合成過程以外にも、合成されたメラニンがケラチノサイトに受け渡される過程等があり、これらの過程をターゲットにした美白効果については、あまり検討られていなかった。

このため、メラニン合成過程以外のしみ発生メカニズムである、合成されたメラニンがケラチノサイトに受け渡される過程を解明し、このメカニズムに起因する美白成分のスクリーニング方法効果の開発が求められていた。

上記実情に鑑み、本発明者らは鋭意検討した結果、メラニン産生抑制効果のある成分のチロシナーゼ活性を調べた結果、両者に相関が得られないことに着目し、メラニンの合成過程以外のメカニズムについて、更に研究した結果、メラノソーム構造蛋白質量とメラニン産生抑制効果とに相関があることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質量を指標とすることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法を提供するものである。

また、メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質の産生抑制効果を指標とすることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法を提供するものである。

更には、メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質量を指標とし、メラニンのケラチノサイトへの受け渡しを阻害することを特徴とする美白成分のスクリーニング方法を提供するものである。

そして、メラノソーム構造蛋白質がｇｐ１００であることを特徴とする前記何れかのスクリーニング方法を提供するものである。

本発明によれば、メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質量を指標とすることにより、化粧料や皮膚外用剤等に用いる美白成分の評価、スクリーニングが可能となる。

本発明において、指標となるメラノソーム構造蛋白質とは、メラノソーム内に特異的に存在しメラニンの生合成に関与する蛋白群のことである。これら蛋白群には、酵素と構造蛋白とがあり、酵素としては、チロシナーゼ、ジヒドロキシインドールカルボン酸オキシダーゼ、ドーパクロム・トウトメラーゼ等のチロシナーゼ遺伝子ファミリーと酵素活性は有しないが、メラノソーム構造蛋白としてメラノサイトに特異的に存在しているものがある。本発明では、メラノソーム構造蛋白質とは、前記した酵素を除く、酵素活性は有しないが、メラノソーム構造蛋白としてメラノサイトに特異的に存在しているもののことをいう。

具体的には、メラノサイトに特異的に存在しているｇｐ１００（マウスではＰｍｅｌ１７／ｓｉｌｖｅｒｌｏｃｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｐ蛋白（マウスではＰ蛋白／Ｐｉｎｋ−ｅｙｅｄｄｉｌｕｔｉｏｎｌｏｕｃｕｓｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＡＲＴ１（ｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙＴｃｅｌｌｓ１）等が挙げられるが、これらの中でもｇｐ１００が好ましい。

前記ｇｐ１００は、ヒトメラノーマの特殊染色の際に用いられる抗体ＨＭＢ４５、ＨＭＢ５０、ＮＫＩ／ｂｅｔｅｂ、ＭＥ２０が認識する糖蛋白である。

本発明のスクリーニング方法は、メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質量を指標とするものであり、メラノソーム構造蛋白質を測定する必要がある。この測定に用いられる方法は、特に限定されず、何れの方法を用いることができる。具体的には、ヒトメラノサイトを培養し、培養した細胞を超音波等により破砕し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等を用いて電気泳動により、蛋白を分画し、ゲル上の蛋白をニトロセルロース膜に転写し、ウエスタンブロッティング法により、蛋白を検出する。これに一次抗体としてモノクロナール抗体、二次抗体として抗マウスペルオキシダーゼ標識ＩｇＧを用いて、ケミルミネッセンス法により検出したバンドをデシメトリーで読み込み、面積を測定して生成量する方法等が挙げられる。

なお、上記において使用する抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であっても良く、これらの組み合わせであっても良い。またこれらの抗体は、いずれも公知であるか成書に記載の周知な方法により、目的とするメラノサイト蛋白質から容易に得ることができるものである。また、抗体に対する蛍光標識等も周知な方法により容易に実施可能である。

本発明のスクリーニング方法に用いられる美白成分としては、化粧料、皮膚外用剤等に用いられる薬剤であれば、何れのものでも良い。

本発明の方法によりスクリーニングされた美白成分は、化粧料、皮膚外用剤等に配合することことができ、美白用の化粧料、美白用の皮膚外用剤等を調製することができる。

以下、実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。

試験例１：メラノサイトのメラニン産生抑制
＜手順＞
１．正常ヒトメラノサイト（ＮＨＥＭ：クラボウ社）を直径１０ｃｍのシャーレに
３０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２播種する。
２．前記播種した細胞を５日間培養し、スクリーニング対象の薬剤を２日目及び４
日目に添加する。
３．培養５日後に培地を取り除き、ＰＢＳ（−）で洗浄後、トリプシンによって細
胞を剥離させる。
４．遠心によって細胞を回収し、細胞数をカウントして各試料における細胞数を一
定にし、５％トリクロロ酢酸５ｍＬにて懸濁し、冷却遠心を行う。
５．上清を取り除き、ペレットにジエチルエーテルとエタノールの重量比が３：１
の溶液５ｍＬ添加する。
６．冷却遠心を行い、この上清を取り除きペレットを風乾させる。
７．次に標準として１００μｇ／ｍＬの合成メラニン（Ｓｉｇｍａ社）を１ＮのＫ
ＯＨを用いて溶解させ１、１０、２０、５０μｇ／ｍＬの希釈系列を作成し、
吸光度＝４００ｎｍにおける値を測定し、検量線を作成する。
８．風乾させたメラニンのペレットに１ＮのＫＯＨを添加して溶解させ、吸光度＝
４００ｎｍにおける値を測定して各濃度におけるメラニン量産生量を算出する。

スクリーニング対象薬剤として、５０ｖｏｌ％含水エタノールに溶解させた雪見草抽出物（注１）による、メラノサイトのメラニン産生抑制効果を図１に示した。
注１：雪見草抽出物の製造例
雪見草の葉及び茎の３００ｇに、精製水、５０ｖｏｌ％
含水エタノールを３Ｌ加え、室温又は加温して１日間抽出を行った後、濾過し、得られた濾液中の溶媒を留去して乾固し、固形分である雪見草の精製水抽出物（収量１８．５ｇ）、５０ｖｏｌ％含水エタノール抽出物（収量９．９ｇ）を得た。

図１より、スクリーニング対象である雪見草抽出物は、メラニン産生抑制効果が認められた。

試験例２：ＤＯＰＡ染色によるチロシナーゼ活性
＜手順＞
１．正常ヒトメラノサイト（ＮＨＥＭ：クラボウ社）を直径１０ｃｍのシャーレに
３０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２播種する。
２．前記播種した細胞を５日間培養し、スクリーニング対象の薬剤を２日目及び４
日目に添加する。
３．培養５日後に培地を取り除き、ＰＢＳ（−）で洗浄後、トリプシンによって細
胞を剥離させる。
４．次に、回収した細胞にｐＨ７．５の１０ｍＭトリス塩酸緩衝液抽出バッファー
を加えた後、超音波にて４℃で１０分間して細胞を破砕し、遠心分離により細
胞残渣を取り除いてから、タンパク定量を行う。
５．各サンプルのタンパク量が一定となるように１０％のポリアクリルアミドゲル、
にサンプルをのせ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
６．０．１％のＬ−ＤＯＰＡ溶液を含むＰＢＳ（−）溶液を泳動後のゲルに添加し、
３７℃にて１時間インキュベート行う。
７．１０％酢酸、４０ｖｏｌ％含水エタノールで１０分固定し、水洗する。
８．検出したバンドはデンシトメトリーで読み込み、面積を測定してチロシナーゼ
活性量とみなした。

スクリーニング対象薬剤として、５０ｖｏｌ％含水エタノールに溶解させた雪見草抽出物（注１）による、チロシナーゼ活性効果を図２に示した。

図２より、スクリーニング対象である雪見草抽出物には、チロシナーゼ活性が低いことが確認された。

試験例３：ｇｐ１００の発現量
＜手順＞
１．正常ヒトメラノサイト（ＮＨＥＭ：クラボウ社）を直径１０ｃｍのシャーレに
３０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２播種する。
２．前記播種した細胞を５日間培養し、スクリーニング対象の薬剤を２日目及び４
日目に添加する。
３．培養５日後に培地を取り除き、ＰＢＳ（−）で洗浄後、トリプシンによって細
胞を剥離させる。
４．次に、回収した細胞にｐＨ７．５の１０ｍＭトリス塩酸緩衝液抽出バッファー
を加えた後、超音波にて４℃で１０分間して細胞を破砕し、遠心分離により細
胞残渣を取り除いてから、タンパク定量を行う。
５．各サンプルのタンパク量が一定となるように１０％のポリアクリルアミドゲル
にサンプルをのせ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
６．電気泳動終了後、ゲル上のタンパクをニトロセルロース膜に転写し、ウエスタ
ンブロッティングを行うことによりｇｐ１００を検出した。
７．１次抗体は抗ヒトｇｐ１００モノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡＣＲＵＺ社）、
２次抗体は抗マウスペルオキシダーゼ標識ＩｇＧ（アマシャム社）を用いてケ
ミルミネッセンス法により検出した。
８．検出したバンドはデンシトメトリーで読み込み、面積を測定してｇｐ１００の
発現量とみなした。

スクリーニング対象薬剤として、５０ｖｏｌ％含水エタノールに溶解させた雪見草抽出物（注１）による、ｇｐ１００の発現量を図３に示した。

図３より、スクリーニング対象である雪見草抽出物は、ｇｐ１００の発現量を低下させる（ｇｐ１００の産生抑制）ことが認められた。

前記図１と図２より、雪見草抽出物は、メラニン産生抑制効果、すなわち、美白効果を有する薬剤であることは、認められるが、そのメカニズムは、チロシナーゼ活性によるものではない。一方、前記図１と図３より、雪見草抽出物の美白効果は、メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質であるｇｐ１００の発現量との相関があることが認められた。

以上により、メラノソーム構造蛋白質発現量量を指標とすることで美白成分のスクリーニングが可能である。また、同様に、メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質の産生抑制効果を指標とすることで美白成分のスクリーニングが可能となった。そして、メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質量を指標とすることで、メラニンのケラチノサイトへの受け渡しを阻害することを特徴とする美白成分のスクリーニングが可能となった。

本発明のメラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質量を指標とすることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法や、メラノソーム構造蛋白質の産生抑制効果を指標とすることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法は、化粧料や皮膚外用剤等に用いる美白成分の開発に用いられるものである。

メラノサイトのメラニン産生抑制ＤＯＰＡ染色によるチロシナーゼ活性ｇｐ１００の発現量

Claims

メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質ｇｐ１００の量を指標とすることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法。
メラノサイト内でのメラノソーム構造蛋白質ｇｐ１００の産生抑制効果を指標とすることを特徴とする美白成分のスクリーニング方法。