JP2005249390A - メラノソーム転送の検出法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 メラノサイト及びケラチノサイトを共培養し、当該培養細胞と、相互に異なる色に染色できる標識でそれぞれ標識されたメラノソーム特異抗体及びケラチノサイト特異抗体との結合体を得、二重に染色された画像を解析することを特徴とするメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送の検出法。
【選択図】 なし
Description
Pigment Cell Res. 14:p185-194(2001) The Journal of Investigative Dermatology, Vol. 115, No.2, August 2000, p162-167
すなわち、本発明は、メラノサイト及びケラチノサイトを共培養し、当該培養細胞と、同時に検出可能で、かつ相互に異なる色に染色できる標識でそれぞれ標識されたメラノソーム特異抗体及びケラチノサイト特異抗体との結合体を得、二重に染色された画像を解析することを特徴とするメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送の検出法を提供するものである。
また本発明は、上記メラノソーム転送の検出系を用い、被験物質によるメラノソーム転送量の変化を検出することを特徴とするメラノソーム転送阻害剤のスクリーニング法を提供するものである。
蛍光量の測定は常法により行うことができる。例えば、フローサイトメーターを用いて蛍光強度を数値化することにより測定できる。
画像解析も常法により行うことができる。例えば、Image Pro Plusを用い、画像をRGB色成分に分解した後、メラノソームを標識した蛍光に対応する特定の色成分のみをグレースケールにて表示し、自動抽出によってメラノソーム領域を抽出することにより測定できる。
(1)市販のヒト正常ケラチノサイト(NHEK(F)、クラボウ社)を4000cells/cm2で播種・培養した。セミコンフルエントの状態でダルベッコのリン酸緩衝液(D-PBS, Invitrogen社)で2回洗浄の後、0.25%トリプシン−EDTA(Invitrogen社)処理によって回収し、7000cells/cm2の密度で継代する。
(2)継代した細胞をセミコンフルエントの状態でトリプシン処理によって回収し、20000cells/cm2の密度で播種・培養した。ケラチノサイト単独の培養にはK-SFM(Invitrogen社)にサプリメント(Invitrogen社)を加えた培地を用いた。
(3)ケラチノサイト播種24時間後、3継代培養したヒト正常メラノサイト(NHEM(F)、クラボウ社)を10000cells/cm2の密度で添加し、Medium154(クラボウ社)にホルボールエステル(PMA)を除くHMGS(クラボウ社)を添加したメラノサイト至適培地と、サプリメントを除いたK-SFMを1:2の比率で混合した培地を用いて4日間培養した。転送阻害のポジティブコントロールとしては、0.1%大豆トリプシンインヒビター(STI)、1mMナイアシンアミドを用い、それぞれ24時間毎に1回、12時間毎に1回添加した。
(4)4日間培養した後、リン酸緩衝液(PBS)で2回洗浄を行ない、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/PBSを用いて4℃で10分間処理することによって細胞を固定し、その後PBSで数回洗浄してPFAを完全に除去した。
(5)3%BSA/PBSを添加し1時間室温にて振盪した後、マウス抗ヒトgp100抗体HMB45(DAKO社)、ウサギ抗ヒトE−カドヘリン抗体(Santa Cruz Biotechnology社)を添加し、4℃で一昼夜振盪を行なった。ネガティブコントロールとしてはマウスユニバーサルネガティブコントロール(DAKO社)、ウサギIgG(Sigma社)を等濃度で加えたものを用いた。
(6)0.3%BSA/PBSで3回洗浄し、さらに3%BSA/PBSを添加して1時間室温にて振盪した後、ヤギ抗ウマスIgG FITC標識(CHEMICON社)、ブタ抗ウサギIgs TRITC標識(DAKO社)を添加し、室温にて1時間振盪した。
(7)0.3%BSA/PBSで3回洗浄後、核を染色する目的で300nM4′,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)/PBS(Molecular Probes社)を添加して更に10分間振盪した。PBSで洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察及びデジタル画像の撮影を行なった(図1)。
(8)撮影した画像を用い、E-cadherin抗体によって赤く染色されるケラチノサイト中に認められるHMB45抗体陽性所見(黄色)の数及び面積を、画像解析ソフトであるImage Pro Plus4.5(MEDIA CYBERNETICS社)を用いて解析し、これをメラニン転送量とした。
PBSを添加したサンプルをコントロールとし、そのメラニン転送量を100としたとき、メラノソーム転送阻害剤剤であるナイアシンアミドを添加すると、ケラチノサイト1細胞あたりにして約40%、単位面積あたりで20%の転送阻害効果が認められた。
実施例においてマウス抗ヒトメラノソーム抗体HMB45(DAKO社)を抗チロシナーゼ抗体であるMab−1に変えた以外は同じ操作をした。ケラチノサイトに転送されたメラノソームは検出されない。
Claims (4)
- メラノサイト及びケラチノサイトを共培養し、当該培養細胞と、相互に異なる色に染色できる標識でそれぞれ標識されたメラノソーム特異抗体及びケラチノサイト特異抗体との結合体を得、二重に染色された画像を解析することを特徴とするメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送の検出法。
- 標識が蛍光標識である請求項1記載の検出法。
- メラノサイト及びケラチノサイトを共培養し、当該培養細胞と、相互に異なる色に染色できる標識でそれぞれ標識されたメラノソーム特異抗体及びケラチノサイト特異抗体との結合体を得、二重に染色された画像を解析することによるメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送の検出系を用い、被験物質によるメラノソーム転送量の変化を検出することを特徴とする、メラノソーム転送阻害剤のスクリーニング法。
- 標識が蛍光標識である請求項3記載のスクリーニング法。
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