JP2011214909A - ケラチノサイトのメラノソーム取り込み輸送の検出方法 - Google Patents
ケラチノサイトのメラノソーム取り込み輸送の検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011214909A JP2011214909A JP2010081487A JP2010081487A JP2011214909A JP 2011214909 A JP2011214909 A JP 2011214909A JP 2010081487 A JP2010081487 A JP 2010081487A JP 2010081487 A JP2010081487 A JP 2010081487A JP 2011214909 A JP2011214909 A JP 2011214909A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- keratinocytes
- label
- melanosome
- melanosomes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
【課題】ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出をフローサイトメーターで行う手段において、より簡便で、その検出感度を更に高めること。
【解決手段】ケラチノサイトを培養しメラノソームを添加する工程、培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、ならびに、フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、を含む、ケラチノサイトが取り込んだメラノソームを検出する方法。
【選択図】なし
【解決手段】ケラチノサイトを培養しメラノソームを添加する工程、培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、ならびに、フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、を含む、ケラチノサイトが取り込んだメラノソームを検出する方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、ケラチノサイトが取り込むメラノソームを検出する方法およびかかる方法を用いてメラノソーム取り込み阻害剤をスクリーニングする方法に関する。
皮膚の色素沈着（皮膚黒化）は、表皮基底層にあるメラノサイト内のメラノソームと呼ばれる小器官（オルガネラ）の中でメラニンの合成が盛んになり、周囲の表皮角化細胞（以下、ケラチノサイトと称す）にメラニンが輸送され、ケラチノサイト中に貯蔵されることによって起こる。
例えば、日焼けによる色素沈着の機序は、（１）Ｂ紫外線がメラノサイトのチロシナーゼ活性を上昇させてメラニンの合成量が増加する、（２）Ｂ紫外線に暴露されたケラチノサイトが種々のメラノサイト活性化因子を放出しそれによってメラノサイトがメラニンの合成亢進や増殖促進する、（３）生成されたメラノソームがケラチノサイトに輸送されて起こる（例えば、非特許文献１などを参照）。
色素沈着のこのような機序から見出された美白剤としては、メラニンの生成を抑制するためのチロシナーゼ阻害剤、メラニンの増殖抑制剤、メラノサイト活性化因子の阻害剤、メラノソームのケラチノサイトへの輸送抑制剤などが挙げられる。
これまで、上記（３）に関する研究は不十分であった。その理由は、ケラチノサイトがメラノソーム取り込みを測定する手段が近年になってようやく開発されてきたためであり、当該手段としては、現在までにいくつかの方法が開示されてきている（例えば、特許文献１、２、３などを参照）。
特許文献１には、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養し、これに異なる色で標識したメラノソーム特異抗体およびケラチノサイト特異抗体を結合させた後、二重に染色された画像を解析する方法が開示されている。さらにこの検出系を用いれば、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能になることが記載されている。
特許文献２には、蛍光標識したケラチノサイトと非標識メラノサイトを共培養し、これに蛍光標識メラノソーム特異抗体を結合させた後フローサイトメーターを用いて解析する方法が開示されている。さらにこの検出系を用いれば、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能になることが記載されている。
フレグランスジャーナル 臨時増刊 No.18 2003
Pigment Cell Res. Vol.18 No.5 2005 p.370-381
Pigment Cell Melanoma Res. Vol.23 No.1 2010 p.129-133
上記のような画像解析によりメラノソーム輸送を検出する方法は、専用のソフトやその解析手段が煩雑であり、ケラチノサイトを直接蛍光標識してメラノソーム輸送を検出する方法は、細胞増殖能が低下し、検出感度が低下してしまうという問題がある。またケラチノサイト単独培養でのメラノソーム取り込み量測定においても、メラノソームをメラノーマ細胞から単離の操作が煩雑で、検出方法として未だ充分とは言えず、より簡便で検出感度の高い方法の開発が望まれている。
そこで、本発明の目的は、従来の検出方法のもつ課題を解決し、より簡便で、且つ、検出感度を向上させた方法を提供することである。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究をすすめてきた。その結果、メラノーマ培養液中にメラノソームが放出されることから、ケラチノサイト培養中に、メラノーマ培養液を濃縮し添加、その後、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体（以下、単に「標識ケラチノサイト結合抗体」という場合がある。）、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体（以下、単に「標識メラノソーム結合抗体」という場合がある。）（この標識は標識ケラチノサイト結合抗体の標識とは異なる標識である。）を添加し、次いでフローサイトメーターによりケラチノサイト中のメラノソームを検出することによって、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みを簡便に検出できることを見出した。
さらに、PAR-2アゴニストを添加することによって、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出感度が著しく向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
（１）ケラチノサイトを培養しメラノソームを添加する工程、培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、ならびに、フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、を含む、ケラチノサイトが取り込んだメラノソームを検出する方法、
（２）培養する工程において、PAR-2アゴニストを添加する工程を含む、（１）に記載の方法、
（３）添加されるPAR-2アゴニストの濃度が10〜100μMである、（２）に記載の方法、
（４）標識が蛍光標識である、（１）〜（３）いずれか１項に記載の方法、
（５）ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、（１）〜（４）いずれか１項に記載の方法、
（６）メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、（１）〜（５）いずれか１項に記載の方法、
（７）該共培養液中にPAR-2アゴニストを添加することにより、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出感度を向上させたことを特徴とする、（１）に記載の方法、
（８）ケラチノサイトを培養しメラノソームを添加する工程、被験化合物を添加する工程、培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、ならびに、メラノソームの検出量が対照と比較して減少していることを確認する工程、を含む、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニング方法、
（９）培養する工程において、PAR-2アゴニストを添加する工程を含む、（８）に記載の方法、
（１０）添加されるPAR-2アゴニストの濃度が10〜100μMである、（９）に記載の方法、
（１１）標識が蛍光標識である、（７）〜（１０）いずれか１項に記載の方法、
（１２）ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、（７）〜（１１）いずれか１項に記載の方法、
（１３）メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、（７）〜（１２）いずれか１項に記載の方法、ならびに
（１４）該培養液中にPAR-2アゴニストを添加することにより、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出感度を向上させたことを特徴とする、（８）に記載の方法、
である。
（１）ケラチノサイトを培養しメラノソームを添加する工程、培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、ならびに、フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、を含む、ケラチノサイトが取り込んだメラノソームを検出する方法、
（２）培養する工程において、PAR-2アゴニストを添加する工程を含む、（１）に記載の方法、
（３）添加されるPAR-2アゴニストの濃度が10〜100μMである、（２）に記載の方法、
（４）標識が蛍光標識である、（１）〜（３）いずれか１項に記載の方法、
（５）ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、（１）〜（４）いずれか１項に記載の方法、
（６）メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、（１）〜（５）いずれか１項に記載の方法、
（７）該共培養液中にPAR-2アゴニストを添加することにより、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出感度を向上させたことを特徴とする、（１）に記載の方法、
（８）ケラチノサイトを培養しメラノソームを添加する工程、被験化合物を添加する工程、培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、ならびに、メラノソームの検出量が対照と比較して減少していることを確認する工程、を含む、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニング方法、
（９）培養する工程において、PAR-2アゴニストを添加する工程を含む、（８）に記載の方法、
（１０）添加されるPAR-2アゴニストの濃度が10〜100μMである、（９）に記載の方法、
（１１）標識が蛍光標識である、（７）〜（１０）いずれか１項に記載の方法、
（１２）ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、（７）〜（１１）いずれか１項に記載の方法、
（１３）メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、（７）〜（１２）いずれか１項に記載の方法、ならびに
（１４）該培養液中にPAR-2アゴニストを添加することにより、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出感度を向上させたことを特徴とする、（８）に記載の方法、
である。
本発明によれば、従来のメラノソーム輸送の検出方法より簡便な操作により、正確にケラチノサイトのメラノソーム取り込み量を測定できるとともに、その検出感度が大幅に向上する。これによって、大量かつ正確にメラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能となる。
本発明は、（１）培養中にメラノソームを添加する工程、（２）培養後に抗体を添加する工程、および（３）メラノソームを検出する工程、を含む、ケラチノサイトが取り込んだメラノソームを検出する方法であり、以下、各工程について詳細に説明する。
（１）培養工程
本発明において用いられるケラチノサイトとしては、哺乳動物のケラチノサイトであれば特に限定されないが、好ましくは、ヒトケラチノサイト、より好ましくは、ヒト正常ケラチノサイト、さらにより好ましくは、メラノソームを有さないヒト正常ケラチノサイトである。かかるケラチノサイトは、例えば、クラボウ社、Cascade Biologics社、Lonza社、コスモ・バイオ社などから市販されている。
本発明において用いられるケラチノサイトとしては、哺乳動物のケラチノサイトであれば特に限定されないが、好ましくは、ヒトケラチノサイト、より好ましくは、ヒト正常ケラチノサイト、さらにより好ましくは、メラノソームを有さないヒト正常ケラチノサイトである。かかるケラチノサイトは、例えば、クラボウ社、Cascade Biologics社、Lonza社、コスモ・バイオ社などから市販されている。
本発明に用いられるメラノーマとしては、哺乳動物のメラノーマであれば特に限定されないが、好ましくは、ヒトメラノーマである。かかるメラノーマは、例えば、MNT-1細胞、B16細胞である。B16細胞は理化学研究所バイオリソースセンターより購入可能である。
本発明における培養は、当該分野で公知の方法で行うことができる。例えば、各培養をそれぞれ継代培養した後に、片方の培養液を抽出し、もう一方の培養した細胞に培養液交換時に添加すればよい。
共培養における培養条件などは、細胞培養可能であれば特に限定されないが、例えば、黒木登志夫 他２名 編、「分子生物学研究のための培養細胞実験法」、株式会社 羊土社、1995年3月20日、p.63-74、渡邊利雄著、「バイオ実験イラストレイテッド ６ すくすく育て 細胞培養」、第１版第５刷、株式会社 秀潤社、2001年7月15日、p.45-99などを参照することができる。培養期間は、ケラチノサイトがメラノソームを取り込むのに十分な期間であれば特に限定されないが、５〜７日間が好ましい。
メラノソーム添加時の培養に使用される培地としては、細胞培養可能な培地であれば特に限定されないが、例えば、Medium154S(クラボウ社)に増殖添加剤HKGS(クラボウ社)を加えた培地などが挙げられる。
なお、培養前に各細胞を継代培養する際に使用される培地としては、各細胞の培養が可能な培地であれば特に限定されないが、ケラチノサイトの場合、Medium 154S（クラボウ社）にHKGS（クラボウ社）を加えた培地など、メラノーマの場合、DMEM（Sigma社）にFBS（DSファーマバイオメディカル）10% ストレプトマイシン（GIBCO社） 100 μg/mL, ペニシリン（GIBCO社） 100 U/mL, アンホテリシンB 2.5 μg/mL(Sigma社)を加えた培地などが挙げられる。
本発明における培養工程は、検出感度をさらに向上させる観点から、PAR-2アゴニストを添加する工程を含むことが好ましい。
本発明で使用されるPAR-2アゴニストとしては、ペプチドH-Ser-Ler-Ile-Gly-Lys-Val-NH2などが挙げられるが、例えば、AnaSpec社から市販されているPAR-2アゴニストを用いればよい。添加されるトリプシン濃度が10〜100μMであることが好ましい。
培養工程においてPAR-2アゴニストを添加する工程を含む場合、PAR-2アゴニスト非存在下で１〜３日間培養し、PAR-2アゴニストを添加して処理し、さらに２〜４日間培養することが好ましい。
（２）抗体結合工程
本発明に使用されるケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体とは、ケラチノサイトに特異的に結合する抗体に標識が付された抗体をいう。ケラチノサイトに特異的に結合する抗体としては、例えば、抗サイトケラチン抗体などが挙げられ、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、ヒト、マウス、ウサギなどの由来であってもよいが、マウス抗ヒトサイトケラチン抗体が好ましい。
本発明に使用されるケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体とは、ケラチノサイトに特異的に結合する抗体に標識が付された抗体をいう。ケラチノサイトに特異的に結合する抗体としては、例えば、抗サイトケラチン抗体などが挙げられ、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、ヒト、マウス、ウサギなどの由来であってもよいが、マウス抗ヒトサイトケラチン抗体が好ましい。
ケラチノサイトに特異的に結合する抗体に付される標識としては、当該分野で公知の蛍光標識が好ましく、フルオレセインイソチオシアナート（以下、単にFITCという場合がある）がより好ましい。
抗体への標識の付与は、当該分野で公知の方法により行うことができる。または、PROGEN Biotechnik社などから市販されている標識抗体を使用してもよい。
本発明に使用されるメラノソームに特異的に結合する標識された抗体とは、メラノソームに特異的に結合する抗体に標識が付された抗体をいう。メラノソームに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、ヒト、マウス、ウサギなどの由来であってもよい。かかる抗体としては、例えば、マウス抗リコンビナントMelan-A抗体、マウス抗ヒトメラノソーム抗体HMB45、抗チロシナーゼ抗体、抗TRP2抗体、抗TRP1抗体などが挙げられ、マウス抗リコンビナントMelan-A抗体が好ましい。
ケラチノサイトに特異的に結合する抗体に付される標識としては、当該分野で公知の蛍光標識が好ましく、ケラチノサイトに付された標識とは異なる色を生じる蛍光標識が好ましい。蛍光標識の例としては、ローダミン、フィコエリスリン（以下、単にPEという場合がある）などが挙げられ、中でもPEが好ましい。
抗体への標識の付与は、当該分野で公知の方法により行うことができる。または、Santa Cruz社などから市販されている標識抗体を使用してもよい。
（３）メラノソームを検出する工程
本工程は、フローサイトメーターによってケラチノサイト中のメラノソームを検出する。検出方法としては、蛍光標識で検出されたケラチノサイト中のメラノソームが、ケラチノサイトとは異なる色の蛍光として定量される。
本工程は、フローサイトメーターによってケラチノサイト中のメラノソームを検出する。検出方法としては、蛍光標識で検出されたケラチノサイト中のメラノソームが、ケラチノサイトとは異なる色の蛍光として定量される。
検出に使用される装置としては、Cell Lab Quanta SC MPL(ベックマンコールター社)などが挙げられる。
本発明のメラノソーム取り込み検出系を用いれば、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能である。例えばケラチノサイト培養時に被験物質を添加してメラノソーム検出量を測定し、被験物質非添加の場合（対照）のメラノソーム検出量と対比すれば、当該被験物質がメラノソーム輸送を阻害するか否かが判定できる。例えば、被験物質の添加によりメラノソーム検出量が対照と比較して減少していれば、その被験物質はメラノソーム輸送抑制能を有することがわかる。なお、被験物質の添加は、培養中に行われるPAR-2アゴニスト添加と同時に行うことが好ましい。
実施例
（１）ヒトメラノーマ細胞(MNT-1)を13000 cells/cm2の密度で播種・培養した。培養開始2週間後に培養上清を回収した。
（２）ヒトメラノーマ細胞の培養には、DMEM(Sigma社)にFBS（DSファーマバイオメディカル）10% ストレプトマイシン（GIBCO社） 100 μg/mL, ペニシリン（GIBCO社） 100 U/mL, アンホテリシンB 2.5 μg/mL(Sigma社)を加えた培地を使用した。
（３）回収した培養上清を1100 rpm, 5分間遠心（KUBOTA社製 5800、）し、上清を回収した。
（４）さらに回収した上清を10000rpm 30分間遠心（HITACHI社製、CR216II）し、沈殿を回収しPBS（GIBCO社）に浮遊させ、メラノソーム浮遊液とした。
（５）市販のヒト正常ケラチノサイト(NHEK(F)、クラボウ社)を4000 cells/cm2で播種・培養した。セミコンフルエントの状態で、HEPES緩衝液(クラボウ社)で１回洗浄の後、0.025％トリプシン-EDTA(クラボウ社)処理によって回収した。
（６）ケラチノサイトの培養にはMedium154S(クラボウ社)に増殖添加剤HKGS(クラボウ社)を加えた培地を用いた。
（７）細胞を浮遊液の状態で、ケラチノサイト5000 cells/cm2の密度で培養を開始した。共培養２日目に培養フラスコから培地のみを吸引した後、メラノソーム浮遊液及びPAR-2アゴニストを添加し、被験物質を加えた培地、または被験物質を加えていない培地に置き換え、さらに３日間培養した。被験物質としては、3mMおよび10mMトラネキサム酸、0.01mMニコチン酸アミドを用いた。
（８）培養開始から５日後、HEPESで１回洗浄を行ない、0.025％トリプシン-EDTA(クラボウ社)処理により細胞を回収した後、細胞数を500000cells/tubeに調整し、2％パラホルムアルデヒド/PBSを加え、室温で20分間固定した。
（９）遠心後、細胞を回収し、0.5％サポニン・0.5％BSA/PBSで室温、10分間処理した後、FITC標識マウス抗ヒトサイトケラチン抗体(PROGEN Biotechnik社製)およびPE標識マウス抗リコンビナントMelan-A抗体(Santa Cruz社製)を加え、室温で1時間振盪した。
（１０）2％パラホルムアルデヒド/PBSに液を交換後、セルストレーナー付きFACS解析用チューブ（FALCON社）中に滴下して、Cell Lab Quanta SC MPL(ベックマンコールター社)にて解析した（図１、２）。
（１１）FITC標識されたケラチノサイトを選別し、ケラチノサイトに取り込まれたメラノソーム表面に存在するMelan-A認識した抗体のPE蛍光強度を、メラノソーム移送量とした。その結果、ケラチノサイト中のメラノソームが正確に検出できた。
（１）ヒトメラノーマ細胞(MNT-1)を13000 cells/cm2の密度で播種・培養した。培養開始2週間後に培養上清を回収した。
（２）ヒトメラノーマ細胞の培養には、DMEM(Sigma社)にFBS（DSファーマバイオメディカル）10% ストレプトマイシン（GIBCO社） 100 μg/mL, ペニシリン（GIBCO社） 100 U/mL, アンホテリシンB 2.5 μg/mL(Sigma社)を加えた培地を使用した。
（３）回収した培養上清を1100 rpm, 5分間遠心（KUBOTA社製 5800、）し、上清を回収した。
（４）さらに回収した上清を10000rpm 30分間遠心（HITACHI社製、CR216II）し、沈殿を回収しPBS（GIBCO社）に浮遊させ、メラノソーム浮遊液とした。
（５）市販のヒト正常ケラチノサイト(NHEK(F)、クラボウ社)を4000 cells/cm2で播種・培養した。セミコンフルエントの状態で、HEPES緩衝液(クラボウ社)で１回洗浄の後、0.025％トリプシン-EDTA(クラボウ社)処理によって回収した。
（６）ケラチノサイトの培養にはMedium154S(クラボウ社)に増殖添加剤HKGS(クラボウ社)を加えた培地を用いた。
（７）細胞を浮遊液の状態で、ケラチノサイト5000 cells/cm2の密度で培養を開始した。共培養２日目に培養フラスコから培地のみを吸引した後、メラノソーム浮遊液及びPAR-2アゴニストを添加し、被験物質を加えた培地、または被験物質を加えていない培地に置き換え、さらに３日間培養した。被験物質としては、3mMおよび10mMトラネキサム酸、0.01mMニコチン酸アミドを用いた。
（８）培養開始から５日後、HEPESで１回洗浄を行ない、0.025％トリプシン-EDTA(クラボウ社)処理により細胞を回収した後、細胞数を500000cells/tubeに調整し、2％パラホルムアルデヒド/PBSを加え、室温で20分間固定した。
（９）遠心後、細胞を回収し、0.5％サポニン・0.5％BSA/PBSで室温、10分間処理した後、FITC標識マウス抗ヒトサイトケラチン抗体(PROGEN Biotechnik社製)およびPE標識マウス抗リコンビナントMelan-A抗体(Santa Cruz社製)を加え、室温で1時間振盪した。
（１０）2％パラホルムアルデヒド/PBSに液を交換後、セルストレーナー付きFACS解析用チューブ（FALCON社）中に滴下して、Cell Lab Quanta SC MPL(ベックマンコールター社)にて解析した（図１、２）。
（１１）FITC標識されたケラチノサイトを選別し、ケラチノサイトに取り込まれたメラノソーム表面に存在するMelan-A認識した抗体のPE蛍光強度を、メラノソーム移送量とした。その結果、ケラチノサイト中のメラノソームが正確に検出できた。
以上の方法によって得られたケラチノサイトへのメラノソーム取り込み量を調べた結果、図２に示すようにPAR-2アゴニストを添加しなかった系に比べ、取り込み量の増加が観察された。
また、図２に示すように、メラノソーム移送抑制剤として公知のニコチン酸アミドを添加するとメラノソーム取込量が抑制されていることから、本発明のスクリーニング方法の妥当性が立証された。また、トラネキサム酸を本発明のスクリーニング法に供した結果、トラネキサム酸はメラノソームの取り込みを抑制することが確認された。
本発明の方法によれば、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養系より簡便かつ正確な操作により、ケラチノサイト単独培養で、PAR-2アゴニストとメラノソームを添加して、ケラチノサイトのメラノソーム取り込み量を測定できるため、有用である。これによって、大量かつ正確にメラノソーム取り込み阻害剤のスクリーニングが可能となり有用である。
Claims (14)
- ケラチノサイト及びメラノーマを培養する工程、
メラノーマ培養液から、メラノソームを抽出する工程
ケラチノサイト培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、ならびに
フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、
を含む、ケラチノサイトが取り込んだメラノソームを検出する方法。 - 共培養する工程において、PAR-2アゴニストを添加する工程を含む、請求項１に記載の方法。
- 添加されるPAR-2アゴニストの濃度が10〜100μMである、請求項２または３に記載の方法。
- 標識が蛍光標識である、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
- ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
- メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
- 該共培養液中にPAR-2アゴニストを添加することにより、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出感度を向上させたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- ケラチノサイトを培養しメラノソームを添加する工程、
被験化合物を添加する工程、
培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、
フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、ならびに
メラノソームの検出量が対照と比較して減少していることを確認する工程、
を含む、メラノソーム取り込み阻害剤のスクリーニング方法。 - 培養する工程において、PAR-2アゴニストを添加する工程を含む、請求項８に記載の方法。
- 添加されるPAR-2アゴニストの濃度が10〜100μMである、請求項８または９に記載の方法。
- 標識が蛍光標識である、請求項７〜１０いずれか１項に記載の方法。
- ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、請求項７〜１１いずれか１項に記載の方法。
- メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、請求項７〜１２いずれか１項に記載の方法。
- 該共培養液中にPAR-2アゴニストを添加することにより、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出感度を向上させたことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010081487A JP2011214909A (ja) | 2010-03-31 | 2010-03-31 | ケラチノサイトのメラノソーム取り込み輸送の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010081487A JP2011214909A (ja) | 2010-03-31 | 2010-03-31 | ケラチノサイトのメラノソーム取り込み輸送の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011214909A true JP2011214909A (ja) | 2011-10-27 |
Family
ID=44944819
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010081487A Pending JP2011214909A (ja) | 2010-03-31 | 2010-03-31 | ケラチノサイトのメラノソーム取り込み輸送の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2011214909A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018072098A (ja) * | 2016-10-27 | 2018-05-10 | 株式会社ナリス化粧品 | 真皮シミ予防・改善剤及び／又はマクロファージ誘引剤のスクリーニング方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002508331A (ja) * | 1997-12-16 | 2002-03-19 | ジョンソン・アンド・ジョンソン・コンシューマー・カンパニーズ・インコーポレイテッド | ファゴサイトーシスおよびｉｃａｍ−１発現を調節するための組成物および方法 |
| JP2003212714A (ja) * | 2001-12-28 | 2003-07-30 | Avon Products Inc | 局所性ライトニング組成物およびその使用方法 |
| JP2005249391A (ja) * | 2004-03-01 | 2005-09-15 | Kao Corp | メラノソーム転送の検出法 |
| JP2005249390A (ja) * | 2004-03-01 | 2005-09-15 | Kao Corp | メラノソーム転送の検出法 |
| JP2008232693A (ja) * | 2007-03-19 | 2008-10-02 | Kose Corp | 美白成分のスクリーニング方法 |
-
2010
- 2010-03-31 JP JP2010081487A patent/JP2011214909A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002508331A (ja) * | 1997-12-16 | 2002-03-19 | ジョンソン・アンド・ジョンソン・コンシューマー・カンパニーズ・インコーポレイテッド | ファゴサイトーシスおよびｉｃａｍ−１発現を調節するための組成物および方法 |
| JP2003212714A (ja) * | 2001-12-28 | 2003-07-30 | Avon Products Inc | 局所性ライトニング組成物およびその使用方法 |
| JP2005249391A (ja) * | 2004-03-01 | 2005-09-15 | Kao Corp | メラノソーム転送の検出法 |
| JP2005249390A (ja) * | 2004-03-01 | 2005-09-15 | Kao Corp | メラノソーム転送の検出法 |
| JP2008232693A (ja) * | 2007-03-19 | 2008-10-02 | Kose Corp | 美白成分のスクリーニング方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018072098A (ja) * | 2016-10-27 | 2018-05-10 | 株式会社ナリス化粧品 | 真皮シミ予防・改善剤及び／又はマクロファージ誘引剤のスクリーニング方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ahola et al. | Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation | |
| Shang et al. | Human hepatic stellate cell isolation and characterization | |
| Sariisik et al. | Probing the interaction forces of prostate cancer cells with collagen I and bone marrow derived stem cells on the single cell level | |
| Liu et al. | Epidermal development in mammals: key regulators, signals from beneath, and stem cells | |
| Morrison et al. | Salamander limb regeneration involves the activation of a multipotent skeletal muscle satellite cell population | |
| Fridriksdottir et al. | Propagation of oestrogen receptor-positive and oestrogen-responsive normal human breast cells in culture | |
| Guo et al. | Epcam, CD44, and CD49f distinguish sphere-forming human prostate basal cells from a subpopulation with predominant tubule initiation capability | |
| JP2017524377A (ja) | 単一細胞由来オルガノイド | |
| Piltti et al. | Live-cell time-lapse imaging and single-cell tracking of in vitro cultured neural stem cells–Tools for analyzing dynamics of cell cycle, migration, and lineage selection | |
| Rapila et al. | Excitation–contraction coupling of the mouse embryonic cardiomyocyte | |
| Nguyen et al. | Enrichment of neonatal rat cardiomyocytes in primary culture facilitates long-term maintenance of contractility in vitro | |
| Jariyal et al. | Advancements in cancer stem cell isolation and characterization | |
| Slotvitsky et al. | Arrhythmogenicity test based on a human-induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocyte layer | |
| Talbot et al. | Use of video bioinformatics tools in stem cell toxicology | |
| Guo et al. | An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells | |
| EP1960553A2 (en) | Pulmonary stem cells, related methods and kits | |
| Huang et al. | Bioengineering of a CLiP‐derived tubular biliary‐duct‐like structure for bile transport in vitro | |
| de Souza Moraes et al. | Simplified low-cost methodology to establish, histologically process and analyze three-dimensional cancer cell spheroid arrays | |
| Polisetti et al. | Efficient isolation and functional characterization of niche cells from human corneal limbus | |
| Dzyubenko et al. | Analysing intercellular communication in astrocytic networks using “astral” | |
| JP2011214909A (ja) | ケラチノサイトのメラノソーム取り込み輸送の検出方法 | |
| Radaszkiewicz et al. | Simple non-invasive analysis of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes beating in vitro | |
| US20180135010A1 (en) | Isolation and long-term culturing of estrogen receptor-positive human breast epithelial cells | |
| Moestrup et al. | Isolation and in vitro characterization of epidermal stem cells | |
| Mainzer et al. | In vitro epidermis model mimicking IGF‐1–specific age‐related decline |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20121029 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20130919 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130924 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140204 |